Антитіла проти фактора росту нервів (фрн), що мають підвищену стабільність in vivo

Реферат: Винахід належить до антитіл проти фактору росту нервів (ФРН), які містять варіабельну область важкого ланцюга, варіабельну область легкого ланцюга та константну область IgG4, причому антитіла демонструють довгий період напіввиведення із сироватки в яванських макаків. Винахід також спрямовано на створення фармацевтичних композицій, що містять антитіла проти ФРН, нуклеїнові кислоти, що кодують антитіла проти ФРН, клітини-хазяїни, що експресують антитіла проти ФРН, і способи застосування антитіл для лікування захворювань або станів, пов'язаних із ФРН. UA 104890 C2 (12) UA 104890 C2 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рівень техніки Фактор росту нервів (ФРН) - це білок, що секретує, який був виявлений більше 50 років тому як молекула, що сприяє виживанню й диференціюванню чутливих і симпатичних нейронів. Беталанцюг ФРН повністю відповідає за активність ФРН, що стимулює ріст нервів. Бета-ланцюг утворює гомодімери й входить до складу більш великого білкового комплексу. ФРН є членом сімейства нейротрофічних факторів, відомих як нейротрофіни. ФРН із високою афінністю зв'язується з кіназою рецептору тропоміозину, що має назву TrkA. ФРН також здатний NTR зв'язуватися з рецептором, відомим як p75 , членом суперсімейства рецепторів фактору некрозу пухлин, що також взаємодіє з іншими нейротрофінами. Структура й функція ФРН розглядаються, наприклад, у роботі Sofroniew, M.V. et al. (2001) Annu. Rev. Neurosci. 24:12171281; Weismann, C. and de Vos, A.M. (2001) Cell. Mol. Life Sci. 58:748-759; Fahnestock, M. (1991) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 165:1-26. Хоча спочатку ФРН був ідентифікований по його здатності забезпечувати виживання й диференціювання нейронів, з'являється усе більше свідчень того, що цей вплив на розвиток є лише одним аспектом біології ФРН. Зокрема, була показана участь ФРН у передачі й підтримці персистентного або хронічного болю. Наприклад, продемонстровано, що як місцеве, так і системне введення ФРН викликає гіпералгезію й аллодинію (Lewin, G.R. et al. (1994) Eur. J. Neurosci. 6:1903-1912). Внутрішньовенна інфузія ФРН людині викликає міалгію у всьому тілі, у той час як місцеве введення викликає гіпералгезію й аллодинію в області ін'єкції, на додаток до системних ефектів (Apfel, S.C. et al. (1998) Neurology 51_:695-702). Крім того, при деяких формах ракових захворювань надлишок ФРН сприяє росту й інфільтрації нервових волокон з індукцією ракового болю (Zhu, Z. et al. (1999) J. Clin. Oncol. 17:241-228). Участь ФРН у механізмах хронічного болю призвело до значної зацікавленості в терапевтичних підходах, заснованих на інгібуванні ефектів ФРН (див., наприклад, Saragovi, H.U. and Gehring, K. (2000) Trends Pharmacol. Sci. 21:93-98). Наприклад, розчинну форму рецептора TrkA застосовували для блокування активності ФРН, що, як було показано, істотно зменшило утворення невром, відповідальних за невропатичний біль, без ушкодження тіл клітин нейронів з патологічними змінами (Kryger, G.S. et al. (2001) J. Hand Surg. (Am.) 26:635-644). Інший спосіб нейтралізації активності ФРН полягає в застосуванні антитіл проти ФРН, приклади яких були описані (див., наприклад, публікації PCT №№ WO 2001/78698, WO 2001/64247, WO 2002/096458, WO 2004/032870, WO 2005/061540, WO 2006/131951, WO 2006/110883, патент США № 7 449 616, публікації США №№ US 20050074821, US 20080033157, US 20080182978 і US 20090041717). У моделях невропатичного болю у тварин (наприклад, перев'язка нервового стовбура або спінального нерва) системна ін'єкція нейтралізуючих антитіл проти ФРН запобігає як аллодинії, так і гіпералгезії (Ramer, M.S. and Bisby, M.A. (1999) Eur. J. Neurosci. 11:837-846; Ro, L.S. et al. (1999) Pain 79:265-274). Більш того, обробка нейтралізуючим антитілом проти ФРН викликає істотне ослаблення болю в моделі болю, що пов'язана з раковими захворюваннями, у мишей (Sevcik, M.A. et al. (2005) Pain 115:128-141). Таким чином, у світі вищевикладеного, потрібні додаткові антагоністи ФРН. Сутність винаходу Даний винахід спрямований на створення антитіл проти ФРН, що володіють підвищеною стабільністю in vivo. Зокрема, даний винахід спрямований на створення антитіла проти ФРН, що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини містить мутацію, переважно мутацію в шарнірній області, і при цьому антитіло демонструє несподівано довгий термінальний період напіввиведення, такий як термінальний період напіввиведення в яванського макака щонайменше 15 днів і в типовому випадку - у діапазоні від приблизно 15 до приблизно 22 днів (або в діапазоні від 15 днів до 22 днів), або в діапазоні від приблизно 15 днів до 28 днів (або в діапазоні від 15 днів до 28 днів), або в діапазоні від приблизно 21 дня до приблизно 28 днів (або в діапазоні від 21 до 28 днів). Це стабілізоване антитіло проти ФРН (наприклад, антитіло зі стабілізованою шарнірною областю) також демонструє термінальний період напіввиведення в пацюків щонайменше 8 днів, у типовому випадку - у діапазоні від приблизно 8 до приблизно 9 днів (або в діапазоні від 8 до 9 днів). В інших варіантах втілення стабілізоване антитіло проти ФРН (наприклад, антитіло зі стабілізованою шарнірною областю) може мати середній термінальний період напіввиведення в людини щонайменше 10-30 днів, або щонайменше 10 днів, щонайменше 15 днів, щонайменше 20 днів, щонайменше 25 днів, щонайменше 30 днів, або в діапазоні від приблизно 10 днів до приблизно 40 днів, або в діапазоні від приблизно 15 днів до приблизно 30 днів (або в діапазоні від 10 до 40 днів або в діапазоні від 15 до 30 днів). В інших варіантах втілення стабілізоване антитіло проти ФРН (наприклад, антитіло зі стабілізованою шарнірною областю) може мати середній фармакологічний період напіввиведення в людини щонайменше 30 днів, або 1 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або у діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Переважно, мутація в консервативній області IgG4 є мутацією в шарнірній області. Ще більш переважно, мутація в шарнірній області в складі консервативної області IgG4 містить мутацію серину в позиції амінокислоти, що відповідає позиції амінокислоти 108 у послідовності ID №: 9 (яка демонструє амінокислотну послідовність дикого типу консервативної області IgG4 людини). Відповідно до цього, цей винахід спрямований на створення антитіла проти фактору росту нервів (ФРН), що містить консервативну область IgG4 людини, а саме - консервативну область IgG4 людини, що включає мутацію в шарнірній області, що включає мутацію серину в позиції амінокислоти, що відповідає позиції амінокислоти 108 у послідовності ID №: 9. Більш переважно, серин у позиції амінокислоти, що відповідає позиції амінокислоти 108 у послідовності ID №: 9, замінений на пролін. У кращому варіанті втілення консервативна область IgG4 людини у складі антитіла проти ФРН містить амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10. Як варіант, у цьому документі описані інші можливі мутації, що стабілізують IgG4. Кращим антитілом проти ФРН згідно з винаходом є антитіло PG110, амінокислотна послідовність важкого ланцюга якого представлена в ПОСЛ. ID №: 13 і амінокислотна послідовність легкого ланцюга якого представлена в ПОСЛ. ID №: 16. Відповідно до цього, цей винахід спрямований на створення антитіла проти ФРН, що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому антитіло містить важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 13 і легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 16. В іншому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення антитіла проти ФРН, що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому антитіло містить важкий ланцюг, що кодується нуклеотидною послідовністю ПОСЛ. ID №: 11, і легкий ланцюг, що кодується нуклеотидною послідовністю ПОСЛ. ID №: 14. В іншому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення антитіла проти ФРН, що містить важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 13, при цьому антитіло має термінальний період напіввиведення у яванського макака щонайменше 15 днів (і в типовому випадку - у діапазоні від приблизно 15 до приблизно 22 днів, або в діапазоні від 15 днів до 22 днів, або в діапазоні від приблизно 15 днів до 28 днів, або в діапазоні від 15 до 28 днів, або в діапазоні від приблизно 21 дня до приблизно 28 днів, або в діапазоні від 21 до 28 днів, і/або має термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів (або щонайменше 10 днів, або щонайменше 15 днів, або щонайменше 20 днів, або щонайменше 25 днів, або щонайменше 30 днів, або в діапазоні від приблизно 10 днів до приблизно 40 днів, або в діапазоні від приблизно 15 днів до приблизно 30 днів, або в діапазоні від 10 до 40 днів або в діапазоні від 15 до 30 днів). Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення у людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Переважно, важкий ланцюг кодує нуклеотидна послідовність ПОСЛ. ID №: 11. Переважно, антитіло містить легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 16. Переважно, легкий ланцюг кодує нуклеотидна послідовність ПОСЛ. ID №: 14. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1 (яка демонструє варіабельну область важкого ланцюга антитіла PG110). В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН містить варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2 (яка демонструє варіабельну область легкого ланцюга антитіла PG110). В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН конкурує за зв'язування ФРН із антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно (де ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5 демонструють CDR 1, 2 і 3, відповідно, у складі варіабельної області важкого ланцюга антитіла PG110). В іншому варіанті втілення антитіло 2 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проти ФРН містить варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно (де ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8 демонструють CDR 1, 2 і 3, відповідно, у складі варіабельної області легкого ланцюга антитіла PG110). В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, і містить варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно. Переважно, антитіло проти ФРН володіє одним або декількома наступними функціональними властивостями: а) зв'язується із ФРН людини, але не зв'язується з нейротрофічним фактором головного мозку (BDNF) людини, нейротрофіном 3 (NT-3) людини або нейротрофіном 4 (NT-4) людини; б) зв'язується із ФРН людини або пацюка з KD, що рівна 100 пМ або менш; NTR в) інгібує зв'язування ФРН із TrkA або p75 ; г) інгібує ФРН-залежну проліферацію клітин TF-1; д) інгібує ФРН-залежне виживання гангліїв заднього корінця спинного мозку курчати; е) інгібує ФРН-залежне розростання аксонів клітин PC12. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу не демонструє синдром рикошету при введенні суб'єктові. Наприклад, розмір дозування й частота введення доз для антитіла можуть бути обрані таким чином, що антитіло не демонструє синдром рикошету при введенні суб'єктові. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу здатно полегшувати біль у суб'єкта протягом тривалого періоду часу, наприклад, протягом щонайменше приблизно одного тижня, або щонайменше приблизно двох тижнів, або щонайменше приблизно чотирьох тижнів, або щонайменше приблизно восьми тижнів, або щонайменше приблизно дванадцяти тижнів, або щонайменше від приблизно одного тижня до приблизно дванадцяти тижнів, або щонайменше від приблизно чотирьох тижнів до приблизно дванадцяти тижнів, або щонайменше від приблизно восьми тижнів до приблизно дванадцяти тижнів, або протягом щонайменше одного тижня, або щонайменше двох тижнів, або щонайменше чотирьох тижнів, або щонайменше восьми тижнів, або щонайменше дванадцяти тижнів, або щонайменше від однієї до дванадцяти тижнів, або щонайменше від чотирьох до дванадцяти тижнів, або щонайменше від восьми до дванадцяти тижнів після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. Зокрема, у кращому втіленні даний винахід спрямований на створення антитіла проти ФРН, що має комбіновані корисні особливості продовженого термінального періоду напіввиведення й пролонгованого періоду полегшення болю. Відповідно до цього, цей винахід також спрямований на створення антитіла проти ФРН, що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини містить мутацію (переважно мутацію в шарнірній області), при цьому антитіло має термінальний період напіввиведення в людини щонайменше 10-30 днів, або щонайменше 10 днів, або щонайменше 15 днів, або щонайменше 20 днів, або щонайменше 25 днів, або щонайменше 30 днів, або в діапазоні від приблизно 10 днів до приблизно 40 днів, або в діапазоні від приблизно 15 днів до приблизно 30 днів (або в діапазоні 10-40 днів або в діапазоні 15-30 днів), і при цьому антитіло полегшує біль на період тривалістю від щонайменше приблизно одного тижня до приблизно дванадцяти тижнів, або щонайменше від одного тижня до дванадцяти тижнів, або по меншої мері від приблизно чотирьох тижнів до приблизно дванадцяти тижнів, або щонайменше від чотирьох тижнів до дванадцяти тижнів після введення разової дози антитіла людині (або щонайменше один тиждень, або щонайменше два тижні, або щонайменше чотири тижні, або щонайменше вісім тижнів, або щонайменше дванадцять тижнів, або від однієї до дванадцяти тижнів, або від чотирьох до дванадцяти тижнів, або від восьми до дванадцяти тижнів після введення разової дози антитіла людині). Переважно, мутація в шарнірній області містить мутацію серину в позиції амінокислоти, що відповідає позиції амінокислоти 108 у послідовності ID №: 9, переважно, заміну серину на пролін у позиції амінокислоти, що відповідає позиції амінокислоти 108 у послідовності ID №: 9. Більш переважно, консервативна область IgG4 людини включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10. У різних варіантах втілення антитіло може демонструвати одне або кілька функціональних властивостей, описаних у цьому документі. У кращому варіанті втілення антитіло конкурує за зв'язування ФРН із антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. В іншому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення антитіла проти фактору росту нервів (ФРН), що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини містить амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10, і при 3 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цьому антитіло зв'язується із ФРН людини або пацюка з K D, рівної 100 пМ або менш, інгібує NTR зв'язування ФРН із TrkA або p75 з IC50, рівної 250 пМ або менш і інгібує ФРН-залежну проліферацію клітин TF-1 з IC50, рівної 50 нг/мл або менш. Переважно, антитіло має середній термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів, або щонайменше 10 днів, або щонайменше 15 днів, або щонайменше 20 днів, або щонайменше 25 днів, або щонайменше 30 днів, або в діапазоні від приблизно 10 днів до приблизно 40 днів, або в діапазоні від приблизно 15 днів до приблизно 30 днів (або в діапазоні від 10 до 40 днів або в діапазоні від 15 до 30 днів). Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення в людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Антитіло може додатково демонструвати одну або кілька додаткових функціональних властивостей, таких як зв'язування із ФРН людини, але відсутність зв'язування з нейротрофічним фактором головного мозку (BDNF) людини, нейротрофіном 3 (NT-3) людини або нейротрофіном 4 (NT-4) людини; інгібування ФРН-залежного виживання гангліїв заднього корінця спинного мозку курчати; і/або інгібування ФРН-залежного розростання аксонів клітин PC12. Переважно, антитіло полегшує біль у суб'єкта протягом щонайменше приблизно від одного тижня до приблизно дванадцяти тижнів, або щонайменше від приблизно чотирьох тижнів до приблизно дванадцяти тижнів, або щонайменше від приблизно восьми тижнів до приблизно дванадцяти тижнів, або щонайменше від одного тижня до дванадцяти тижнів, або щонайменше від чотирьох тижнів до дванадцяти тижнів, або щонайменше від восьми до дванадцяти тижнів (або щонайменше одного тижня, або щонайменше чотирьох тижнів, або щонайменше восьми тижнів, або щонайменше дванадцяти тижнів, або від однієї до дванадцяти тижнів, або від чотирьох до дванадцяти тижнів, або від восьми до дванадцяти тижнів) після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. Переважно, антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, або антитіло містить варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно, або антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно. Переважно, антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, або антитіло містить варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2 або антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2, або антитіло конкурує за зв'язування ФРН із антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. У різних кращих варіантах втілення даний винахід спрямований на створення антитіл проти ФРН, що мають наступні особливості: Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно, і (iii) консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини містить амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10, при цьому антитіло має середній термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів. Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення у людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2, і (iii) консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини містить амінокислотну 4 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність ПОСЛ. ID №: 10, при цьому антитіло має середній термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів. Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення в людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно, і (iii) консервативну область IgG4 людини, що включає мутацію у шарнірній області, при цьому антитіло має середній термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів. Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення у людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2, і (iii) консервативну область IgG4 людини, що включає мутацію в шарнірній області, при цьому антитіло має середній термінальний період напіввиведення в людини щонайменше 10-30 днів. Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення в людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно, і (iii) консервативну область, що включає мутацію в шарнірній області, при цьому антитіло має середній термінальний період напіввиведення в людини щонайменше 10-30 днів. Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення у людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2, і (iii) консервативну область, що включає мутацію в шарнірній області, при цьому антитіло має середній термінальний період напіввиведення в людини щонайменше 10-30 днів. Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення у людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини містить амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10, при цьому антитіло зв'язується із ФРН людини або пацюка з K D, рівної 100 пМ NTR або менш, інгібує зв'язування ФРН із TrkA або p75 з IC50, рівної 250 пМ або менш, і інгібує ФРН-залежну проліферацію клітин TF-1 з IC50, рівної 50 нг/мл або менш, і при цьому антитіло має середній термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів. 5 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення у людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно, і (iii) консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини містить амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10, при цьому антитіло зв'язується із ФРН людини або пацюка з K D, рівної 100 пМ NTR або менш, інгібує зв'язування ФРН із TrkA або p75 з IC50, рівної 250 пМ або менш і інгібує ФРН-залежну проліферацію клітин TF-1 з IC50, рівної 50 нг/мл або менш. Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2, і (iii) консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини містить амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10, при цьому антитіло зв'язується із ФРН людини або пацюка зK D, NTR рівної 100 пМ або менш, інгібує зв'язування ФРН із TrkA або p75 з IC50, рівної 250 пМ або менш і інгібує ФРН-залежну проліферацію клітин TF-1 з IC50, рівної 50 нг/мл або менш. Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно, і (iii) консервативну область IgG4 людини, що включає мутацію в шарнірній області, при цьому антитіло зв'язується із ФРН NTR людини або пацюка з KD, рівної 100 пМ або менш, інгібує зв'язування ФРН із TrkA або p75 з IC50, рівної 250 пМ або менш, і інгібує ФРН-залежну проліферацію клітин TF-1 з IC50, рівної 50 нг/мл або менш. Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2, і (iii) консервативну область IgG4 людини, що включає мутацію в шарнірній області, при цьому антитіло зв'язується із ФРН людини або пацюка з KD, рівної 100 пМ або менш, інгібує зв'язування ФРН із TrkA або NTR p75 з IC50, рівної 250 пМ або менш, і інгібує ФРН-залежну проліферацію клітин TF-1 з IC50, рівної 50 нг/мл або менш. Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно, і (iii) консервативну область, що включає мутацію в шарнірній області, при цьому антитіло зв'язується із ФРН людини або NTR пацюка з KD, рівної 100 пМ або менш, інгібує зв'язування ФРН із TrkA або p75 з IC50, рівної 250 пМ або менш, і інгібує ФРН-залежну проліферацію клітин TF-1 з IC50, рівної 50 нг/мл або менш. Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2, і (iii) консервативну область, що включає мутацію в шарнірній області, при цьому антитіло зв'язується із ФРН NTR людини або пацюка з KD, рівної 100 пМ або менш, інгібує зв'язування ФРН із TrkA або p75 з IC50, рівної 250 пМ або менш, і інгібує ФРН-залежну проліферацію клітин TF-1 з IC50, рівної 50 нг/мл або менш. Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини включає мутацію, і при цьому антитіло має середній термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів. Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення у людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). 6 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіло проти фактору росту нервів (ФРН), що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини включає мутацію, і при цьому антитіло має термінальний період напіввиведення у яванського макака щонайменше 15 днів. Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення у людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). У різних варіантах втілення антитіло проти ФРН по винаходу може бути, наприклад, химерним, гуманізованим антитілом або антитілом людини, або антитілом, у якому були вилучені потенційні епітопи T-клітин. Іншою особливістю є те, що даний винахід спрямований на створення фармацевтичної композиції, що містить антитіло проти ФРН по винаходу й фармацевтично прийнятний носій. Ще одною особливістю є те, що даний винахід спрямований на створення способу ослаблення або інгібування пов'язаного із ФРН захворювання або стану в суб'єкта, а саме, способу, що включає введення суб'єктові антитіла проти ФРН по винаходу. Необмежуючі приклади пов'язаних із ФРН захворювань і станів включають біль при запаленні, післяопераційний біль, невропатичний біль, біль при переломах, біль у суглобах при подагрі, постгерпетичну невралгію, біль при онкологічних захворюваннях, біль при остеоартриті або ревматоїдному артриті, ішіалгію, болі, асоційовані із кризою серповидно-клітинної анемії, головним болем, дисменореєю, ендометріозом, кістково-м'язовий біль, хронічний біль у нижній частині спини, фіброміалгію, розтягання, вісцеральний біль, кісти яєчника, простатит, цистит, інтерстиціальний цистит, біль в області післяопераційного рубця, мігрень, невралгію тройничного нерва, біль від опіків і/або ран, біль, асоційована із травмою, біль, асоційована із захворюваннями скелетно-м'язової системи, анкілозуючий спонділоартрит, навколосуставні патології, біль, викликаний метастазами в кості, біль, викликаний ВІЛ, еритромелалгію або біль, викликаний панкреатитом або каменями в нирках. Інші приклади пов'язаних із ФРН захворювань і станів включають злоякісну меланому, ксеродерматоз і астму, таку як неконтрольована астма з важкою гіперчутливістю дихальних шляхів, і хронічний кашель. Зокрема, кращі захворювання й стани для лікування у відповідності зі способами по винаходу включають біль при запаленні (зокрема, біль, викликаний остеоартритом або ревматоїдним артритом), кістково-м'язовий біль (зокрема, хронічний біль у нижній частині спини), невропатичний біль (зокрема, дрифтер невропатію), біль при онкологічних захворюваннях і біль, викликаний метастазами в кості, інтерстиціальний цистит/ синдром хворобливого сечового міхура, біль, асоційований з хронічним небактеріальним простатитом, біль, асоційований з ендометріозом і/або фібромами матки й післяопераційний біль. Антитіло може вводитися, наприклад, внутрівенно, підшкірно (наприклад, із застосуванням шприца-ручки або підшкірного імплантату), внутрім'язово або внутрісуглобно, при цьому інші придатні способи введення описані в цьому документі. Переважно, антитіло вводять у дозі, що перебуває в діапазоні від 0,1 мг/кг до 3 мг/кг або в дозі, що перебуває в діапазоні від 0,1 мг/кг до 30 мг/кг. Антитіло може вводитися, наприклад, у дозі, що перебуває в діапазоні від приблизно 3 мкг/кг до приблизно 3000 мкг/кг, при цьому кращі дозування включають від 100 мкг/кг до 300 мкг/кг. В інших варіантах втілення антитіло вводять у дозі, що перебуває в діапазоні від 0,1 мг/кг до 30 мг/кг, або в діапазоні від 0,1 мг/кг до 20 мг/кг, або в діапазоні від 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, або в діапазоні від 1 мг/кг до 30 мг/кг, або в діапазоні від 1 мг/кг до 20 мг/кг, або в діапазоні від 1 мг/кг до 10 мг/кг, при цьому інші придатні діапазони дозувань і доз описані в цьому документі. Додатково, можуть застосовуватися рецептури антитіла з фіксованою дозою. Антитіло може вводитися окремо або в комбінації з одним або декількома додатковими фармацевтичними агентами. Наприклад, другий фармацевтичний агент, такий як НПВС, анальгетик (наприклад, опіоїдний анальгетик), місцевий анестетик, провідникова анестезія, фенольна блокада, терапевтичне антитіло, противосудомний засіб, антидепресант, місцевий капсаїцин, стероїд або антивірусний агент можуть уводитися в комбінації з антитілом проти ФРН по винаходу. Зокрема, кращі другі фармацевтичні агенти для комбінованого лікування разом з антитілом по винаходу включають опіоїдні анальгетики, такі як морфін і т.п. Інші кращі другі фармацевтичні агенти для комбінованого лікування включають інгібітори TrkA і інгібітори протеїнкінази C (PKC). У кращому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення способу ослаблення або інгібування болю у суб'єкта, а саме, способу, що включає введення суб'єктові антитіла проти фактору росту нервів (ФРН), що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому 7 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 консервативна область IgG4 людини містить амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10, при цьому антитіло полегшує біль у суб'єкта протягом щонайменше від чотирьох до дванадцяти тижнів (або щонайменше від одного до дванадцяти тижнів, або щонайменше від восьми до дванадцяти тижнів, або від чотирьох до дванадцяти тижнів, або від однієї до дванадцяти тижнів, або від восьми до дванадцяти тижнів, або протягом щонайменше одного тижня, або щонайменше чотирьох тижнів, або щонайменше восьми тижнів, або щонайменше дванадцяти тижнів) після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. Переважно, антитіло проти ФРН містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно. Переважно, антитіло проти ФРН містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. Переважно, тип болю обраний із групи, що складає з болю при остеоартриті, хронічного болю в нижній частині спини, болю при діабетичній невропатії, болю при онкологічних захворюваннях, болю через метастази в кості, інтерстиціальний цистит, синдрому хворобливого сечового міхура, болю, асоційованого із хронічним небактеріальним простатитом, болю, асоційованого з ендометріозом, болю, асоційованого з фібромами матки й післяопераційного болю. Переважно, антитіло проти ФРН уводять у дозі, що перебуває в діапазоні від 0,1 до 3 мг/кг або в дозі, що перебуває в діапазоні від 0,1 мг/кг до 30 мг/кг. Переважно, антитіло вводять внутрівенно або підшкірно. Переважно, антитіло має термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів (або щонайменше 10 днів, або щонайменше 15 днів, або щонайменше 20 днів, або щонайменше 25 днів, або щонайменше 30 днів, або в діапазоні від приблизно 10 днів до приблизно 40 днів, або в діапазоні від приблизно 15 до приблизно 30 днів, або в діапазоні від 10 до 40 днів або в діапазоні від 15 до 30 днів). В іншому кращому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення способу ослаблення або інгібування пов'язаного з фактором росту нервів (ФРН) захворювання або стану в суб'єкта таким чином, щоб уникнути виникнення в суб'єкта синдрому рикошету, а саме, способу, що включає введення суб'єктові антитіла проти ФРН, що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини включає мутацію в шарнірній області, і при цьому антитіло має термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів (або щонайменше 10 днів, або щонайменше 15 днів, або щонайменше 20 днів, або щонайменше 25 днів, або щонайменше 30 днів, або в діапазоні від приблизно 10 днів до приблизно 40 днів, або в діапазоні від приблизно 15 до приблизно 30 днів, або в діапазоні від 10 до 40 днів або в діапазоні від 15 до 30 днів), і при цьому антитіло вводять у такому дозуванні й з такою частотою, щоб уникнути в суб'єкта виникнення синдрому рикошету. Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення в людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Переважно, консервативна область IgG4 людини містить мутацію в позиції амінокислоти, що відповідає позиції амінокислоти 108 у ПОСЛ. ID №: 9. Переважно, серин у позиції амінокислоти, що відповідає позиції амінокислоти 108 у ПОСЛ. ID №: 9, замінений на пролін. Переважно, консервативна область IgG4 людини включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10. Переважно, антитіло проти ФРН містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно. Переважно, антитіло проти ФРН містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. Переважно, антитіло конкурує за зв'язування ФРН із антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. Переважно, пов'язане із ФРН захворювання або стан є болем, обраним із групи, що складається з болю при остеоартриті, хронічного болю в нижній частині спини, болю при діабетичній невропатії, болю при онкологічних захворюваннях, болю через метастази в кості, інтерстиціального циститу, синдрому хворобливого сечового міхура, болю, асоційованого із хронічним небактеріальним простатитом, болю, асоційованого з ендометріозом, болю, асоційованого з фібромами матки й 8 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 післяопераційного болю. Переважно, антитіло проти ФРН уводять у дозі, що перебуває в діапазоні від 0,1 до 3 мг/кг або в діапазоні від 0,1 мг/кг до 30 мг/кг. Переважно, антитіло вводять внутрівенно або підшкірно. Іншою особливістю є те, що винахід спрямований на створення застосування антитіла проти ФРН по винаходу для одержання лікарського препарату для застосування з метою ослаблення або інгібування пов'язаного із ФРН захворювання або стану в суб'єкта. Необмежуючі приклади пов'язаних із ФРН захворювань і станів включають ті, що перераховані вище. Переважним пов'язаним із ФРН захворюванням або станом є біль. Переважно, тип болю обраний із групи, що складається з болю при остеоартриті, хронічного болю в нижній частині спини, болю при діабетичній невропатії, болю при онкологічних захворюваннях, болю через метастази в кості, інтерстиціального циститу, синдрому хворобливого сечового міхура, болю, асоційованого із хронічним небактеріальним простатитом, болю, асоційованого з ендометріозом, болю, асоційованого з фібромами матки й післяопераційного болю. Ще одною особливістю є те, що даний винахід спрямований на використання антитіла проти ФРН по винаходу для одержання лікарського препарату, що застосований з метою ослаблення або інгібування болю в суб'єкта таким чином, щоб полегшення або інгібування болю в суб'єкта тривало протягом щонайменше приблизно від одного тижня до приблизно дванадцяти тижнів, або щонайменше від приблизно чотирьох тижнів до приблизно дванадцяти тижнів, або щонайменше від приблизно восьми тижнів до приблизно дванадцяти тижнів (або протягом від одного до дванадцяти тижнів, або від чотирьох до дванадцяти тижнів, або від восьми до дванадцяти тижнів, або щонайменше одного тижня, або щонайменше двох тижнів, або щонайменше чотирьох тижнів, або щонайменше восьми тижнів, або щонайменше дванадцяти тижнів) після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. Іншою особливістю є те, що винахід спрямований на створення застосування антитіла проти ФРН по винаходу для одержання лікарського препарату, застосовуваного з метою ослаблення або інгібування пов'язаного із ФРН захворювання або стану в суб'єкта таким чином, щоб уникнути виникнення в суб'єкта синдрому рикошету. Зокрема, антитіло вводять у такому дозуванні й з такою частотою, щоб уникнути виникнення в суб'єкта синдрому рикошету. Іншою особливістю є те, що даний винахід спрямований на створення молекул нуклеїнової кислоти, що кодують важкі ланцюги й/або легкі ланцюги антитіл проти ФРН по винаходу, а також векторів (наприклад, експресійних векторів), що містять такі вектора, клітин-хазяїв, що містять такі вектори й способи для експресії антитіл проти ФРН із застосуванням клітин-хазяїв по винаходу. Ще одною особливістю є те, що даний винахід спрямований на створення способу ослаблення або інгібування пов'язаного з фактором росту нервів (ФРН) захворювання або стану в суб'єкта таким чином, щоб уникнути виникнення в суб'єкта синдрому рикошету. Спосіб включає введення суб'єктові антитіла проти ФРН, що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини включає мутацію (переважно, мутацію в шарнірній області), і при цьому антитіло має термінальний період напіввиведення в яванського макака щонайменше 15 днів, більш переважно щонайменше 21 день, і при цьому антитіло вводять у такому дозуванні й з такою частотою, щоб уникнути виникнення в суб'єкта синдрому рикошету. В іншому варіанті втілення даного винаходу антитіло має термінальний період напіввиведення в яванського макака в діапазоні від приблизно 15 днів до приблизно 22 днів (або 15-22 днів), або в діапазоні від приблизно 15 днів до приблизно 28 днів (або 15-28 днів), або в діапазоні від приблизно 21 днів до приблизно 28 днів (або 21-28 днів). В іншому варіанті втілення антитіло має термінальний період напіввиведення в пацюка щонайменше 8 днів. У ще одному варіанті втілення даного винаходу, антитіло має середній термінальний період напіввиведення в людини щонайменше 10-30 днів (або щонайменше 10 днів, або щонайменше 15 днів, або щонайменше 20 днів, або щонайменше 25 днів, або щонайменше 30 днів, або в діапазоні від приблизно 10 днів до приблизно 40 днів, або в діапазоні від приблизно 15 до приблизно 30 днів, або в діапазоні від 10 до 40 днів або в діапазоні від 15 до 30 днів). Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення у людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Кращі мутації включають ті, що описані вище. Кращі антитіла включають ті, що мають послідовності й/або додаткові функціональні властивості як описана вище. Необмежуючі приклади пов'язаних із ФРН захворювань і станів включають такі, перераховані вище. 9 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід також спрямований на створення застосування антитіла проти ФРН по винаходу для одержання лікарського препарату для застосування з метою ослаблення або інгібування пов'язаного із ФРН захворювання або стану в суб'єкта таким чином, щоб уникнути виникнення в суб'єкта синдрому рикошету. Набори, що містять антитіло проти ФРН по винаходу, також описані в цьому документі. Наприклад, набір може містити антитіло проти ФРН і посібник із застосування антитіла для лікування пов'язаного із ФРН захворювання або стану. Короткий опис графічних матеріалів На фігурі 1 представлений графік, що демонструє зв'язування PG110 з фактором росту нервів (ФРН) людини й відсутність зв'язування з нейротрофічним фактором головного мозку (BDNF) людини, нейротрофіном 3 (NT-3) людини або нейротрофіном 4 (NT-4) людини, згідно даним ELISA. На фігурі 2A представлений графік, що демонструє інгібування зв'язування ФРН із рецептором TrkA антитілом PG110, згідно даним експерименту по зв'язуванню радіоактивно міченого ліганду. На фігурі 2B представлений графік, що демонструє інгібування зв'язування ФРН із NTR рецептором p75 антитілом PG110, згідно даним експерименту по зв'язуванню радіоактивно міченого ліганду. На фігурі 3A представлений графік, що демонструє інгібуючий ефект антитіла PG110 на проліферацію клітин TF-1, стимульованих ФРН людини. На фігурі 3B представлений графік, що демонструє інгібуючий ефект антитіла PG110 на проліферацію клітин TF-1, стимульованих ФРН пацюка. На фігурі 3C представлений графік, що демонструє інгібуючий ефект антитіла PG110 на проліферацію клітин TF-1, стимульованих ФРН миші. На фігурі 4 представлений графік, що демонструє ефект лікування антитілом PG110 на ушкодження шкіри в пацюків. Детальний опис винаходу Винахід відноситься до антитіл проти фактору росту нервів, які мають підвищену стабільність in vivo, що очевидно, наприклад, зі несподіванно тривалого термінального періоду напіввиведення в яванських макаків. Антитіла по винаходу включають модифікацію консервативної області IgG4 людини у складі антитіла шляхом внесення мутації в консервативну область IgG4, переважно в шарнірну область консервативної області. З метою спрощення розуміння даного винаходу спочатку приводяться визначення деяких термінів. Додаткові визначення викладені в тексті детального опису. I. Визначення Терміни "фактор росту нервів" або "ФРН" використовуються в цьому документі як взаємозамінні й включають варіанти, ізоформи, гомологи, ортологи й паралоги. Наприклад, антитіло, специфічне до ФРН людини, може в деяких випадках демонструвати перехресну реактивність із ФРН видів, відмінних від людини. В інших варіантах втілення антитіло, специфічне до ФРН людини, може бути повністю специфічно до ФРН людини й може не демонструвати видоспецифичну або іншого типу перехресну реактивність. Термін "ФРН людини" означає послідовність ФРН людини, таку як утримуючу амінокислотну послідовність ланцюга ФРН-β людини, форма попередника для якої має номер доступу в базі Genbank NP_002497, і кодується нуклеотидною послідовністю з номером доступу в базі Genbank NM_002506. Послідовність ланцюга ФРН- β людини може відрізнятися від такої ФРН- β людини, наведеної в Genbank з номером доступу NP_002497, наприклад, наявністю консервативних замін або замін у неконсервативних областях, при цьому ФРН-β людини має в істотному ступені ту ж біологічну функцію, що й ФРН-β людини з Genbank з номером доступу NP_002497. Термін "ФРН пацюка" означає послідовність ФРН пацюка, таку як утримуючу амінокислотну послідовність ланцюга ФРН-β пацюка, форма попередника для якої має номер доступу в базі Genbank XP_227525, і кодується нуклеотидною послідовністю з номером доступу в базі Genbank XP_227525. Термін "ФРН миші" означає послідовність ФРН пацюка, таку як утримуючу амінокислотну послідовність ланцюга ФРН-β миші, форма попередника для якої має номер доступу в базі Genbank NP_038637, і кодується нуклеотидною послідовністю з номером доступу в базі Genbank NM_013609. Термін "рецептор TrkA", що використовується у цьому документі означає рецептор для ФРН, також відомий фахівцям у даній області як тропоміозин-рецепторна кіназа A і нейротрофна рецепторна тірозинкіназа 1 типу (NTRK1). Наведені як необмежуючі приклади послідовності рецептора TrkA людини включають амінокислотні послідовності, наведені в базі Genbank з 10 UA 104890 C2 5 10 15 20 номерами доступу NP_001012331 (ізоформа 1), NP_002520 (ізоформа 2) і NP_001007793 (ізоформа 3). NTR Термін "рецептор p75 ", що використовується у цьому документі означає рецептор нейротрофіну з молекулярною масою приблизно 75 кДа, що зв'язується із ФРН і іншими нейротрофінами, рецептор, що описаний, наприклад, у роботі Bothwell, M. (1996) Science NTR 272:506-507. Зазначена як необмежуючий приклад послідовністю рецептора p75 людини є амінокислотна послідовність, наведена в базі Genbank з номером доступу NP_002498, що кодується нуклеотидною послідовністю, що наведена в базі Genbank з номером доступу NM_002507. Термін "термінальний період напіввиведення", що використовується у цьому документі відносно антитіл проти ФРН означає кількість часу, необхідний для того, щоб концентрація антитіла, вимірювана в сироватці суб'єкта, якому було уведене антитіло, знизилася наполовину за умови завершення усмоктування й розподіли антитіла. При використанні групи суб'єктів, як міра термінального періоду напіввиведення антитіла може застосовуватися показник геометричного середнього термінального періоду напіввиведення в суб'єктів. Термін "фармакологічний період напіввиведення", що використовується у цьому документі відносно антитіл проти ФРН означає середню кількість часу підтримки ефекту лікарського засобу in vivo (середній час утримання для ефекту лікарського засобу). Його можна обчислити як співвідношення площі під кривої ефективності в початковий момент, скоректованої щодо базової лінії, (AUMEC) до площі залежності накопиченого й скоректованого щодо базової лінії ефекту лікарського засобу від часу (площа під кривої ефективності, AUEC), використовуючи наступну формулу: Фармакологи ческий период полувыведения  25 30 35 40 45 50 55 E( t )tdt AUMEC  AUEC  E( t )dt При використанні групи суб'єктів, як міру фармакологічного періоду напіввиведення антитіла може застосовуватися показник геометричного середнього фармакологічного періоду напіввиведення в суб'єктів. Термін "мутація в шарнірній області", що використовується у цьому документі означає мутацію, таку як крапкова мутація, заміна, вставка або делеція, у шарнірній області консервативного домена імуноглобуліну. Термін "інгібування", що використовується у цьому документі означає статистично значиме зниження біологічної активності, у тому числі повне блокування активності. Наприклад, "інгібування" може означати зниження біологічної активності приблизно на 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % або 100 %. Терміни "антитіло" або "імуноглобулін", що використовуються в цьому документі в якості взаємозамінних включають ціле антитіло й будь-який антигензв'язуючий фрагмент (тобто, "антигензв'язуюча частина") або його одиничні ланцюги, які зберігають підвищену стабільність in vivo, як описано в цьому документі. "Антитіло" містить щонайменше два важкі (H) ланцюги й дві легекі (L) ланцюги, з'єднані між собою дісульфідними зв'язками. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (що позначається в цьому документі за допомогою абревіатури VH) і консервативної області важкого ланцюга. Консервативна область важкого ланцюга складається із трьох доменів, CH1, CH2 і CH3. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (що позначається в цьому документі за допомогою абревіатури VL) і консервативної області легкого ланцюга. Консервативна область легкого ланцюга складається з одного домена, CL. Області VH і VL можуть додатково підрозділятися на гіперваріабельні області, що називають областями, що визначають комплементарність (CDR), що чергуються з більше консервативними областями, що називають каркасними областями (FR). Кожна область VH і VL складається із трьох CDR і чотирьох FR, розташованих у напрямку від N-кінця до C-кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні області важкого й легкого ланцюгів містять єднальних домен, що взаємодіє з антигеном. Консервативні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами організму=-хазяїна, у тому числі з різними клітинами імунної системи (наприклад, з ефекторними клітинами) і з першим компонентом (Clq) класичної системи комплементу. Термін "моноклональне антитіло", що використовується в цьому документіозначає антитіло, отримане з популяції в істотній мері однорідних антитіл, тобто, індивідуальні антитіла, що становлять популяцію, є ідентичними, за винятком можливих мутацій природного походження, які можуть бути присутні у невеликих кількостях. Моноклональні антитіла високоспецифічні, тому що виробляються проти одиничного антигенного сайту. Додатково, на відміну від 11 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 препаратів звичайних (поліклональних) антитіл, які в типовому випадку містять різні антитіла, вироблені проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло вироблене проти одиничної детермінанти на антигені. Моноклональні антитіла можуть бути приготовлені із застосуванням способів, відомих фахівцям у даній області, наприклад, гібридомного способу, як описано в роботі Kohler et al. (1975) Nature, 256:495, за допомогою трансгенних тварин, як описано, наприклад, у роботі Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859), методів рекомбінантних ДНК (див., наприклад, патент США № 4 816 567) або із застосуванням фагових бібліотек антитіл і способів, описаних, наприклад, у роботах Clarkson et al., Nature, 352:624-628 (1991) і Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991). Моноклональні антитіла включають химерні антитіла, антитіла людини й гуманізовані антитіла й можуть бути природними або отриманими рекомбінантними способами. Термін "рекомбінантне антитіло" означає антитіла, які приготовлені, експресовані, створені або виділені із застосуванням рекомбінантних способів, такі як (а) антитіла, виділені із тварини (наприклад, миші), що є трансгенними або трансхромосомними відносно генів імуноглобулінів (наприклад, генів імуноглобулінів людини), або з гібридоми, отриманої з такої тварини, (б) антитіла, виділені із клітини-хазяїна, трансформованої для експресії антитіла, наприклад, із трансфектоми, (в) антитіла, виділені з рекомбінантної комбінаторної бібліотеки антитіл (наприклад, що містить послідовності антитіл людини) із застосуванням фагового дісплею й (г) антитіла, приготовлені, експресовані створеними або виділені будь-якими іншими способами, що включають сплайсінг послідовностей генів імуноглобулінів (наприклад, генів імуноглобулінів людини) з іншими послідовностями ДНК. Такі рекомбінантні антитіла можуть містити варіабельні й консервативні області, що пішли від послідовностей імуноглобулінів людини гаметичного типу. Однак у деяких втіленнях такі рекомбінантні антитіла людини можуть піддавати мутагенезу in vitro, і внаслідок цього амінокислотні послідовності областей VH і VL рекомбінантних антитіл є послідовностями, які хоч і походять від гаметичних послідовностей VH і VL людини, можуть не існувати в природі в складі набору гаметичних антитіл людини in vivo. Термін "химерний імуноглобулін" або антитіло означає імуноглобулін або антитіло, у якого варіабельні області мають походження з першого біологічного виду, і в якого консервативні області мають походження із другого біологічного виду. Химерні імуноглобуліни або антитіла можуть бути сконструйовані, наприклад, шляхом генетичної інженерії, із сегментів генів імуноглобулінів, що належать різним біологічним видам. Термін "гуманізоване антитіло" або "гуманізований імуноглобулін" означає антитіло або імуноглобулін, що містить щонайменше одну гуманізований ланцюг імуноглобуліну або антитіла (тобто, щонайменше одну гуманізований легкий або важкий ланцюг). Термін "ланцюг гуманізованого антитіла" або "ланцюг гуманізованого імуноглобуліну" (тобто, "легкий ланцюг гуманізованого імуноглобуліну" або "важкий ланцюг гуманізованого імуноглобуліну") означає ланцюг імуноглобуліну або антитіла (тобто, легкий або важкий ланцюг, відповідно), що включає варіабельну область, що містить варіабельну каркасну область, в істотному ступені, що походить з імуноглобуліну або антитіла людини, і області, що визначають комплементарність (CDR) (наприклад, щонайменше одну CDR, переважніше дві CDR, більш переважно три CDR), в істотному ступені, що походить з імуноглобуліну або антитіла, що належить виду, відмінному від людини, і додатково включає консервативні області(наприклад, щонайменше одну консервативну область або її частину, у випадку легкого ланцюга, і переважно три консервативні області у випадку важкого ланцюга). Термін "гуманізована варіабельна область" (наприклад, "гуманізована варіабельна область легкого ланцюга" або "гуманізована варіабельна область важкого ланцюга") означає варіабельну область, що включає варіабельну каркасну область, в істотному ступені, що походить з імуноглобуліну або антитіла людини, і області, що визначають комплементарність (CDR), в істотному ступені, що походить з імуноглобуліну або антитіла, що належать виду, відмінному від людини. Передбачається, що термін "антитіло людини", що використовується у цьому документі включає антитіла, що мають варіабельні області, у яких і каркасні області, області CDR походять із послідовностей імуноглобулінів гаметичного типу людини, як описано, наприклад, у роботі Kabat et al. (Див. Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Крім того, якщо антитіло містить консервативну область, консервативна область також походить із послідовностей імуноглобулінів гаметичного типу людини. Антитіла людини можуть включати амінокислотні залишки, не кодуємі послідовностями імуноглобулінів гаметичного типу людини (наприклад, мутації, уведені із застосуванням випадкового або сайт-специфічного мутагенезу in vitro або шляхом соматичних мутацій in vivo). Однак мається на увазі, що термін "антитіло людини", що використовується у цьому документі не включає антитіла, у яких послідовності 12 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR, що відбуваються з антитіл гаметичного типу, що належать іншому виду ссавців, такому як миша, були впроваджені в каркасні послідовності антитіла людини. "Виділене антитіло" при використанні в цьому документі означає антитіло, в істотному ступені вільне від інших антитіл, що володіють іншими антигенними специфічностями (наприклад, виділене антитіло, що специфічно зв'язується із ФРН, в істотному ступені вільне від антитіл, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від ФРН). Крім того, виділене антитіло в типовому випадку в істотному ступені вільно від іншого клітинного матеріалу й/або хімічних сполук. При використанні в цьому документі термінів "специфічне зв'язування", "специфічно зв'язується", " селективне зв'язування" і "селективно зв'язується" означають, що антитіло або його антигензв'язуюча частина демонструють істотну афінність до певного антигену або епітопу й, звичайно, не демонструють істотну перехресну реактивність відносно інших антигенів і 6 епітопав. "Істотне" або краще зв'язування включає зв'язування з афінністю щонайменше 10 , 7 8 9 -1 10 -1 7 -1 10 , 10 , 10 M або 10 M . Більше кращими є афінності більш ніж 10 M , переважно більш 8 -1 ніж 10 M . Передбачається, що значення, що є проміжними стосовно зазначеного в цьому документі, перебувають у межах обсягу даного винаходу, і краща афінність зв'язування може 6 10 -1 7 10 бути зазначена як діапазон афінностей, наприклад, від 10 до 10 M , переважно від 10 до 10 -l 8 10 -1 M , більш переважно від 10 до 10 M . Антитіло, що "не демонструє істотну перехресну реактивність" - це антитіло, що не буде в істотному ступені зв'язуватися з небажаним об'єктом (наприклад, небажаним білковим об'єктом). Специфічне або селективне зв'язування може бути визначене із застосуванням будь-якого визнаного в даній області способу для визначення такого зв'язування, включаючи, наприклад, аналіз графіків Скетчарда й/або аналіз конкурентного зв'язування. Передбачається, що термін "KD, що використовується у цьому документі означає рівноважну константу дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген або афінності антитіла до антигену. В одному з варіантів втілення, антитіло по цьому винаході зв'язується з антигеном (наприклад, ФРН) з афінністю (KD), що рівна приблизно 100 пМ або менш (тобто, або краще) (наприклад, приблизно 90 пМ, або приблизно 80 пМ, або приблизно 70 пМ, або приблизно 60 пМ, або приблизно 50 пМ, або приблизно 40 пМ, або приблизно 30 пМ), відповідно до вимірів, проведених із застосуванням аналізу методом поверхневого плазмонного резонансу або аналізу клітинного зв'язування. У кращому варіанті втілення антитіло зв'язується із ФРН із афінністю (KD), що перебуває в діапазоні приблизно 25-35 пМ. Передбачається, що термін "Kass", що використовується у цьому документі означає константу швидкості асоціації для асоціації антитіла в комплекс антитіло/антиген. Передбачається, що термін "Kdiss", що використовується у цьому документі означає константу швидкості дисоціації для дисоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген. Термін "IC50", що використовується у цьому документі означає концентрацію антитіла, що інгібує відповідь, як при аналізі in vitro, так і при аналізі in vivo, до рівня, рівного 50 % від максимального інгібуючої відповіді, тобто, середнього між максимальним інгібуючої відповіддю й відповіддю при відсутності обробки. Передбачається, що термін "молекула нуклеїнової кислоти", що використовується у цьому документі включає молекули ДНК і молекули РНК. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але переважно є дволанцюговою ДНК. Передбачається, що термін "виділена молекула нуклеїнової кислоти", що використовується у цьому документі у відношенні нуклеїнових кислот, що кодують антитіла або частини антитіл (наприклад, VH, VL, CDR3), що зв'язуються із ФРН, означає молекулу нуклеїнової кислоти, у якій нуклеотидна послідовність, що кодує антитіло або частину антитіла, вільна від інших нуклеотидних послідовностей, що кодують антитіла, які зв'язуються з антигенами, відмінними від ФРН, при цьому ці інші послідовності можуть у природі фланкірувати дану нуклеотидну послідовність у геномній ДНК людини. Термін "функціонально приєднаний" означає, що послідовність нуклеїнової кислоти розташували таким чином, що виник функціональний зв'язок цієї послідовності з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК для сигнальної послідовності або секреторної лідерної послідовності функціонально приєднана до ДНК для поліпептиду, якщо вона експресує у вигляді пре-білку, що бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер функціонально приєднаний до послідовності, що кодує, якщо він впливає на транскрипцію послідовності; або сайт зв'язування рибосоми функціонально приєднаний до послідовності, що кодує, якщо він розташований таким чином, щоб сприяти трансляції. У загальному випадку, "функціонально приєднаний" означає, що з'єднані послідовності ДНК є суміжними й, у випадку секреторної лідерної послідовності, суміжними й перебувають в одній 13 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рамці зчитування. Однак енхансери не обов'язково повинні бути суміжними. Приєднання досягається за допомогою лігірування по стандартним рестрикційним сайтам. Якщо такі сайти відсутні, застосовують синтетичні олігонуклеотидні адаптори або лінкери у відповідності зі стандартними способами. Нуклеїнова кислота "функціонально приєднана", коли її розташували таким чином, що виник функціональний зв'язок цієї послідовності з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, промотор або енхансер, є функціонально приєднаним до послідовності, що кодує, якщо він впливає на транскрипцію послідовності. Стосовно послідовностей, що регулюють транскрипцію, функціонально приєднані означає, що з'єднані послідовності ДНК є суміжними й, якщо потрібно з'єднати дві білка, що кодують, області, вони суміжні й перебувають в одній рамці зчитування. Стосовно послідовностей областей перемикання, термін функціонально приєднаний указує, що послідовності здатні впливати на рекомбінацію на етапі перемикання. Передбачається, що термін "вектор", що використовується у цьому документі означає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну переносити іншу нуклеїнову кислоту, до якої вона була приєднана. Одним з типів вектора є "плазміда", що означає замкнуту дволанцюгову ДНК-петлю, до складу якої можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Ще одним типом векторів є вірусний вектор, при цьому додаткові сегменти ДНК можуть бути ліговані у вірусний геном. Деякі вектори здатні до автономної реплікації в клітині-хазяїні, у якій їх впровадили (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальний оріджин реплікації, і епісомальні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, ніепісомальні вектори ссавців) можуть бути інтегровані в геном клітини-хазяїна після впровадження в клітину-хазяїна, і в такий спосіб реплікуються разом з геномом хазяїна. Більше того, деякі вектори здатні управляти експресією генів, до яких вони були функціонально приєднані. Такі вектори в цьому документі називають "рекомбінантними експресійними векторами" (або просто " експресійними векторами"). У загальному випадку, експресуючі вектори, корисні для застосування в методиках рекомбінантних ДНК, часто мають форму плазмід. Терміни "плазміда" і "вектор" можуть використовуватися як взаємозамінні. Однак мається на увазі, що даний винахід включає такі інші форми експресуючих векторів, як вірусні вектори (наприклад, дефектні по реплікації ретровіруси, аденовіруси й аденосателлітні віруси), які виконують еквівалентні функції. Мається на увазі, що термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто " клітина-хазяїн"), що використовується у цьому документі означає клітину, у яку був впроваджений рекомбінантний експресійний вектор. Варто розуміти, що передбачається, що такі терміни відносяться не тільки до конкретної розглянутої клітини, але й до нащадків такої клітини. Через те, що деякі модифікації можуть виникати в наступних поколіннях у результаті мутацій або впливу факторів зовнішнього середовища, такі нащадки можуть, фактично, не бути ідентичні батьківській клітині, але проте залишаються включеними в обсяг терміна "клітина-хазяїн" при використанні в цьому документі. Терміни "лікування", "обробка" і "лікувати", що використовуються в цьому документі відносяться до терапевтичних або профілактичних способів, описаних у цьому документі. Способи "лікування" включають введення суб'єктові антитіла по цьому винаході, наприклад, суб'єктові з пов'язаним із ФРН захворюванням або станом, з метою профілактики, лікування, відстрочки, зниження ваги або зменшення інтенсивності одного або декількох симптомів захворювання або стану. Термін "пов'язане із ФРН захворювання або стан", що використовується у цьому документі означає захворювання або стан, у якому активність ФРН бере участь у виникненні одного або декількох симптомів захворювання або стани, асоційована з ними або опосередковує або сприяє їм. Термін, що використовується у цьому документі "суб'єкт" включає будь-яку людину або представника виду тварин, відмінного від людини. В одному з варіантів втілення суб'єкт є людиною. Термін "тварина, відмінне від людини" включає всіх хребетних, наприклад, ссавців або не ссавців, таких як всі примати, крім людини, вівця, собака, корова, кури, амфібії, рептилії й т.д. Термін, що використовується в цьому документі "синдром рикошету" означає знижену ефективність єднальних ФРН агентів, таких як антитіло проти ФРН, що спостерегається в суб'єкта після початкового періоду ефективності після разового або повторного введення. Наприклад, лікування із застосуванням антитіла проти ФРН може спочатку послабити біль, наприклад, що виник через запалення або ушкодження нерва або іншої етіології, після чого йде період зниженої анальгезуючої ефективності, під час якого біль згодом стає майже настільки ж інтенсивним або більше інтенсивним, чим до лікування. Ще в одному прикладі антитіло проти ФРН може демонструвати початкову ефективність у суб'єкта протягом деякого періоду часу 14 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 після разового або повторного введення, такого як період довжиною один тиждень після введення(наприклад, дні 1-7 після введення), після чого треба період зниженої ефективності, такий як період від 1 до 2 тижнів після введення (наприклад, дні 7-14 після введення). За періодом "синдрому рикошету" може випливати період відновлення ефективності антитіла проти ФРН. Наприклад, може спостерігатися двофазний профіль аналгезії після разового або повторного введення антитіла проти ФРН, із проміжним періодом зниженої ефективності або навіть надмірно підвищеного болючого відчуття. Цей синдром рикошету можна оцінити, наприклад, у ході клінічних досліджень болю, в експериментальних моделях болю й/або інших моделях ефективності придушення ФРН. Синдром рикошету може бути асоційований, наприклад, з посиленням болю в суб'єкта й/або більше вираженими небажаними явищами (такими як аномальна чутливість, у діапазоні від аллодинії до дізестезії, парестезії й гіпер- або гіпоестезії) під час періоду синдрому рикошету. Не обмежуючись якимсь одним механізмом, синдром рикошету може бути викликаний зміною експресії ФРН, зміною експресії або передачі сигналу рецепторів TrkA або p75 або будь-яким іншим механізмом, що приводить до короткочасного зниження ефективності після разового або повторного введення антитіла проти ФРН після початкового періоду ефективності. Різні особливості даного винаходу описані більш докладно в наступних підрозділах. II. Антитіла згідно з винаходом A. Підвищена стабільність in vivo Антитіла проти ФРН по винаходу характеризуються наявністю підвищеної стабільності in vivo, що очевидно із тривалого термінального періоду напіввиведення, що спостерегається in vivo. Не обмежуючись якимсь одним механізмом, думають, що подовжений термінальний період напіввиведення антитіла є результатом зниженої швидкості кліренсу антитіла, а не підвищення обсягу розподілу антитіла. Антитіла по винаходу містять консервативну область IgG4 людини, що містить мутацію. Кращою мутацією є мутація в шарнірній області. Переважно, мутація в шарнірній області містить мутацію серину в позиції амінокислоти 108 у послідовності ID №: 9 (при цьому ПОСЛ. ID №: 9 демонструє амінокислотну послідовність дикого типу консервативної області IgG4 людини). Більш переважно, мутація в шарнірній області містить мутацію із заміною серину в позиції амінокислоти 108 у послідовності ID №: 9 на пролін. У кращому варіанті втілення консервативна область IgG4 людини містить амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10. Антитіло проти ФРН по винаходу демонструє несподівано довгий термінальний період напіввиведення, такий як термінальний період напіввиведення в яванського макака щонайменше 15 днів і в типовому випадку - у діапазоні від приблизно 15 до приблизно 22 днів (або в діапазоні від 15 до 22 днів), або в діапазоні від приблизно 15 днів до 28 днів (або в діапазоні від 15 до 28 днів), або в діапазоні від приблизно 21 дня до приблизно 28 днів (або в діапазоні від 21 до 28 днів). Це стабілізоване антитіло проти ФРН також демонструє термінальний період напіввиведення в пацюків щонайменше 8 днів, у типовому випадку - у діапазоні від приблизно 8 до приблизно 9 днів (або в діапазоні від 8 до 9 днів). Як описано більш докладно в прикладі 4, PG110, антитіло проти ФРН по винаходу, демонструє середній термінальний період напіввиведення в яванських макаках щонайменше 15 днів і, у типовому випадку, ще більш тривалий. Наприклад, у дослідженні на яванських макаках спостерігали середній термінальний період напіввиведення в діапазоні від приблизно 15 до приблизно 22 днів. В іншому дослідженні на яванських макаках спостерігали середній термінальний період напіввиведення в діапазоні від приблизно 21 до приблизно 28 днів. Додатково, PG110 демонструє середній термінальний період напіввиведення в пацюків від приблизно 8 до приблизно 9 днів. Додатково, тому що фахівцям у даній області відомо, що термінальний період напіввиведення для IgG у людини приблизно у два рази більше, ніж у мавп, передвіщено, що антитіла проти ФРН по винаходу, такі як PG110, будуть мати термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів, або щонайменше 10 днів, або щонайменше 15 днів, або щонайменше 20 днів, або щонайменше 25 днів, або, більш переважно, щонайменше 30 днів або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від приблизно 10 днів до приблизно 40 днів (або в діапазоні 10-40 днів), або в діапазоні від приблизно 15 до приблизно 30 днів (або в діапазоні 15-30 днів). Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення в людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Як більш докладно описано в прикладі 8, було показано, що антитіло проти ФРН по винаходу має 15 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 середній фармакологічний період напіввиведення в людини, що попадає в зазначені вище діапазони. Термінальний період напіввиведення PG110 у яванських макаків істотно довший, ніж період напіввиведення, про який повідомляли фахівці в даній області для інших антитіл IgG4 у яванських макаків. Наприклад, повідомлялося про період напіввиведення приблизно 40-90 годин (приблизно 1,6-3,8 днів) у яванських макаків для CDP571, антитіла IgG4 проти TNF (див. Stephens, S. et al. (1995) Immunol. 85:668-674). Схожим образом, повідомлялося про період напіввиведення приблизно 3 дні в яванських макаків для наталйзумабу, антитіла IgG4 проти інтегрину (див. Refusal CHMP Assessment Report for Natalizumab, European Medicines Agency, London, 15 November 2007, Doc. Ref. EMEA/CHMP/8203/2008). Кращою мутацією в шарнірній області, що застосовується у винаході, є заміна серину на пролін у позиції 108 у ПОСЛ. ID №: 9. Ця мутація була описана раніше фахівцями в даній області (див. Angal, S. et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108), і, як повідомлялося, вона унеможливлює гетерогенність молекул IgG4, зокрема, утворення напівмолекул антитіл, що містять один важкий ланцюг і один легкий ланцюг. Відповідно, заміна на амінокислоту, відмінну від проліну, у позиції 108 ПОСЛ. ID №: 9 також включена в обсяг даного винаходу, при цьому заміна викликає той же ефект, що й заміна Ser на Pro, у запобіганні гетерогенності молекул IgG4 (наприклад, утворення напівмолекул антитіл). Здатність мутації в положенні 108 запобігати гетерогенність молекул IgG4 можна оцінити, як описано в роботі Angal et al. (1993), див. вище. На додаток до цього або як варіант, була описана модифікація в позиції 108 ПОСЛ. ID №: 9, відмінна від мутації в шарнірній області IgG, що підвищувала афінність взаємодії FcRn-IgG, що приводило до збільшення періоду напіввиведення модифікованого IgG. Приклади таких додаткових чи альтернативних модифікацій включають мутації по одному або декількох залишкам консервативних областей IgG, що відповідають: Thr250, Met252, Ser254, Thr256, Thr307, Glu308, Met428, His433 і/або Asn434 (як додатково описано в роботах Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Petkova, S.B. et al. (2006) Int. Immunol. 18:17591769; Hinton, P.R. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:6213-6216; Kamei, D.T. et al. (2005) Biotechnol. Bioeng. 92:748760; Vaccaro, C. et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:1283-1288; Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol. 176:346-356). Додатково, як альтернатива мутаціям у шарнірній області, були описані інші стабілізуючі модифікації консервативної області IgG4. Наприклад, в інших варіантах втілення мутація консервативної області IgG4 людини включає заміну області CH3 з IgG4 на область CH3 з IgG1, заміну областей CH2 і CH3 з IgG4 на області CH2 і CH3 з IgG1 або заміну аргініну в позиції 409 консервативної області IgG4 (відповідно до нумерації по Kabat) на лізин, як додатково описано в публікації патенту США 20080063635. В інших варіантах втілення мутації консервативної області IgG4 людини включає заміну Arg409, Phe405 або Lys370 (відповідно до нумерації по Kabat), таку як заміна Arg409 на Lys, Ala, Thr, Met або Leu, або заміна Phe405 на Ala, Val, Gly або Leu, як додатково описано в публікації PCT WO 2008/145142. Необхідна мутація може бути внесена в домен консервативної області IgG4 людини із застосуванням стандартних методик рекомбінантних ДНК, таких як сайт-спрямований мутагенез або опосередкований ПЦР мутагенез нуклеїнової кислоти, що кодує консервативну область IgG4 людини. Додатково, ДНК, що кодує варіабельну область важкого ланцюга антитіла, може бути вставлена в експресійний вектор, що кодує мутантну консервативну область IgG4 людини, таким чином, щоб варіабельну область і консервативна область були функціонально зв'язані, у результаті чого створюється вектор, що кодує повнорозмірний важкий ланцюг імуноглобуліну, у якій консервативна область є мутантною консервативною областю IgG4 людини. Після цього експресійний вектор можна застосовувати для експресії повнорозмірного важкого ланцюга імуноглобуліну за допомогою стандартних способів експресії рекомбінантних білків. Наприклад, антитіло проти ФРН по винаходу може бути сконструйовано, як додатково докладно описано в прикладі 1. Термінальний період напіввиведення антитіла можна визначити із застосуванням стандартних способів, відомих фахівцям у даній області. Наприклад, після введення антитіла суб'єктові (наприклад, яванському макаку, пацюкові лінії Спрейг-Даулі), можуть бути отримані проби крові в різних тимчасових крапках після введення й визначена концентрація антитіла в сироватці із проб крові із застосуванням відомих фахівцям у даній області методів визначення концентрації антитіл (таких як аналіз ELISA). Обчислення термінального періоду напіввиведення антитіла можна проводити із застосуванням відомих фармакокінетичних методів, наприклад, за допомогою комп'ютерної системи й програмного забезпечення, створених для обчислення фармакокінетичних параметрів (необмежуючим прикладом яких є 16 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 система для фармакокінетичного аналізу компанії SNBL USA із програмним забезпеченням WinNonlin). B. Варіабельні області антитіла Кращими варіабельними областями антитіла для застосування в антитілі проти ФРН по винаходу є варіабельні області важкого й легкого ланцюгів антитіла PG110. Варіабельна область важкого ланцюга PG110 показана в ПОСЛ. ID №: 1 і варіабельна область легкого ланцюга PG110 показана в ПОСЛ. ID №: 2. Відповідно, в одному з варіантів втілення антитіло проти ФРН по винаходу містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу містить варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. Повнорозмірна амінокислотна послідовність важкого ланцюга PG110 (варіабельна й консервативна області) показана в ПОСЛ. ID №: 13. Цей важкий ланцюг може бути приготовлений з попередника важкого ланцюга, що містить лідерну або сигнальну послідовність, такий як амінокислотна послідовність, показана в ПОСЛ. ID №: 12. Попередник важкого ланцюга з ПОСЛ. ID №: 12 кодується нуклеотидною послідовністю, що показана в ПОСЛ. ID №: 11. Повнорозмірна амінокислотна послідовність легкого ланцюга PG110 (варіабельна й консервативна області) показана в ПОСЛ. ID №: 16. Цей легкий ланцюг може бути приготовлений з попередника легкого ланцюга, що містить лідерну або сигнальну послідовність, такий як амінокислотна послідовність, показана в ПОСЛ. ID №: 15. Попередник легкого ланцюга з ПОСЛ. ID №: 15 кодується нуклеотидною послідовністю, що показана в ПОСЛ. ID №: 14. Відповідно, в іншому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення антитіла проти ФРН, що містить важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 13, при цьому антитіло має період напіввиведення із сироватки в яванського макака щонайменше 15 днів. В іншому варіанті втілення даного винаходу період напіввиведення із сироватки в яванського макака може перебувати в діапазоні від приблизно 15 днів до приблизно 22 днів (або в діапазоні 15-22 днів). В іншому варіанті втілення період напіввиведення із сироватки в пацюка може становити щонайменше 8 днів, або перебувати в діапазоні від приблизно 8 днів до приблизно 9 днів (або в діапазоні 8-9 днів). У ще одному варіанті втілення період напіввиведення із сироватки у людини може становити щонайменше 10-30 днів, або щонайменше 10 днів, або щонайменше 15 днів, або щонайменше 20 днів, або щонайменше 25 днів, або щонайменше 30 днів, або щонайменше 40 днів, або перебувати в діапазоні від приблизно 10 днів до приблизно 40 днів (або в діапазоні 10-40 днів), або в діапазоні від 15 до 30 днів (або в діапазоні 15-30 днів). Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення в людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Переважно, важкий ланцюг кодує нуклеотидною послідовністю ПОСЛ. ID №: 11. Переважно, легкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 16. Переважно, легкий ланцюг кодує нуклеотидною послідовністю ПОСЛ. ID №: 14. В іншому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення антитіла проти ФРН, що містить важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 13 і легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 16. В іншому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення антитіла проти ФРН, що містить важкий ланцюг, що кодується нуклеотидною послідовністю ПОСЛ. ID №: 11, і легкий ланцюг, що кодується нуклеотидною послідовністю ПОСЛ. ID №: 14. З обліком того, що специфічність зв'язування PG110 забезпечують області, що визначають комплементарність (CDR) варіабельного домену, в іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу містить області CDR важкого ланцюга PG110, легкого ланцюга PG110 або обох ланцюгів. CDR 1, 2 і 3 важкого ланцюга PG110 показані в ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно. CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга PG110 показані в ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно. Відповідно, в одному з варіантів втілення антитіло проти ФРН по винаходу містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу 17 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містить варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, і містить варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу може містити варіабельні області важкого й легкого ланцюгів, що включають амінокислотні послідовності, гомологічні варіабельним областям важкого й/або легкого ланцюгів PG110, і при цьому антитіла зберігають підвищену стабільність in vivo, що показує PG110. Наприклад, варіабельна область важкого ланцюга антитіла проти ФРН може містити амінокислотну послідовність, що щонайменше на 90 % гомологічна, більш переважно щонайменше на 95 % гомологічна, більш переважно щонайменше на 97 % гомологічна або ще більш переважно щонайменше на 99 % гомологічна амінокислотної послідовності ПОСЛ. ID №: 1. Варіабельна область легкого ланцюга антитіла проти ФРН може містити амінокислотну послідовність, що щонайменше на 90 % гомологічна, більш переважно щонайменше на 95 % гомологічна, більш переважно щонайменше на 97 % гомологічна або ще більш переважно щонайменше на 99 % гомологічна амінокислотної послідовності ПОСЛ. ID №: 2. При використанні в цьому документі відсоток гомології між двома амінокислотними послідовностями еквівалентний відсотку ідентичності між двома послідовностями. Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією від кількості ідентичних позицій, загальних для обох послідовностей (тобто, % гомології = кількості ідентичних позицій/сумарна кількість позицій x 100), з урахуванням кількості пропусків і довжини кожного пропуску, які необхідно внести для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Порівняння послідовностей і визначення відсотка ідентичності між двома послідовностями можна проводити із застосуванням математичного алгоритму. Наприклад, відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями можна визначити із застосуванням алгоритму, розробленого E. Meyers і W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), що був використаний у програмі ALIGN (версія 2.0), із застосуванням матриці порівняння амінокислотних залишків PAM120, штрафу за довжину пропуску, рівного 12, і штрафу за довжину пропуску, рівного 4. Крім того, відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями можна визначити із застосуванням алгоритму, запропонованого Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), що використаний у програмі GAP у складі пакета програмного забезпечення GCG (доступного за адресою http://www.gcg.com), із застосуванням матриці Blossum 62 або матриці PAM250, штрафу за пропуск, рівного 16, 14, 12, 10, 8, 6 або 4 і штрафи за довжину, рівного 1, 2, 3, 4, 5 або 6. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу може містити варіабельні області важкого й легкого ланцюгів, що включають амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого й/або легкого ланцюгів PG110, але при в послідовність(і) були внесені одна або кілька консервативних замін, хоча антитіло зберігає підвищену стабільність in vivo, демонстровану PG110. Наприклад, варіабельна область важкого ланцюга антитіла проти ФРН може містити амінокислотну послідовність, що ідентична амінокислотної послідовності ПОСЛ. ID №: 1, за винятком 1, 2, 3, 4 або 5 консервативних амінокислотних замін у порівнянні з ПОСЛ. ID №: 1. Варіабельна область легкого ланцюга антитіла проти ФРН може містити амінокислотну послідовність, що ідентична амінокислотної послідовності ПОСЛ. ID №: 2, за винятком 1, 2, 3, 4 або 5 консервативних амінокислотних замін у порівнянні з ПОСЛ. ID №: 2. Передбачається, що при використанні в цьому документі термін "консервативна амінокислотна заміна" означає амінокислотні модифікації, які не впливають або не змінюють істотно параметри зв'язування або стабільності антитіла, що містить амінокислотну послідовність. Такі консервативні модифікації включають амінокислотні заміни, вставки й делеції. Модифікації можуть бути уведені в антитіло по цьому розкриттю із застосуванням стандартних методик, відомих фахівцям у даній області, таких як сайт-спрямований мутагенез і опосередкований ПЦР мутагенез. Консервативними амінокислотними замінами є такі амінокислотні заміни, при яких даний амінокислотний залишок заміняється на амінокислотний залишок, що має схожий бічний ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, що мають схожий бічний ланцюг, визначені у відповідній області знань. Ці сімейства включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидін), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тірозин, цістеїн, триптофан), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, 18 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пролін, фенілаланін, метіонін), розгалуженими в бета-атомі вуглецю бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тірозин, фенілаланін, триптофан, гістидін). Таким чином, один або кілька амінокислотних залишків у складі варіабельних областей PG110 можуть бути замінені на інші амінокислотні залишки з того ж сімейства, виділеного на підставі властивостей бічного ланцюга, і змінене антитіло може бути випробуване на збереження функції із застосуванням методів функціонального аналізу, описаних у цьому документі. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу містить антигензв'язуючі області (тобто, варіабельні області), які зв'язуються з тим же епітопом, що й антитіло PG110, або які перехресно конкурують із PG110 за зв'язування із ФРН. Відповідно, в одному з варіантів втілення антитіло проти ФРН по винаходу конкурує за зв'язування із ФРН із антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. Такі перехресно конкуруючі антитіла можна ідентифікувати на підставі їхньої здатності перехресно конкурувати з PG110 при стандартному аналізі зв'язування із ФРН. Наприклад, можна застосовувати стандартний аналіз ELISA, у якому рекомбінантний білок ФРН (наприклад, ФРН-β людини) іммобілізований на планшеті, одне з антитіл флуоресцентно мічене, і оцінюється здатність немічених антитіл конкурентно придушувати зв'язування міченого антитіла. Додатково або відповідно до іншого варіанта для оцінки здатності антитіл до перехресної конкуренції можна застосовувати BIAcore-аналіз. Придатні способи аналізу зв'язування, які можуть застосовуватися для випробування здатності антитіла конкурувати за зв'язування із ФРН із антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2, додатково докладно описані в прикладі 2. В інших варіантах втілення антитіло проти ФРН по винаходу демонструє одне або кілька функціональних властивостей антитіла PG110. Наприклад, антитіло проти ФРН по винаходу може демонструвати одне або більше з наступних функціональних властивостей: а) зв'язується із ФРН людини, але не зв'язується з нейротрофічним фактором головного мозку (BDNF) людини, нейротрофіном 3 (NT-3) людини або нейротрофіном 4 (NT-4) людини; б) зв'язується із ФРН людини або пацюка з KD, рівної 100 пМ або менш; NTR в) інгібує зв'язування ФРН із TrkA або p75 ; г) інгібує ФРН-залежну проліферацію клітин TF-1; д) інгібує ФРН-залежне виживання гангліїв заднього корінця спинного мозку курчати; е) інгібує ФРН-залежне розростання аксонів клітин PC12. Ці функціональні властивості можна оцінити із застосуванням аналізу in vitro, докладно викладених у прикладах 2 і 3. Стосовно специфічного зв'язування антитіла до ФРН людини при використанні в цьому документі термін "не зв'язується з нейротрофічним фактором головного мозку (BDNF), нейротрофіном 3 (NT-3) людини або нейротрофіном 4 (NT-4) людини" означає, що спостережуваний кількісний показник зв'язування антитіла з BDNF, NT-3 або NT-4 при стандартному аналізі зв'язування (наприклад, ELISA або інший придатний метод аналізу in vitro, як описано в прикладах) зіставимо з фоновим рівнем зв'язування(наприклад, для контрольного антитіла), наприклад, з перевищенням рівня фону не більш ніж в 2 рази, або зв'язування з BDNF, NT-3 або NT-4 становить менш 5 % при порівнянні зі зв'язуванням із ФРН людини (при цьому рівень зв'язування із ФРН людини встановлюють у якості 100 % зв'язування). В іншому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення антитіла проти фактору росту нервів (ФРН), що містить консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини містить амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10 (або при цьому консервативна область IgG4 людини містить мутацію серину в позиції амінокислоти 108 у ПОСЛ. ID №: 9, переважно заміну серину на пролін у позиції 108), і при цьому антитіло зв'язується із ФРН людини або пацюка з KD, рівної 100 пМ або менш (або, відповідно до іншого варіанта, з KD, рівної 300 пМ або менш, 200 пМ або менш, 150 пМ або менш, 75 пМ або менш NTR або 50 пМ або менш), інгібує зв'язування ФРН із TrkA або p75 з IC50, рівної 250 пМ або менш (або, відповідно до іншого варіанта, з IC50, рівної 500 пМ або менш, 400 пМ або менш, 300 пМ або менш або 200 пМ або менш), і інгібує ФРН-залежну проліферацію клітин TF-1 з IC50, рівної 50 нг/мл або менш (або, відповідно до іншого варіанта, з IC50, рівної 150 нг/мл або менш, 100 нг/мл або менш, 75 нг/мл або менш або 40 нг/мл або менш). Переважно, антитіло має середній термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів, або щонайменше 10 днів, або щонайменше 15 днів, або щонайменше 20 днів, або щонайменше 25 днів, або щонайменше 30 днів, або в діапазоні від приблизно 10 днів до приблизно 40 днів (або в 19 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 діапазоні 10-40 днів), або в діапазоні від приблизно 15 днів до приблизно 30 днів (або в діапазоні 15-30 днів). Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може мати середній фармакологічний період напіввиведення у людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів (або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до семи тижнів (або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів), або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів (або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів). Додатково або відповідно до іншого варіанту антитіло може демонструвати середній термінальний період напіввиведення в яванського макака щонайменше 15 днів і в типовому випадку - у діапазоні від приблизно 15 до приблизно 22 днів (або в діапазоні від 15 до 22 днів), або в діапазоні від приблизно 15 днів до 28 днів (або в діапазоні від 15 до 28 днів), або в діапазоні від приблизно 21 дня до приблизно 28 днів (або в діапазоні від 21 до 28 днів). Додатково або відповідно до іншого варіанта антитіло може демонструвати термінальний період напіввиведення в пацюків щонайменше 8 днів, у типовому випадку - у діапазоні від приблизно 8 до приблизно 9 днів (або в діапазоні від 8 до 9 днів). Антитіло може додатково демонструвати одне або кілька додаткових функціональних властивостей, таких як зв'язування із ФРН людини, але відсутність зв'язування з нейротрофічним фактором головного мозку (BDNF) людини, нейротрофіном 3 (NT-3) людини або нейротрофіном 4 (NT-4) людини; інгібування ФРН-залежного виживання гангліїв заднього корінця спинного мозку курчати; і/або інгібування ФРН-залежного розростання аксонів клітин PC12. Переважно, антитіло полегшує біль на період тривалістю щонайменше від приблизно одного тижня до приблизно дванадцяти тижнів після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. Переважно, антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, і антитіло містить варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно, і антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно. Переважно, антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, або антитіло містить варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2 або антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2, або антитіло конкурує за зв'язування ФРН із антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу не викликає синдром рикошету при введенні суб'єктові (наприклад, антитіло вводять у такому дозуванні й з такою частотою, щоб уникнути виникнення в суб'єкта синдрому рикошету). Про синдром рикошету, при якому антитіло проти ФРН демонструє знижену ефективність у суб'єкта після початкового періоду ефективності після разового або повторного введення, повідомлялося в ході як досліджень на модельних тваринах, так і клінічних досліджень інших антитіл проти ФРН. Наприклад, про такий ефект, названий "феноменом рикошету", повідомлялося для антитіл проти ФРН пацюка в моделі хронічного здавлювання (CCI) на пацюках (Ro, L-S. et al. (1999) Pain 79:265-274). Додатково, повідомлялося про клінічні дослідження болю із застосуванням антитіла проти ФРН танезумаб (також відомого як RN624, E3, CAS регістр. № 88026657-9), у яких період підвищеного прояву небажаних явищ, таких як чутливість до дотику й почуття поколювання, спостерігався після початкового анальгезуючого періоду (див. презентацію доповіді Hefti, Franz F., Rinat Neuroscience, LSUHSC, Shreveport, Louisiana, зроблену 26 вересня 2006 р.) Не обмежуючись якимсь одним механізмом, думають, що тривалий термінальний період напіввиведення антитіл проти ФРН по винаходу дозволяє їм уникнути індукції синдрому рикошету. Таким чином, інші переваги антитіл проти ФРН по винаходу включають більше стабільну й тривалу активність in vivo, у порівнянні з іншими прототипними антитілами проти ФРН. З обліком тривалого термінального періоду напіввиведення антитіл проти ФРН по винаходу, можна застосовувати більше низькі дозування (у порівнянні з іншими антитілами проти ФРН), і антитіло можна застосовувати з більше частими інтервалами, якщо це необхідно, таким чином, дозування й режими лікування можуть бути обрані так, що в суб'єкта не виникає синдром рикошету. В іншому варіанті втілення антитіло проти ФРН по винаходу здатно полегшувати біль у суб'єктапротягом тривалого періоду, наприклад, антитіло здатне полегшувати біль протягом 20 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше від приблизно одного тижня до приблизно дванадцяти тижнів (або протягом від одного тижня до дванадцяти тижнів) після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. В одному з варіантів втілення антитіло полегшує біль на період тривалістю щонайменше приблизно один тиждень (або щонайменше один тиждень) після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. В іншому варіанті втілення антитіло полегшує біль на період тривалістю щонайменше приблизно два тижні (або щонайменше два тижні) після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. В іншому варіанті втілення антитіло полегшує біль на період тривалістю щонайменше приблизно чотири тижні (або щонайменше чотири тижні) після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. В іншому варіанті втілення антитіло полегшує біль на період тривалістю щонайменше приблизно вісім тижнів (або щонайменше вісім тижнів) після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. В іншому варіанті втілення антитіло полегшує біль на період тривалістю щонайменше приблизно дванадцять тижнів (або щонайменше дванадцять тижнів) після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. В іншому варіанті втілення антитіло полегшує біль на період тривалістю щонайменше від приблизно чотирьох тижнів до приблизно дванадцяти тижнів (або від чотирьох тижнів до дванадцяти тижнів) після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. В іншому варіанті втілення антитіло полегшує біль на період тривалістю щонайменше від приблизно восьми тижнів до приблизно дванадцяти тижнів (або від восьми тижнів до дванадцяти тижнів) після введення разової дози антитіла проти ФРН суб'єктові. Здатність антитіла полегшувати біль у суб'єкта можна оцінити із застосуванням методів аналізу, прийнятих у даній області. Придатні моделі на тварин для оцінки тривалості полегшення болю антитілами проти ФРН описані, наприклад, у публікації PCT № WO 2006/131951 і публікації патенту США 20080182978. Необмежуючі приклади таких моделей на тваринах включають модель невропатичного болю, викликану хронічним здавлюванням сідничного нерва, модель післяопераційного болю, що включає розсічення передньої лапи, модель болю при ревматоїдному артриті, що включає артрит, індукований повним ад'ювантом Фрейнда (CFA), і моделі болю при онкологічному захворюванні, такі як описані в роботах Halvorson, K.G. et al. (2005) Cancer Res. 65:9426-9435 і Sevcik, M.A. et al. (2005) Pain 115:128141. Додатково, полегшення болю можна оцінювати клінічно у людини, і тривалість полегшення болю можна визначити на підставі повідомлень пацієнта(ів), що одержують лікування антитілом проти ФРН, про ступінь болю. В інших варіантах втілення антитіло проти ФРН по винаходу може містити варіабельну область важкого ланцюга й/або варіабельну область легкого ланцюга антитіла проти ФРН, описаного фахівцями в даній області. Наприклад, варіабельну область важкого ланцюга й/або варіабельну область легкого ланцюга антитіла проти ФРН, описаного в публікації PCT № WO 2001/78698, публікації PCT № WO 2001/64247, публікації PCT № WO 2002/096458, публікації PCT № WO 2004/032870, PCT публікації PCT № WO 2004/058184, публікації PCT № WO 2005/061540, публікації PCT № WO 2005/019266, публікації PCT № WO 2006/077441, публікації PCT № WO 2006/131951, публікації PCT № WO 2006/110883, публікації PCT № WO 2009/023540, патенті США № 7 449 616; публікації патенту США № US 20050074821, публікації патенту США № US 20080033157, публікації патенту США № US 20080182978 або публікації патенту США № US 20090041717, можуть застосовуватися в антитілі проти ФРН по винаходу. В інших варіантах втілення антитіло проти ФРН по винаходу може містити варіабельну область важкого ланцюга й/або варіабельну область легкого ланцюга антитіла проти ФРН, що приготовлено із застосуванням стандартного, відомого фахівцям у даній області, способу одержання моноклональних антитіл, такого як стандартний спосіб гібридизації соматичних клітин, описаний у роботі Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495 для створення моноклональних антитіл, що не належать людині (антитіл, які після цього можуть бути гуманізовані), а також способів із застосуванням бібліотек у форматі фагового дисплею або способів із застосуванням трансгенних тварин, експресуючих гени імуноглобулінів людини. Способи із застосуванням бібліотек у форматі фагового дисплея для добору антитіл описані, наприклад, у роботах McCafferty et al, Nature, 348:552-554 (1990), Clarkson et al, Nature, 352:624628 (1991), Marks et al, J. Mol Biol, 222:581-597 (1991) і Hoet et al (2005) Nature Biotechnology 23, 344-348; патентах США №№ 5 223 409; 5 403 484 і 5 571 698, що належать Ladner et al; патентах США №№ 5 427 908 і 5 580 717, що належать Dower et al; патентах США №№ 5 969 108 і 6 172 197, що належать McCafferty et al; і патентах США №№ 5 885 793; 6 521 404; 6 544 731; 6 555 313; 6 582 915 і 6 593 081, що належать et al. Способи застосування трансгених тварин, експресуючих гени імуноглобулінів людини, для одержання антитіл описані, наприклад, у роботах Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. NY. Acad. Sci. 764:536 21 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 546; патентах США №№ 5 545 806; 5 569 825; 5 625 126; 5 633 425; 5 789 650; 5 877 397; 5 661 016; 5 814 318; 5 874 299 і 5 770 429; усі належать Lonberg і Kay; патенті США № 5 545 807, що належить Surani et al; публікаціях PCT №№ WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 і WO 99/45962, усі належать Lonberg і Kay; публікації PCT WO 02/43478, що належить Ishida et al, патентах США №№ 5 939 598; 6 075 181; 6 114 598; 6 150 584 і 6 162 963, що належать Kucherlapati et al. У різних варіантах втілення антитіло проти ФРН по винаходу може бути химерним антитілом, гуманізованим антитілом або антитілом людини. Додатково, антитіло може бути антитілом, у якому були вилучені потенційні епітопи T-клітин. Способи видалення потенційних епітопів T-клітин для зниження потенційної імуногенності антитіла були описані в даній області (див., наприклад, публікацію патенту США № 20030153043, що належить Can et al). Антитіло або частина антитіла по винаходу може бути похідною іншої функціональної молекули або бути з нею з'єднана (наприклад, з іншим пептидом або білком). Відповідно, передбачається, що антитіла або частини антитіл по винаходу включають похідні й в інший спосіб модифіковані форми антитіл PG110, описані у цьому документі. Наприклад, антитіло або частина антитіла по винаходу може бути функціонально приєднана (шляхом хімічної сполуки, генетичного злиття, нековалентної асоціації або інакше) до однієї або декількох іншим молекулам, таким як інше антитіло(наприклад, біспецифічне антитіло або діатіло), детектуючий агент, цитотоксичний агент, фармацевтичний агент і/або білок або пептид, здатний опосередковувати асоціацію антитіла або частини антитіла з іншою молекулою (такий як коркова область стрептавідину або полігістидінова мітка). Один тип дериватних антитіл одержують поперечною зшивкою двох або декількох антитіл (того самого типу або різних типів, наприклад, для створення біспецифічних антитіл). Придатні агенти для поперечної зшивки включають такі, що є гетеробіфункціональними, що мають дві різні реакційно-здатні групи, розділені відповідним спейсером (наприклад, малеімідобензоїл-Nгідроксисукцинімідний ефір), або гомобіфункціональними (наприклад, дісукцинімідила суберат). Такі лінкери доступні для придбання в компанії Pierce Chemical Company, Рокфорд, Іллінойс, США. Корисні детектуючі агенти, з якими можуть бути отримані похідні антитіла або частини антитіла по винаходу, включають флуоресцентні сполуки. Приклади флуоресцентних детектуючих агентів включають флуоресцеїн, флуоресцеїна ізотіоцианат, родамін, 5діметиламін-1-нафталенсульфоніла хлорид, фікоерітрин і т.п. Також може бути отримана похідна антитіла з детектуючими ферментами, такими як лужна фосфатаза, пероксидаза хріну, глюкозооксидаза й т.п. Коли антитіло отримане як похідна з детектуючим ферментом, його детектують за допомогою внесення додаткових реагентів, які використовуються ферментом з утворенням детектуючого продукту реакції. Наприклад, коли є присутнім детектуючий агент пероксидаза хріну, додавання водню пероксиду й діамінобензидіну веде до прояву пофарбованої реакції, яку можна детектувати. Також антитіло може бути похідним з біотином, і детектуватися шляхом опосередкованого виміру рівня зв'язування авідину або стрептавідину. III. Одержання антитіл Ще одна особливість даного розкриття відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, які кодують антитіла по розкриттю. Нуклеїнові кислоти можуть бути присутні у цілій клітині, у клітинному лізаті або в частково очищеній або в істотному ступені очищеній формі. Нуклеїнова кислота є "виділеною" або "в істотному ступені очищеною", коли вона очищена від інших клітинних компонентів або інших домішок, наприклад, інших клітинних нуклеїнових кислот або білків, із застосуванням стандартних способів, включаючи обробку лугом/ДСН, зональне центрифугування в розчині CsCl, колоночну хроматографію, агарозний гель-електрофорез і інші добре відомі фахівцям у даній області способи. Див. F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Нуклеїнова кислота по цьому розкриттю може бути, наприклад, ДНК або РНК і може містити або не містити інтронні послідовності. У кращому варіанті втілення нуклеїнова кислота є молекулою кДНК. Нуклеїнові кислоти по цьому розкриттю можуть бути отримані із застосуванням стандартних методик молекулярної біології. Краща молекула нуклеїнової кислоти по винаходу містить нуклеотидну послідовність ПОСЛ. ID №: 11. Інша краща молекула нуклеїнової кислоти по винаходу містить нуклеотидну послідовність ПОСЛ. ID №: 14. Після одержання фрагментів ДНК, що кодують сегменти VH і VL, із цими фрагментами ДНК можна робити додаткові маніпуляції із застосуванням стандартних методик рекомбінантних ДНК, наприклад, перетворювати гени варіабельних областей у гени повнорозмірних ланцюгів антитіл таким чином, що варіабельна область функціонально пов'язана з консервативною 22 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 областю (див. наприклад, приклад 1). Передбачається, що термін "функціонально зв'язаний" при використанні в даному контексті означає, що два фрагменти ДНК з'єднані таким чином, що амінокислотні послідовності, що кодуються цими двома фрагментами ДНК, перебувають в одній рамці зчитування. Антитіла можуть бути отримані в клітині-хазяїні із застосуванням способів, відомих фахівцям у даній області (наприклад, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Наприклад, для експресії антитіл, ДНК, що кодують важкі й легкі ланцюги, можуть бути вставлені в експресуючі вектори таким чином, щоб гени були функціонально пов'язані з послідовностями, що контролюють транскрипцію й трансляцію. Передбачається, що в цьому контексті термін "функціонально зв'язаний" означає, що ген антитіла лігований у вектор таким чином, що послідовності, що контролюють транскрипцію й трансляцію й розташовані в межах вектору, виконують функції, для яких вони призначені, по регуляції транскрипції й трансляції гена антитіла. Експресійний вектор і послідовності, що контролюють експресію, обрані таким чином, щоб вони були сумісні з експресією в застосовуваній клітині-хазяїні. Ген легкого ланцюга антитіла й ген важкого ланцюга антитіла можуть бути вставлені в різні вектора, або, що більш типово, обидва гени вставляють у той самий експресійний вектор. Гени антитіл вставляють в експресійний вектор із застосуванням стандартних способів (наприклад, лігірування комплементарних сайтів рестрикції на фрагменті гену антитіла й векторі, або лігованих тупих кінців, якщо рестрикційні сайти відсутні). Додатково, рекомбінантний експресійний вектор може кодувати сигнальний пептид, що полегшує секрецію ланцюга антитіла із клітини-хазяїна. Ген ланцюга антитіла може бути клонований у вектор таким чином, щоб сигнальний пептид був приєднаний в одній рамці зчитування з N-кінця гена ланцюга антитіла. Сигнальний пептид може бути сигнальним пептидом імуноглобуліну або гетерологічним сигнальним пептидом (тобто, сигнальним пептидом білка, відмінного від імуноглобуліну). Крім генів ланцюгів антитіл рекомбінантні експресуючі вектори в типовому випадку несуть регуляторні послідовності, які контролюють експресію генів ланцюгів антитіл у клітині-хазяїні. Передбачається, що термін "регуляторна послідовність" включає промотори, енхансери й інші елементи, що контролюють експресію (наприклад, сигнали поліаденілювання), які контролюють транскрипцію або трансляцію генів ланцюгів антитіл. Такі регуляторні послідовності описані, наприклад, у роботі Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Фахівцеві в даній області зрозуміло, що конструкція експресійного вектора, включаючи вибір регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна для трансформації, бажаний рівень експресії білка й т.д. Кращі регуляторні послідовності для експресії в клітинах-хазяях, що належать ссавцям, включають вірусні елементи, які забезпечують високі рівні експресії білків у клітинах ссавців, такі як промотори й/або енхансери, отримані від цитомегаловірусу (CMV), вакуолізуючого мавпячого вірусу 40 (SV40), аденовірусу (наприклад, аденовірусний основний пізній промотор (AdMLP) і вірусу поліоми. Відповідно до іншого варіанта, можуть застосовуватися невірусні регуляторні послідовності, такі як промотор гену убіквітину або промотор гена β-глобіну. Додатково, регуляторні елементи, що складаються з послідовностей з інших джерел, такі як промоторна система SRa, що містить послідовності з раннього промотору SV40 і довгого кінцевого повтору вірусу T-клітинної лейкемії 1 типу (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). Крім генів ланцюгів антитіл і регуляторних послідовностей, рекомбінантні експресуючі вектори можуть нести додаткові послідовності, такі як послідовності, що регулюють реплікацію вектору в клітинах-хазяях (наприклад, оріджини реплікації), і гени селектуючих маркерів. Ген селектуючого маркеру полегшує добір клітин-хазяїв, у які був впроваджений вектор (див., наприклад, патенти США №№ 4 399 216, 4 634 665 і 5 179 017, усі належать Axel et al.). Наприклад, у типовому випадку ген селектуючого маркера надає стійкість до лікарських речовин, таких як G418, гігроміцин або метотрексат, клітині-хазяїнові, у яку був впроваджений вектор. Кращі гени селектуючих маркерів включають ген дігідрофолатредуктази (DHFR) (для застосування в dhfr- клітинах із селекцією/ампліфікацією в присутності метотрексату) і ген neo (для селекції в присутності G418). Для експресії легкого й важкого ланцюгів експресійний вектор(и), що кодує важкі й легкі ланцюги, трансфекують у клітину-хазяїна із застосуванням стандартних способів. Мається на увазі, що різні форми терміну "трансфекція" включають широку розмаїтість способів, стандартно застосовуваних для впровадження екзогенної ДНК у прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна, наприклад, електропорацію, кальцій-фосфатну преципітацію, трансфекцію із застосуванням Деае-Декстрану й т.п. Хоча теоретично можливо експресуювати антитіла як у прокаріотичних, так і в еукаріотичних клітинах-хазяях, експресія антитіл в еукариотичних клітинах, і найбільше переважно - у клітинах-хазяях, що належать ссавцям, є найбільш кращою, 23 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тому що такі еукариотичні клітини, і, зокрема, клітини ссавців, з більшою ймовірністю, чим прокаріотичні клітини, забезпечать складання й секрецію належним чином зкрученого й імунологічно активного антитіла. Повідомлялося, що прокаріотична експресія генів антитіл неефективна для одержання високого виходу активного антитіла (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13). Кращі клітини-хазяї, що належать ссавцям, для експресії рекомбінантних антитіл по цьому розкриттю включають клітини яєчника китайського хом'ячка (клітини CHO) (у тому числі клітини dhfr CHO, описані в роботі Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, використані із селектуючим маркером DHFR, наприклад, як описано в роботі R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), клітини мієломи NSO, клітини COS і клітини SP2. Ще однією кращою системою експресії є система експресії генів з GS, описана в WO 87/04462 (приналежної Wilson), WO 89/01036 (приналежної Bebbington) і EP 338 841 (приналежному Bebbington). Коли рекомбінантні експресуючі вектори, що кодують гени антитіл, впроваджені в клітини-хазяї, що належать ссавцям, антитіла одержують, культивуючи клітини-хазяї протягом періоду часу, достатнього для проходження експресії антитіла в клітинах-хазяях, або, більш переважно, секреції антитіла в культуральне середовище, у якій вирощують клітини-хазяї. Антитіла можна витягти з культурального середовища із застосуванням стандартних способів очищення білків. У кращому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення експресійного вектора, що кодує антитіло проти ФРН, при цьому вектор містить нуклеотидну послідовність ПОСЛ. ID №: 11, що кодує важкий ланцюг антитіла, і нуклеотидну послідовність ПОСЛ. ID №: 14, що кодує легкий ланцюг антитіла. Кращий експресійний вектор по винаходу містить ген GS (глутамінсинтетази). У ще одному кращому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення клітини-хазяїна, що містить експресійний вектор по винаходу. Кращою клітиноюхазяїном по винаходу є клітина CHO (яєчника китайського хом'ячка). У ще одному кращому варіанті втілення даний винахід спрямований на створення способу експресії антитіла проти ФРН, що включає культивування клітини-хазяїна, що містить експресійний вектор, що містить нуклеотидну послідовність ПОСЛ. ID №: 11 (що кодує важкий ланцюг антитіла) і нуклеотидну послідовність ПОСЛ. ID №: 14 (що кодує легкий ланцюг антитіла), таким чином, що експресує антитіло проти ФРН, що містить важкий ланцюг, що кодується ПОСЛ. ID №: 11, і легкий ланцюг, що кодується ПОСЛ. ID №: 14. Ще одною особливістю є те, що винахід відноситься до способу одержання антитіла проти ФРН, що несе мутацію в консервативній області антитіла (наприклад, мутацію в шарнірній області), способу, що включає внесення відповідної мутації в консервативну область, наприклад, із застосуванням стандартних методик рекомбінантних ДНК. Наприклад, даний винахід спрямований на створення способу одержання антитіла проти ФРН, при цьому антитіло містить (i) варіабельну область важкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 3, 4 і 5, відповідно, (ii) варіабельну область легкого ланцюга, що включає CDR 1, 2 і 3, що мають амінокислотні послідовності ПОСЛ. ID №№: 6, 7 і 8, відповідно, і (iii) консервативну область IgG4 людини, при цьому консервативна область IgG4 людини містить амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10 (і, наприклад, при цьому антитіло має середній термінальний період напіввиведення у людини щонайменше 10-30 днів), або, додатково або відповідно до іншого варіанта, має середній фармакологічний період напіввиведення у людини щонайменше 30 днів, або щонайменше 35 днів, або щонайменше 40 днів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до шести тижнів, або в діапазоні від чотирьох до шести тижнів, або в діапазоні від щонайменше від чотирьох до семи тижнів, або в діапазоні від чотирьох до семи тижнів, або в діапазоні від щонайменше чотирьох до восьми тижнів, або в діапазоні від чотирьох до восьми тижнів), при цьому спосіб одержання антитіла включає внесення мутації із заміною серину в позиції амінокислоти 108 у ПОСЛ. ID №:. 9 на пролін зі створенням консервативної області IgG4 людини, що містить амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 10. Переважно, варіабельну область важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 1. Переважно, варіабельну область легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 2. Переважно, важкий ланцюг включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 13. Переважно, легкий ланцюг включає амінокислотну послідовність ПОСЛ. ID №: 16. IV. Фармацевтичні композиції Ще однією особливістю є те, що дійсний винахід спрямований на створення композицій, наприклад, фармацевтичної композиції, що містить антитіло згідно винаходу в суміші з фармацевтично прийнятним носієм. У кращих втіленнях фармацевтичні композиції придатні для введення внутрішньовенно, підшкірно (наприклад, за допомогою шприца-ручки) або 24 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 внутрішньосуглобово, при цьому інші придатні способи введення описані в цьому документі. В одному із варіантів втілення композиція може включати комбінацію безлічі (наприклад, двох або декількох) антитіл згідно винаходу, наприклад, антитіл, які зв'язуються із різними епітопами на ФРН. При використанні в цьому документі, "фармацевтично прийнятний носій" включає будь-який і всі розчинники, солі, диспергувальні середовища, агенти для нанесення оболонки, антибактеріальні й протигрибкові агенти, ізотонічні агенти та агенти, які відкладають всмоктування, і т.п., які є фізіологічно сумісними. Залежно від способу введення, активна речовина може бути покритою оболонкою з матеріалу, що захищає активну речовину від дії кислот і інших природних умов, які можуть інактивувати цю речовину. "Фармацевтично прийнятна сіль" означає сіль, що зберігає необхідну біологічну активність вихідного з'єднання і не викликає будь-які небажані токсикологічні ефекти (див., наприклад, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Приклади таких солей включають солі, що утворюються при додаванні кислоти, і солі, що утворюються при додаванні основи. Солі, що утворюються при додаванні кислоти, включають солі, що є похідними нетоксичних неорганічних кислот, таких як соляна, азотна, фосфорна, сірчана, бромистоводнева, йодистоводнева, фосфориста й т.п., а також нетоксичних органічних кислот, таких як аліфатичні моно- і дікарбонові кислоти, феніл-заміщені карбонові кислоти, гідроксикарбонові кислоти, ароматичні кислоти, аліфатичні й ароматичні сульфонові кислоти й т.п. Солі, що утворюються при додаванні основи, включають солі, що є похідними лужноземельних металів, таких як натрій, калій, магній, кальцій і т.п., а також нетоксичних органічних амінів, таких як N, N'дібензилетилендіамін, N-метилглюкамін, хлоропрокаїн, холін, діетаноламін, етилендіамін, прокаїн і т.п. Фармацевтичні композиції можуть вводитися окремо або в складі комбінованої терапії, тобто, у комбінації з іншими агентами. Наприклад, комбінована терапія може включати композицію згідно дійсного винаходу із щонайменше одним або декількома додатковими фармацевтичними агентами. Наприклад, щонайменше один або кілька додаткових фармацевтичних агентів можуть вводитися окремо або можуть бути також включені в композицію. У кращому варіанті втілення, антитіло проти ФРН згідно винаходу вводять у комбінації із другим фармацевтичним агентом, при цьому, другий фармацевтичний агент обраний із групи, що складається із НПЗЛЗ, анальгетиків (включаючи опіоїдні анальгетики та атипові анальгетики), місцевих анестетиків, препаратів для провідникової анестезії, препаратів для фенольної блокади, терапевтичних антитіл, стероїдів, протисудомних засобів, антидепресантів, капсаїцину для місцевого застосування і противірусних агентів. Зокрема, кращим класом других фармацевтичних агентів для застосування з метою полегшення болю є опіоїдні анальгетики. Додатково або відповідно до іншого варіанта, другий режим лікування може бути скомбінований із застосуванням антитіла згідно винаходу, наприклад, для полегшення болю. Приклади таких других режимів лікування включають променеву терапію (наприклад, у випадку болю при онкологічних захворюваннях), хірургічні процедури (наприклад, абляційні (із застосуванням голок) процедури на гасеровому ганглії та області, розташованої позаду трійчастого вузла, при невралгії трійчастого нерва), гіпноз і голковколювання. Приклади НПЗЛЗ включають ацетильовані саліцилати, у тому числі аспірин; неацетильовані саліцилати, у тому числі салсалат, дифлунісал; похідні оцтової кислоти, у тому числі етодолак, диклофенак, індометацин, кеторолак, набуметон; похідні пропіонової кислоти, у тому числі фенопрофен, флурбіпрофен, ібупрофен, кетопрофен, напроксен, напроксен натрію, оксапрозин; фенамати, у тому числі меклофенамова кислота, мефенамова кислота; фенілбутазон, піроксикам; інгібітори COX-2, у тому числі целекоксиб, еторікоксиб, валдекоксиб, рофекоксиб, луміракоксиб. Приклади анальгетиків включають парацетамол (ацетамінофен), трамадол, капсаїцин (для місцевого застосування), опіоїдні анальгетики й атипові анальгетики. Приклади опіоїдних анальгетиків включають морфін, кодеїн, тебаїн, гідроморфон, гідрокодон, оксикодон, оксиморфон, дезоморфін, діацетилморфін, нікоморфін, діпропіонілморфін, бензилморфін, етилморфін, фентаніл, петидин, метадон, трамадол і пропоксифен. Приклади атипових анальгетиків включають трициклічні антидепресанти, карбазепін, габапентин, прегабалін, дулоксетин і кофеїн. Приклади стероїдів включають кортикостероїди для внутрішньосуглобного введення (IAC) і преднізолон. Приклади терапевтичних антитіл ® ® включають антитіла проти TNF, такі як Ремикейд і Хуміра , і антитіла проти CD20, такі як ® Ритуксан і Арзерра™. Приклади противірусних агентів включають ацикловір і озельтамівіра ® фосфат (Таміфлю ). У кращому варіанті втілення комбінована терапія може включати антитіло проти ФРН згідно дійсного винаходу із щонайменше одним або декількома інгібіторами TrkA (наприклад, сполуки, 25 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 які є антагоністами активності TrkA). Інгібітори TrkA можуть діяти, наприклад, шляхом позаклітинної взаємодії з рецептором TrkA, або шляхом внутрішньоклітинної взаємодії з компонентами передачі сигналу від TrkA (наприклад, шляхом інгібувания кіназної активності TrkA). Необмежуючі приклади позаклітинних інгібіторів TrkA включають антитіла проти TrkA (такі як гуманізованні антитіла проти TrkA, описані в публікації патенту США № 20090208490 і публікації патенту США № 20090300780) і пептидні міметики ФРН, що є антагоністами TrkA (такі як описані в роботі Debeir, T. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4067-4072). Необмежуючі приклади внутрішньоклітинних інгібіторів TrkA включають пептиди, які здатні проникати в клітину, що є антагоністами функції TrkA (наприклад, як описано в роботах Hirose, M. et al. (2008) J. Pharmacol. Sci. 106:107-113; Ueda, K. et al. (2010) J. Pharmacol. Sci., March 30, 2010 issue) інгібітори у вигляді малих молекул, такі як інгібітори кінази TrkA (наприклад, як описано в роботах Wood, E.R. et al. (2004) Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:953-957; Tripathy, R. et al. (2008) Bioorg. Med. Chem. Lett. 18:3551-3555). Інші необмежуючі приклади інгібіторів TrkA включають ARRY-470 і ARRY-872 (Array Biopharma). У ще одному кращому варіанті втілення, комбінована терапія може включати антитіло проти ФРН згідно дійсного винаходу із щонайменше одним або декількома інгібіторами протеїнкінази C (PKC) (наприклад, сполуками, які є антагоністами активності PKC). Композиція згідно дійсного винаходу може вводитися із застосуванням різних способів, відомих фахівцям даної галузі. Фахівцю даної галузі буде зрозуміло, що шлях та/або спосіб введення буде змінюватися залежно від необхідних результатів. Переважно, носій є придатним для внутрішньовенного, інраартикулярного, підшкірного, внутрішньом'язового, парентерального, внутрішньопухлинного, інтраназального, інтравезікулярного, внутрішньосуглобного, перорального, мукозного, під'язичного, спінального або епідермального введення або інстиляції в порожнини тіла (наприклад, черевну порожнину, плевральну порожнину, придаткові порожнини носа) або на поверхню ока, або введення в легені інгаляційним шляхом. Для конкретних шляхів введення може бути обрано застосування придатних виробів для доставки. Наприклад, для підшкірного або внутрішньом'язового введення може застосовуватися шприцьручка (наприклад, такий, що дозволяє робити введення самостійно). Такі шприці-ручки, що також називаються інжекторами, відомі фахівцям у даній галузі, у тому числі такі, що містять рідку дозу антитіла (наприклад, шприць-ручка разового використання, що застосовується для ® введення Хуміри ) і, більш переважно, такі, які містять дозу антитіла у вигляді сухої речовини, яку відновлюють у рідку форму безпосередньо перед ін'єкцією. Також для підшкірного введення можуть застосовуватися підшкірні імплантати. Додатково, черезшкірна доставка може досягатися застосуванням трансдермального (черезшкірного) пластиру для місцевого застосування (наприклад, лейкопластиру). Черезшкірна доставка також може бути досягнута із застосуванням ін'єкції сухого порошку (такої як ін'єкція із застосуванням інжекторів, що є доступними для придбання в компанії Glide Pharma). Додатково, для доставки в легені (наприклад, при лікуванні астми або хронічного кашлю), може застосовуватися розпилюваний розчин у небулайзері. Активні сполуки можуть бути приготовлені з носіями, які забезпечують захист сполуки від швидкого вивільнення, такими як рецептури з контрольованим вивільненням, включаючи імплантати, трансдермальні пластири і мікроінкапсульовані системи доставки. Можуть застосовуватися полімери, які піддаються біодеградації, біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоефіри і полімолочна кислота. Багато способів приготування таких рецептур запатентовані або загальновідомі фахівцям у даній галузі. Див., наприклад, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Для введення сполуки згідно винаходу із застосуванням деяких шляхів введення, може знадобитися покриття сполуки оболонкою, або спільного введення сполуки із матеріалом, що запобігає її інактивації. Наприклад, сполуки можуть бути введені суб'єктові у відповідному носії, наприклад, у ліпосомах, або в розріджувачі. Фармацевтично прийнятні розріджувачі включають розчин натрію хлориду й водні буферні розчини. Ліпосоми включають емульсії камеді з кукурудзяних волокон типу вода у маслі й масло у воді, а також стандартні ліпосоми (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27). Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій для негайного введення. Застосування таких середовищ і агентів для фармацевтично активних субстанцій відомо фахівцям у даній галузі. За винятком випадків, коли будь-яке стандартне середовище або агент несумісні з активними сполуками, їхнє застосування у фармацевтичних композиціях 26 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 згідно винаходу розглядається як таке, що входить до обсягу винаходу. Допоміжні активні сполуки також можуть впроваджуватися в композиції. Терапевтичні композиції в типовому випадку повинні бути стерильними й стабільними в умовах виробництва й зберігання. Композиції можуть бути виготовлені у вигляді розчину, мікроемульсії, ліпосоми або іншої впорядкованої структури, придатної для високої концентрації лікарського засобу. Носій може бути розчинником або диспергувальним середовищем, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь і т.п.), і їх придатними сумішами. Необхідна плинність може підтримуватися, наприклад, за допомогою застосування оболонки, наприклад, з лецитина, підтримки необхідного розміру часток у випадку дисперсії і застосування поверхнево-активних речовин. У багатьох випадках буде краще включити в композицію ізотонічні агенти, наприклад, цукри, поліспирти, такі як маннітол, сорбітол, або натрію хлорид. Тривале всмоктування ін'єкційних композицій може бути досягнуто включенням у композицію агента, що сповільнює всмоктування, наприклад, солей моностеарата і желатину. Стерильні ін'єкційні розчини можна приготувати додаванням активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним або з комбінацією інгредієнтів, перерахованих вище, відповідно до вимог, з подальшою стерилізацією із застосуванням мікрофільтрації. У загальному випадку, дисперсії готують додаванням активної сполуки в стерильний носій, що містить основне диспергувальне середовище й інші необхідні інгредієнти з тих, що перераховані вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів, кращими способами приготування є вакуумне висушування й заморожування-висушування (ліофілізація), у результаті яких одержують порошок активної речовини в суміші з додатковим необхідним інгредієнтом з їх розчину, який був раніше простерилізований за допомогою фільтрації. Режими дозування коригують для забезпечення оптимально необхідної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді). Наприклад, може бути введена разова ударна доза, кілька розділених доз можуть бути введені протягом певного часу або доза може бути пропорційно знижена або підвищена, відповідно до потреб у конкретній терапевтичній ситуації. Типова разова доза (яку можуть вводити відповідно до режиму дозування як додатково описано нижче) може знаходитись в діапазоні від приблизно 0,1 мкг/кг до 1 мкг/кг або до 3 мкг/кг або до 30 мкг/кг або до 300 мкг/кг або до 3000 мкг/кг (3 мг/кг) або до мг/кг або до 100 мг/кг або більше, у залежності від факторів, описаних у цьому документі. Наприклад, антитіло проти ФРН може бути введене в дозі приблизно 1 мкг/кг, приблизно 10 мкг/кг, приблизно 20 мкг/кг, приблизно 50 мкг/кг, приблизно 100 мкг/кг, приблизно 200 мкг/кг, приблизно 300 мкг/кг, приблизно 400 мкг/кг, приблизно 500 мкг/кг, приблизно 1 мг/кг, приблизно 2 мг/кг або приблизно 3 мг/кг. У кращому варіанті втілення антитіло проти ФРН уводять у дозі, що знаходиться в діапазоні від приблизно 3 мкг/кг до приблизно 3000 мкг/кг. В іншому кращому варіанті втілення антитіло проти ФРН уводять у дозі 100 мкг/кг. В іншому кращому варіанті втілення антитіло проти ФРН уводять у дозі 200 мкг/кг. В іншому кращому варіанті втілення антитіло проти ФРН уводять у дозі 300 мкг/кг. В іншому кращому варіанті втілення антитіло проти ФРН уводять у дозі 400 мкг/кг. Для повторних введень протягом декількох днів, тижнів або місяців, або довше, залежно від стану, лікування триває до настання необхідного придушення симптомів або до досягнення достатнього терапевтичного рівня (наприклад, зменшення болю). Режим, що наведений в якості приклада дозування, включає введення початкової дози в діапазоні приблизно від 3 мкг/кг до 500 мкг/кг, з наступною щомісячною підтримуючою дозою приблизно від 3 мкг/кг до 500 мкг/кг антитіла проти ФРН. В іншому варіанті втілення дійсного винаходу, дозу, що дорівнює приблизно 200 мкг/кг, вводять однократно щомісяця. В іншому варіанті втілення дійсного винаходу, дозу, що дорівнює приблизно 400 мкг/кг, вводять однократно один раз у два місяці. Однак можуть бути кориснми і інші режими дозування, залежно від характеру фармакокінетичного розпаду, якого бажає досягти практикуючий лікар. Наприклад, у деяких варіантах втілення передбачається введення доз від одного до чотирьох разів на тиждень. Однак, з урахуванням великої тривалості полегшення болю антитілами проти ФРН, може застосовуватися менш часте введення доз. У деяких варіантах втілення, антитіло проти ФРН вводять однократно щотижня, однократно кожні 2 тижня, однократно кожні 3 тижня, однократно кожні 4 тижня, однократно кожних 5 тижнів, однократно кожних 6 тижнів, однократно кожних 7 тижнів, однократно кожних 8 тижнів, однократно кожних 9 тижнів, однократно кожних 10 тижнів, однократно кожних 15 тижнів, однократно кожних 20 тижнів, однократно кожних 25 тижнів, однократно кожних 26 тижнів або довше. У деяких варіантах втілення антитіло проти ФРН уводять однократно кожний 1 місяць, однократно кожні 2 місяці, однократно кожні 3 місяці, однократно кожні 4 місяці, однократно кожних 5 місяців, однократно кожних 6 місяців або довше. 27 UA 104890 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як додатково обговорюється в прикладі 6, у кращому втіленні антитіло проти ФРН згідно винаходу вводять (наприклад, людині) внутрішньовенно в дозі, що знаходиться в діапазоні від 0,1 мг/кг до 0,2 мг/кг, переважно 0,15 мг/кг, однократно кожних 12 тижнів. В іншому кращому втіленні антитіло проти ФРН згідно винаходу вводять (наприклад, людині) підшкірно в дозі, що знаходиться в діапазоні від 0,2 мг/кг до 0,4 мг/кг, переважно 0,3 мг/кг, однократно кожні дванадцять тижнів. В інших варіантах втілення, антитіло проти ФРН згідно винаходу вводять у дозі, що знаходиться в діапазоні від 0,1 мг/кг до 3 мг/кг, або в діапазоні від 0,1 мг/кг до 30 мг/кг, або в діапазоні від 0,1 мг/кг до 20 мг/кг, або в діапазоні від 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, або в діапазоні від 1 мг/кг до 30 мг/кг, або в діапазоні від 1 мг/кг до 20 мг/кг, або в діапазоні від 1 мг/кг до 10 мг/кг. Особливою перевагою є розробка рецептури парентеральних композицій у формі одиниць дозування для полегшення введення і однорідності дозування. Форма одиниці дозування при використанні в цьому документі означає фізично розділені одиниці, що приготовлені як одиничні дозування для суб'єктів, які отримують лікування; кожна одиниця містить заздалегідь установлену кількість активної сполуки, що розрахована для одержання необхідного терапевтичного ефекту, в асоціації з необхідним фармацевтичним носієм. Специфікація для форм одиниць дозування згідно винаходу обумовлена і прямо залежить від (а) унікальних характеристик активної сполуки і конкретного терапевтичного ефекту, що потрібно досягти, і (б) обмежень, що властиві галузі приготування таких активних сполук для лікування чутливості у пацієнтів. Наприклад, необмежуючі приклади форм одиниць дозування включають 0,2 мг (відповідає дозі 3 мкг/кг для пацієнта з масою тіла приблизно 70 кг), 2 мг (відповідає дозі 30 мкг/кг для пацієнта з масою тіла приблизно 70 кг) і 7 мг (відповідає дозі 100 мкг/кг для пацієнта з масою тіла приблизно 70 кг). Приклади фармацевтично прийнятних антиоксидантів включають: (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, цистеїна гідрохлорид, натрію бісульфат, натрію метабісульфіт, натрію сульфіт і т.п.; (2) жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбіл пальмітат, бутилгідроксианізол (BHA), бутилгідрокситолуол (BHT), лецитин, пропілгаллат, альфатокоферол і т.п.; і (3) метал-хелатуючі агенти, такі як лимонна кислота, етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТА), сорбітол, винна кислота, фосфорна кислота й т.п. В одному варіанті рецептури можуть бути представлені у формі одиниць дозування й можуть бути приготовлені будь-яким способом, відомим фахівцям в галузі фармації. Форма одиниці дозування при використанні в цьому документі означає фізично розділені одиниці, приготовлені як одиничні дозування для суб'єктів, які отримують лікування; при цьому кожна одиниця містить заздалегідь установлену кількість активної сполуки, що розрахована для одержання необхідного терапевтичного ефекту, в асоціації з необхідним фармацевтичним носієм. Кількість активної речовини, що може бути скомбінована з матеріалом носія для одержання разової лікарської форми, буде змінюватися залежно від суб'єкта, що отримує лікування, і конкретного способу введення. Кількість активної речовини, що може бути скомбінована з матеріалом носія для одержання разової лікарської форми, у загальному випадку буде дорівнювати кількості композиції, що дає терапевтичний ефект. У загальному випадку, виходячи зі ста відсотків, ця кількість буде знаходитись в діапазоні від приблизно 0,001 відсотка до приблизно дев'яноста відсотків активної речовини, переважно від приблизно 0,005 відсотка до приблизно 70 відсотків, найбільш переважно від приблизно 0,01 відсотка до приблизно 30 відсотків. Фрази "парентеральне введення" і "введений парентерально" при використанні в цьому документі означають способи введення, відмінні від ентерального і місцевого введення, звичайно із застосуванням ін'єкції, і що включають, зокрема, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, інтратекальну, внутрішньокапсульну, внутрішньоочноямкову, інтракардіальну, внутрішньошкірну, внутрішньоочеревинну, транстрахеальну, підшкірну, субкутикулярну, внутрішньосуглобну, субкапсульну, субарахноїдальну, інтраспінальну, епідуральну й інтрастернальну ін'єкцію і інфузію. Приклади придатних водних і неводних носіїв, які можуть застосовуватися у фармацевтичних композиціях згідно винаходу, включають воду, етанол, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т.п.) і їхні придатні суміші, рослинні масла, такі як маслинове масло, і ін'єкційні органічні складні ефіри, такі як етилолеат. Необхідна плинність може підтримуватися, наприклад, за допомогою застосування матеріалів для оболонки, наприклад, лецитина, підтримки необхідного розміру часток у випадку дисперсій і застосування поверхнево-активних речовин. Ці композиції можуть також містити ад'юванти, такі як консерванти, агенти що змочують, емульгатори і диспергувальні агенти. Зокрема, приклади ад'ювантів, які добре відомі фахівцям у 28