Спосіб визначення імунних комплексів, що вміщують специфічні антигени

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в стационарных и амбулаторных условиях для диагностики и контроля эффективности лечения заболеваний внутренних органов, например при обследовании больных коронарным атеросклерозом. Известен способ определения липопротеида печени в циркулирующих иммунных комплексах в крови (А.с. №1651214, G01N33/53), включающий связывание циркулирующи х иммунных комплексов (ИК) субкомпонентом комплемента C1q и определение оптической плотности. После связывания ИК добавляют раствор коньюгата иммуноглобулина igG к специфическому липопротеиду печени с щелочной фосфатазой и при наличии 0,3 и более единиц оптической плотности определяют липопротеид, выделяемый при нарушении клеточных мембран. Недостаток этого способа заключается в том, что он не предусматривает определение концентрации липопротеида, т.е. проведение количественного анализа. Известен способ определения иммунных комплексов, содержащих антиген лейкоцитов человека (HLA) (заявка PCT №94/00760, G01N33/53, ИСМ, 1995, №84 - 09, С.51. Приоритет: США) - прототип, включающий связывание компонента комплемента C1g с твердым субстратом. Затем биологический образец, содержащий ИК, вводят в ячейки планшета для проведения иммуноферментного анализа, добавляют к биологическому образцу HLA антигена или антитело к HLA, связывают ИК с C1q и добавляют в качестве индикатора меченый реактив. Недостатком прототипа является то, что он предусматривает качественное определение иммунных комплексов (МК), содержащих только один вид антигенов - антиген лейкоцитов человека (HLA), что сужает его область применения. Следует заметить, что известный способ не учитывает способность C1q связывать не только ИК, но и другие компоненты сыворотки крови, например липопротеины, что снижает его специфичность. Кроме того, данный способ не обеспечивает достаточную воспроизводимость результатов, т.к. он не предусматривает использование стандартного раствора и построение калибровочной кривой, что снижает точность исследований. В основу изобретения поставлена задача: повышение специфичности и точности способа определения ИК, содержащих специфические антигены. Для решения поставленной задачи авторами предложен способ, включающий связывание компонента комплемента C1q с твердым субстратом, фиксацию иммунных комплексов на комплемент C1q1 проведение иммуноферментного анализа с применением индикатора и определение оптической плотности субстратного реактива. До проведения исследования готовят стандартный раствор, перед фиксацией ИК исследуемую пробу обрабатывают раствором полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ-6000), а в качестве индикатора используют конъюгат антител к любому специфическому антигену в зависимости от патологического процесса. Отличительными признаками изобретения являются: - Дополнительно приготовляют стандартный раствор для построения калибровочной кривой, которую используют для определения концентрации иммунных комплексов в исследуемых пробах по величине оптической плотности. - Перед фиксацией ИК на компоненте комплимент C1q исследуемую пробу обрабатывают раствором ПЭГ-6000. - При проведении иммуноферментного анализа в качестве индикатора используют коньюгат антител к любому специфическому антигену в зависимости от патологического процесса. Введение операции обработки исследуемой пробы раствором ПЭГ-6000 перед фиксацией ИК на компоненте комплемента C1q способствует повышению специфичности исследования, так как C1 по своим свойствам обладает способностью фиксировать не только ИК, но и другие компоненты сыворотки крови, а ПЭГ-6000 позволяет выделить из исследуемой пробы очищенный иммунный комплекс. Предварительное приготовление стандартного раствора и построение калибровочной кривой, используемой для определения концентрации ИК в исследуемых пробах по величине оптической плотности, способствует повышению степени воспроизводимости и точности исследования, а также расширяет его функциональные возможности, так как позволяет проводить не только качественный анализ, но и количественный, т.е. концентрацию ИК. Использование в качестве индикатора конъюгата антител к любому специфическому антигену позволяет расширить область применения заявляемого способа, т.е. предложенный способ может быть применен для определения ИК при различной патологии. Отличительные признаки предложенного решения соответствуют критерию "новизна" и требованиям изобретательского уровня. Исследования по данному способу и прототипу проведены в секторе иммунологии отдела биохимии и отделения атеросклероза и его осложнений в Институте терапии АМН Украины на 44 больных. Использование предложенного способа в медицинской практике позволит повысить специфичность и точность способа, увеличить степень воспроизводимости и достоверности результатов исследования, а также дает возможность проводить качественный и количественный анализ и расширяет функциональные возможности способа. Кроме того, предложенный способ можно рассматривать как типовой процесс получения тест-системы определения ИК, содержащих специфические антигены. В таблице показано преимущество заявляемого способа по сравнению с известным. Заявляемый способ осуществляют следующим образом. 1. Приготовляют искусственные ИК с избытком антигена путем инкубации смеси растворов, содержащих ИК, например апопротеин B (Апо-B) и антитела в Апо-B, которые применяют в качестве стандарта. Инкубацию проводят при T = 37°C в течение часа. Соотношение количества Апо-B к его антителу подбирают предварительно по реакции микропреципитации (образование осадка). 2. Разводят сыворотку крови в боратном буфере 0,1М, pH 8,4. 3. Смешивают разведенную сыворотку крови с равным объемом 5% - ного раствора полиэтиленгликоля-6000 (ПЭГ-6000) и инкубируют при T = 4°C в течение 18 часов для осаждения иммунных комплексов. 4. Центрифугируют полученную смесь при T = 4°C в течение 30мин. 5. Промывают образовавшийся осадок в ПЭГ-6000 с концентрацией 2,5% и объемом, равным объему разведенной сыворотки крови. 6. Вторично центрифугир уют пробы по п.4. 7. Растворяют полученный осадок в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), содержащем фосфа тный буфер 0,05М pH 7,4. 8. Приготавливают последовательно разведение стандарта. 9. Смешивают пробы, подготовленные по пп.2 - 7, и последовательные разведения стандарта по п.8, с равным объемом ЗФР, содержащим 0,05% - ного Твин-20. 10. Инкубируют полученные пробы и разведения стандарта при T = 37°C в течение 30 минут и добавляют к ним ЗФР, содержащий 0,01М раствор этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА) и 0,05% ного Твин-20. 11. Для связывания компонента комплимента C1q с твердым субстратом вносят раствор C1q в лунки планшета и инкубируют при T = 4°C в течение 16 - 18 часов. 12. Вносят полученные растворы в лунки планшета и проводят иммуноферментный анализ, используя в качестве индикатора коньюгат антител к специфическому антигену, например аполипротеину-B (Апо-B). с пероксидазой с последующим измерением оптической плотности с помощью микрофотометра при длине волны 492нм. 13. Строят калибровочную кривую зависимости концентрации иммунных комплексов, например Апо-B, и оптической плотности последовательных разведении искусственных иммунных комплексов, принятых за стандарт. 14. Определяют концентрацию иммунных комплексов, содержащих специфические антигены, например Апо-B, по величине оптической плотности, используя полученную калибровочную кривую. Осуществление заявляемого способа подтверждается на примере обследования больных коронарным атеросклерозом и контрольной группы (здоровых лиц). Пример. Больной Б., 52 лет 21.04.95 поступил в клинику Института терапии АН Украины с диагнозом: ишемическая болезнь сердца (ИБС), стабильная стенокардия напряжения и покоя, III функциональный класс, постинфарктный (1993г.) кардиосклероз, недостаточность кровообращения II-A стадии, гипертоническая болезнь III стадии. Для выявления участия иммунных механизмов в развитии коронарного атеросклероза больному Б. проводят исследование сыворотки крови по заявляемому способу. Предварительно приготовляют искусственные иммунные комплексы с избытком антигена - Апо-B. Затем у больного Б. берут натощак кровь из локтевой вены в количестве 2мл. Перед фиксацией ИК на компоненте комплимента C1q исследуемую сыворотку крови обрабатывают раствором ПЭГ-6000 и приготовляют последовательные разведения стандарта: 32,4, 16,2, 5,4, 1,8, 0,6, 0,2мкг/мл. После этого добавляют забуференный физиологический раствор (ЗФР), содержащий 0,01М раствора ЭДТА и 0,05% - ного Твин-20. Для связывания компонента комплимента C1q с твердым субстратом вносят раствор C1q в лунки планшета и инкубируют при T = 4°C в течение 16 часов. Проводят иммуноферментный анализ, измеряют оптическую плотность с помощью микрофотометра при длине волны 492нм и по калибровочной кривой определяют концентрацию ИК, содержащих Апо-B. В контрольной группе концентрация ИК, содержащих Апо-B, составила в среднем 1,736 ± 0,067. У больного Б. концентрация ИК, содержащих Апо-B, составила 6,518, т.е. у больного Б. содержание исследуемых ИК повышено по сравнению с их содержанием у лиц контрольной группы. Поэтому больному Б. показано назначение иммунокорегирующей терапии. Заключение. Определение ИК, содержащих Апо-B, по предложенному способу позволило провести качественный и количественный анализ с высокой специфичностью и достоверностью, что дало возможность выявить участие иммунных механизмов в развитии коронарного атеросклероза.