Рекомбінантні антигени рсв

Реферат: Винахід належить до рекомбінантного антигену респіраторно-синцитіального вірусу (РСВ), що містить розчинний поліпептид F-білка РСВ без трансмембранного домену, що включає домен F2 і домен F1 поліпептиду F-білка РСВ, при цьому поліпептид F-білка містить модифікацію, яка збільшує глікозилування, причому зазначена модифікація, яка збільшує глікозилування, містить заміну, де амінокислоти, що відповідають положенням 500-502 в послідовності SEQ ID NO: 2, UA 111141 C2 (12) UA 111141 C2 вибрані з: NGS, NGT. Винахід також належить до способу отримання заявленого рекомбінантного антигену і його застосування для лікування та/або профілактики РСВ-інфекції. UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднені заявки По цій заявці заявляється пріоритет по раніших датах подачі тимчасових попередніх заявок на видачу патенту США 61/334568, поданої 13 травня 2010, і 61/219964, поданої 24 червня 2009, описи яких включені в дану публікацію у вигляді посилання. Повідомлення про авторське право згідно 37 C.F.R. § 1.71(E) Частина опису патентного документа містить матеріал, який підлягає охороні авторського права. Володар авторського права не заперечує проти факсимільного відтворення патентного документа або опису патенту ким-небудь, оскільки ці документи фігурують у файлах або регістрах бюро по реєстрації патентів і товарних знаків, проте у всіх без виключення останніх відношеннях всі авторські права зберігаються. Рівень техніки Даний винахід відноситься до області імунології. Конкретніше даний винахід відноситься до композицій і способів індукції імунної відповіді, специфічної для респіраторно-синцитіального вірусу (РСВ). Респіраторно-синцитіальний вірус людини (РСВ) у всьому світі є найбільш поширеною причиною інфекцій нижніх дихальних шляхів (LRI) у маленьких дітей у віці менше 6 місяців і недоношених дітей, народжених на терміні менше або рівному 35 тижням вагітності. Спектр РСВ-захворювань включає широкий ряд респіраторних симптомів від риніту і отиту до пневмонії і бронхіоліту, при цьому останні два захворювання асоційовані з високою захворюваністю і смертністю. Людина є єдиним відомим джерелом РСВ. Поширення вірусу з інфікованого носового секрету відбувається через крупні видихувані крапельки, так що для передачі потрібний близький контакт з інфікованою людиною або забрудненою поверхнею. РСВ може персистувати протягом декількох годин на іграшках або інших предметах, що пояснює високу частоту нозокоміальних РСВ-інфекцій, особливо в педіатричних відділеннях. Щорічні показники інфекції по всьому світу і смертності в разі РСВ оцінюють на рівні 64 мільйонів і 160000, відповідно. Лише у США, судячи по оцінках, РСВ відповідальний за 1800075000 випадків госпіталізації і 90-1900 смертей щорік. Переконливо підтверджено документальними доказами, що в помірному кліматі РСВ є причиною епідемій гострих LRI в ранній зимовий період, включаючи бронхіоліт і пневмонію. У США майже всі діти після досягнення дворічного віку інфіковані РСВ. Коефіцієнт захворюваності РСВ-асоційованими LRI у здорових в інших відносинах дітей, як було розраховано, складає 37 на 1000 дітей на рік в перші два роки життя (45 на 1000 дітей на рік у дітей у віці менше 6 місяців), і ризик госпіталізації складає 6 на 1000 дітей на рік (на 1000 дітей на рік в перші шість місяців життя). Частота вище у дітей із захворюванням серця і легенів і у недоношених дітей, які складають майже половину пацієнтів, що поступають в лікувальні заклади у зв'язку з РСВ в США. Серед дітей, які перенесли важче LRI, викликане РСВ, згодом спостерігають підвищену частоту захворювання дитячої астми. Такі дослідження свідчать про повсюдну необхідність в РСВвакцинах, а також їх вживанні в промислово розвинених країнах, де витрати на догляд за пацієнтами з важкими LRI і їх ускладненнями є значними. РСВ також все більше і більше визнають як важливу причину захворюваності грипоподібними захворюваннями у літніх людей. Були зроблені різні підходи при спробах отримати безпечну і ефективну РСВ-вакцину, аби викликати тривалі і захисні імунні відповіді в популяціях здорових людей і популяціях, що піддаються ризику. Проте жоден з оцінюваних до теперішнього часу кандидатів не зарекомендував себе як безпечну і ефективну вакцину для цілей профілактики РСВ-інфекції та/або ослаблення або профілактики РСВ-захворювання, включаючи інфекції нижніх дихальних шляхів (LRI). Суть винаходу Даний винахід відноситься до рекомбінантних антигенів респіраторно-синцитіального вірусу (РСВ). Конкретніше, даний опис відноситься до антигенів, включаючи рекомбінантний F-білок, який був модифікований для стабілізації тримерної конформації, яку білок має перед злиттям. Описані рекомбінанті антигени проявляють чудову імуногенність і особливо переважно застосовні як компоненти імуногенних композицій (наприклад, вакцин) для захисту від РСВінфекції та/або захворювання. Також описані нуклеїнові кислоти, які кодують рекомбінантні антигени, імуногенні композиції, що містять антигени, і спосіб отримання і вживання антигенів. Короткий опис креслень Фіг. 1A є схематичною ілюстрацією відмінних структурних ознак F-білка РСВ. Фіг. 1B є схематичною ілюстрацією прикладів антигенів F РСВ перед злиттям (PreF). На фіг. 2 показаний лінійчатий графік, що ілюструє типові результати аналізу PreF проточним фракціонуванням в асиметричному полі (AFF-MALS). На фіг. 3 представлена стовпчаста діаграма, що показує інгібування PreF-антигеном 1 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здатності сироватки людини до нейтралізації. На фіг. 4A і B представлена стовпчаста діаграма, що показує титри IgG в сироватці, викликані у мишей у відповідь на антиген PreF. На фіг. 5A і B представлена стовпчаста діаграма, що ілюструє титри нейтралізуючих антитіл, специфічних для РСВ, викликаних антигеном PreF. На фіг. 6A і B представлені графіки, що показують захист проти зараження, що забезпечується антигеном PreF РСВ у мишей. Фіг. 7 являє собою графік оцінки лейкоцитів BAL після імунізації і зараження. На фіг. 8 представлена стовпчаста діаграма, що ілюструє IgG в сироватці, отриманий після імунізації PreF, приготованим з різними розведеннями емульсії типу "масло у воді" (AS03). На фіг. 9 представлена стовпчаста діаграма, що ілюструє титри нейтралізуючих антитіл після імунізації PreF, приготованим з розведеннями емульсії типу "масло у воді" (AS03) Фіг. 10 являє собою графік, що ілюструє захист від зараження після імунізації PreF, приготованим з розведеннями емульсії типу "масло у воді" (AS03). Детальний опис Введення Розробка вакцин для профілактики РСВ-інфекції була ускладнена тим фактом, що імунні відповіді хазяїна, мабуть, грають роль в патогенезі захворювання. Ранні дослідження 1960-х років показали, що діти, яким вводили вакцину на основі інактивованого формаліном РСВ, страждали від важчого захворювання при подальшій дії вірусу, в порівнянні з невакцинованими контрольними особами. Такі ранні випробування привели до госпіталізації 80 % вакцинованих пацієнтів і двом смертельним результатам. Підвищена тяжкість захворювання була відтворена в тваринних моделях і, як вважають, є результатом неадекватних рівнів нейтралізуючих антитіл у сироватці, відсутність місцевого імунітету і надмірної індукції імунної відповіді, подібної до відповіді T-клітин-хелперів типу 2 (Th2) з легеневою еозинофілією і підвищеною продукцією цитокінів IL-4 і IL-5. Навпаки, успішна вакцина, яка захищає від РСВ-інфекції, індукує імунну відповідь, зміщену убік Th1, що характеризується продукцією IL-2 і γ-інтерферона (IFN). Даний винахід відноситься до рекомбінантних антигенів респіраторно-синцитіального вірусу (РСВ), які вирішують проблеми, що мають місце в разі антигенів РСВ, раніше використовуваних у вакцинах, і покращують імунологічні властивості антигена, а також властивості, важливі при виробництві антигена. Рекомбінантні антигени РСВ, описані в даній публікації, включають аналог білка злиття (F), який включає розчинний поліпептид F-білка, який був модифікований так, щоб стабілізувати конформацію F-білка, що є перед злиттям, тобто конформацію зрілого зібраного F-білка перед злиттям з мембраною клітини хазяїна. Такі аналоги F-білка позначені "PreF" або "PreF-антигени" в цілях ясності і простоти. PreF-антигени, описані в даній публікації, запропоновані на підставі несподіваного відкриття того, що розчинні аналоги F-білка, які були модифіковані так, щоб вони включали в себе гетерологічний домен тримеризації, проявляють підвищені імуногенні властивості і є безпечними і забезпечують високу міру захисту при введенні пацієнтові in vivo. Детальний опис структури F-білка РСВ представлено в даній публікації з використанням термінології і позначень, широко прийнятих в даній галузі, і схематично проілюстровано на фіг. 1A. Схематична ілюстрація прикладів PreF-антигенів представлена на фіг. 1B. Фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що будь-який F-білок РСВ може бути модифікований, аби стабілізувати конформацію, що є до злиття, згідно інструкціям, приведеним в даному описі. Тому, аби полегшити розуміння принципів, на яких засновано отримання PreF-антигенів, окремі структурні компоненти будуть вказані із посиланням на приклад F-білка, полінуклеотидна і амінокислотна послідовності якого представлені в SEQ ID NO: 1 і 2, відповідно. Так само, в застосовних випадках антигени G-білка описані із посиланням на приклад G-білка, полінуклеотидна і амінокислотна послідовності якого представлений в SEQ ID NO: 3 і 4, відповідно. На підставі первинної амінокислотної послідовності поліпептиду F-білка (фіг. 1A), використовували наступні терміни для опису структурних ознак PreF-антигенів. Термін F0 відноситься до повнорозмірного трансльованого попередника F-білка. Поліпептид F0 може бути підрозділений на домен F2 і домен F1, які розділені проміжним пептидом, званим pep27. Під час дозрівання поліпептид F0 піддається протеолітичному розщеплюванню в двох сайтах фурина, розташованих між F2 і F1 і фланкуючих pep27. В цілях подальшого обговорення домен F2 включає щонайменше частину, і аж до всіх амінокислот 1-109, і розчинна частина домена F1 включає щонайменше частину, і аж до всіх амінокислот 137-526 F-білка. Як вказано вище, такі положення амінокислот (і все подальші положення амінокислот, названі в даному описі) приведені на підставі ілюстративного поліпептиду F-білка (F0) з послідовністю SEQ ID NO: 2. 2 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антиген F перед злиттям (або "PreF") є розчинним (тобто, не зв'язаним з мембраною) аналогом F-білка, який містить щонайменше одну модифікацію, яка стабілізує конформацію Fбілка, що є до злиття, так що антиген РСВ зберігає щонайменше один імунодомінантний епітоп конформації F-білка, яку він має до злиття. Розчинний поліпептид F-білка включає домен F2 і домен F1 F-білка РСВ (але не містить трансмембранного домена F-білка РСВ). У ілюстративних варіантах домен F2 містить амінокислоти 26-105, а домен F1 містить амінокислоти 137-516 Fбілка. Проте можна використовувати менші за розміром частини, за умови, що тривимірна конформація стабілізованого антигена PreF зберігається. Так само, поліпептиди, які містять додаткові структурні компоненти (наприклад, поліпептиди злиття), також можна використовувати замість приведених як приклад доменів F2 і F1, за умови, що додаткові компоненти не порушують тривимірну конформацію або не роблять іншого несприятливого впливу на стабільність, продукцію або процесинг, або не знижують імуногенність антигена. Домени F2 і F1 розташовані в орієнтації від N-кінця до C-кінця, аби відтворити фолдинг і збірку аналога F-білка в зрілу конформацію, характерну для білка перед злиттям. Аби підвищити продукцію, домену F2 може передувати сигнальний пептид секреції, так аби вибраний нативний сигнальний пептид F-білка або гетерологічний сигнальний пептид підсилював продукцію і секрецію в клітинах-хазяях, в яких необхідно експресувати рекомбінантний антиген PreF. Антигени PreF стабілізують (у тримерній конформації перед злиттям) введенням однієї або декількох модифікацій, таких як додавання, делеція або заміна однієї або декількох амінокислот. Однією з таких стабілізуючих модифікацій є додавання амінокислотної послідовності, що містить гетерологічний стабілізуючий домен. У ілюстративних варіантах гетерологічний стабілізуючий домен являє собою домен мультимеризації білка. Одним особливо переважним прикладом такого домену мультимеризації білка є домен ізолейцинової блискавки, який стимулює тримеризацію декількох поліпептидів, що мають такий домен. Приклад домену ізолейцинової блискавки показаний в SEQ ID NO: 11. Зазвичай гетерологічний стабілізуючий домен розташований на C-кінці від домена F1. Необов'язково домен мультимеризації зв'язаний з доменом F1 через коротку амінокислотну лінкерну послідовність, таку як послідовність GG. Лінкером також може бути довший лінкер (наприклад, що включає послідовність GG, такий як амінокислотна послідовність: GGSGGSGGS; SEQ ID NO: 14). У даній галузі відомі багаточисельні конформаційно нейтральні лінкери, які можуть бути використані у даному контексті без порушення конформації антигену PreF. Іншою стабілізуючою модифікацією є виключення сайту пізнавання і розщеплювання фурином, який розташований між доменами F2 і F1 в нативному білку F0. Один або обидва сайти пізнавання фурином, розташовані в положеннях 105-109 і в положеннях 133-136, можуть бути виключені делетуванням або заміною однієї або декількох амінокислот сайтів пізнавання фурином, так аби протеаза була нездібна розщеплювати поліпептид PreF на складові його домени. Необов'язково проміжний пептид pep27 також може бути видалений або замінений, наприклад, лінкерним пептидом. Додатково або необов'язково нефуриновий сайт розщеплювання (наприклад, сайт металопротеїнази в положеннях 112-113) поблизу пептиду злиття може бути видалений або замінений. Іншим прикладом стабілізуючої мутації є додаванням або заміна гідрофільною амінокислотою в гідрофобному домені F-білка. Зазвичай заряджена амінокислота, така як лізин, може бути додана або введена у вигляді заміни нейтрального залишку, такого як лейцин, в гідрофобну ділянку. Наприклад, гідрофільна амінокислота може бути додана або може замінювати гідрофобну або нейтральну амінокислоту суперспіралізованому домені HRB позаклітинного домену F-білка. Як приклад заряджений залишок амінокислоти, такий як лізин, може замінювати лейцин, присутній в положенні 512 F-білка. Альтернативно або додатково гідрофільна амінокислота може бути додана або може замінювати гідрофобну або нейтральну амінокислоту в домені HRA F-білка. Наприклад, одна або декілька заряджених амінокислот, таких як лізин, можуть бути вбудовані в положення 105-106 або поблизу вказаного положення (наприклад, після амінокислоти, відповідної залишку 105 в еталонній послідовності SEQ ID NO: 2, наприклад, між амінокислотами 105 і 106) антигену PreF). Необов'язково гідрофільні амінокислоти можуть бути додані або введені як заміна в обох доменах HRA і HRB. Альтернативно один або декілька гідрофобних залишків можуть бути делетовані, за умови, що це не зробить несприятливого впливу на загальну конформацію антигену PreF. Додатково або альтернативно може бути здійснена одна або декілька модифікацій, які змінюють сайт глікозилування антигену PreF. Наприклад, одна або декілька амінокислот в сайті глікозилування, присутніх в нативному F-білку РСВ, наприклад, в положенні амінокислотного залишку 500 або довкола нього (в порівнянні з SEQ ID NO: 2) можуть бути делетовані або 3 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 замінені (або амінокислота може бути додана так, щоб порушити сайт глікозилування), аби збільшити або зменшити статус глікозилування антигену PreF. Наприклад, амінокислоти, відповідні положенням 500-502 в послідовності SEQ ID NO: 2, можуть бути вибрані з: NGS, NKS, NGT і NKT. Таким чином, в деяких варіантах антигени PreF включають розчинний поліпептид Fбілка, що містить домен F2 (наприклад, відповідним амінокислотам 26-105 в SEQ ID NO: 2) і домен F1 (наприклад, відповідний амінокислотам 137-516 в SEQ ID NO: 2) поліпептиду F-білка РСВ, в який була введена щонайменше одна модифікація, яка змінює глікозилування. Антиген PreF РСВ зазвичай містить інтактний пептид злиття між доменом F2 і доменом F1. Необов'язково антиген PreF містить сигнальний пептид. Як описано вище, такі поліпептиди F-білка можуть мати щонайменше одну модифікацію, вибрану з: (i) додавання амінокислотної послідовності, що містить гетерологічний домен тримеризації (такої як домен ізолейцинової блискавки); (ii) делеції щонайменше одного сайту розщеплювання фурином; (iii) делеції щонайменше одного нефуринового сайту розщеплювання; (iv) делеції однієї або декількох амінокислот домена pep27; і (v) щонайменше, однієї заміни або додавання гідрофільної амінокислоти в гідрофобний домен позаклітинного домену F-білка. Як описано вище, такі модифіковані по глікозилуванню антигени PreF РСВ збираються в мультимери, наприклад, тримери. У ілюстративних варіантах модифіковані по глікозилуванню антигени PreF вибрані з групи, що складається з: а) поліпептиду, що містить або складається з послідовності SEQ ID NO: 22; b) поліпептиду, що кодується послідовністю SEQ ID NO: 21 або полінуклеотидною послідовністю, яка гібридизується в жорстких умовах по суті по всій довжині з послідовністю SEQ ID NO: 21; з) поліпептиду, що має щонайменше 95 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 22. Будь-яку та/або всі стабілізуючі модифікації можна використовувати окремо та/або у поєднанні з будь-якими іншими стабілізуючими модифікаціями, описаними в даній публікації, аби отримати антиген PreF. У ілюстративних варіантах білок PreF містить поліпептид, що включає домен F2 і домен F1 без проміжного сайту розщеплювання фурином між доменом F2 і доменом F1 і з гетерологічним стабілізуючим доменом (наприклад, доменом тримеризації), розташованим на C-кінці від домену F1. У деяких варіантах антиген PreF також містить одне або декілька додавань та/або замін гідрофільним залишком в гідрофобному домені HRA та/або HRB. Необов'язково антиген PreF має модифікацію щонайменше одного нефуринового сайту розщеплювання, такого як сайт металопротеїнази. Антиген PreF необов'язково містить додатковий поліпептидний компонент, який включає щонайменше імуногенну частину G-білка РСВ. Тобто, в деяких варіантах антиген PreF являє собою химерний білок, який містить як F-білковий компонент, так і G-білковий компонент. Fбілковий компонент може являти собою будь-який з антигенів PreF, описаних вище, а Gбілковий компонент вибирають так, щоб він являв собою імунологічно активну частину G-білка РСВ (аж до та/або включаючи повнорозмірний G-білок). У ілюстративних варіантах поліпептид G-білка містить амінокислоти 149-229 G-білка (при цьому положення амінокислот позначені на базі послідовності G-білка, показаної в SEQ ID NO: 4). Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що можна використовувати меншу за розміром частину або фрагмент G-білка, за умови, що вибрана частина зберігає домінантні імунологічні властивості крупнішого фрагмента G-білка. Зокрема, вибраний фрагмент зберігає імунологічно домінантний епітоп приблизно в області положень амінокислот 184-198 (наприклад, амінокислоти 180-200), і є досить довгим, аби укладатися і збиратися в стабільну конформацію, яка представляє імунодомінантний епітоп. Також можна використовувати довші фрагменти, наприклад, приблизно від амінокислоти 128 до приблизно амінокислоти 229, аж до повнорозмірного G-білка. За умови, що вибраний фрагмент укладається в стабільну конформацію в контексті химерного білка і не заважає продукуванню, процесингу або стабільності при рекомбінантному отриманні в клітинах-хазяях. Необов'язково G-білковий компонент зв'язаний з F-білковим компонентом через коротку амінокислотну лінкерну послідовність, таку як послідовність GG. Лінкер також може являти собою довший лінкер (такий як амінокислотна послідовність: GGSGGSGGS: SEQ ID NO: 14). У даній галузі відомі багаточисельні конформаційно нейтральні лінкери, які можна використовувати у даному контексті, не порушуючи конформацію антигену PreF. Необов'язково G-білковий компонент може містити одну або декілька амінокислотних замін, які зменшують або запобігають важчому вірусному захворюванню в тваринній моделі захворювання, викликаного РСВ. Тобто, G-білок може мати амінокислотну заміну, так що при введенні імуногенної композиції, що містить химерний антиген PreF-G, пацієнтові, вибраному з прийнятної тваринної моделі (наприклад, мишачої моделі РСВ), у пацієнта спостерігалися ослаблені симптоми або були відсутні симптоми підсилюваного вакциною вірусного захворювання (наприклад, еозинофілії, нейтрофілії), в порівнянні з контрольною твариною, 4 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержуючою вакцину, включаючи вакцину, яка містить немодифікований G-білок. Ослаблення та/або запобігання підсилюваному вакциною вірусному захворюванню може спостерігатися, коли імуногенні композиції вводять у відсутність ад'юванта (але не спостерігаються, наприклад, коли антигени вводять у присутності сильного індукуючого Th1 ад'юванта). Крім того, амінокислотна заміна може ослабляти або запобігати підсилюваному вакциною вірусному захворюванню при введенні людині. Прикладом відповідної амінокислотної заміни є заміна аспарагіну в положенні 191 аланіном (Asn → Ala в положенні 191: N191A). Необов'язково будь-який антиген PreF, описаний вище, може містити додаткову послідовність, яка допомагає при очищенні. Одним з прикладів є полігістидинова мітка. Така мітка за бажання може бути видалена з кінцевого продукту. При експресії антигени PreF піддаються внутрішньомолекулярному фолдингу і збірці в зрілий білок, який містить мультимер поліпептидів. Переважно поліпептиди антигена PreF збираються в тример, який схожий на конформацію зрілого процесованного F-білка, що є перед злиттям. Будь-який з антигенів PreF (включаючи антигени PreF-G), описаних в даній публікації, можна переважно використовувати в імуногенних композиціях для того, щоб викликати захисну імунну відповідь проти РСВ. Такі імуногенні композиції зазвичай містять фармацевтично прийнятний носій та/або ексципієнт, такий як буфер. Аби підсилити імунну відповідь, що отримується після введення, імуногенна композиція зазвичай також містить ад'ювант. В разі імуногенних композицій, призначених для того, щоб викликати захисну імунну відповідь проти РСВ (наприклад, вакцин), композиції переважно містять ад'ювант, який переважно викликає Th1імунну відповідь (ад'ювант, що зміщує відповідь убік Th1). Зазвичай ад'ювант вибирають так, щоб він підходив для введення цільової популяції, якій необхідне введення композиції. Таким чином, залежно від вживання ад'ювант вибирають так, щоб він підходив для введення, наприклад, новонародженим або літнім людям. Імуногенні композиції, описані в даній публікації, переважно використовують як вакцини для зменшення або запобігання інфекції РСВ без індукування патологічної реакції (такої як підсилюване вакциною вірусне захворювання) після введення або дії РСВ. У деяких варіантах імуногенна композиція містить антиген PreF (такий як приблизний варіант, показаний в SEQ ID NO: 6) і другий поліпептид, який включає G-білковий компонент. Gбілковий компонент зазвичай містить щонайменше амінокислоти 149-229 G-білка. Хоча можна використовувати менші за розміром частини G-білка, такі фрагменти повинні включати, як мінімум, імунологічний домінантний епітоп з амінокислот 184-198. Альтернативно, G-білок може включати крупнішу частину G-білка, таку як амінокислоти 128-229 або 130-230, необов'язково у вигляді елементу крупнішого білка, такого як повнорозмірний G-білок або химерний поліпептид. У інших варіантах імуногенна композиція містить антиген PreF, який є химерним білком, який також містить G-білковий компонент (такий як приблизьні варіанти, показані в SEQ ID NO: 8 і 10). G-білковий компонент такого химерного антигену PreF (або PreF-G) зазвичай містить щонайменше амінокислоти 149-229 G-білка. Як вказано вище, також можна використовувати менші або більші за розміром фрагменти (такі як амінокислоти 129-229 або 130-230) G-білка, за умови, що зберігаються імунодомінантні епітопи і не виявляється несприятливий вплив на конформацію антигену PreF-G. Необов'язково імуногенні композиції також можуть містити щонайменше один додатковий антиген патогенного організму, відмінний від РСВ. Наприклад, патогенним організмом є інший вірус, відмінний від РСВ, такий як вірус парагрипу (PIV), кору, гепатиту B, вірус поліомієліту або вірус грипу. Альтернативно патогенним організмом може бути бактерія, така як дифтерійна, правцева бактерія, бактерія, що викликає коклюш, Haemophilus influenzae і Pneumococcus. Рекомбінантні нуклеїнові кислоти, які кодують будь-який з антигенів PreF (включаючи антигени PreF-G), також є відмінною ознакою даного винаходу. У деяких варіантах полінуклеотидну послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує антиген PreF, оптимізують для експресії у вибраному хазяїні (такому як клітини CHO, інші клітини ссавців або клітини комах). Відповідно, вектори, включаючи експресуючі вектори (включаючи прокаріотичні і єукаріотичні експресуючі вектори), є відмітною ознакою даного винаходу. Таким чином, клітини-хазяї, що містять такі нуклеїнові кислоти і вектори, є відмітною ознакою даного винаходу. Такі нуклеїнові кислоти також можна застосовувати в контексті імуногенних композицій для введення пацієнтові, аби викликати імунну відповідь, специфічну для РСВ. Антигени PreF переважно застосовують для профілактики та/або лікування РСВ-інфекції. Таким чином, інший аспект даного винаходу відноситься до способу, що дозволяє викликати імунну відповідь проти РСВ. Спосіб включає введення імунологічно ефективної кількості композиції, що містить антиген PreF, пацієнтові (такому як людина або тварина). Введення 5 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імунологічно ефективної кількості композиції викликає імунну відповідь, специфічну для епітопів, присутніх на антигені PreF. Така імунна відповідь може включати B-клітинну відповідь (наприклад, продукцію нейтралізуючих антитіл) та/або T-клітинні відповіді (наприклад, продукцію цитокінів). Переважно імунна відповідь, викликана антигеном PreF, включає елементи, які специфічні щонайменше для одного конформаційного епітопа, присутнього на конформації до злиття F-білка РСВ. Антигени PreF і композиції можна вводити пацієнтові без посилення вірусного захворювання після контакту з РСВ. Переважно, антигени PreF, описані в даній публікації, і відповідним чином отримані імуногенні композиції викликають імунну відповідь, зміщену убік Th1, який ослабляє або запобігає інфекції РСВ та/або зменшує або запобігає патологічній відповіді після інфекції РСВ. Імуногенні композиції можуть бути введені різними шляхами, включаючи такі шляхи, як інтраназальний, який дозволяє безпосередньо вводити антиген PreF в контакт із слизистою оболонкою верхніх дихальних шляхів. Альтернативно можна використовувати більш традиційні шляхи введення, такі як внутрішньом'язовий шлях введення. Таким чином, також передбачається вживання будь-якого з описаних антигенів РСВ (або нуклеїнових кислот) при отриманні лікарського засобу для лікування РСВ-інфекції (наприклад, профілактичного лікування або профілактики РСВ-інфекції). Відповідно, даний винахід відноситься до описаних рекомбінантних антигенів РСВ або імуногенних композицій для вживання в медицині, а також до їх вживання для профілактики або лікування РСВасоційованих захворювань. Додаткові деталі, що мають відношення до антигенів PreF і способам їх вживання приведені в описі і прикладах нижче. Терміни Аби полегшити огляд різних варіантів здійснення даного винаходу, приведені наступні пояснення термінів. Додаткові терміни і пояснення можуть бути приведені в контексті даного опису. Якщо не вказане інше, всі технічні і наукові терміни, використовувані в даному описі, мають таке ж значення, яке зазвичай додає таким термінам фахівець в галузі, до якої даний винахід відноситься. Визначення загальних термінів молекулярної біології можна знайти в роботах: Benjamin Lewin, Genes V, опублікованої Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew із співавторами (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опублікованої Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); і Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: а Comprehensive Desk Reference, опублікованої VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Форми однини включають множинні об'єкти, якщо контекст ясно не вказує інше. Так само мається на увазі, що слово включає "і", якщо контекст ясно не вказує інше. Термін "безліч" відноситься до двох або більшій кількості. Крім того, повинно бути зрозуміло, що всі розміри в кількості основ або розміри в кількості амінокислот і всі значення молекулярних вагів або молекулярних мас, приведені для нуклеїнових кислот або поліпептидів, є приблизними і приведені для опису. Крім того, мається на увазі, що числові обмеження, приведені по відношенню до концентрацій або рівнів речовини, такої як антиген, є приблизними. Таким чином, у тому випадку, коли вказують концентрацію, складову щонайменше (наприклад) 200 пг, мають на увазі, що слід розуміти, що концентрація складає щонайменше приблизно (або "приблизно" або «~») 200 пг. Хоча при практичному здійсненні або перевірці винаходу можна використовувати способи і речовини, схожі або еквівалентні способам і речовинам, описаним в даній публікації, відповідні способи і речовини описані нижче. Термін "містить" означає "включає". Таким чином, якщо контекст не вимагає інше, слід розуміти, що слово "містить" і варіанти, такі як "містять" і "той, що містить" означатиме включення вказаної сполуки або композиції (наприклад, нуклеїнової кислоти, поліпептиду, антигену) або стадії, або групи сполук або стадій, але не вилучення якихнебудь інших сполук, композицій, стадій або їх груп. Скорочення "e.g.» отримано з латинського "Exempli gratia", і використовується в даному описі для вказівки не обмежуючого прикладу. Таким чином, скорочення "e.g.» є синонімом терміну "наприклад". Респіраторно-синцитіальний вірус (РСВ) є патогенним вірусом сімейства Paramyxoviridae, підсімейства Pneumovirinae, роду Pneumovirus. Геном РСВ представлений мінус-смисловою молекулою РНК, яка кодує 11 білків. Тісна асоціація РНК-генома з вірусним N-білком утворює нуклеокапсид, згорнутий усередині вірусної оболонки. Описано дві групи штамів РСВ людини, групи A і B, на основі відмінностей в антигенності глікопротеїду G. До теперішнього часу виділені багаточисельні штами РСВ. Приклади штамів, вказаних з номерами доступу в GenBank та/або EMBL, можна знайти в публікації WO2008114149, яка включена в даний опис у вигляді 6 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 посилання в цілях опису послідовностей нуклеїнових кислот і поліпептидів F- і G-білків РСВ, відповідних для вживання в антигенах PreF (включаючи химерні антигени PreF-G) і в поєднаннях з антигенами PreF. Можуть бути виділені додаткові штами РСВ, які відносяться до роду РСВ. Так само, рід РСВ охоплює варіанти, що виникають з тих, що зустрічаються в природі (наприклад, раніше або пізніше ідентифікованих штамів) в результаті генетичного дрейфу або штучного синтезу та/або рекомбінації. Термін "F-білок" або "білок злиття" або "поліпептид F-білка" або "поліпептид білка злиття" відноситься до поліпептиду або білка, що має всю або частину амінокислотної послідовності поліпептиду білка злиття РСВ. Так само, термін "G-білок" або "поліпептид G-білка" відноситься до поліпептиду або білка, що має всю або частину амінокислотної послідовності поліпептиду білка прикріплення РСВ. Багаточисельні білки злиття і прикріплення РСВ описані і відомі фахівцям в даній галузі. У WO2008114149 описані приклади варіантів F- і G-білків (наприклад, варіанти, що зустрічаються в природі), загальнодоступних на дату подачі даної заявки. "Варіант" по відношенню до нуклеїнової кислоти або поліпептиду (наприклад, нуклеїнової кислоти або поліпептиду F- або G-білка РСВ або нуклеїнової кислоти або поліпептиду PreF) являє собою нуклеїнову кислоту або поліпептид, який відрізняється від еталонної нуклеїнової кислоти або поліпептиду. Звичайна відмінність(відмінності) між варіантом і еталонною нуклеїновою кислотою або поліпептидом являє собою пропорційно невелику кількість відмінностей в порівнянні з еталоном. "Домен" поліпептиду або білка являє собою структурно певний елемент в поліпептиді або білці. Наприклад, "доменом тримеризації" є амінокислотна послідовність в поліпептиді, яка симулює збірку поліпептиду в тримери. Наприклад, домен тримеризації може стимулювати збірку в тримери за допомогою асоціацій з іншими доменами тримеризації (додатковими поліпептидами з такою ж або іншою амінокислотною послідовністю). Термін також використовують по відношенню до полінуклеотиду, який кодує такий пептид або поліпептид. Терміни "нативний" і "що зустрічається в природі" відносяться до елементу, такому як білок, поліпептид або нуклеїнова кислота, який присутній в такому ж стані в природі. Тобто, елемент не був модифікований штучно. Буде зрозуміло, що в контексті даного опису, що існують багаточисельні нативні/що зустрічаються в природі варіанти білків або поліпептидів РСВ, наприклад, отриманих з різних штамів, що зустрічаються в природі, або ізолятів РСВ. Термін "поліпептид" відноситься до полімеру, в якому мономерами є залишки амінокислот, які зв'язані разом амідними зв'язками. Мається на увазі, що терміни "поліпептид" або "білок" у використовуваному в даному описі сенсі охоплюють будь-яку амінокислотну послідовність і включають модифіковані послідовності, такі як глікопротеїди. Мається на увазі, що термін "поліпептид" спеціально охоплює білки, що зустрічаються в природі, а також отримані рекомбінантно або синтетично. Термін "фрагмент" відносно поліпептиду відноситься до частини (тобто підпослідовності) поліпептиду. Термін "імуногенний фрагмент" відноситься до всіх фрагментів поліпептиду, які зберігають щонайменше один домінантний імуногенний епітоп повнорозмірного еталонного білка або поліпептиду. Орієнтація в межах поліпептиду зазвичай вказана в напрямі від N-кінця до C-кінця, визначуваних по орієнтації аміно- і карбоксильних залишків окремих амінокислот. Поліпептиди транслюються від N- або аміно-кінця у напрямку до C- або карбоксильного кінця. "Сигнальний пептид" являє собою коротку амінокислотну послідовністю (наприклад, завдовжки приблизно 18-25 амінокислот), яка направляє знов синтезовані секреторні або мембранні білки в мембрани і через мембрани, наприклад, ендоплазматичної сітці. Сигнальні пептиди часто, але не завжди, розташовані на N-кінці поліпептиду і часто відщеплюються сигнальною пептидазою після того, як білок пересікає мембрану. Сигнальні послідовності зазвичай володіють трьома загальними структурними ознаками: N-кінцевою полярною основною ділянкою (n-ділянкою), гідрофобною центральною частиною і гіброфильною сділянкою). Терміни "полінуклеотид" і "послідовність нуклеїнової кислоти" відносяться до полімерної форми нуклеотидів завдовжки щонайменше 10 основ. Нуклеотиди можуть являти собою рибонуклеотиди, дезоксирибонуклеотиди або модифіковані форми будь-якого нуклеотиду. Термін включає однониткові і двониткові форми ДНК. Термін "ізольований полінуклеотид" означає полінуклеотид, який не є безпосередньо сусіднім з обома кодуючими послідовностями, з якими він безпосередньо сусідні (одна на 5’-кінці і одна на 3’-кінці) в геномі організму, з якого він отриманий, що зустрічається в природі. У одному варіанті полінуклеотид кодує поліпептид. 5’- і 3’-направлення нуклеїнової кислоти визначають, виходячи із зв'язку окремих нуклеотидних одиниць, і позначають згідно положенням атомів вуглецю в кільці цукру дезоксирибози (або рибози). Інформація (закодована інформація) в послідовності полінуклеотиду зчитується в 5’-3’ 7 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 направленні. "Рекомбінантною" нуклеїновою кислотою є нуклеїнова кислота, яка має послідовність, яка не зустрічається в природі, або має послідовність, яка отримана в результаті штучного поєднання двох в іншому випадку розділених ділянок послідовності. Таке штучне поєднання можна здійснювати за допомогою хімічного синтезу або частіше за допомогою штучної обробки виділених ділянок нуклеїнових кислот, наприклад, способами генетичної інженерії. "Рекомбінантним" білком є білок, який кодується гетерологічною (наприклад, рекомбінантною) нуклеїновою кислотою, яка була введена в клітину-хазяя, таку як бактерійна або еукаріотична клітина. Нуклеїнова кислота може бути введена в експресуючому векторі, що має сигнали, здатні викликати експресію білка, що кодується введеною нуклеїновою кислотою, або нуклеїнова кислота може бути інтегрована в хромосому клітини-хазяя. Термін "гетерологічний" по відношенню до нуклеїнової кислоти, поліпептиду або іншому клітинному компоненту вказує, що компонент знаходиться там, де він зазвичай не зустрічається в природі, та/або що він походить з іншого джерела або виду. Термін "очищення" (наприклад, по відношенню до патогену або композиції, що містить патоген) відноситься до процесу видалення компонентів з композиції, присутність яких небажана. Очищення є відносним поняттям і не вимагає, аби всі сліди небажаного компонента були видалені з композиції. У контексті отримання вакцин очищення включає такі способи як центрифугування, діалізація, іонообмінна хроматографія і ексклюзійна хроматографія за розміром, афінне очищення або преципітація. Таким чином, термін "очищений" не вимагає абсолютної чистоти; і він призначений як відносне поняття. Таким чином, наприклад, очищений препарат нуклеїнової кислоти або білка являє собою препарат, який більш збагачений конкретною нуклеїновою кислотою або білком, чим нуклеїнова кислота або білок в середовищі, де вони утворюються, наприклад, в клітині або камері, де відбувається біохімічна реакція. Препарат по суті чистої нуклеїнової кислоти або білка може бути очищений так, що необхідна нуклеїнова кислота присутня в кількості, що становить щонайменше 50 % від загального вмісту нуклеїнової кислоти в препараті. У деяких варіантах по суті чиста нуклеїнова кислота буде присутня в кількості, що становить щонайменше 60 %, щонайменше 70 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 % або щонайменше 95 % або більше від загального вмісту нуклеїнової кислоти або білка в препараті. "Ізольований" біологічний компонент (такий як молекула нуклеїнової кислоти, білок або органела) по суті відділяють або очищають від інших біологічних компонентів клітини організму, в якій компонент зустрічається в природі, таких як інші хромосомні і позахромосомні ДНК і РНК, білки і органели. Нуклеїнові кислоти і білки, які були "ізольовані", включають нуклеїнові кислоти і білки, очищені стандартними способами очищення. Термін також охоплює нуклеїнові кислоти і білки, отримані за допомогою рекомбінантної експресії в клітині-хазяї, а також хімічно синтезовані нуклеїнові кислоти і білки. "Антигеном" є сполука, композиція або речовина, яка стимулює продукцію антитіл та/або Tклітинну відповідь у тварини, включаючи композиції, які ін'єктовані, поглинені або іншим чином введені тварині. Термін "антиген" включає всі споріднені антигенні епітопи. Термін "епітоп" або "антигенна детермінанта" відноситься до ділянки антигену, на який відповідають B- та/або Tклітини. "Домінантні антигенні епітопи" або "домінантні епітопи" являють собою такі епітопи, до яких виробляється функціонально значима імунна відповідь хазяя, наприклад, гуморальна відповідь або T-клітинна відповідь. Таким чином, що стосується захисної імунної відповіді проти патогену, то домінантними антигенними епітопами є такі антигенні залишки, які при розпізнаванні імунною системою хазяя приводять до захисту від захворювання, викликаного патогеном. Термін "T-клітинний епітоп" відноситься до епітопа, який будучи зв'язаним з відповідною молекулою MHC специфічно зв'язується T-клітиною (за допомогою T-клітинного рецептора). "B-клітинним епітопом" є епітоп, який специфічно зв'язується антитілом (або молекулою B-клітинного рецептора). "Ад'ювантом" є засіб, який підсилює вироблення імунної відповіді неспецифічним чином. Звичайні ад'юванти включають суспензії мінералів (галун, гідроксид алюмінію, фосфат алюмінію), на яких адсорбується антиген; емульсії, включаючи емульсії типу "вода у маслі" і "масло у воді" (і їх варіанти, включаючи подвійні емульсії і оборотні емульсії), ліпосахариди, ліпополісахариди, імуностимулюючі нуклеїнові кислоти (такі як олігонуклеотиди CрG), ліпосоми, агоністи Toll-подібного рецептора (зокрема, агоністи TLR2, TLR4, TLR7/8 і TLR9) і різні поєднання таких компонентів. "Імуногенна композиція" являє собою композицію речовини, відповідну для введення людині або тварині (наприклад, в умовах експерименту), яка здатна викликати специфічну імунну відповідь, наприклад, проти патогену, такого як РСВ. Як така імуногенна композиція включає 8 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 один або декілька антигенів (наприклад, поліпептидних антигенів) або антигенних епітопів. Імуногенна композиція також може містити один або декілька додаткових компонентів, здатних викликати або підсилювати імунну відповідь, таких як ексципієнт, носій та/або ад'ювант. В деяких випадках імуногенні композиції вводять для того, щоб викликати імунну відповідь, яка захищає пацієнта від прояву симптомів або станів, що індукуються патогеном. В деяких випадках симптоми або захворювання, що викликаються патогеном, запобігають (або зменшуються або ослабляються) в результаті інгібування реплікації патогену (наприклад, РСВ) після того, як пацієнт піддається дії патогену. У контексті даного опису слід розуміти, що термін імуногенна композиція охоплює композиції, які передбачається вводити пацієнтові або популяції пацієнтів для того, щоб викликати захисну або паліативну імунну відповідь проти РСВ (тобто, композиції вакцин або вакцини). "Імунною відповіддю" є відповідь клітини імунної системи, такої як B-клітина, T-клітина або моноцит, на стимул. Імунна відповідь може бути B-клітинною відповіддю, яка приводить до продукції специфічних антитіл, таких як антигенспецифічні нейтралізуючі антитіла. Імунна відповідь також може бути T-клітинною відповіддю, такою як відповідь CD4+ або відповідь CD8+. В деяких випадках відповідь специфічна для конкретного антигену (тобто, "антигенспецифічна відповідь"). Якщо антиген отриманий з патогену, то антигенспецифічна відповідь є "специфічною для патогену відповіддю". "Захисною імунною відповіддю" є імунна відповідь, яка інгібує шкідливу функцію або активність патогену, знижує інфекцію патогеном або зменшує симптоми (включаючи загибель), які є результатом інфекції патогеном. Захисна імунна відповідь може бути виміряна, наприклад, по інгібуванню реплікації вірусу або утворення бляшок в аналізі зменшення утворення бляшок або аналізі нейтралізації в ELISA, або за допомогою виміру стійкості до зараження патогеном in vivo. Імунна відповідь, зміщена убік "Th1", характеризується присутністю хелперних T-клітин CD4+, які продукують IL-2 і IFN-γ, і отже, секрецією або присутністю IL-2 і IFN-γ. Навпаки, імунна відповідь, зміщена убік "Th2" характеризується переважанням хелперних клітин CD4+, які продукують IL-4, IL-5 і IL-13. "Імунологічно ефективною кількістю" є кількість композиції (зазвичай імуногенної композиції), використовувана для того, щоб викликати імунну відповідь у пацієнта на композицію або на антиген в композиції. Зазвичай необхідним результатом є вироблення специфічної для антигену (наприклад, для патогену) імунної відповіді, яка здатна або вносить вклад до захисту пацієнта від патогену. Проте, аби отримати захисну імунну відповідь проти патогену, може бути потрібним багатократне введення імуногенної композиції. Таким чином, в контексті даного опису термін "імунологічно ефективна кількість" охоплює дробову дозу, яка разом з попередніми або подальшими введеннями робить внесок у досягнення захисної імунної відповіді. Прикметник "фармацевтично прийнятний" вказує, що вказаний об'єкт підходить для введення пацієнтові (наприклад, людині або тварині). У публікації: Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975), описані композиції і препарати (включаючи розчинники), відповідні для фармацевтичної доставки терапевтичних та/або профілактичних композицій, включаючи імуногенні композиції. Термін "модулювати" відносно відповіді, такої як імунна відповідь, означає змінювати або варіювати початок, величину, тривалість або характеристики відповіді. Засіб, який модулює імунну відповідь, змінює щонайменше один з показників: початок, величину, тривалість або характеристики імунної відповіді після його введення, або змінює щонайменше один з показників: початок, величину, тривалість або характеристики, в порівнянні з еталонним засобом. Термін "зменшує" є відносним поняттям, так що засіб зменшує відповідь або стан, якщо показники відповіді або стану кількісно знижуються після введення засобу, або якщо вони знижуються після введення засобу в порівнянні з еталонним засобом. Так само, термін "запобігає" не обов'язково означає, що засіб повністю виключає відповідь або стан, за умови, що щонайменше одна характеристика відповіді або стану виключається. Таким чином, імуногенна композиція, яка зменшує або запобігає інфекції або відповіді, такої як патологічна відповідь, наприклад, підсилюване вакциною вірусне захворювання, може, але не обов'язково, повністю виключати таку інфекцію або відповідь, за умови, що інфекція або відповідь вимірювано зменшуються, наприклад щонайменше приблизно на 50 %, наприклад щонайменше приблизно на 70 % або приблизно на 80 %, або навіть приблизно на 90 % (тобто до 10 % або менше) в порівнянні з інфекцією або відповіддю у відсутність засобу або в порівнянні з еталонним засобом. "Пацієнтом" є живий багатоклітинний організм хребетного. У контексті даного опису пацієнтом може бути експериментальний пацієнт, такий як тварина, відмінна від людини, 9 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, миша, бавовняний хом'як або примат, відмінний від людини. Альтернативно пацієнтом може бути людина. Антигени PreF У природі F-білок РСВ експресується у вигляді одного поліпептидного попередника довжиною 574 амінокислот, званого F0. In vivo F0 олігомеризується в ендоплазматичній сітці і протеолітично процесується протеазою фурином в двох консервативних консенсусних 109 послідовностях для фурина (сайтах розщеплювання фурином), RARR (SEQ ID NO: 15) і 136 RKRR (SEQ ID NO: 16) з утворенням олігомеру, що складається з двох зв'язаних дисульфідом фрагментів. Менший з таких фрагментів називають F2, і він походить з N-кінцевої частини попередника F0. Фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що скорочення F0, F1 і F2 в науковій літературі зазвичай приведені у вигляді F 0, F1 і F2. Крупніший C-кінцевий фрагмент F1 заякорює F-білок в мембрані за допомогою послідовності з гідрофобних амінокислот, яка розташована поряд з 24-амінокислотним цитоплазматичним хвостом. Три димери F2-F1 піддаються асоціації з утворенням зрілого F-білка, який приймає метастабільну предф'юзогенну конформацію ("конформацію перед злиттям"), в якій при контакті з мембраною клітини-мішені ініціюється конформаційна зміна. Конформаційна зміна приводить до експонування гідрофобної послідовності, відомої як пептид злиття, яка піддається асоціації з мембраною клітини-хазяя і стимулює злиття мембрани вірусу або інфікованої клітини з мембраною клітини-мішені. Фрагмент F1 містить щонайменше два гептадних домену, що повторюються, називаних HRA і HRB, які розташовані в безпосередній близькості від пептиду злиття і трансмембранних якірних доменів, відповідно. У конформації, що є перед злиттям, димер F2-F1 утворює структуру глобулярної голівки і стебла, в якій домени HRA знаходяться в сегментованій (витягнутій) конформації в глобулярній голівці. Навпаки, домени HRB утворюють трьохниткове спіральне стебло, що виходить з ділянки голівки. Під час переходу від конформації, що є перед злиттям, в конформацію після злиття домени HRA згортаються і опиняються в безпосередній близькості з доменами HRB з утворенням вузла з шести антипаралельних спіралей. В стані після злиття пептид злиття і трансмембранні домени розташовуються поруч, полегшуючи злиття з мембраною. Хоча приведений вище опис конформації заснований на молекулярному моделюванні кристалографічних даних, структурні відмінності між конформаціями перед злиттям і після злиття можна спостерігати. Не удаючись до кристалографії. Наприклад, можна використовувати електронну мікроскопію, аби розрізняти конформації перед злиттям і після злиття (альтернативно названі предф'юзогенною і ф'юзогенною), як показано в публікаціях Calder із співавторами (Virology, 271: 122-131 (2000)) і Morton із співавторами (Virology, 311: 275-288), які включені в даний опис у вигляді посилання з метою надання технічних інструкцій. Конформацію перед злиттям також можна відрізнити від ф'юзогенної конформації (конформації після злиття) з використанням аналізів асоціації ліпосом, як описано в публікації Connolly із співавторами (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 17903-17908 (2006)), яка також включена в даний опис з метою надання технічних інструкцій. Крім того, конформацію перед злиттям і ф'юзогенну конформацію можна відрізнити з використанням антитіл (наприклад, моноклональних антитіл), які специфічно впізнають конформаційні епітопи, присутні в одній або іншій формі F-білка РСВ: формі перед злиттям або ф'юзогенній формі, але відсутній в другій формі. Такі конформаційні епітопи можуть бути наслідком переважного експонування антигенної детермінанти на поверхні молекули. Альтернативно, конформаційні епітопи можуть виникати в результаті зближення амінокислот, які не є сусідніми в лінійному поліпептиді. Антигени PreF, описані в даній публікації, сконструйовані для стабілізації і підтримки конформації F-білка РСВ, що є перед злиттям, так аби в популяції експресованого білка значна частина популяції експресованого білка була в предф'юзогенній конформації (конформації перед злиттям) (наприклад, як розраховано при структурному та/або термодинамічному моделюванні або як оцінено одним або декількома способами, описаними вище). Стабілізуючі модифікації вводять в нативний (або синтетичний) F-білок, такий як ілюстративний F-білок з послідовністю SEQ ID NO: 2, так аби основні імуногенні епітопи конформації, що є перед злиттям F-білка, зберігалися після введення антигену PreF в клітинне або позаклітинне середовище (наприклад, in vivo, наприклад, після введення пацієнтові). По-перше, гетерологічний стабілізуючий домен може бути поміщений на C-кінці конструкції, аби замінити заякорюючий в мембрані домен поліпептиду F0. Передбачається, що стабілізуючий домен компенсує нестабільність HRB, допомагаючи стабілізувати конформер перед злиттям. У ілюстративних варіантах гетерологічний стабілізуючий домен є доменом мультимеризації білка. Одним особливо переважним прикладом такого домену мультимеризації білка є домен тримеризації. Ілюстративні домени тримеризації укладаються в суперспіраль, яка 10 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стимулює збірку в тримери декількох поліпептидів, що мають такі суперспіралізовані домени. Одним переважним прикладом домену тримеризації є ізолейцинова блискавка. Прикладом домену ізолейцинової блискавки є сконструйований ізолейциновий варіант GCN4 дріжджів, описаний Harbury із співавторами (Science 262: 1401-1407 (1993). Послідовність одного відповідного домену ізолейцинової блискавки показана в SEQ ID NO: 11, хоча в рівній мірі відповідними є варіанти такої послідовності, які зберігають здатність утворювати суперспіралізований стабілізуючий домен. Альтернативні стабілізуючі суперспіралізовані домени тримеризації включають: TRAF2 (GENBANK®, номер доступу Q12933 [gi:23503103]; амінокислоти 299-348); тромбоспондин 1 (номер доступу PO7996 [gi:135717]; амінокислоти 291314); матрилін-4 (номер доступу 095460 [gi: 14548117]; амінокислоти 594-618; CMP (матрилін-1) (номер доступу NP 002370 [gi:4505111]; амінокислоти 463-496; HSF1 (номер доступу AAX42211 [gi:61362386]; амінокислоти 165-191; і кубулін (номер доступу NP_001072 [gi:4557503]; амінокислоти 104-138. Передбачається, що відповідний домен тримеризації приводить до збірки значної частини експресованого білка в тримери. Наприклад щонайменше 50 % рекомбінантного поліпептиду PreF, що має домен тримеризації, збиратиметься в тример {наприклад, як оцінено з використанням AFF-MALS). Зазвичай щонайменше 60 %, переважніше щонайменше 70 % і найпереважніше щонайменше приблизно 75 % або більш експресованного поліпептиуа існує у вигляді тримеру. Аби ще більше стабілізувати HRB, залишок лейцину, що знаходиться в положенні 512 (відносно нативного білка F0) PreF, може бути замінений лізином (L482K ілюстративного поліпептиду антигену PreF з послідовністю SEQ ID NO: 6). Така заміна покращує періодичність гідрофобних залишків в суперспіралі. Так само, лізин може бути доданий після амінокислоти в положенні 105. По-друге, pep27 може бути видалений. Аналіз структурної моделі F-білка РСВ в стані перед злиттям свідчить, що pep27 утворює велику природну петлю між F1 і F2. Така петля не вносить вклад до стабілізації стану перед злиттям і віддаляється після розщеплювання нативного білка фурином. По-третє, можуть бути делетовані один або обидва мотива розщеплювання фурином. В разі такої конструкції пептид злиття не відщеплюється від F2, запобігаючи вивільненню з глобулярної голівки конформера, що існує перед злиттям, і доступність для розташованих рядом мембран. Взаємодія між пептидом злиття і межею контакту мембран, як передбачають, є основною проблемою, зв'язаною з нестабільністю стану перед злиттям. Під час процесу злиття взаємодія між пептидом злиття і мембраною-мішенню наводить до експонування пептиду злиття із структури глобулярної голівки, підсилюючи нестабільність стану перед злиттям і укладання в конформер, характерний для стану після злиття. Така зміна конформації забезпечує процес злиття з мембраною. Видалення одного або обох сайтів розщеплювання фурином імовірно перешкоджає доступності мембрани для N-кінцевої частини пептиду злиття, стабілізуючи стан, що є перед злиттям. Таким чином, в ілюстративних варіантах, описаних в даній публікації, видалення мотивів розщеплювання фурином приводить до утворення антигену PreF, який містить інтактний пептид злиття, який не відщеплюється фурином під час або після процесингу і збірки. Необов'язково також може бути видалений щонайменше один нефуриновий сайт розщеплювання, наприклад, в результаті заміни однієї або декількох амінокислот. Наприклад, експериментальні дані свідчать, що в умовах, сприятливих для розщеплювання деякими металопротеїназами, антиген PreF може бути розщеплений в ділянці амінокислот 110-118 (наприклад, в результаті розщеплювання, що відбувається між амінокислотами 112 і 113 антигену PreF; між лейцином в положенні 142 і гліцином в положенні 143 еталонного поліпептида F-білка з послідовністю SEQ ID NO: 2). Відповідно, модифікація однієї або декількох амінокислот в даній ділянці може зменшувати розщеплювання антигену PreF. Наприклад, лейцин в положенні 112 може бути замінений іншою амінокислотою, такою як ізолейцин, глутамін або триптофан (як показано в ілюстративному варіанті SEQ ID NO: 20). Альтернативно або додатково гліцин в положенні 113 може бути замінений серином або аланіном. Необов'язково антиген PreF може містити одну або декілька модифікацій, які змінюють картину або статус глікозилування (наприклад, завдяки збільшенню або зменшенню долі молекул, глікозилованних в одному або декількох сайтах глікозилування, присутніх в нативному поліпептиді F-білка. Наприклад, нативний поліпептид F-білка з послідовністю SEQ ID NO: 2 імовірно глікозилован в положеннях амінокислот 27, 70 і 500 (відповідних положенням 27, 70 і 470 ілюстративного антигену PreF з послідовністю SEQ ID NO: 6). У одному варіанті модифікацію вводять в ділянки сайту глікозилування в положенні амінокислоти 500 (що 11 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 позначається N470). Наприклад, сайт глікозилування може бути видалений заміною амінокислотою, такою як глутамін (Q), що вводиться замість аспарагіну в положенні 500 (еталонної послідовності, яке відповідає при вирівнюванні положенню 470 ілюстративного антигену PreF). Переважно вводять модифікацію, яка підвищує ефективність глікозилування в даному сайті глікозилування. Приклади відповідних модифікацій включають наступні амінокислотні послідовності в положеннях 500-502: NGS; NKS; NGT; NKT. Цікаво що, як було виявлено, модифікації в такому сайті глікозилування, які приводять до посиленого гликозилуванню, також приводять до значимо підвищеного отриманню PreF. Таким чином, в деяких варіантах антигени PreF мають модифікований сайт глікозилування в положенні, відповідному амінокислоті 500 в еталонній послідовності PreF (SEQ ID NO: 2), наприклад, в положенні 470 антигену PreF, показаного у вигляді послідовності SEQ ID NO: 6. Відповідні модифікації включають послідовності: NGS; NKS; NGT; NKT в амінокислотах, відповідних положенням 500-502 еталонної послідовності поліпептиду F-білка. Амінокислота ілюстративного варіанту, який включає модифікацію "NGT", приведена в послідовності SEQ ID NO: 18. Фахівець в даній галузі легко може визначити схожі модифікації в разі відповідних модифікацій NGS, NKS і NKT. Такі модифікації переважно поєднують з будь-якою із стабілізуючих мутацій, описаних в даній публікації (наприклад, гетерологічною суперспіраллю, такою як ізолейцинова блискавка, доменом та/або модифікацією в гідрофобній ділянці та/або видаленням pep27 та/або видаленням сайту розщеплювання фурином, та/або видаленням нефуринового сайту розщеплювання, та/або видаленням нефуринового сайту розщеплювання). Наприклад, в одному конкретному варіанті антиген PreF містить заміну, яка виключає нефуриновий сайт розщеплювання, і модифікацію, яка збільшує глікозилування. Приклад послідовності наведений в SEQ ID NO: 22 (вказаний ілюстративний варіант включає модифікацію "NGT" і заміну глутаміном амінокислоти лейцину в положенні 112). У загальнішому сенсі будь-яку із стабілізуючих модифікацій, описаних в даній публікації, наприклад, додавання гетерологічного стабілізуючого домену, такого як суперспіраль (наприклад, домен ізолейцинової блискавки), переважно розташовану на C-кінці розчинного антигену PreF; модифікацію залишку, таку як заміну лейцину на лізин, в гідрофобному домені HRB; видалення pep27; видалення одного або обох мотивів розщеплювання фурином; видалення нефуринового сайту розщеплювання; та/або модифікацію сайту глікозилування, можна використовувати у поєднанні з будь-якою однією або декількома (або аж до всіх будьяких необхідних поєднань) іншими стабілізуючими модифікаціями. Наприклад, гетерологічну суперспіраль (або інший гетерологічний стабілізуючий домен) можна використовувати окремо або у поєднанні з будь-якою з наступних модифікацій: модифікацією в гідрофобній ділянці та/або видаленням pep27 та/або видаленням сайту розщеплювання фурином, та/або видаленням нефуринового сайту розщеплювання, та/або видаленням нефуринового сайту розщеплювання. У деяких конкретних варіантах антиген PreF містить C-кінцевий суперспіралізований домен (ізолейцинову блискавку), стабілізуючу заміну в гідрофобному домені HRB і видалення одного або обох сайтів розщеплювання фурином. Такий варіант включає інтактний пептид злиття, який не видаляється при розщеплюванні фурином. У одному конкретному варіанті антиген PreF також містить модифікований сайт глікозилування в положенні амінокислоти 500. Нативний поліпептид F-білка може бути вибраний з будь-якого F-білка штаму РСВ A або РСВ B або з їх варіантів (які визначені вище). У деяких ілюстративних варіантах поліпептид Fбілка являє собою F-білок, представлений послідовністю SEQ ID NO: 2. Аби полегшити розуміння даного опису, всі положення амінокислотних залишків, незалежно від штаму приведені відносно (тобто, положення залишку амінокислоти відповідає) положення амінокислоти в ілюстративному F-білці. Порівнянні положення амінокислот в будь-якому іншому штамі РСВ A або B легко можуть бути визначені фахівцями в даній галузі за допомогою вирівнювання амінокислотних послідовностей вибраного штаму РСВ з ілюстративною послідовністю з використанням легко доступних і добре відомих алгоритмів вирівнювання (таких як BLAST, наприклад, з використанням параметрів за умовчанням). Багаточисельні додаткові приклади поліпептидів F-білка з різних штамів РСВ описані в публікації WO2008114149 (яка включена в даний опис у вигляді посилання з метою приведення додаткових прикладів послідовностей F- і G-білків РСВ). Додаткові варіанти можуть виникати в результаті дрейфу генів або можуть бути отримані штучно з використанням сайт-специфічного або випадкового мутагенезу або в результаті рекомбінації двох або більш раніше існуючих варіантів. Такі додаткові варіанти також є застосовними в контексті антигенів PreF (і PreF-G), описаних в даній публікації. При виборі доменів F2 і F1 F-білка фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що немає строгої 12 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 необхідності в тому, аби включати повний домен F2 та/або F1. Зазвичай конформаційні розрахунки мають значення при виборі підпослідовності (або фрагмента) домену F2. Таким чином, домен F2 зазвичай містить частину домену F2, який сприяє збірці і стабільності поліпептиду. У деяких ілюстративних варіантах домен F2 включає амінокислоти 26-105. Проте також можливі варіанти, що мають невеликі по довжині модифікації (в результаті додавання або делеції однієї або декількох амінокислот). Зазвичай вибирають і конструюють щонайменше підпослідовність (або фрагмент) домену F1, аби підтримати стабільну конформацію, яка включає імунодомінантні епітопи F-білка. Наприклад, зазвичай потрібний вибір підпослідовності поліпептидного домену F1, який містить епітопи, впізнанні нейтралізуючими антитілами, в ділянках амінокислот 262-275 (нейтралізація палцівізумабом) і 423-436 (мАт ch101F Centocor). Крім того, бажане включення T-клітинних епітопів, наприклад, в ділянці амінокислот 328-355. Частіше всього у вигляді однієї безперервної частини субодиниці F1 (наприклад, що охоплює амінокислоти 262-436), але епітопи можуть міститися в синтетичній послідовності, яка включає такі імунодомінантні епітопи у вигляді переривистих елементів, зібраних в стабільну конформацію. Таким чином, поліпептид домену F1 містить щонайменше приблизно амінокислоти 262-436 поліпептиду F-білка РСВ. У одному не обмежуючому прикладі, пропонованому в даному описі, домен F1 містить амінокислоти 137-516 нативного поліпептиду F-білка. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що можна використовувати додаткові коротші підпослідовності на розсуд фахівця-практика. При виборі підпослідовності домену F2 або F1 (або як обговорюватиметься нижче відносно G-білкового компонента деяких антигенів PreF-G) на додаток до оцінки конформації може бути бажано вибрати послідовності (наприклад, варіанти, підпослідовності і тому подібне) на основі включення додаткових імуногенних епітопів. Наприклад, додаткові T-клітинні епітопи можуть бути ідентифіковані з використанням якірних мотивів або іншими способами, такими як використання нейронної сітки або поліноміальні визначення, відомі в даній галузі, див., наприклад, RANKPEP (доступний на сайті в Інтернеті: mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html); ProPredI (доступний на сайті в Інтернеті: imtech.res.in/raghava/propredl/index.html); Bimas (доступний на сайті в Інтернеті: www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html); і SYFPEITH (доступний на сайті в Інтернеті: syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm). Наприклад, алгоритми використовують для визначення "порогу зв'язування" пептидів і для їх вибору з оцінками, які свідчать про високу вірогідність їх зв'язування з MHC або антитілами з певною афінністю. Алгоритми засновані або на впливі на зв'язування MHC конкретної амінокислоти в конкретному положенні, або на впливі на зв'язування антитіл конкретної амінокислоти в конкретному положенні, або на впливі на зв'язування конкретної заміни в пептиді, що містить мотив. У контексті імуногенного пептиду "консервативним залишком" є залишок, який зустрічається із значно вищою частотою, ніж можна чекати при випадковому розподілі, в конкретному положенні в пептиді. Якірні залишки є консервативними залишками, які забезпечують точку контакту з молекулою MHC. T-клітинні епітопи, ідентифіковані такими прогностичними способами, можуть бути підтверджені завдяки виміру їх зв'язування із специфічним білком MHC і на основі їх здатності стимулювати T-клітини в разі представлення в контексті білка MHC. Переважно антигени PreF (включаючи антигени PreF-G, які обговорюються нижче) містять сигнальний пептид, відповідний системі експресії, наприклад, сигнальний пептид ссавця або вірусу, такий як нативна сигнальна послідовність F0 РСВ (наприклад, амінокислоти 1-25 послідовностей SEQ ID NO: 2 або амінокислоти 1-25 послідовностей SEQ ID NO: 6). Зазвичай сигнальний пептид вибирають так, щоб він був сумісний з клітинами, вибраними для експресії рекомбінантів. Наприклад, сигнальний пептид (такий як бакуловірусний сигнальний пептид або сигнальний пептид мелітину, може бути замінений для експресії в клітинах комах. Відповідні сигнальні пептиди рослин відомі в даній галузі, якщо переважна система експресії рослин. У даній галузі відомі багаточисельні приклади сигнальних пептидів (див., наприклад, Zhang and Henzel, Protein Sci., 13: 2819-2824 (2004), де описані багаточисельні сигнальні пептиди людини), які систематизовані, наприклад, в базі даних про сигнальні пептиди SPdb, в яку включені сигнальні послідовності архебактерії, прокаріоти і еукаріоти (http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/). Необов'язково будь-який з раніше вказаних антигенів може містити додаткову послідовність або мітку, таку як His-мітка, для полегшення очищення. Необов'язково антиген PreF може містити додаткові імуногенні компоненти. У деяких особливо переважних варіантах антиген PreF включає антигенний компонент G-білка РСВ. Приклади химерних білків, що мають PreF і G-компонент, включають PreF_V1 (представлений послідовностями SEQ ID NO: 7 і 8) і PreF_V2 (представлений послідовностями SEQ ID NO: 9 і 10). 13 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У антигенах PreF-G антигенну частину G-білка (наприклад, укороченого G-білка, такого як білок, що складається з амінокислотних залишків 149-229) додають до C-кінця конструкції. Зазвичай G-білковий компонент зв'язують з компонентом F-білка через гнучку лінкерну послідовність. Наприклад, в ілюстративній конструкції PreF_V1 G-білок зв'язаний з компонентом PreF лінкером -GGSGGSGGS- (SEQ ID NO: 14). У конструкції PreF_V2 лінкер є коротшим. Замість наявності лінкера -GGSGGSGGS- (SEQ ID NO: 14) PreF_V2 містить 2 гліцини (-GG-) як лінкер. В разі присутності домен поліпептиду G-білка може містити весь або частину G-білка, вибраного з будь-якого штаму РСВ A або РСВ B. У деяких ілюстративних варіантах G-білок являє собою G-білок, представлений послідовністю SEQ ID NO: 4 (або на 95 % ідентичний йому). Додаткові приклади відповідних послідовностей G-білка можна знайти в публікації WO2008114149 (яка включена в даний опис у вигляді посилання). Поліпептидний компонент G-білка вибирають так, щоб він містив щонайменше підпослідовність (або фрагмент) G-білка, який зберігає імунодомінантний T-клітинний епітоп(пи), наприклад, в ділянці амінокислот 183-197, наприклад, фрагменти G-білка, які включають амінокислоти 151-229, 149-229 або 128-229 нативного G-білка. У одному ілюстративному варіанті поліпептид G-білка являє собою підпослідовність (або фрагмент) нативного поліпептиду G-білка, який включає все або частину амінокислотних залишків 149-229 нативного поліпептиду G-білка. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що також можна використовувати довші або коротші частини G-білка, за умови, що вибрана частина конформаційно не дестабілізує або не порушує експресію, фолдинг або процесинг антигена PreF-G. Необов'язково домен G-білка містить амінокислотну заміну в положенні 191, яке, як було показано раніше, залучене в зниження та/або запобігання посиленому захворюванню, що характеризується еозинофілією, асоційованого з інактивованими формаліном РСВ-вакцинами. Детальний опис властивостей G-білків, що зустрічаються в природі і мають заміни (N191A), можна знайти, наприклад, в публікації патенту США № 2005/0042230, яка включена в даний опис у вигляді посилання. Наприклад, що стосується вибору послідовностей, відповідних штамам, що зустрічаються в природі, то один або декілька доменів можуть відповідати по послідовності штаму РСВ A або B, таким як звичайні лабораторні ізоляти, що позначаються A2 або Long, або будь-який інший штам, що зустрічається в природі, або ізолят (які описані в згадуваній вище публікації WO2008114149). Окрім таких, що зустрічаються в природі і виділених варіантів також можна використовувати сконструйовані варіанти, які володіють схожістю послідовності з вищезгаданими послідовностями, в контексті антигенів PreF (включаючи PreF-G). Фахівцям вданій галузі буде зрозуміло, що схожість між поліпептидами антигена PreF (і полінуклеотидними послідовностями, які описані нижче), як і в разі поліпептидів (і нуклеотидних послідовностей, загалом), може бути виражено у вигляді схожості між послідовностями, інакше званого ідентичністю послідовностей. Ідентичність послідовностей часто вимірюють у вигляді відсотках ідентичності (або схожість); чим вище відсоток, тим більше схожі первинні структури двох послідовностей. Загалом, чим більше схожість первинних структур двох амінокислотних (або полінуклеотидних) послідовностей, тим більше схожі структури вищого порядку, що утворюються в результаті фолдинга і складання. Варіанти поліпептидних (і полінуклеотидних) послідовностей PreF зазвичай мають одну або невелику кількість амінокислотних делецій, додавань або замін, але проте можуть мати дуже високий відсоток загальних амінокислотних і зазвичай їх полінуклеотидних послідовностей. Більш того, варіанти зберігають структурні і, отже, конформаційні властивості еталонних послідовностей, описаних в даній публікації. Способи визначення ідентичності послідовностей добре відомі в даній галузі і застосовні до поліпептидів антигенів PreF, а також нуклеїнових кислот, які їх кодують (наприклад, які описані нижче). Різні програми і алгоритми вирівнювання описані в: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988; and Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988. У публікації Altschul із співавторами (Nature Genet. 6: 119, 1994) приведений детальний розгляд способів вирівнювання послідовностей і обчислення гомології. Основний засіб пошуку, заснований на локальних вирівнюваннях NCBI (BLAST) (Altschul співавторами (J. Mol. Biol. 215: 403, 1990)) доступно з декількох джерел, включаючи Національний центр біотехнологічної інформації (NCBI, Bethesda, MD), і в Інтернеті, для використання стосовно програм аналізу послідовностей blastp, blastn, blastx, tblastn і tblastx. Опис того, як визначити ідентичність послідовностей з використанням такої програми, доступно на веб-сайті NCBI в Інтернеті. В деяких випадках антигени PreF мають одну або декілька амінокислотних модифікацій в 14 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порівнянні з амінокислотною послідовністю штаму, що зустрічається в природі, з якого вона отримана (наприклад, на додаток до вказаних вище стабілізуючих модифікацій). Такі відмінності можуть являти собою додавання, делецію або заміну однієї або декількох амінокислот. Варіант зазвичай відрізняється не більше ніж приблизно на 1 % або 2 %, або 5 %, або 10 %, або 15 %, або 20 % амінокислотних залишків. Наприклад, варіант поліпептидної послідовності антигена PreF (включаючи PreF-G) може містити 1 або 2, або до 5, або приблизно до 10, або приблизно до 15, або приблизно до 50, або приблизно до 100 амінокислотних відмінностей в порівнянні з ілюстративними поліпептидними послідовностями антигенів PreF SEQ ID NO: 6, 8, 10, 18, 20 і 22. Таким чином, варіант в контексті F- або G-білка РСВ або антигена PreF (включаючи антиген PreF-G), зазвичай має щонайменше 80 % або 85 %, частіше щонайменше приблизно 90 % або більше, наприклад, 95 % або навіть 98 % або 99 % ідентичність послідовності з еталонним білком, наприклад, з еталонними послідовностями, показаними в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20 та/або 22, або будь-якими ілюстративними антигенами PreF, описаними в даній публікації. Додатковими варіантами, включеними як відмітна ознака даного винаходу, є антигени PreF (включаючи антигени PreF-G), які містять всю або частину нуклеотидної або амінокислотної послідовності, вибраної з варіантів, що зустрічаються в природі, описаних в WO2008114149. Додаткові варіанти можуть виникати в результаті дрейфу генів або можуть бути отримані штучно з використанням сайт-специфічного або випадкового мутагенезу, або в результаті рекомбінації двох або більш раніше існуючих варіантів. Такі додаткові варіанти також застосовні в контексті антигенів PreF (і PreF-G), описаних в даній публікації. Наприклад, модифікація може являти собою заміну однієї або декількох амінокислот (наприклад, двох амінокислот, трьох амінокислот, чотирьох амінокислот, п'яти амінокислот, приблизно до десяти амінокислот або більше), які не змінюють конформацію або імуногенні епітопи отриманого в результаті антигену PreF. Альтернативно або додатково модифікація може включати делецію однієї або декількох амінокислот та/або додавання однієї або декількох амінокислот. Дійсно, за бажання один або декілька поліпептидних доменів можуть являти собою синтетичний поліпептид, який не відповідає жодному окремому штаму, але містить підпослідовності компонентів з багатьох штамів або навіть з консенсусної послідовності, обчисленої в результаті вирівнювання безлічі штамів поліпептидів вірусу РСВ. У деяких варіантах один або декілька поліпептидних доменів модифікують додаванням амінокислотної послідовності, яка складає мітку, яка полегшує подальшу обробку або очищення. Така мітка може бути антигенною або епітопною міткою, ферментативною міткою або полігістидиновою міткою. Зазвичай мітка розташована на одному або на іншому кінці білка, наприклад, на C-кінці або N-кінці антигену або білка злиття. Нуклеїнові кислоти, які кодують антигени PREF Інший аспект даного винаходу стосується рекомбінантних нуклеїнових кислот, які кодують антигени PreF, які описані вище. Більш точно такі нуклеїнові кислоти кодують поліпептиди, які включають розчинний пептидний антиген F-білка, який містить домен F2 і домен F1 поліпептиду F-білка РСВ, який має щонайменше одну модифікацію, вибрану з: (i) додавання амінокислотної послідовності, що містить гетерологічний домен тримеризації; (ii) делеції щонайменше одного сайту розщеплювання фурином; (iii) делеції щонайменше одного нефуринового сайту розщеплювання; (iv) делеції однієї або декількох амінокислот домену pep27; і (v) щонайменше, однієї заміни або додавання гідрофільної амінокислоти в гідрофобний домен позаклітинного домену F-білка. Необов'язково такий полінуклеотид кодує антиген PreF з модифікацією в сайті глікозилування. Природа і структурні особливості таких поліпептидів детально описані вище. Фахівець в даній галузі легко зможе визначити нуклеотидні послідовності, які кодують будь-яку і всі описані поліпептидні послідовності, на основі приведених в даному описі інструкцій, включаючи приклади послідовностей, приведені в списку послідовностей, і включені іншим чином (наприклад, завдяки включенню у вигляді посилання) в даний опис. У деяких варіантах рекомбінантні нуклеїнові кислоти оптимізовані по кодонах для експресії у вибраній прокаріотичній або еукаріотичній клітині-хазяї. Наприклад, послідовності SEQ ID NO: 5, 12, 17, 19 і 21 є різними ілюстративними не обмежуючими прикладами послідовностей, які кодують антиген PreF, які оптимізовані по кодонах для експресії в клітинах ссавців, наприклад, CHO. Аби полегшити реплікацію і експресію, нуклеїнові кислоти можуть бути включені у вектор, такий як прокаріотичний або еукаріотичний експресуючий вектор. Клітини-хазяї, що містять нуклеїнові кислоти, що кодують рекомбінантний антиген PreF, також є відмітною ознакою даного винаходу. Переважні клітини-хазяї включають прокаріотичні (тобто, бактерійні) клітини-хазяї, такі як E. coli, а також багаточисельні еукаріотичні клітини-хазяї, включаючи клітини грибів (наприклад, дріжджів), клітини комах і клітини ссавців (такі як клітини CHO, VERO і HEK293). Аби полегшити реплікацію і експресію, нуклеїнові кислоти можуть бути включені у вектор, 15 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такий як прокаріотичний або еукаріотичний експресуючий вектор. Хоча нуклеїнові кислоти, описані в даній публікації, можуть бути включені в будь-який з безлічі векторів (включаючи, наприклад, бактерійні плазміди; фагову ДНК; бакуловірус; дріжджові плазміди; вектори, отримані в результаті комбінування плазмід і фагової ДНК, вірусну ДНК, таку як вірус осповакцини, аденовірус, поксвірус птиць, вірус псевдосказу, аденовірус, аденоасоційований вірус, ретровіруси і багато інших), найчастіше вектором буде експресуючий вектор, відповідний для утворення поліпептидних продуктів експресії. У експресуйочому векторі нуклеїнова кислота, що кодує антиген PreF, зазвичай розташована поблизу і в такій же орієнтації, як і відповідна послідовність регуляції транскрипції (промотор і, необов'язково, один або декілька енхансерів) для управління синтезом мРНК. Тобто полінуклеотидна послідовність, що представляє інтерес, оперативно зв'язана з відповідною послідовністю регуляції транскрипції. Приклади таких промоторів включають: негайний ранній промотор CMV, LTR або промотор SV40, промотор поліедрину бакуловірусу, промотор lac або trp E. coli, промотор фага T7 і промотор PL лямбда і інші промотори, які, як відомо, контролюють експресію генів в прокаріотичних або еукаріотичних клітинах або їх вірусах. Експресуючий вектор зазвичай також містить сайт зв'язування рибосоми для ініціації трансляції і термінатор транскрипції. Вектор необов'язково містить відповідні послідовності для посилення експресії. Крім того, експресуючі вектори необов'язково містять один або декілька селектованих маркерних генів, що забезпечують фенотипічну ознаку для селекції трансформованих клітин-хазяїв, таких як ген дигідрофолатредуктази або резистентності до неоміцину в разі культури еукаріотичних клітин або таких як гени резистентності до канаміцину, тетрацикліну або ампіциліну в разі E. coli. Експресуючий вектор також може містити додаткові елементи експресії, наприклад, для підвищення ефективності трансляції. Такі сигнали можуть включати, наприклад, кодон ініціації ATG і довколишні послідовності. В деяких випадках, наприклад, кодон ініціації трансляції і асоційовані елементи послідовності вбудовують у відповідний експресуючий вектор одночасно з полінуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес (наприклад, нативний стартовий кодон). У таких випадках додаткові сигнали регуляції трансляції не потрібні. Проте в тих випадках, коли вбудовують послідовність, що лише кодує поліпептид, або її частину, то забезпечують екзогенні сигнали регуляції трансляції, включаючи кодон ініціації ATG, для трансляції нуклеїнової кислоти, що кодує антиген PreF. Кодон ініціації поміщають в правильній рамці зчитування, аби гарантувати трансляцію полінуклеотидної послідовності, що представляє інтерес. Екзогенні транскрипційні елементи і кодони ініціації можуть мати різне походження, як природне, так і синтетичне. При необхідності ефективність експресії може бути додатково підвищена за рахунок включення енхансерів, відповідних для використовуваної клітинної системи (Scharf et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-62; Bitter et al. (1987) Methods in Enzymol. 153: 516-544). В деяких випадках нуклеїнова кислота (така як вектор), яка кодує антиген PreF, включає один або декілька додаткових елементів послідовності, вибраних для збільшення та/або оптимізації експресії нуклеїнової кислоти, кодуючої PreF, при введенні в клітину-хазяя. Наприклад, в деяких варіантах нуклеїнові кислоти, які кодують антиген PreF, включають інтронну послідовність, таку як послідовність інтрону вірусу герпесу 5 людини (див., наприклад, SEQ ID NO: 13). Інтрони, як неодноразово було показано, підсилюють експресію гомологічних і гетерологічних нуклеїнових кислот, коли вони відповідним чином розташовані в рекомбінантній конструкції. Інший клас послідовностей, що підсилюють експресію, включає епігенетичний елемент, такий як ділянка прикріплення до матриксу (або MAR) або подібний епігенетичний елемент, наприклад, елементи STAR (наприклад, такі як елементи STAR, описані Otte із співавторами (Biotechnol. Prog. 23: 801-807, 2007). Не вдаючись до теорії, вважають, що MAR опосередкують заякорювання послідовності ДНК-мішені в ядерному матриксі, утворюючи домени петель хроматину, які виступають з гетерохроматинового кора. Хоча MAR не містять жодної явної консенсусної або впізнанної послідовності, їх найбільш постійною ознакою, мабуть, є високий загальний вміст A/T і переважання основ C в одній нитці. Такі ділянки, мабуть, утворюють зігнуті вторинні структури, які можуть бути схильні до розділення ниток, і можуть включати елемент розкручування кора (CUE), який може служити як точка нуклеації для розділення ниток. Декілька простих AT-багатих мотивів послідовності було асоційовано з послідовностями MAR: наприклад, A-бокс, T-бокс, мотиви розкручування ДНК, сайти зв'язування SATB1 (H-бокс, A/T/C25) і консенсусні сайти топоізомерази II хребетних або Drosophila. Приклади послідовностей MAR описані в опублікованій заявці на видачу патенту США № 20070178469 і в міжнародній заявці на видачу патенту № WO 02/074969 (які включені в даний опис у вигляді посилання). Додаткові послідовності MAR, які можна використовувати для посилення експресії нуклеїнової кислоти, що кодує антиген PreF, включають MAR лізоциму 16 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 курей, MARp1-42, MARp1-6, MARp1-68 і MARpx-29, описані Girod із співавторами (Nature Methods, 4: 747-753, 2007) (розкриті в GenBank з номерами доступу EA423306, DI107030, DI106196, DI107561 і DI106512, відповідно). Фахівцеві буде зрозуміло, що експресію можна додатково модулювати, за допомогою відбору MAR, які забезпечують проміжний рівень посилення, як повідомлялося для MAR 1-9. При необхідності альтернативні послідовності MAR для збільшення експресії антигену PreF можуть бути ідентифіковані в результаті пошуку в базах даних про послідовності, наприклад, з використанням комп'ютерної програми, такий як MARFinder (доступної на веб-сайті futuresoft.org/MarFinder), SMARTest (доступної на веб-сайті genomatix.de) або SMARScan I (Levitsky et al., Bioinformatics 15: 582-592, 1999). У деяких варіантах MAR вводять (наприклад, трансфікують) в клітину-хазяя в тій же нуклеїновій кислоті (наприклад, векторі), що і послідовність, що кодує антиген PreF. У альтернативному варіанті MAR вводять в окремій нуклеїновій кислоті (наприклад, in trans), і він необов'язково може коінтегрувати з полінуклеотидною послідовністю, що кодує антиген PreF. Приклади способів, достатні як керівництво для фахівця в даній галузі при отриманні нуклеїнових кислот рекомбінантного антигену PreF, можна знайти в публікаціях: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (and Supplements to 2003); and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999. Приклади нуклеїнових кислот, які кодують поліпептиди антигену PreF, представлені в SEQ ID NO: 5, 7, 9, 12, 13, 17, 19 і 21. Варіанти, які містять модифікацію в сайті глікозилування, наприклад, в амінокислоті, відповідній положенню 500 в послідовності SEQ ID NO: 2, можуть бути отримані в результаті зміни (наприклад, мутації) нуклеотидів в області положень 1408-1414 (в порівнянні, наприклад, з полінуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 12, наприклад, SEQ ID NO: 17 і 21). Відповідні послідовності нуклеотидів для кодування варіантів по глікозилуванню {наприклад, які підвищують ефективність глікозилування) включають: aacgggt, aacaagt, aacggga і aacaaga. Також можливі альтернативні послідовності, такі як cagcagt, які виключають сайт глікозилування. Додаткові варіанти можуть бути отримані при збірці аналогічних поліпептидних послідовностей F- і G-білків, вибраних з будь-яких відомих (або згодом відкритих) штамів РСВ, наприклад, як описано в WO2008114149. Додаткові варіанти послідовності, які володіють ідентичністю послідовності з ілюстративними варіантами, можуть бути отримані фахівцями в даній галузі. Як правило, варіанти нуклеїнових кислот кодуватимуть поліпептиди, які відрізняються не більше ніж на 1 % або 2 %, або 5 %, або 10 %, або 15 %, або 20 % по амінокислотних залишках. Тобто, кодовані поліпептиди володіють щонайменше 80 % або 85 %, переважніше щонайменше приблизно 90 % або більше, наприклад 95 % або навіть 98 % або 99 % ідентичністю послідовностей. Фахівцям в даній галузі буде відразу ж зрозуміло, що полінуклеотидні послідовності, що кодують поліпептиди PreF, самі по собі можуть мати меншу ідентичність послідовностей унаслідок надмірності генетичного коду. В деяких випадках антигени PreF мають одну або декілька модифікацій амінокислот в порівнянні з амінокислотною послідовністю штаму, що зустрічається в природі, з якого він отриманий (наприклад, на додаток до вказаних вище стабілізуючих модифікацій). Такі відмінності можуть являти собою додавання, делецію або заміну одного або декількох нуклеотидів або амінокислот, відповідно. Варіант зазвичай відрізняється не більше ніж приблизно на 1 % або 2 %, або 5 %, або 10 %, або 15 %, або 20 % залишків нуклеотидів. Наприклад, нуклеїнова кислота варіанту антигену PreF (включаючи PreF-G) може містити 1 або 2, або до 5, або приблизно до 10, або приблизно до 15, або приблизно до 50, або приблизно до 100 відмінностей нуклеотидів в порівнянні з ілюстративними нуклеїновими кислотами антигену PreF з послідовностями SEQ ID NO: 5, 7, 9, 12, 13, 17, 19 та/або 21. Таким чином, варіант в контексті F- або G-білка РСВ або нуклеїнової кислоти антигену PreF (включаючи антиген PreF-G антиген) зазвичай володіє щонайменше 80 % або 85 %, переважніше щонайменше приблизно 90 % або більше, наприклад 95 % або навіть 98 % або 99 % ідентичністю послідовності з еталонною послідовністю, наприклад, еталонними послідовностями, показаними в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, 17, 19 та/або 21, або будь-якою іншою з ілюстративних нуклеїнових кислот антигену PreF, описаних в даній публікації. Додаткові варіанти, включені як відмітна ознака даного винаходу, являє собою антигени PreF (включаючи антигени PreF-G), які включають всю або частину нуклеотидної послідовності, вибраної з варіантів, що зустрічаються в природі, описаних в WO 2008114149. Додаткові варіанти можуть виникати в результаті дрейфу генів або можуть бути отримані штучно з використанням сайт-специфічного або випадкового мутагенезу або в результаті рекомбінації двох або більш раніше існуючих варіантів. Такі додаткові варіанти також є 17 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідними в контексті антигенів PreF (і PreF-G), описаних в даній публікації. Окрім варіантів нуклеїнових кислот, описаних раніше, також можна використовувати нуклеїнові кислоти, які гібридизуються з однією або декількома ілюстративними нуклеїновими кислотами, представленими в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, 17, 19 та/або 21, для кодування антигенів PreF. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що на додаток до виміру ідентичності послідовностей в %, обговорюваному вище, іншим показником схожості послідовностей між двома нуклеїновими кислотами є здібність до гібридизації. Чим більш схожими є послідовності двох нуклеїнових кислот, тим більше жорсткими є умови, в яких вони будуть гібридизуватися. Жорсткість умов гібридизації залежить від послідовності і різна при різних параметрах довкілля. Таким чином, умови гібридизації, що приводять до конкретної міри жорсткості, варіюватиме залежно від природи вибраного способу гібридизації і від складу і довжини гібридизуючих послідовностей нуклеїнових кислот. Загалом, температура гібридизації і іонна сила (особливо + + концентрація Na та/або Mg ) буфера для гібридизації визначатимуть жорсткість гібридизації, хоча кількість промивань також впливають на жорсткість. Загалом, умови жорсткості вибирають так, щоб були приблизно на 5 °C-20 °C нижче, ніж температура плавлення (T m) для конкретної послідовності при певній іонній силі і pH. T m означає температуру (при певній іонній силі і pH), при якій 50 % послідовності-мішені гібридизуються з точно співпадаючим зондом. Умови для гібридизації нуклеїнових кислот і розрахунок жорсткості можна знайти, наприклад, в публікаціях: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993.and Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999. В цілях даного опису термін "умови жорсткості" охоплює умови, в яких гібридизація відбуватиметься лише якщо існує менш ніж 25 % помилкових спаровувань між молекулою, що гібидизується, і послідовністю-мішенню. "Умови жорсткості" можна підрозділити на конкретні рівні жорсткості для точнішого визначення. Таким чином, у використовуваному в даному описі сенсі умови "помірної жорсткості" являє собою умови, в яких молекули з невідповідністю більш ніж 25 % послідовностей не буде гібридизуватися; умови "середньої жорсткості" являють собою умови, в яких молекули з невідповідністю більш ніж на 15 % не будуть гібридизуватися, і умови "високої жорсткості" являють собою умови, в яких послідовності з невідповідністю більш ніж на 10 % не будуть гібридизуватися. Умовами "дуже високої жорсткості" є умови, в яких послідовності з невідповідністю більш ніж на 6 % не будуть гібридизуватися. Навпаки, нуклеїнові кислоти, які гібридизуються в умовах "низької жорсткості", включають нуклеїнові кислоти з набагато меншою ідентичністю послідовностей або з ідентичністю послідовностей впродовж лише коротких підпослідовностей нуклеїнової кислоти. Тому буде зрозуміло, що різні варіанти нуклеїнових кислот, які входять в об'єм даного винаходу, здатні гібридизуватися щонайменше з однією з послідовностей SEQ ID NO: 1, 3, 5, 1, 9, 12, 13, 17, 19 і 21 впродовж по суті їх повної довжини. Способи отримання антигенних поліпептидів РСВ Антигени PreF (включаючи антигени PreF-G, а також у відповідних випадках антигени G), описані в даній публікації, отримують, використовуючи добре розроблені способи експресії і очищення рекомбінантних білків. Способи, достатні як керівництво для фахівця в даній галузі, можна знайти в наступних публікаціях: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 200; and Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 999. Додаткові і конкретні подробиці приведені в даному описі нижче. Рекомбінантні нуклеїнові кислоти, які кодують антигени PreF, вводять в клітини-хазяї будьяким з безлічі добре відомих способів, таких як електропорація, опосередкована ліпосомами трансфекція (наприклад, з використанням комерційно доступного реагенту для ліпосомної TM TM трансфекції, такої як ліпофектамін 2000 або трансфектин ), преципітації фосфатом кальцію, інфекції, трансфекції і тому подібного, залежно від вибору векторів і клітин-хазяїв. Приклади нуклеїнових кислот, які кодують антигени PreF (включаючи антигени PreF-G), приведені в SEQ ID NO: 5, 7, 9, 12, 13, 17, 19 і 21. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що послідовності SEQ ID NO: 5, 7, 9, 12, 13, 17, 19 і 21 є ілюстративними і не призначені для обмеження. Наприклад, полінуклеотидні послідовності, які кодують такі ж білки, як і послідовності SEQ ID NO: 5, 7 і 9, (наприклад, представлені послідовностями SEQ ID NO: 6, 8 і 10), але які відрізняються лише у зв'язку з надмірністю генетичного коду (наприклад, в результаті альтернативної оптимізації кодонів, як показано в SEQ ID NO: 12), поза сумнівом, можна використовувати замість ілюстративних послідовностей SEQ ID NO: 5, 7, і 9. Це справедливо і в разі послідовностей SEQ 18 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ID NO: 17, 19 і 21. Так само можна використовувати полінуклеотидні послідовності, які містять елементи, що підсилюють експресію, такі як розташовані усередині інтрони (або додавання промотору, енхансеру, інтрону або інших схожих елементів), які показані в SEQ ID NO: 13. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що також застосовні поєднання таких модифікацій. Так само також можна використовувати гомологічні послідовності, вибрані з будь-якого штаму РСВ A або РСВ B, та/або інші послідовності, які мають значну ідентичність послідовностей, як обговорювалося вище, для експресії антигенів PreF. Дійсно, будь-який з варіантів нуклеїнових кислот, описаних раніше, може бути відповідним чином введений в клітини-хазяї і використаний для отримання антигенів PreF (включаючи антигени PreF-G) і в прийнятному випадку поліпептидів G. Наприклад, в деяких випадках варіанти нуклеїнових кислот модифікують, аби змінити картину глікозилування, наприклад, як описано вище, заміною однієї або декількох амінокислот поблизу положення амінокислоти 500 (відносно послідовності SEQ ID NO: 2, наприклад, SEQ ID NO: 17). Було виявлено, що модифікація картини глікозилування, наприклад, у поєднанні з модифікацією сайту пізнавання для розщеплювання, підвищує продукцію антигену PreF в культурі клітин. У таких випадках способи, описані нижче, для експресії і виділення рекомбінантних антигенів PreF, дозволяють збільшувати продукцію антигену PreF за рахунок зміни картини глікозилування антигену PreF в результаті заміни однієї або декількох амінокислот в сайті пізнавання для глікозилування, необов'язково у поєднанні з модифікацією одного або декількох сайтів розщеплювання (таких як сайт пізнавання для розщеплювання нефуриновим ферментом або фурином), які описані вище. Таким чином, клітини-хазяї, які містять нуклеїнові кислоти, що кодують рекомбінантний антиген PreF, також є відмітною ознакою даного винаходу. Переважні клітини-хазяї включають прокаріотичні (тобто, бактерійні) клітини-хазяї, такі як E. coli, а також багаточисельні еукаріотичні клітини-хазяї, включаючи клітини грибів (наприклад, дріжджі, такі як Saccharomyces cerevisiae і Picchia pastoris), клітини комах, клітини рослин і клітини ссавців (включаючи клітини CHO і HEK293). Нуклеїнові кислоти рекомбінантних антигенів PreF вводять (наприклад, трансдукують, трансформують або трансфікують) в клітини-хазяї, наприклад, за допомогою вектора, такого як експресуючий вектор. Як описано вище, вектор найчастіше являє собою плазміду, але такі вектори також можуть являти собою, наприклад, вірусну частку, фаг і т.д. Приклади відповідних для експресії хазяїв включають: бактерійні клітини, такі як E. coli, Streptomyces і Salmonella typhimurium; клітини грибів, такі як Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris і Neurospora crassa; клітини комах, такі як Drosophila і Spodoptera frugiperda; клітини ссавців, такі як 3T3, COS, CHO, BHK, HEK 293 або меланоми Боуеса; клітини рослин, включаючи клітини водоростей і т.д. В деяких випадках можна використовувати тимчасово трансфіковані клітини, аби отримати рекомбінантні антигени PreF. У деяких варіантах відбирають клітини (наприклад, клони), які мають стабільно інтегровану нуклеїнову кислоту PreF, і використовують для отримання рекомбінантного антигену PreF. Клітини-хазяї можна культивувати в звичайному живильному середовищі, модифікованому відповідним чином для активації промоторів, відбору трансформантів або ампліфікації вбудованих полінуклеотидних послідовностей. Умови культивування, такі як температура, pH і тому подібне, зазвичай являють собою умови, раніше використовувані для клітини-хазяя, вибраної для експресії, і такі умови відомі фахівцям в даній галузі і описані в публікаціях, цитованих в даному описі, включаючи, наприклад, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, а Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York, і приведені у вказаній публікації посилання. Необов'язково клітини-хазяї культивують в безсироватковому середовищі та/або в середовищі, що не містить тваринних продуктів. Продукти експресії, відповідні нуклеїновим кислотам згідно винаходу, також можуть бути отримані в інших клітинах, відмінних від клітин тварин, таких як клітини рослин, дріжджів, грибів, бактерій і тому подібних. На додаток до публікацій Sambrook, Berger і Ausubel подробиці, що мають відношення до культивування клітин, можна знайти в публікаціях: Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL. У бактерійних системах може бути вибрано декілька експресуючих векторів, залежно від передбачуваного вживання експресованого продукту. Наприклад, у разі потреби великих кількостей поліпептиду або його фрагментів для отримання антитіл переважно використовують вектори, які сприяють високим рівням експресії злитих білків, які можна легко очистити. Такі вектори включають без обмеження багатофункціональні клонуючі і експресуючі вектори E. coli, 19 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такі як BLUESCRIPT (Stratagene), в яких кодуюча послідовність, що представляє інтерес, наприклад, полінуклеотид згідно винаходу, який описаний вище, може лігувати у вектор в рамці з послідовностями для аміно-кінцевого ініціюючого трансляцію метіоніну і подальших 7 залишків бета-галактозидази із отриманням каталітично активного злитого білка бета-галактозидази; вектори pIN (Van Heeke and Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509). У деяких прикладах нуклеїнові кислоти вводять в клітини за допомогою векторів, відповідних для введення і експресії в прокаріотичних клітинах, наприклад, в клітинах E. coli. Наприклад, нуклеїнова кислота, включаюча полінуклеотидну послідовність, яка кодує антиген PreF, може бути введена в будь-який з безлічі комерційно доступних або запатентованих векторів, таких як серія експресуючих векторів pET (наприклад, pET9b і pET2d). Експресія кодуючої послідовності індукується IPTG, приводячи до високих рівнів експресії білка. Полінуклеотидна послідовність, що кодує антиген PreF, транскрибується під контролем промотора фага T7. Також застосовні альтернативні вектори, такі як pURV22, які містять індукований нагріванням промотор pL лямбда. Експресуючий вектор потім вводять (наприклад, за допомогою електропорації) у відповідного бактерійного хазяя. Є багаточисельні відповідні штами E. Coli, які можуть бути вибрані фахівцем в даній галузі (наприклад, штами Rosetta і BL21 (DE3), як було підтверджено, є переважними для експресії рекомбінантних векторів, що містять полінуклеотидні послідовності, які кодують антигени PreF. Так само в дріжджах, таких як Saccharomyces cerevisiae, можна використовувати ряд векторів, що містять конститутивні або індуковані промотори, такі як промотори альфа-чинника, алкогольоксидази і PGH, для отримання необхідних продуктів експресії. Огляд дивиться в публікаціях Berger, Ausubel і, наприклад, Grant із співавторами (1987; Methods in Enzymology 153: 516-544). У клітинах-хазяях ссавців можна використовувати ряд систем експресії, включаючи як плазміди, так і системи, засновані на вірусах. У іншому прикладі полінуклеотидну послідовність, яка кодує антиген PreF, вводять в клітини комах, використовуючи систему експресії на основі бакуловірусних векторів (BEVS). Рекомбінантний бакуловірус, здатний інфікувати клітини комах, може бути створений з використанням комерційно доступних векторів, наборів та/або систем, таких як система BD BaculoGold з BD BioScience. Коротко, полінуклеотидну послідовність, що кодує антиген, вбудовують у вектор для перенесення pAcSG2. Потім клітини-хазяї SF9 (Spodoptera frugiperda) котрансфікують химерною плазмідою pAcSG2 і BD BaculoGold, що містить лінеаризовану геномну ДНК бакуловірусу - вірусу ядерного поліедрозу Autographa californica (ACNPV). Після трансфекції відбувається гомологічна рекомбінація між плазмідою pACSG2 і бакуловірусним геномом з утворенням рекомбінантного вірусу. У одному прикладі антиген PreF експресується під регуляторним контролем промотора поліедрину (pH). Схожі вектори для перенесення можуть бути отримані з використанням інших промоторів, таких як основний промотор (Ba) і промотор p10. Так само можна використовувати альтернативні клітини комах, такі як SF21, які близько споріднені клітинам Sf9, і лінія клітин High Five, отримана з капустяної совки Trichoplusia ni. Найчастіше полінуклеотиди, які кодують антигени PreF, включають в експресуючі вектори, які підходять для введення і експресії в еукаріотичних клітинах (наприклад, клітинах комах або ссавців). Переважно такі нуклеїнові кислоти оптимізують по кодонах для експресії у вибраному векторі/клітині-хазяї (наприклад, послідовності, показані в SEQ ID NO: 5, 7, 9, 12, 13, 17, 19 і 21, оптимізують відносно кодонів для експресії в клітинах CHO). У одному ілюстративному варіанті полінуклеотидну послідовність, яка кодує антиген PreF, вводять у вектор, такий як вектор pEE14, розроблений Lonza Biologicals. Поліпептид експресують під контролем конститутивного промотора, такого як негайний ранній промотор CMV (цитомегаловірусу). Селекцію стабільно трансфікованих клітин, експресуючих поліпептид, здійснюють на основі здатності трансфікованих клітин зростати у відсутність джерела глутаміну. Клітини, які успішно інтегрували pEE14, здатні зростати у відсутність екзогенного глутаміну, оскільки вектор pEE14 експресує фермент GS (глутамінсинтетазу). Відібрані клітини можуть бути клонально розмножені і охарактеризовані відносно експресії необхідного поліпептиду PreF. Клітину-хазяя необов'язково вибирають по її здатності модулювати експресію вбудованих послідовностей або процесувати експресований білок необхідним чином. Такі модифікації білка включають без обмеження глікозилування (а також, наприклад, ацетилювання, карбоксилювання, фосфорилування, ліпідизацію і ацилування). Посттрансляційний процесинг, наприклад, який розщеплює форму попередника з утворенням зрілої форми білка (наприклад, протеазою фурином), необов'язково здійснюється в контексті клітини-хазяя. Різні клітини-хазяї, такі як 3T3, COS, CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38 і т.д., володіють специфічним клітинним 20 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 апаратом і характерними механізмами такої посттрансляційної активності і можуть бути вибрані так, щоб вони забезпечували правильну модифікацію і процесинг введеного чужорідного білка. Для довготривалої продукції рекомбінантних антигенів PreF, описаних в даній публікації, з високим виходом зазвичай використовують стабільні системи експресії. Наприклад, в разі ліній клітин, які стабільно експресують поліпептид антигену PreF, введення в клітину-хазяя здійснюють з використанням експресуючих векторів, які містять вірусні початки реплікації або ендогенні елементи експресії і селектований маркерний ген. Після введення вектора клітинам дають можливість зростати протягом 1-2 діб в збагаченому середовищі перед їх переведенням на середовище для селекції. Метою селектованого маркера є додання резистентності до умов селекції, і його присутність дозволяє вирощувати і витягувати клітини, які успішно експресують введені послідовності. Наприклад, резистентні групи або колонії стабільно трансформованих клітин можуть бути піддані проліферації з використанням способів культури тканини, відповідних для типу клітин. Клітини-хазяї, трансформовані нуклеїновою кислотою, що кодує антиген PreF, необов'язково культивують в умовах, відповідних для експресії і витягання кодованого білка з культури клітин. Як вказано вище, при необхідності клітини-хазяя можна культивувати в безсироватковому середовищі (та/або середовищі, що не містить тваринних продуктів). Після трансдукції відповідної лінії клітин-хазяїв і вирощування клітин-хазяїв до відповідної щільності клітин вибраний промотор індукують відповідними способами (наприклад, використовуючи зрушення температури або хімічну індукцію) і клітини культивують упродовж додаткового періоду часу. Необов'язково середовище містить компоненти та /або добавки, які зменшують руйнування експресованого білка протеїназами. Наприклад, середовище, використовуване для культивування клітин з метою отримання антигену PreF, може містити інгібітор протеаз, такий як хелатуючий агент або низькомолекулярний інгібітор (наприклад, AZ11557272, AS111793 і т.д.), аби зменшити або виключити небажане розщеплювання клітинними або позаклітинними протеїназами (протеїназами матриксу). Секретований поліпептидний продукт потім витягують з культурального середовища. Альтернативно клітини можуть бути зібрані центрифугуванням, зруйновані фізичними або хімічним способами, і отриманий неочищений екстракт зберігають для подальшого очищення. Еукаріотичні або мікробні клітини, використовувані для експресії білків, можуть бути зруйновані будь-яким зручним способом, включаючи цикли заморожування-розморожування, обробку ультразвуком, механічне руйнування або використанням засобів, лізуючих клітини, або інші способи, які добре відомі фахівцям в даній галузі. Експресовані антигени PreF можуть бути витягнуті і очищені з культури рекомбінантних клітин будь-яким з ряду способів, відомих в даній галузі, включаючи преципітацію сульфатом амонію або етанолом, екстракцію кислотою, фільтрацію, ультрафільтрацію, центрифугування, аніонообмінну або катіонообмінну хроматографію, хроматографію на фосфоцелюлозі, хроматографію на основі гідрофобної взаємодії, афінну хроматографію (наприклад, з використанням будь-якої з систем мічення, вказаних в даному описі), хроматографію на гідроксилапатиті і хроматографію на лектині. Можна використовувати необхідні стадії рефолдингу білка для отримання завершеної конфігурації зрілого білка. Нарешті, можна використовувати високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ) на стадіях кінцевого очищення. На додаток до вказаних вище посилань в даній галузі добре відомо безліч способів очищення, включаючи, наприклад, способи, вказані в публікаціях: Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; and Bollag et al. (1996)Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, U.K.; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition WILEY-VCH, NY; and Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ. В одному ілюстративному варіанті білки PreF витягують з клітин згідно наступній схемі очищення. Після введення рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид PreF, в клітини-хазяї CHO тимчасово трансфіковані клітини-хазяї або розмножені стабільні популяції, що містять введену полінуклеотидну послідовність, вирощують в середовищі і в умовах, відповідних для зростання, в прийнятному масштабі для необхідної мети (наприклад, як загалом описано в публікації Freshney (1994) Culture of Animal Cells, а Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York і в цитованих у вказаній публікації посиланнях). Зазвичай клітини вирощують в безсироватковому середовищі при 37C і пересівають з інтервалами в 2-3 дні в струшуваних флаконах або в біореакторах. Нові культури, отримані з клітин, розмножених в таких умовах, зазвичай культивують в біореакторах в безсироватковому 21 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 середовищі і інкубують при 27C з pO2, підтримуваним на рівні 20 % протягом 5-7 діб, аби отримати антиген PreF. Аби витягувати рекомбінантний антиген PreF, культуру клітин центрифугують і надосад культури клітин зберігають при мінус 70C аж до подальшого використання. Після розморожування надосадів культур надосади розбавляють в 2 рази водою MILLIQ і доводять до pH 6,0, використовуючи HCl. Розбавлений надосад наносять із швидкістю 75 см/год. на 3 л смоли CM Ceramic HYPERD FF, упакованою в колонку BPG 140/500, зрівноваженою 20 мМ фосфатом, pH 6,0. Після завантаження зразка буфер для зрівноваження пропускають через колонку, аби знову отримати вихідний УФ-рівень. Після промивання 5 об'ємами колонки (CV) 25 мМ фосфатного буфера, pH 7,0, здійснюють елюювання, використовуючи 50 мМ фосфатний буфер, pH 7,0, що містить 0,1 М NaCl. Елюат CM Hyper D розбавляють в 3,3 рази 20 мМ фосфатом, pH 7,0, для нанесення на колонку об'ємом 270 мл з гідроксіапатитом типу II (упакованою в XK 50), зрівноважену 20 мМ PO4 (Na) -буфером, pH 7,0, 50 мл/хв. Після промивання колонки буфером для зрівноваження (~3 CV) здійснюють елюювання, використовуючи 20 мМ PO 4 (Na) 0буфер, pH 7,0, що містить 0,5 М NaCl. Елюат з HA наносять із швидкістю 15 мл/хв (дотримуючи 10-хвилинний період контакту із смолою) на колонку Capto Adhere об'ємом 150 мл (упаковану в XK 26), зрівноважену в 20 мМ фосфаті, pH 7,0. Після промивання 5 CV 10 мМ фосфатного буфера, pH 7,0, що містить 0,1 М аргініну, здійснюють елюювання, використовуючи 10 мМ фосфатний буфер, pH 7,0, що містить 0,6 М аргініну. Елюат з Capto Adhere потім концентрують приблизно в 10 разів для нанесення на колонку для препаративної ексклюзійної хроматографії за розміром (SEC). Концентрування здійснюють, використовуючи поліефірсульфонову мембрану Pellicon 50 кД. Перед нанесенням на колонку 2 SEC речовину фільтрують через фільтр PLANOVA 20N, 100 см , при цьому фільтрування використовують як стадію елімінації вірусу. Така стадія нанофільтрації може бути здійснена або після, або перед концентруванням на мембрані Pellicon. Потім здійснюють препаративну SEC, використовуючи колонку Superdex S200 об'ємом 500 мл і 10 мМ фосфатний буфер (Na/K2), що містить 160 мМ NaCl, pH 6,5 (відповідний кінцевому буферу) як рухлива фаза. Об'єм концентрованого PreF, відповідний 5 % об'єму колонки SEC, наносять на смолу з швидкістю ~2,6 мл/хв. Зазвичай збирають фракції по 10 мл. Аналітичні пули фракцій можна аналізувати в SDS-гелі, використовуючи забарвлювання сріблом і при необхідності анти-HCP (білки клітини-хазяя) для Вестерн-блотів, аби оптимізувати виходи при мінімізації рівнів HCP. Очищену масу отримували після фільтрування через фільтри Millex 0,22 мкм (альтернативно можна використовувати фільтр Sterivex). При необхідності очищений препарат антигену PreF можна зберігати при мінус 70C до використання. Альтернативно білки PreF можуть містити полігістидинову мітку (наприклад, шість гістидинів), яку можна використовувати для полегшення очищення. Для отримання таких мічених гістидином поліпептидів PreF можна використовувати наступний протокол очищення. Перед очищенням з використанням афінної хроматографії на імобілізованних іонах металів (IMAC) надосад культури клітин розбавляють в два рази в буфері A (20 мМ бицин, pH 8,5) і pH доводять до 8,5. Отриманий розчин навантажують на колонку з Q-сефарозою FF (GE Healthcare), наприклад, колонку об'ємом 23 мл, заздалегідь зрівноважену буфером A. Білки PreF уловлюють на колонці разом з деякими домішками з клітин-хазяїв. Компоненти культурального середовища, які можуть заважати стадії IMAC-очищення, не стримуються і віддаляються в прохідному потоці. Білки розділяють і елюють, використовуючи ступінчасте елюювання розчинами 200 мМ, 400 мМ, 600 мМ, 800 мМ і 1 М NaCl. Білки PreF, що представляють інтерес, елюються на першій стадії при 200 мМ NaCl. Необов'язково витягання можна контролювати за допомогою SDS-ПААГ і Вестерн-блотинга, використовуючи антитіло проти His-мітки для виявлення міченого білка PreF. Фракції можуть бути об'єднані перед продовженням очищення. (Об'єднаний) елюат, що містить білок PreF, розбавляють в три рази в буфері B (20 мМ біцин, 500 мМ NaCl, pH 8,3) і pH доводять до 8,3. Отриманий розчин наносять на смолу сефарозу FF для IMAC, на яку навантажений хлорид нікелю (GE Healthcare) (наприклад, на колонку об'ємом 5 мл), заздалегідь зрівноважену буфером B. PreF зв'язується із смолою, і велика частина домішок з клітин-хазяїв піддається елююванню в прохідному потоці. Колонку промивають 20 мМ імідазолом, аби видалити слабо зв'язані домішки. Білки PreF елюють ступінчастим елююванням з використанням 250 мМ імідазолу. SDS-ПААГ з забарвлюванням Кумассі синім і Вестерн-блот з антитілом проти His-мітки можуть бути здійснені для ідентифікації позитивних фракцій. 22 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пул, отриманий при IMAC, потім можна концентрувати до концентрації, складовій щонайменше 150 мкг/мл, використовуючи пристрій для концентрації Centricon (Millipore), і білок можна діалізувати в PBS-буфері з додаванням 500 мМ L-аргініну. Отриманий білок кількісно оцінюють, використовуючи аналіз білка RCDC (BioRad), і зберігають при -70 або -80C аж до використання. Імуногенні композиції і способи Також пропонуються імуногенні композиції, що містять будь-який з антигенів PreF, описаних вище (таких як антигени, приведені як приклад в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 18, 20 і 22), і фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт. У деяких варіантах, зазвичай в тих варіантах, в яких антиген PreF не містить G-білкового компонента (такого як послідовність SEQ ID NO: 6), імуногенна композиція може містити ізольований, рекомбінантний та/або очищений G-білок. Багаточисельні відповідні G-білки були описані в даній галузі і включають повнорозмірні рекомбінантні G-білки і химерні білки, що складаються з частини G-білка (наприклад, амінокислот 128-229 або 130-230) і партнера в злитті (такого як тіоредоксин) або сигнальної та/або лідерної послідовності, яка полегшує експресію та/або очищення. Приклади G-білків для вживання в суміші з антигеном PreF можна знайти в WO2008114149, патенті США № 5149650, патенті США № 6113911, опублікованій заявці на видачу патенту США № 20080300382 і патенті США № 7368537, кожна з вказаних публікацій включена в даний опис у вигляді посилання. Як вказано у зв'язку з химерними білками PreF-G, менший за розміром фрагмент G-білка, такий як частина, що складається з амінокислот 149-229 або частина приблизно від амінокислоти 128 до приблизно амінокислоти 229, переважно можна використовувати в контексті сумішей, що містять PreF (без G) і G. Як обговорюється вище, важливим чинником є присутність імунодомінантних епітопів, наприклад, вхідних в ділянку амінокислот 183-197. Альтернативно в таких композиціях можна використовувати повнорозмірний G-білок. Фармацевтично прийнятні носії і ексципієнти добре відомі і можуть бути вибрані фахівцями в даній галузі. Наприклад, носій або ексципієнт переважно може містити буфер. Необов'язково носій або ексципієнт також містить щонайменше один компонент, який стабілізує розчинність та/або стабільність. Приклади солюбілізуючих/стабілізуючих засобів включають детергенти, наприклад, лаурилсаркозил та/або твін. Альтернативні солюбілізуючі/стабілізуючі засоби включають аргінін і склотвірні поліоли (такі як сахароза, трегалоза і тому подібні). Багаточисельні фармацевтично прийнятні носії та/або фармацевтично прийнятні ексципієнти відомі в даній галузі і описані, наприклад, в Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5th Edition (975). Відповідно, фахівцями в даній галузі можуть бути вибрані відповідні ексципієнти і носії для отримання препарату, відповідного для доставки пацієнтові вибраним шляхом введення. Відповідні ексципієнти включають без обмеження: гліцерин, поліетиленгліколь (ПЕГ), сорбіт, трегалозу, натрієву сіль N-лауроілсаркозину, L-пролін, недетергентний сульфобетаїн, 2+ 2+ 2+ 2+ гідрохлорид гуанідину, сечовину, оксид триметиламіну, KCl, Ca , Mg , Mn , Zn і інші споріднені солі двовалентних катіонів, дитіотреітол, дитіоеритрол і β-меркаптоетанол. Інші ексципієнти можуть являти собою детергенти (включаючи: твін 80, твін 20, тритон X-00, NP-40, емпіген BB, октилглюкозид, лауроїлмальтозид, цвітергент 3-08, цвітергент 3-0, цвітергент 3-2, цвітергент 3-4, цвітергент 3-6, CHAPS, дезоксихолат натрію, додецилсульфат натрію, бромід цетилтриметиламонію). Необов'язково імуногенні композиції також містять ад'ювант. У контексті імуногенної композиції, відповідних для введення пацієнтові з метою викликання захисної імунної відповіді проти РСВ ад'ювант вибирають так, щоб він викликав зміщену убік Th1 або збалансовану по Th1/Th2 імунну відповідь, що характеризується продукцією інтерферону-гама (IFN-γ). Ад'ювант зазвичай вибирають так, щоб він підсилював зміщену убік Th1 імунну відповідь (або збалансовану по Th1/Th2 імунну відповідь), що характеризується продукцією і секрецією IFN- γ, у пацієнта або в популяції пацієнтів, яким вводять композицію. Наприклад, коли імуногенну композицію необхідно ввести пацієнтові конкретної вікової групи, чутливої (або підданної підвищеному ризику) РСВ-інфекції, ад'ювант вибирають так, щоб він був безпечним і ефективним для пацієнта або популяції пацієнтів. Таким чином, в разі приготування імуногенної композиції, що містить антиген PreF РСВ для введення літній людині (такої як людина після 65 років), ад'ювант вибирають так, щоб він був безпечним і ефективним для літньої людини. Так само, у тому випадку, коли імуногенна композиція, що містить антиген PreF РСВ, призначена для введення новонародженим або маленьким дітям (таким як діти від народження до дворічного віку), ад'ювант вибирають так, щоб він був безпечним і ефективним у новонароджених і маленьких дітей. В разі ад'юванту, вибраного відносно безпеки і ефективності 23 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у новонароджених і маленьких дітей, може бути вибрана доза ад'юванту, яка є розведенням (наприклад, дробовою дозою) дози, що зазвичай вводиться дорослій людині. Крім того, ад'ювант зазвичай вибирають так, щоб він підсилював імунну Th1-відповідь при введенні тим шляхом введення, яким вводять імуногенну композицію. Наприклад, в разі приготування імуногенної композиції, що містить антиген PreF, для назального введення, переважними ад'ювантами, що зміщують відповідь убік Th1, є ад'юванти на основі протеосом і протолін. Навпаки, коли імуногенну композицію готують для внутрішньом'язового введення, переважно вибирають ад'юванти, що включають один або декілька з наступних засобів: 3DMPL, сквалеон (наприклад, QS21), ліпосоми та/або масляні і водні емульсії. Одним відповідним ад'ювантом для використання у поєднанні з антигенами PreF є нетоксичне похідне бактерійного ліпополісахариду. Прикладом відповідного нетоксичного похідного ліпіду A є монофосфорилліпід A або конкретніше 3-деацилованний монофосфорилліпід A (3D-MPL). 3D-MPL продається під назвою MPL GlaxoSmithKline Biologicals N.A., і він згадується впродовж документа як MPL або 3D-MPL. Див., наприклад, патенти США № 4436727, 4877611, 4866034 і 4912094. 3D-MPL перш за все стимулює відповіді T-клітин CD4+ з фенотипом IFN-γ (Th1). 3D-MPL може бути отриманий способами, описаними в GB2220211 A. Хімічно він являє собою суміш 3-деацилованного монофосфорилліпіду A з 3, 4, 5 або 6ацилованими ланцюгами. У композиціях згідно даному винаходу можна використовувати дрібні частки 3D-MPL. 3D-MPL у вигляді дрібних часток має такий розмір часток, що його можна стерильно фільтрувати через фільтр 0,22 мкм. Такі препарати описані в WO94/21292. Ліпополісахарид, такий як 3D-MPL, можна використовувати в кількостях від 1 до 50 мкг в дозі імуногенної композиції для людини. Такий 3D-MPL можна використовувати на рівні приблизно 25 мкг, наприклад, 20-30 мкг, у відповідних випадках 21-29 мкг або від 22 до 28 мкг, або від 23 до 27 мкг, або від 24 до 26 мкг, або 25 мкг. У іншому варіанті доза імуногенної композиції для людини містить 3D-MPL на рівні приблизно 10 мкг, наприклад, від 5 до 15 мкг, у відповідних випадках від 6 до 14 мкг, наприклад, від 7 до 13 мкг або від 8 до 12 мкг, або від 9 до 11 мкг, або 10 мкг. У наступному варіанті доза імуногенної композиції для людини містить 3D-MPL на рівні приблизно 5 мкг, наприклад, від 1 до 9 мкг або від 2 до 8 мкг, або у відповідних випадках від 3 до 7 мкг, або 4 мкг, або 5 мкг. У інших варіантах ліпополісахаридом може бути β (1-6)глюкозаміндисахарид, який описаний в патенті США № 6005099 і патенті EP № 0 729 473 B1. Фахівець в даній галузі легко може отримати різні ліпополісахариди, такі як 3D-MPL, на основі інструкцій, приведених у вказаних публікаціях. Проте, кожна з вказаних публікацій включена в даний опис у вигляді посилання. На додаток до вказаних вище імуностимуляторів (які схожі по структурі з ЛПС або MPL або 3DMPL), також відповідними ад'ювантами є ациловані моносахаридні і дисахаридні похідні, які являють собою деяку частину вказаної вище структури MPL. У інших варіантах ад'ювантомє синтетичне похідне ліпіду A, деякі з яких описані як агоністи TLR-4, і які включають без обмеження: OM174 (2-дезокси-6-o-[2-дезокси-2-[(R)-3-додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-4-oфосфоно-β-D-глікопіранозіл]-2-[(R)-3-гідрокситетрадеканоїламіно]-α-Dглікопіранозилдигідрогенфосфат) (WO 95/14026); OM 294 DP (3S, 9R)-3--[(R)додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-4-оксо-5-аза-9(R)-[(R)-3-гідрокситетрадеканоїламіно]декан1,10-діол, 1,10-біс(дигідрогенфосфат) (WO 99/64301 і WO 00/0462); і OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R)3-[(R)-додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3гідрокситетрадеканоїламіно]декан-1,10-діол, 1-дигідрогенфосфат-10-(6-аміногексаноат) (WO 01/46127). Іншими лігандами TLR4, які можна використовувати, є алкілглюкозамінідфосфати (AGP), такі як сполуки, описані в WO 98/50399 або патенті США № 6303347 (також описані способи отримання AGP), відповідно RC527 або RC529 або фармацевтично прийнятні солі AGP, які описані в патенті США № 6764840. Деякі AGP є агоністами TLR4, а деякі є антагоністами TLR4. Вважають, що і ті та інші застосовні як ад'юванти. Іншим відповідним лігандом TLR-4, здатним викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-4 (Sabroe et al., JI 2003 р. 1630-5), є, наприклад, ліпополісахарид з грамнегативних бактерій і його похідні або його фрагменти, зокрема, нетоксичне похідне ЛПС (таке як 3D-MPL). Іншими відповідними агоністами TLR є: білок теплового шоку (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 або 90; поверхнево-активний білок A, олігосахариди гіалуронану, фрагменти гепарансульфату, фрагменти фібронектину, пептиди фібриногену і b-дефензин-2 і мурамілдипептид (MDP). У одному варіанті агоністом TLR є HSP 60, 70 або 90. Інші відповідні ліганди TLR-4 описані в WO 2003/011223 і в WO 2003/099195, такі як сполука I, сполука II і сполука III, описані на сторінках 45 в WO2003/011223 або на сторінках 3-4 в WO2003/099195 і, зокрема, сполуки, описані в WO2003/011223 як ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, 24 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ER804059, ER804442, ER804680 і ER804764. Наприклад, одним відповідним лігандом TLR-4 є ER804057. Додаткові агоністи TLR також застосовні як ад'юванти. Термін "агоніст TLR" відноситься до засобу, який здатний викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через шляхи передачі сигналів TLR, або як безпосереднього ліганду, або опосередковано через утворення ендогенного або екзогенного ліганду. Такі природні або синтетичні агоністи TLR можуть бути використані як альтернативні або додаткові ад'юванти. Короткий огляд ролі TLR як рецепторів ад'ювантів приведений в публікації: Kaisho and Akira, Biochimica et Biophysica Acta 1589: 1-13, 2002. Такі потенційні ад'юванти включають без обмеження агоністи TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 і TLR9. Відповідно, в одному варіанті ад'ювант і імуногенна композиція додатково містить ад'ювант, який вибраний з групи, що складається з: агоніста TLR-1, агоніста TLR-2, агоніста TLR-3, агоніста TLR-4, агоніста TLR-5, агоніста TLR-6, агоніста TLR-7, агоніста TLR-8, агоніста TLR-9 або їх поєднання. У одному варіанті здійснення даного винаходу використовують агоніст TLR, який здатний викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-1. Відповідно, агоніст TLR, здатний викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-1, вибраний з: триацилованних ліпопептидів (LP); розчинного у фенолі модуліну; LP Mycobacterium tuberculosis; S-(2,3біс(пальмитоїлокси) -(2-RS) -пропіл) -N-пальмітоїл-(R) -цис-(S) -Ser-(S) -Lys(4) -OH, тригідрохлориду (Pam3Cys) -LP, який імітує ацетилований аміно-кінець бактерійного ліпопротеїду і LP OSPA з Borrelia burgdorferi. У альтернативному варіанті використовують агоніст TLR, який здатний викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-2. Відповідно, агоністом TLR, здатним викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-2, є один або декілька з наступних засобів: ліпопротеїд, пептидоглікан, бактерійний ліпопептид з M. tuberculosis, B. burgdorferi або T. pallidum; пептидоглікани деяких видів, включаючи Staphylococcus aureus; ліпотейхоєві кислоти, маннуронові кислоти, порини Neisseria, бактерійні фімбрії, чинники вірулентності Yersina, віріони CMV, гемаглютинін вірусу кору і зимозан дріжджів. У альтернативному варіанті використовують агоніст TLR, який здатний викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-3. Відповідно, агоністом TLR, здатним викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-3, є двониткова РНК (днРНК) або поліїнозиноваполіцитидилова кислота (полі-IC), молекулярна картина нуклеїнових кислот, асоційована з вірусною інфекцією. У альтернативному варіанті використовують агоніст TLR, який здатний викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-5. Відповідно, агоністом TLR, здатним викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-5, є бактерійний флагелін. У альтернативному варіанті використовують агоніст TLR, який здатний викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-6. Відповідно, агоністом TLR, здатним викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-6, є ліпопротеїд мікобактерій, діацилованний LP і розчинний у фенолі модулін. Додаткові агоністи TLR6 описані в WO 2003/043572. У альтернативному варіанті використовують агоніст TLR, який здатний викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-7. Відповідно, агоністом TLR, здатним викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-7, є однониткова РНК (онРНК), локсоридин, аналог гуанозину в положеннях N7 і C8 або сполука імідазохиноліну або її похідне. У одному варіанті агоністом TLR є іміквимод. Додаткові агоністи TLR7 описані в WO 2002/085905. У альтернативному варіанті використовують агоніст TLR, який здатний викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-8. Відповідно, агоністом TLR, здатним викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-8, є однониткова РНК (онРНК), молекула імідазохиноліну з противірусною активністю, наприклад, резиквімод (R848); резиквімод також може розпізнаватися TLR-7. Інші агоністи TLR-8, які можна використовувати, включають агоністи, описані в WO 2004/071459. У альтернативному варіанті використовують агоніст TLR, який здатний викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-9. У одному варіанті агоністом TLR, здатним викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-9, є HSP90. Альтернативно агоністом TLR, здатним викликати відповідь у вигляді передачі сигналу через TLR-9, є бактерійна або вірусна ДНК, ДНК, що містить неметиловані нуклеотиди CPG, зокрема, контексти послідовності, відомі як мотиви CPG. CpG-що містять олігонуклеотиди переважно індукують Th1-відповідь. Такі олігонуклеотиди добре відомі і описані, наприклад, в WO 96/02555, WO 99/33488 і патентах США № 6008200 і 5856462. Відповідно, CpG-нуклеотиди є CpG-олігонуклеотидами. Відповідними олігонуклеотидами для застосування в імуногенних композиціях згідно даному винаходу є CpG-що містять олігонуклеотиди, необов'язково, що містять, два або більш мотивів 25 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 динуклеотидів CPG, розділених щонайменше трьома, у відповідних випадках щонайменше шістьма або більшою кількістю нуклеотидів. Мотив CPG являє собою цитозиновий нуклеотид, за яким слідує гуаніновий нуклеотид. CpG-олігонуклеотиди згідно даному винаходу зазвичай являють собою дезоксинуклеотиди. У конкретному варіанті між нуклеотидами в олігонуклеотиді присутній фосфородитіоат, або відповідно фосфоротіоатний зв'язок, хоча фосфодіефірні і інші міжнуклеотидні зв'язки входять в об'єм винаходу. Також в об'єм винаходу входять олігонуклеотиди із змішаними міжнуклеотидними зв'язками. Способи отримання фосфоротіоатних олігонуклеотидів або фосфородитіоатів описані в патентах США № 5666153, 5278302 і в WO 95/26204. Інші ад'юванти, які можна використовувати в імуногенних композиціях з антигенами PreF, наприклад, окремо або у поєднанні з 3D-MPL або іншим ад'ювантом, описаним в даній публікації, є сапоніни, такі як QS21. Сапоніни обговорюються в публікації: Lacaille-Dubois M. and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol. 2 pp 363-386). Сапоніни є стероїдними або тритерпеновими глікозидами, широко поширеними в царствах рослин і морських тварин. Сапоніни пропонували для утворення колоїдних розчинів у воді, які піняться при струшуванні, і для преципітації холестерину. Коли сапоніни знаходяться поблизу клітинних мембран, вони створюють подібні порам структури в мембрані, що приводить до розриву мембрани. Гемоліз еритроцитів є прикладом такого явища, яке обумовлене властивістю деяких, але не всіх, сапонінів. Сапоніни відомі як ад'юванти у вакцинах для системного введення. Ад'ювантна і гемолітична активність окремих сапонінів широко досліджена в даній галузі (Lacaille-Dubois і Wagner, вище). Наприклад, Quil A (отримуваний з кори південноамериканського дерева Quillaja Saponaria Molina) і його фракції описані в US 5057540 і в публікації "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12 (1-2): 1-55; і в EP 0 362 279 B1. Структури часток, називаних імуностимулюючими комплексами (ISCOMS), що містять фракції Quil A, є гемолітичними і були використані у виробництві вакцин (Morein, B., EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739). Гемолітичні сапоніни QS21 і QS17 (очищені з використанням ВЕРХ фракції Quil A) описані як сильні системні ад'юванти, і спосіб їх отримання описаний в патенті США № 5057540 і в EP 0 362 279 B1, які включені в даний опис у вигляді посилання. Інші сапоніни, які застосовували в дослідженнях системної вакцинації, включають сапоніни, отримані з інших видів рослин, таких як Gypsophila і Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9): 572-577, 1992). QS21 являють собою очищену з використанням ВЕРХ нетоксичну фракцію, отриману з кори Quillaja Saponaria Molina. Спосіб отримання QS21 описаний в патенті США № 5057540. Нереактогенні ад'ювантні препарати, що містять QS21, описані в WO 96/33739. Вищезгадані публікації включені в даний опис у вигляді посилання. Вказаний імунологічно активний сапонін, такий як QS21, можна використовувати в кількостях від 1 до 50 мкг на дозу для людини в імуногенній композиції. Переважно QS21 використовують на рівні приблизно 25 мкг, наприклад, 20-30 мкг, у відповідних випадках 21-29 мкг або 22-28 мкг, або 23-27 мкг, або 24-26 мкг, або 25 мкг. У іншому варіанті доза імуногенної композиції для людини містить QS21 на рівні приблизно 10 мкг, наприклад, від 5 до 15 мкг, у відповідних випадках 6-14 мкг, наприклад, 7-13 мкг або 8-12 мкг, або 9-11 мкг або 10 мкг. У наступному варіанті доза імуногенної композиції для людини містить QS21 на рівні приблизно 5 мкг, наприклад, 1-9 мкг або 2-8 мкг, або у відповідному випадку 3-7 мкг або 4-6 мкг або 5 мкг. Показано, що такі препарати, що містять QS21 і холестерин, є успішними Th1-стимульованими ад'ювантами в разі приготування разом з антигеном. Таким чином, наприклад, поліпептиди PreF переважно можна використовувати в імуногенних композиціях з ад'ювантом, що містить поєднання QS21 і холестерину. Необов'язково ад'ювант також може містити неорганічні солі, такі як солі алюмінію або кальцію, зокрема, гідроксид алюмінію, фосфат алюмінію і фосфат кальцію. Наприклад, ад'ювант, що містить 3D-MPL у поєднанні з сіллю алюмінію (наприклад, гідроксидом алюмінію або "галуном"), є відповідним для приготування імуногенної композиції, що містить антиген PreF, для введення людині. Інший клас відповідних ад'ювантів, що зміщують убік Th1, для вживання в препаратах антигенів PreF включає засновані на OMP імуностимулюючі композиції. Засновані на OMP імуностимулюючі композиції особливо застосовні як мукозні ад'юванти, наприклад, для інтраназального введення. Засновані на OMP імуностимулюючі композиції складають рід препаратів білків зовнішньої мембрани (OMP, включаючи деякі порини) грамнегативних бактерій, таких як, наприклад, але без обмеження, види Neisseria (див., наприклад, Lowell et al., J. Exp. Med. 167:658, 1988; Lowell et al., Science 240:800, 1988; Lynch et al., Biophys. J. 45:104, 26 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1984; Lowell, in "New Generation Vaccines" 2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, page 193, 1997; U.S. Pat. No. 5,726,292; U.S. Pat. No. 4,707,543), патент США № 5726292, патент США № 4707543), які застосовні як носій або в композиціях для імуногенів, таких як бактерійні або вірусні антигени. Деякі засновані на OMP імуностимулюючі композиції можуть бути названі "протеосомами", які є гідрофобними і безпечними для застосування на людині. Протеосоми володіють здібністю до самозбірці у везикули або везикулоподібні кластери OMP розміром приблизно від 20 нм до приблизно 800 нм, і до нековалентного включення, координування, асоціації (наприклад, електростатично або гідрофобно) або іншої кооперації з білковими антигенами (Аг), особливо антигенами, які мають гідрофобний компонент. Будь-який спосіб отримання, який в результаті дає компонент білка зовнішньої мембрани у формі везикул або у везикулоподібній формі, включаючи структури, що складаються з багатомолекулярних мембран, або композиції OMP в подібній розплавленій глобулі формі, що містять один або декілька OMP, включений у визначення протеосоми. Протеосоми можуть бути отримані, наприклад, як описано в даній галузі (див., наприклад, патент США № 5726292 або патент США № 5985284). Протеосоми також можуть містити ендогенний ліпополісахарид або ліпоолігосахарид (ЛПС або ЛОС, відповідно), що походять з бактерій, використовуваних для отримання поринів OMP (наприклад, вигляду Neisseria), які зазвичай складають менш ніж 2 % від загального препарату OMP. Протеосоми, головним чином, складаються з хімічно екстрагованих білків зовнішньої мембрани (OMP) з Neisseria menigitidis (найчастіше поринів A і B, а також OMP класу 4), підтримуваних в розчині за допомогою детергенту (Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206). Протеосоми можуть бути приготовані з різними антигенами, такими як очищені або рекомбінантні білки, отримані з вірусних джерел, включаючи поліпептиди PreF, описані в даній публікації, наприклад, з використанням діафільтрації або традиційних способів діалізу. Поступове видалення детергенту забезпечує можливість для утворення гідрофобних комплексів у вигляді часток діаметром приблизно 100-200 нм (Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206). "Протеосома: ЛПС або протолін" у використовуваному в даному описі сенсі відноситься до препаратів протеосом, змішаних, наприклад, в результаті екзогенного додавання щонайменше з одним виглядом ліпополісахариду, для отримання композиції OMP-ЛПС (яка може функціонувати як імуностимулююча композиція). Таким чином, композиція OMP-ЛПС може складатися з двох основних компонентів протоліну, які включають (1) препарат протеосом на основі білків зовнішньої мембрани (наприклад, Projuvant), отриманий з грамнегативних бактерій, таких як Neisseria meningitidis, і (2) препарат одного або декількох ліпосахаридів. Ліпоолігосахарид може бути ендогенним (наприклад, що природно входить в препарат протеосом на основі OMP), його можна змішувати або поєднувати з препаратом OMP в разі отримання екзогенного ліпоолігосахариду (наприклад, отримання з іншої культури або мікроорганізму, чим культура або мікроорганізм, з якого отриманий препарат OMP), або можливе поєднання вказаних варіантів. Такий екзогенно доданий ЛПС може бути з тієї ж грамнегативної бактерії, з якої отримують препарат OMP, або з іншої грамнегативної бактерії. Також слід розуміти, що протолін необов'язково містить ліпіди, гліколіпіди, глікопротеїди, малі молекули або тому подібне і їх поєднання. Протолін може бути отриманий, наприклад, як описано в публікації заявки на видачу патенту США № 2003/0044425. Поєднання різних ад'ювантів, таких як ад'юванти, що згадуються вище, також можна використовувати в композиціях з антигенами PreF. Наприклад, як вже наголошувалося, QS21 може бути приготований разом з 3D-MPL. Співвідношення QS21:3D-MPL зазвичай може бути порядку від 1:10 до 10:1; наприклад, від 1:5 до 5:1, і часто, по суті 1:1. Зазвичай, співвідношення знаходиться в діапазоні від 2,5:1 до 1:1 3D-MPL:QS21. Препарат з іншим поєднанням ад'ювантів включає 3D-MPL і сіль алюмінію, наприклад, гідроксид алюмінію. В разі приготування в поєднанні таке поєднання може підсилювати специфічну для антигена імунну відповідь Th1. В деяких випадках ад'ювантний препарат містить мінеральну сіль, таку як сіль кальцію або алюмінію (галун), наприклад фосфат кальцію, фосфат алюмінію або гідроксид алюмінію. В разі присутності галунів, наприклад, у поєднанні з 3D-MPL, кількість зазвичай складає приблизно від 100 мкг до 1 мг, наприклад, близько 100 мкг, або приблизно від 200 мкг до приблизно 750 мкг, наприклад, близько 500 мкг на дозу. У деяких варіантах ад'ювант містить масляну і водну емульсію, наприклад, емульсію типу "масло у воді". Один приклад емульсії типу "масло у воді" містить метаболізуюче масло, таке як 27 UA 111141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сквалеон, токол, такий як токоферол, наприклад, альфа-токоферол, і поверхнево-активну TМ речовину, таку як тріолеат сорбітану (Span 85 ) або моноолеат поліоксіетиленсорбитану (твін TМ 80 ), у водному носієві. У деяких варіантах емульсія типу "масло у воді" не містить жодних додаткових імуностимуляторів (зокрема, не містить нетоксичного похідного ліпіду A, такого як 3D-MPL, або сапоніну, такого як QS21). Водним носієм може бути, наприклад, фосфатносольовий буфер. Крім того, емульсія типу "масло у воді" може містити span 85 та/або лецитін та/або трикаприлін. У іншому варіанті винаходу пропонується композиція вакцини, що містить антиген або антигенну композицію і ад'ювантну композицію, що містить емульсію типу "масло у воді" і необов'язкові один або декілька додаткових імуностимуляторів, при цьому вказана емульсія типу "масло у воді" містить 0,5-10 мг метаболізуючого масла (у відповідних випадках сквалену), 0,5-11 мг токолу (у відповідних випадках токоферолу, такого як альфа-токоферол) і 0,4-4 мг емульгатора. У одному конкретному варіанті ад'ювантний препарат містить 3D-MPL, отриманий у формі емульсії, такої як емульсія типу "масло у воді". В деяких випадках емульсія має невеликий розмір частини, менше 0,2 мкм в діаметрі, як описано в WO 94/21292. Наприклад, частки 3DMPL можуть бути досить дрібними, аби їх можна було стерильно фільтрувати через мембрану 0,22 мікрона (як описано в Європейському патенті номер 0 689 454). Альтернативно 3D-MPL може бути отриманий у формі ліпосомного препарату. Необов'язково ад'ювант, що містить 3DMPL (або його похідне), також містить додатковий імуностимулюючий компонент. Ад'ювант вибирають так, щоб він був безпечний і ефективний в популяції, в якій вводять імуногенну композицію. В разі популяцій дорослих і літніх людей препарати зазвичай містять більше ад'ювантного компоненту, ніж зазвичай міститься в препараті для маленьких дітей. У конкретних препаратах з використанням емульсії типу "масло у воді" така емульсія може містити додаткові компоненти, наприклад, такі як холестерин, сквалеон, альфа-токоферол та/або детергент, такий як твін-80 або span85. У ілюстративних препаратах такі компоненти можуть бути присутніми в наступних кількостях: приблизно 1-50 мг холестерину, 2-10 % сквалену, від 2 до 10 % альфа-токоферолу і від 0,3 до 3 % твіну-80. Звичайне співвідношення сквален:альфа-токоферол менше або рівне 1, оскільки таке співвідношення забезпечує стабільнішу емульсію. У деяких випадку препарат також може містити стабілізатор. У тому випадку, коли імуногенну композицію з поліпептидним антигеном PreF готують для введення маленьким дітям, визначають дозу ад'юванта, аби вона була ефективною і відносно нереактогенної у дитини. Загалом, доза ад'юванта в препараті для дітей молодшого віку нижче (наприклад, доза може складати частину дози, наявної в препараті для введення дорослим), ніж доза, використовувана в препаратах, призначених для введення дорослій людині (наприклад, дорослим у віці 65 років і після). Наприклад, кількість 3D-MPL зазвичай знаходиться в діапазоні 1 мкг - 200 мкг, наприклад, 10-100 мкг або 10 мкг - 50 мкг на дозу. Доза для дітей молодшого віку зазвичай відповідає нижній межі вказаного діапазону, наприклад, приблизно від 1 мкг до приблизно 50 мкг, наприклад, приблизно від 2 мкг або приблизно від 5 мкг, або приблизно від 10 мкг, приблизно до 25 мкг або приблизно до 50 мкг. Зазвичай, в разі використання в препараті QS21 діапазони порівнянні (і відповідають співвідношенням, вказаним вище). В разі масляної і водної емульсії (наприклад, емульсії типу "масло у воді") доза ад'юванта, пропонована дітям або немовлятам, може складати частину від дози, що вводиться дорослій людині. Демонстрація ефективності імуногенних композицій, що містять антиген PreF у поєднанні з різними дозами ілюстративного ад'юванта типу "масло у воді" приведена в прикладі 9. Імуногенна композиція зазвичай містить імунопротекторну кількість (або її дробову дозу) антигену і може бути отримана звичайними способами. Отримання імуногенних композицій, включаючи композиції для введення людині, загалом описане в Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Інкапсулювання в ліпосоми описане, наприклад, Fullerton в патенті США 4235877. Кон'югування білків з макромолекулами описано, наприклад, Likhite в патенті США 4372945 і Armor із співавторами в патенті США 4474757. Звичайна кількість білка в кожній дозі імуногенної композиції вибирають у вигляді кількості, яка індукує імунопротекторну відповідь без істотних несприятливих побічних ефектів у звичайної людини. Імунопротекторний у даному контексті не обов'язково означає повний захист від інфекції; термін означає захист від симптомів або захворювання, особливо важкого захворювання, асоційованого з вірусом. Кількість антигену може варіювати залежно від того, який конкретний імуноген використовують. Зазвичай передбачається, що кожна доза для людини міститиме 1-1000 мкг білка, наприклад, приблизно від 1 мкг до приблизно 100 мкг, 28