Стійка до імідазолінону рослина соняшника з новою мутацією в гені, що кодує велику субодиницю ацетогідроксидної синтази

Реферат: Винахід належить до рослини соняшника, яка має гербіцидно стійкі характеристики лінії MUT9, причому зразок насіння зазначеної лінії депоновано під ATCC патентним депозитарним номером PTA-6325, причому зазначена рослина соняшника містить у своєму геномі принаймні одну копію принаймні одного полінуклеотиду великої субодиниці 1 синтази ацетогідроксикислот UA 99095 C2 (12) UA 99095 C2 (AHASL1), де полінуклеотид AHASL1 кодує толерантний до гербіциду білок AHASL1, що має заміну ізолейцину у положенні 188 або у еквівалентному положенні, і де заміна спричиняє підвищення толерантності рослини соняшника до імідозолінонового гербіциду в порівнянні із рослиною соняшника дикого типу. Винахід також належить до касет експресії та трансформуючого вектору, що включають полінуклеотид з зазначеною мутацією, та рослини і клітини, які трансформовані зазначеними полінуклеотидами. Винахід також належить до застосування полінуклеотидів для підсилення стійкості рослин до імідазолінонових гербіцидів. UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід належить до галузі сільськогосподарської біотехнології, особливо до гербіцидо-стійких рослин соняшнику і нових полінуклеотидних послідовностей, які кодують білки великої субодиниці ацетогідроксидної синтази дикого типу та гербіцидо-стійкого соняшнику. Ацетогідроксидна синтаза (AHAS; EC 4.1.3.18, також відома як ацетолактатсинтаза або ALS) - це перший фермент, який каталізує біохімічні синтези розгалуженого ланцюга амінокислот валіну, лейцину та ізолейцину (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine," in Plant Amino Acid, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, сс. 227-247). AHAS - це місце дії п'яти різних за структурою гербіцидних родин, включаючи сульфонілсечовинну (LaRossa та Falco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161), імідазолінонову (Shaner та ін. (1984) Plant Physiol. 76:545-546), тріазолопіримідинову (Subramanian та Gerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines," in Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. та Sonnet, P.E.. eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., сс. 277-288), та піримідилоксибензоатну (Subramanian та ін. (1990) Plant Physiol. 94: 239-244). Імідазолінонові та сульфонілсечовинні гербіциди широко використовуються в сучасному сільському господарстві завдяки їх ефективності в дуже низькому заявленому діапазоні і відносній нетоксичності для тварин. Інгібуючи активність AHAS, ці гербіцидні родини запобігають подальшому росту та розвитку сприйнятливих рослин, включаючи багато різновидів бур'яну. Окремі приклади комерційно доступних імідазолінонових гербіцидів - це PURSUIT® (імазетапір), SCEPTER® (імазаквін) і ARSENAL® (імазапір). Приклади сульфонілсечовинних гербіцидів - це хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлорімуронетил, тіфенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, нікосульфурон, етаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примісульфуронметил, циносульфурон, амідосульфурон, флазасульфурон, імазосульфурон, піразосульфуронетил та галосульфурон. Завдяки своїй високій ефективності і низькій токсичності, імідазолінонові гербіциди володіють перевагою в обробці за допомогою розпилення зверху над поверхнею широкої області вегетації. Здатність до розпилення гербіциду зверху над поверхнею широкої області вегетації зменшує витрати, пов'язані з рослинною організацією і доглядом, і зменшує потребу у підготовчих роботах для використання таких хімікатів. Розпилення зверху над поверхнею бажаних толерантних видів також приводить до здатності досягти максимального прибуткового потенціалу бажаних видів завдяки відсутності конкурентних видів. Проте, здатність використовувати такі методи як розпилення зверху залежить від присутності імідазоліноновостійких видів бажаної вегетації для розпилення над поверхнею. Серед головних сільськогосподарських культур, деякі різновиди бобів, як наприклад соя, природно стійкі до імідазолінонових гербіцидів завдяки їх здатності швидко метаболізувати гербіцидні сполуки (Shaner та Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471). Інші культури, як наприклад злаки (Newhouse та ін. (1992) Plant Physiol. 100:882-886) і Barrett та ін. (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York, сс. 195-220) дещо чутливі до імідазолінонових гербіцидів. Характерна чутливість до імідазолінонових гербіцидів залежить від хімічної природи специфічного гербіциду і різному метаболізмі сполуки від токсичної до нетоксичної форми в кожній рослині (Shaner та ін. (1984) Plant Physiol. 76:545-546; Brown та ін., (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29). Інші фізіологічні відмінності рослини, як наприклад абсорбція і транслокація також грають важливу роль для чутливості (Shaner та Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471). Стійкі до імідазолінонів, сульфонілуреаз, тіазолпіримідинів та піримідилоксибензоатів рослини були успішно одержані, використовуючи насіння, мікроспору, пилок та калюс мутагенеза у Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (тобто, канола) Glycine max, Nicotiana tabacum, цукровий буряк (Beta vulgaris) і Oryza sativa (Sebastian та ін. (1989) Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson та ін., 1989 Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Newhouse та ін. (1991) Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan та ін. (1991) Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourand та ін. (1993) J. Heredity 84:91-96; Wright and Penner (1998) Theor. Appl. Genet. 96:612-620; патент США 5,545,822). У всіх випадках, один, частково домінуючий ядерний ген дає стійкість. Чотири стійкі до імідазолінонів рослини пшениці були також попередньо ізольовані після мутагенезу насіння Triticum aestivum L. cv. Fidel (Newhouse та ін. (1992) Plant Physiol. 100:882-886). Дослідження спадковості підтверджують, що один, частково домінуючий ген надає стійкість. Базуючись на алельних дослідженнях, автори дійшли висновку, що мутації в чотирьох тотожних лініях були локалізовані в тому ж локусі. Один з генів стійкості сорту Фіделя був позначений FS-4 (Newhouse та ін. (1992) Plant Physiol. 100:882-886). Природні популяції рослин, які були відкриті як стійкі до імідазолінонових та/або сульфонілсечовинних гербіцидів були також використані для створення гірбіцидо-стійких 1 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виведених ліній соняшнику. Нещодавно, дві лінії соняшнику, які стійкі до сульфонілсечовинного гербіциду, були створені, використовуючи зародкову плазму, що походить від звичайного соняшнику дикої популяції (Helianthus annuus), як джерело гербіцидо-стійкої особливості (Miller та Al-Khatib (2004) Crop Sci. 44:1037-1038). Попередньо, White та ін. ((2002) Weed Sci. 50:432437) повідомив, що представники дикої популяції звичайного соняшнику з Південної Дакоти, США, були перехресно-стійкі до імідазолінонових та сульфонілсечовинних гербіцидів. Аналіз частини кодуючої зони генів великої субодиниці ацетогідроксидної синтази (AHASL) представників цієї популяції виявив точкову мутацію в результаті заміні амінокислоти Ala-на-Val в AHASL білку соняшнику, що відповідає Ala205 в AHASL білку Arabidopsis thaliana дикого типу (White та ін. (2003) Weed Sci. 51:845-853). Комп'ютерне моделювання трьохмірної структури комплексу AHAS-інгібітор передбачає окремі амінокислоти в запропонованій інгібітор-зв'язуючій кишені як сайти, де вимушені мутації ймовірно б надавали селективну стійкість до імідазолінонів (Ott та ін. (1996) J. Mol. Biol. 263:359368). Рослини пшениці, одержані з деякими з цих раціонально виконаних мутацій в запропонованих сайтах зв'язування ферменту AHAS, фактично проявляли специфічну стійкість до одного класу гербіцидів (Ott та ін. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368). Стійкі до імідазолінонових гербіцидів рослини були також згадані у ряді патентів. Патенти США № 4,761,373, 5,331,107, 5,304,732, 6,211,438, 6,211,439 та 6,222,100 загалом описують застосування зміненого гена AHAS для виявлення стійкості до гербіциду у рослин, і особливо розкриває певні злакові лінії, стійкі до імідазолінонів. Патент США № 5,013,659 розкриває рослини, що проявляють стійкість до гербіциду завдяки мутаціям як мінімум однієї амінокислоти в одній або більше консервативних зонах. Мутації, описані там, кодують будь-яку перехресну стійкість до імідазолінонів та сульфонілуреаз або сульфонілсечовинну специфічну стійкість, але не описана імідазолінонова специфічна стійкість. Патент США № 5,731,180 та патент США № 5,767,361 розглядають ізольований ген, що має одну амінокислотну заміну в амінокислотній послідовності AHAS однодольних дикого типу, як результат є імідазоліноново-специфічна стійкість. Крім того, рослини рису, стійкі до гербіцидів, які протидіють AHAS, були створені мутаційною селекцією, а також селекцією гербіцидо-стійких рослин з сукупності рослин рису, що продукуються культурою пильовиків. Дивись патенти США № 5,545,822, 5,736,629, 5,773,703, 5,773,704, 5,952,553 і 6,274,796. В рослин, як у всіх інших дослідних організмах, фермент AHAS складається з двох субодиниць: великої субодиниці (каталітична роль) і малої субодиниці (регуляторна роль) (Duggleby та Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36). Велика субодиниця AHAS (також згадується тут як AHASL) може кодуватися одним геном як у випадку Arabidopsis, рису і цукрового буряку або представників множинної родини генів як маїсу, каноли та бавовни. Специфічні одно-нуклеотидні заміни у великій субодиниці надають ферменту ступінь нечутливості до одного або більше класів гербіцидів (Chang і Duggleby (1998) Biochem J. 333:765-777). Наприклад, кормова пшениця, Triticum aestivum L., містить три гомологічні гени великої субодиниці ацетогідроксильної синтази. Кожний з генів проявляє значну експресію, що базується на гербіцидній відповіді і біохімічних даних мутантів в кожному з трьох генів (Ascenzi та ін. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref. No. S10-17). Кодуючі послідовності всіх трьох генів мають просторову гомологію на нуклеотидному рівні (WO 03/014357). Через упорядкованість AHASL генів від окремих різновидів Triticum aestivum молекулярна основа толерантності до гербіциду в найбільш IMI-толерантних (імідазоліно-толерантний) лініях була знайдена як мутація S653(на)N, вказуючи на заміну серину на аспарагін в еквівалентному положенні до серину в амінокислоті 653 в Arabidopsis thaliana (WO 03/01436; WO 03/014357). Ця мутація відбувається завдяки одному нуклеотидному поліморфізму (SNP) в послідовності ДНК, що кодує білок AHASL. Також відомо, що множинні гени AHASL зустрічаються в дводольних видах рослин. Нещодавно, Kolkman і інші. ((2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147–1159) повідомили про розпізнавання, клонування та секвенування трьох генів AHASL (AHASL1, AHASL2, і AHASL3) генотипів гербіцидо-стійкого і дикого типу соняшнику (Helianthus annuus L.). Kolkman і інші повідомили, що гербіцидо-стійкість виявлялась або завдяки заміні Pro197Leu (використовуючи номенклатуру положення амінокислоти AHASL Arabidopsis), або заміні Ala205Val в білку AHASL1, і що кожна з цих замін забезпечувала стійкість як до імідазолінонових, так і до сульфонілсечовинних гербіцидів. Підтверджена висока ефективність та низька токсичність імідазолінонових гербіцидів надає переваги для застосування їх в сільському господарстві. Проте, здатність використовувати імідазолінонові гербіциди в специфічній системі рослинництва залежить від наявності інтересу 2 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до імідазоліноно-стійких різновидів культурних рослин. Щоб створювати такі імідазоліноно-стійкі різновиди, селекціонери рослин повинні розробляти селекційні лінії з імідазоліноно-стійкою ознакою. Тому потрібні додаткові імідазоліноно-стійкі селекційно виведені лінії і різновиди урожайних рослин, також як і методи і композиції для їх створення та застосування імідазоліноно-стійких селекційних ліній і різновидів. СТИСЛИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід передбачає підвищення стійкості рослин соняшнику до гербіцидів у порівнянні із рослиною соняшнику дикого типу. Зокрема, рослини соняшнику за винаходом мають підвищену стійкість до імідазолінонових гербіцидів у порівнянні із рослинами соняшнику дикого типу. Гербіцидо-стійкі рослини соняшнику за винаходом включають мінімум одну копію гена або полінуклеотид, що кодує велику субодиницю гербіцидо-стійкої ацетогідроксидної синтази (AHASL). Такий гірбіцидо-стійкий білок AHASL включає ізолейцин в 188 амінокислотному положенні або еквівалентному положенні. Гербіцидо-стійка рослина соняшнику за винаходом може містити один, два, три, чотири, п'ять, шість, або більше копій гена або полінуклеотид, що кодує гербіцидо-стійкий білок AHASL за винаходом. Рослини соняшнику за винаходом також включають насіння і нащадки рослин, які включають як мінімум одну копію гена або полінуклеотид, що кодує гербіцидо-стійкий білок AHASL за винаходом. В одному втіленні, даний винахід передбачає гербіцидо-стійкі рослини соняшнику з лінії соняшнику, яка позначена як MUT9. Зразок насіння лінії MUT9 депоновано Американською колекцією типових культур (ATCC) під ATCC патентним депозитарним номером PTA-6325. Такі MUT9 рослини соняшнику містять в своїх геномах ген AHASL1, який включає нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO 1 і яка кодує білок AHASL1, що містить амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO 2. При порівнянні амінокислотної послідовності AHASL1 білку (SEQ ID NO 4), який кодується AHASL1 геном (SEQ ID NO 3) рослини соняшнику дикого типу, амінокислотна послідовність SEQ ID NO 2 відрізняється від амінокислотної послідовності дикого типу однією амінокислотою. В амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO 2, в амінокислотному положенні 102 знаходиться ізолейцин. Це положення відповідає положенню 188 в первинному білку AHASL1 соняшнику, що кодується нуклеотидною послідовністю, представленою SEQ ID NO 24 (Зразок № AY541451). В амінокислотній послідовності AHASL1 дикого типу за винаходом (SEQ ID NO 4) цією еквівалентною амінокислотою є треонін. Якщо не вказано інше, амінокислотні положення білків соняшнику AHASL, що розглядаються тут, відповідають амінокислотним положенням первинної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO 24. Даний винахід окрім того передбачає ізольовані полінуклеотиди та ізольовані поліпептиди соняшникових (Helianthus annuus) білків AHASL. Полінуклеотиди за винаходом включають нуклеотидні послідовності, що кодують гербіцидо-стійкі та дикого типу білки AHASL, включаючи, але не обмежуючись білками, що кодуються генами соняшнику AHASL1, AHASL2, і AHASL3. Гербіцидо-стійкі білки AHASL соняшнику за винаходом є імідазоліноно-стійкими білками AHASL, які містять іншу за треонін амінокислоту в 188 положенні первинного білку AHASL1 або в еквівалентному положенні. Краще, амінокислотою в положенні 188 або еквівалентному положенні є ізолейцин. Полінуклеотиди за винаходом включають нуклеотидні послідовності, представлені в SEQ ID NO 1 і 3, нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO 2 і 4, і фрагменти та варіанти означених нуклеотидних послідовностей, що кодують білки, які проявляють AHAS активність. Даний винахід передбачає касети експресії для експресії полінуклеотидів за винаходом в рослинах, клітинах рослин та інших клітинах-хазяїна, що не належать до людини. Касети експресії містять промотор, що експресується в рослині, рослинній клітині чи інших клітинаххазяїна, функціонально зв’язаний з полінуклеотидом за винаходом, що кодує або дикий тип або гербіцидо-стійкий білок AHASL. У разі необхідності для націленої експресії у хлоропласті, касета експресії може також містити функціонально зв’язану хлоропласт-націлюючу послідовність, яка кодує хлоропластний транзитний пептид для спрямування експресованого AHASL до хлоропласту. Касети експресії за винаходом використовуються в способі підсилення гербіцидної стійкості рослин та клітин хазяїна. Спосіб включає трансформування рослини чи клітини хазяїна касетою експресії за винаходом, де касета експресії включає промотор, який є експресуючим в рослині або клітині хазяїна, що цікавить, та промотор, функціонально зв’язаний з полінуклеотидом за винаходом, який кодує гербіцидо-стійкий білок AHASL за винаходом. Спосіб окрім того включає відновлення трансформованої рослини з трансформованої рослинної клітини. Даний винахід передбачає спосіб підвищення активності AHAS у рослини, що включає трансформування рослинної клітини полінуклеотидом, і передбачає включення нуклеотидної 3 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, функціонально зв’язаної з промотором, що стимулює експресію в рослинній клітині та відновлення трансформованої рослини з трансформованої рослинної клітини. Нуклеотидна послідовність, вибрана з тих нуклеотидних послідовностей, які кодують гербіцидостійкі або білки дикого типу AHASL за винаходом, особливо нуклеотидних послідовностей, представлених в SEQ ID NO 1 і 3, та нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO 2 і 4, і їх фрагменти та варіанти. При порівнянні із нетрансформованою рослиною, рослина, створена за цим способом містить підвищену активність AHAS або підвищену гербіцидо-стійку активність AHAS. Даний винахід передбачає спосіб виробництва гербіцидо-стійкої рослини, що включає трансформування рослинної клітини полінуклеотидом, і передбачає включення нуклеотидної послідовності, функціонально зв’язаної з промотором, що стимулює експресію в рослинній клітині та відновлення трансформованої рослини з вказаної трансформованої рослинної клітини. Нуклеотидна послідовність, вибрана з таких нуклеотидних послідовностей, які кодують гербіцидо-стійкі або білки дикого типу AHASL за винаходом, особливо нуклеотидної послідовності, представленої в SEQ ID NO 1, та нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO 2, і їх фрагменти та варіанти. При порівнянні із нетрансформованою рослиною, гербіцидо-стійка рослина, створена за цим способом, містить підсилену стійкість до щонайменше одного гербіциду, особливо імідазолінонового гербіциду. Даний винахід передбачає спосіб підсилення гербіцидної толерантності у гербіцидотолерантної рослини. Спосіб знаходить застосування у підсиленні стійкості рослини, яка вже стійка до рівня гербіциду, який зруйнував би або істотно пошкодив рослину дикого типу. Така гербіцидо-толерантна рослина може бути гербіцидо-толерантною рослиною, у якої гербіцидотолерантність була генетично сконтруйована або гербіцидо-толерантної рослини, що була отримана без залучення рекомбінантної ДНК, такі як наприклад, рослини соняшнику MUT9 даного винаходу. Спосіб включає трансформування гербіцидо-толерантної рослини полінуклеотидом, і передбачає включення нуклеотидної послідовності, функціонально зв’язаної з промотором, що стимулює експресію в рослинній клітині, та відновлення трансформованої рослини з вказаної трансформованої рослинної клітини. Нуклеотидна послідовність, вибрана з таких нуклеотидних послідовностей, які кодують гербіцидо-стійкі білки AHASL за винаходом, особливо нуклеотидної послідовності, представленої в SEQ ID NO 1, нуклеотидних послідовностей, що кодують амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO 2, і їх фрагменти та варіанти. Даний винахід передбачає трансформаційні вектори, що містять ген селектуючого маркера за винаходом. Ген селектуючого маркера містить промотор, що стимулює експресію в клітині хазяїна, функціонально зв’язаного з полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує гербіцидо-стійкий білок AHASL за винаходом. Трансформаційний вектор може додатково містити цікавлячий ген, який експресується в клітині хазяїна, і може також, якщо є бажаним, включати хлоропласт-націлювальну послідовність, яка функціонально зв’язується з полінуклеотидом за винаходом. Даний винахід окрім того передбачає способи застосування трансформаційних векторів за винаходом для селекціонування трансформованих клітин з цікавлячим геном. Такі способи включають трансформацію клітини хазяїна трансформаційним вектором, впливаючи на клітину рівнем імідазолінонового гербіциду, який зруйнував би або інгібував ріст нетрансформованої клітини хазяїна, і ідентифікацію трансформованої клітини хазяїна за його здатністю рости в присутності гербіциду. В одному втіленні винаходу, клітина хазяїн - це рослинна клітина та ген селектуючого маркеру, що містить промотор, який стимулює експресію в рослинній клітині. Даний винахід передбачає спосіб контролювання бур'янів в оточуючому гербіцидо-стійкими рослинами просторі за винаходом, включаючи гербіцидо-стійкі рослини соняшнику, описані вище і трансформовані рослини з гербіцидо-стійким полінуклеотидами AHASL за винаходом. Такі трансформовані рослини містять в своїх геномах щонайменше одну касету експресії, що включає промотор, який стимулює експресію гену в рослинній клітині, в якій промотор функціонально зв’язується з полінуклеотидом AHASL за винаходом. Спосіб включає використання ефективної кількості гербіциду для бур'янів та гербіцидо-стійкої рослини, де гербіцидо-стійка рослина має підвищену стійкість до щонайменше одного гербіциду, особливо імідазолінонового гербіциду, у порівнянні з диким типом або трансформованою рослиною. Рослини за даним винаходом можуть бути трансгенними та нетрансгенними. Приклади нетрансгенної рослини соняшнику, що має підвищену стійкість до імідазолінонового та/або сульфонілсечовинного гербіцидів, включають рослину соняшнику (MUT9), що має ATCC патентий депозитарний номер PTA-6325; або мутант, рекомбінант, або генетично 4 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сконструйоване похідне рослини, що ATCC патентий депозитарний номер PTA-6325; або будьякий нащадок рослини, що має ATCC патентий депозитарний номер PTA- 6325; або рослина, що є нащадком будь-якої з цих рослин; або рослина, що має гербіцидо-стійкі характеристики рослини, яка має ATCC патентий депозитарний номер PTA-6325. Даний винахід також передбачає рослини, органи рослин, тканини рослин, рослинні клітини, насіння та клітини хазяїна нелюдського походження, трансформовані щонайменше одним полінуклеотидом, касетою експресії чи трансформаційним вектором за винаходом. Такі трансформовані рослини, органи рослин, тканини рослин, рослинні клітини, насіння та клітини хазяїна нелюдського походження мають підсилену толерантність або стійкість щонайменше до одного гербіциду, в рівні гербіциду, що викликає загибель або інгібує ріст нетрансформованої рослини, тканини рослин, рослинної клітини або клітини хазяїна нелюдського походження, відповідно. Краще, трансформовані рослини, тканини рослин, рослинні клітини та насіння за винаходом є Arabidopsis thaliana та культурні рослини. Даний винахід окрім того передбачає ізольовані поліпептиди, що місять імідазоліно-стійкі та дикого типу білки AHASL соняшнику. Ізольовані поліпептиди включають амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID No 2 і 4, амінокислотні послідовності кодовані нуклеотидними послідовностями, представленими в SEQ ID No 1 та 3, та фрагменти і варіанти вказаних амінокислотних послідовностей, які кодують білки, що проявляють AHAS активність. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фігура 1 - це нуклеотидна послідовність розміщення кодуючих послідовностей гербіцидостійкого гена AHASL1 соняшнику (MUT9 SUNALS1; SEQ ID No 1), гена AHASL1 (RHA266; SEQ ID No 3) соняшнику дикого типу, гена AHASL Arabidopsis thaliana (GenBank Зразок № NM_114714; SEQ ID No 9, гена AHASL Zea mays (GenBank Зразок № X63553; SEQ ID No 25) гербіцидо-стійкого гена AHASL з Xanthium sp. (GenBank Зразок № U16279; SEQ ID No 5), і гена дикого типу AHASL з Xanthium sp. (GenBank Зразок № U16280; SEQ ID No 7). Місцезнаходження мутації в MUT SUNALS1 (SEQ ID No 1) вказується зірочкою. Мутація - це заміна C-на-T в нуклеотидному положенні 305 SEQ ID No 1. Фігура 2 - це амінокислотна послідовність розміщення гербіцидо-стійкого білку AHASL1 соняшнику (MUT9 SUNALS1; SEQ ID No 2), білку AHASL1 соняшнику дикого типу (RHA266; SEQ ID NO 4), білку AHASL Arabidopsis thaliana (GenBank Зразо, № NM_114714; SEQ ID No 10) , білку AHASL Zea mays (GenBank Зразо, № X63553; SEQ ID No 26) гербіцидо-стійкого білку AHASL з Xanthium sp. (GenBank Зразо, № U16279; SEQ ID No 6), і білку AHASL дикого типу з Xanthium sp. (GenBank Зразо, № U16280; SEQ ID No 8). Зірочка вказує місцезнаходження заміни однієї амінокислоти (Thr-на-Ile), знайденої в гербіцидо-стійкому білку AHASL1 соняшнику. Це місцезнаходження заміни відповідає амінокислотному положенню 102 в амінокислотній послідовності часткової довжини AHASL1, представленої в SEQ ID No 2. Еквівалентне положення такої заміни в первинній амінокислотній послідовності AHASL1 соняшнику, представленої в SEQ ID No 24, складає 188. ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ Нуклеотидна та амінокислотна послідовності перераховані в супровідному переліку послідовностей показують використання стандартних буквених абревіатур для нуклеотидів та трибуквеного коду для амінокислот. Нуклеотидні послідовності ідуть за стандартною умовою, що починається на 5' кінці послідовності, і продовжуються вперед (тобто, зліва направо в кожному ланцюгу) до 3' кінця. Тільки один ланцюг кожної нуклеотидної послідовності, як показано, але зрозуміло комплементарний ланцюг, буде включений як будь-яке посилання представленого ланцюга. Амінокислотні послідовності ідуть за стандартною умовою, що починаються аміно кінцем послідовності, і слідує вперед (тобто, зліва направо в кожному ланцюгу) до карбоксильного кінця. SEQ ID NО 1 демонструє часткову нуклеотидну послідовність, що кодує гербіцидо-стійкий AHASL1 білок MUT9 лінії соняшнику. SEQ ID NО 2 демонструє часткову амінокислотну послідовність гербіцидо-стійкого AHASL1 білку, кодованого нуклеотидною послідовністю, описаною в SEQ ID NO 1. SEQ ID NO 3 демонструє часткову нуклеотидну послідовність, що кодує білок AHASL1 дикого типу RHA266 лінії соняшнику. SEQ ID NO 4 демонструє часткову амінокислотну послідовність білку AHASL1 дикого типу, кодованого нуклеотидною послідовністю, описаною в SEQ ID NO 3. SEQ ID NO 5 - це нуклеотидна послідовність GenBank Зразок No U16279. SEQ ID NO 6 - це амінокислотна послідовність, кодована нуклеотидною послідовністю GenBank Зразок No U16279. SEQ ID NO 7 - це нуклеотидна послідовність GenBank Зразок No U16280. 5 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO 8 - це амінокислотна послідовність, кодована нуклеотидною послідовністю GenBank Зразок No U16280. SEQ ID NO 9 - це нуклеотидна послідовність GenBank Зразок No NM_114714. SEQ ID NO 10 - це амінокислотна послідовність, кодована нуклеотидною послідовністю GenBank Зразок No NM_114714. SEQ ID NO 11 демонструє нуклеотидну послідовність C2359-FI праймера, описаного в Прикладі 2. SEQ ID NO 12 демонструє нуклеотидну послідовність ALSRI праймера, описаного в Прикладі 2. SEQ ID NO 13 демонструє нуклеотидну послідовність SUNALS1-F1 праймера, описаного в Прикладі 2. SEQ ID NO 14 демонструє нуклеотидну послідовність ALS1-8R праймера, описаного в Прикладі 2. SEQ ID NO 15 демонструє нуклеотидну послідовність ALS-2R праймера, описаного в Прикладі 2. SEQ ID NO 16 демонструє нуклеотидну послідовність ALS-2F праймера, описаного в Прикладі 2. SEQ ID NO 17 демонструє нуклеотидну послідовність ALS-3R праймера, описаного в Прикладі 2. SEQ ID NO 18 демонструє нуклеотидну послідовність ALS-3F праймера, описаного в Прикладі 2. SEQ ID NO 19 демонструє нуклеотидну послідовність ALS-4F праймера, описаного в Прикладі 2. SEQ ID NO 20 демонструє нуклеотидну послідовність ALS-6R праймера, описаного в Прикладі 2. SEQ ID NO 21 демонструє нуклеотидну послідовність ALS-7F праймера, описаного в Прикладі 2. SEQ ID NO 22 демонструє нуклеотидну послідовність ALS-8F праймера, охарактризованого в Прикладі 2. SEQ ID NO 23 - це нуклеотидна послідовність GenBank Зразок No. AY541451. SEQ ID NO 24 - це амінокислотна послідовність, кодована нуклеотидною послідовністю GenBank Зразок No. AY41451. SEQ ID NO 25 - це нуклеотидна послідовність GenBank Зразок No. X63553. SEQ ID NO 26 - це амінокислотна послідовність, кодована нуклеотидною послідовністю GenBank Зразок No. X63553. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід стосується рослин соняшнику, що мають підвищену стійкість до гербіцидів у порівнянні із рослиною соняшнику дикого типу. Гербіцидо-стійкі рослини соняшнику були створені, як описано нижче, під впливом на рослини соняшнику дикого типу (щодо стійкості до гербіциду) мутагену, що дозволяє рослинам дозрівати та відтворюватись, та селекцією нащадків рослин, що показують підсилену стійкість до імідазолінонового гербіциду, відносно стійкості рослини соняшнику дикого типу. Винахід передбачає гербіцидо-стійку лінію соняшнику, яка надалі позначається як MUT9. Кодуюча область гену великої субодиниці ацетогідроксидної синтази (позначеної як AHASL1) гербіцидо-стійких MUT9 рослин соняшнику та рослин соняшнику дикого типу була ізольована за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (PCR) ампліфікацією та секвенуванням. За допомогою порівняння полінуклеотидних послідовностей рослин соняшнику гербіцидо-стійких і дикого типу, було встановлено, що кодуюча область полінуклеотидної послідовності AHASL1 гербіцидо-стійкої рослини соняшнику відрізняється від полінуклеотидної послідовності AHASL1 рослини дикого типу одиним нуклеотидом, заміною в 305 нуклеотиді Cна-T (SEQ ID NO 1). Ця заміна C-на-T в полінуклеотидній послідовності AHASL1 приводить до заміни треоніну-на-ізолейцин в 102 амінокислоті в консервативній області передбаченої амінокислотної послідовності гербіцидо-стійкого AHASL1 білку соняшнику (SEQ ID NO 2) відносно положення еквівалентної амінокислоти AHASL1 білку дикого типу лінії соняшнику RHA266 (амінокислота 108 SEQ ID NO 4). Так як нуклеотидна послідовність, демонстрована в SEQ ID NO 1, не відповідає первинній кодуючій області AHASL білку, амінокислотна послідовність, кодована такою яка демонстрована в SEQ ID NO 2, є також меншою за первинну. Щоб полегшити порівняння з іншими амінокислотними послідовностями ASHAL соняшнику, положення амінокислот білків AHASL соняшнику, що тут розглядаються, якщо не вказано інше або видно з контексту, в яких такі 6 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 положення з'являються, відповідають положенням амінокислот первинної амінокислотної послідовності білку AHASL1 соняшнику, кодованого нуклеотидною послідовністю, що має GenBank Зразок No. AY541451 (SEQ ID NO 24). Відповідно, заміна треоніну на ізолейцин в положенні амінокислоти 102 SEQ ID NO 2 відповідає положенню амінокислоти 188 в амінокислотній послідовності SEQ ID NO 24. Не дивлячись на те, що відома різноманітність амінокислотних замін в білках AHASL дикого типу для надання стійкості рослини до гербіциду, експресія такого заміщеного білку AHASL, що включає заміну амінокислоти в положенні 188 або еквівалентному положенні (наприклад, положенні 203 в білку AHASL Arabidopsis, кодованого нуклеотидною послідовністю, описаною в GenBank Зразок No. X51514), і яка надає стійкості рослини до гербіциду, що містить такий AHASL білок, не була попередньо розкрита. Див., Приклад 5 нижче. Див. також, Hartnett та ін. (1990) "Herbicide-resistant plants carrying mutated acetolactate synthase genes," In: Managing Resistance to Agrochemicals: Fundamental Research to Practical Strategies, Green та ін. (eds.), American Chemical Soc. Symp., Series No. 421, Washington, DC, USA; Simpson (1998) Down to Earth 53(1):26-35; Bruniard (2001) Inheritance of imidazolinone resistance, characterization of crossresistance pattern, and identification of molecular markers in sunflower (Helianthus annuus L.), Ph.D. Thesis, North Dakota State University, Fargo, ND, USA, pp 1-78.; White та ін. (2002) Weed Sci. 50:432-437; та Kolkman та ін. (2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147–1159; включені в опис як посилання. Тому, даний винахід розкриває нову амінокислотну заміну, яка може використовуватися для продукування гербіцидо-стійких білків AHASL соняшнику, полінуклеотидів, що кодують такі білки, і гербіцидо-стійких рослин, тканин рослин, рослинних клітин, і насіння. Так як треонін, знайдений в положенні амінокислоти 188 в білках AHASL1 соняшнику дикого типу, або еквівалентному положенні в інших білках AHASL, знаходиться в межах амінокислотної області, збереженої різновидами рослин, чекають, що заміна на іншу амінокислоту, краще ізолейцин, для цього ж зберігається треонін в інших білках AHASL соняшнику (наприклад, AHASL2 і AHASL3 соняшнику) або інших різновидів рослин, приведе до гербіцидо-стійкості білків AHASL. Відповідно, такі гербіцидо-стійкі білки AHASL і полінуклеотиди, що кодують їх, використовуються в одержанні гербіцидо-стійких рослин, рослинних клітин, тканин рослин і насіння, за допомогою розкритих тут методів. Даний винахід додатково включає ізольовані полінуклеотиди AHASL2 і AHASL3 соняшнику, які кодують гербіцидо-стійкі білки AHASL2 і AHASL3 відповідно. Кожний з таких гербіцидостійких білків AHASL2 і AHASL3 містить іншу за треонін амінокислоту в положенні 188 або еквівалентному в положенні. Краще в таких гербіцидо-стійких білках AHASL2 і AHASL3 амінокислотою в положенні 188 або еквівалентному положенні є ізолейцин. Винахід окрім того стосується ізольованих полінуклеотидних молекул, що включають нуклеотидні послідовності, які кодують білки великої субодиниці ацетогідроксидної синтази (AHASL) і такі білки AHASL. Винахід розкриває ізоляцію і нуклеотидну послідовність полінуклеотиду, що кодує гербіцидо-стійкий білок AHASL1 соняшнику гербіцидо-стійкої рослини соняшнику, яка була отримана за допомогою хімічного мутагенезу рослин соняшнику дикого типу. Гербіцидо-стійкі білки AHASL1 соняшнику за винаходом мають заміну треоніну на ізолейцин в положенні 188 в їх відповідних амінокислотних послідовностях, у порівнянні з відповідною амінокислотною послідовністю дикого типу. Винахід окрім того розкриває ізоляцію і нуклеотидну послідовність полінуклеотидної молекули, що кодує білок AHASL1 соняшнику дикого типу. Даний винахід передбачає ізольовані полінуклеотидні молекули, які кодують білки AHASL соняшнику (Helianthus annuus L.). Особливо, винахід передбачає ізольовані полінуклеотидні молекули, що містять: нуклеотидні послідовності, демонстровані в SEQ ID NOS: 1 і 3, нуклеотидні послідовності, що кодують білки AHASL, які включають амінокислотні послідовності, демонстровані в SEQ ID NOS: 2 і 4 та фрагменти і варіанти таких нуклеотидних послідовностей, які кодують функціональні білки AHASL. Ізольовані гербіцидо-стійкі AHASL полінуклеотидні молекули за винаходом включають нуклеотидні послідовності, які кодують гербіцидо-стійкі білки AHASL. Такі полінуклеотидні молекули можуть використовуватися в полінуклеотидних конструкціях для трансформації рослин, особливо культурних рослин, для підсилення стійкості рослин до гербіцидів, особливо гербіциди, які відомі для інгібування AHAS активності, більш особливо імідазолінонових гербіцидів. Такі полінуклеотидні конструкції можуть використовуватися в касетах експресії, векторах експресії, трансформаційних векторах, плазмідах тощо. Трансгенні рослини, отримані нижченаведеною трансформацією такими полінуклеотидними конструкціями, показують 7 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підвищену стійкість до AHAS-інгібуючих гербіцидів, як наприклад, імідазолінонових та сульфонілсечовинних гербіцидів. Композиції за винаходом включають нуклеотидні послідовності, які кодують білки AHASL. Зокрема, даний винахід передбачає ізольовані полінуклеотидні молекули, що включають нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності, демонстровані в SEQ ID NOS: 2 і 4 та фрагменти і їх варіанти, які кодують поліпептиди, що проявляють AHAS активність. Окрім того передбачено є поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, кодовану полінуклеотидною молекулою, описаною тут, наприклад такі, що демонстровані в SEQ ID NOS: 1 і 3, та фрагменти і їх варіанти, які кодують поліпептиди, що проявляють AHAS активність. Винахід включає ізольовані або по суті очищені нуклеїнові кислоти або білкові композиції. "Ізольована" або "очищена", полінуклеотидна молекула або білок, або біологічно активна його частина, істотно або по суті вільна від компонентів, які звичайно супроводжують або взаємодіють з полінуклеотидною молекулою або білком, як знайдено в його природному оточенні. Тому, ізольована або очищена полінуклеотидна молекула або білок, по суті вільна від іншого клітинного матеріалу, або культурального середовища, одержується рекомбінантними методами, або істотно вільні від хімічних передвісників або інших хімікатів коли хімічно синтезуються. Краще, "ізольована" нуклеїнова кислота, вільна від послідовностей (краще кодуючі послідовності білку), що природно розміщуються з двох сторін нуклеїнової кислоти (тобто, послідовності, розміщені на 5' і 3' кінцях нуклеїнової кислоти) в геномі ДНК організму, від якого нуклеїнова кислота отримана. Наприклад, в різних втіленнях, ізольована полінуклеотидна молекула може містити менш ніж приблизно 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0.5 т.п.н., або 0.1 т.п.н. нуклеотидних послідовностей, що природно розміщуються з двох сторін полінуклеотиднної молекули в геномній ДНК клітини, з якої нуклеїнова кислота отримана. Білок, який по суті вільний від клітинного матеріалу, включає препарати білку, що мають менш ніж приблизно 30%, 20%, 10%, 5%, або 1% (на суху вагу) контамінованого білку. Коли білок за винаходом або біологічно активна його частина рекомбінантно отримані, краще культуральне середовище представляє менш ніж приблизно 30%, 20%, 10%, 5%, або 1% (на суху вагу) вихідних хімічних речовин або небілкових необхідних хімічних речовин. Даний винахід передбачає ізольовані поліпептиди, що включають білки AHASL. Ізольовані поліпептиди включають амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з амінокислотних послідовностей, демонстрованих в SEQ ID NOS: 1 і 3, та функціональні фрагменти і варіанти вказаних амінокислотних послідовностей, які кодують поліпептид AHASL, що проявляє AHAS активність. "Функціональні фрагменти і варіанти" - це фрагменти і варіанти наведених поліпептидів, які проявляють AHAS активність. В певних втіленнях винаходу, способи включають застосування гербіцидо-толерантних або гербіцидо-стійких рослин. Під "гербіцидо-толерантною або "гербіцидо-стійкою" рослиною мається на увазі рослина,яка є толерантною або стійкою до щонайменше одного гербіциду у кількості, яка звичайно знищує, або інгібує ріст звичайної або рослини дикого типу. В одному втіленні винаходу, гербіцидо-толерантні рослини за винаходом включають гербіцидотолерантний або гербіцидо-стійкий білок AHASL. Під "гербіцидо-толерантним білком AHASL" або "гербіцидо-стійким білком AHASL" мається на увазі такий білок AHASL, що проявляє вищу активність AHAS, по відношенню до активності білку AHAS дикого типу, коли в присутності щонайменше одного гербіциду, що, як відомо, протидіє AHAS активності і в концентрації або кількості гербіциду, яка інгібує AHAS активність білку AHASL дикого типу. До того ж, AHAS активність такого гербіцидо-толерантного або гербіцидо-стійкого білку AHASL може бути позначена далі як "гербіцидо-толерантна" або "гербіцидо-стійка" AHAS активність. Для даного винаходу, терміни "гербіцидо-толерантний" і "гербіцидо-стійкий" використовуються взаємозамінно і мають на увазі еквівалентне значення і еквівалентний об’єм. Так само, терміни "гербіцидо-толерантність” і "гербіцидо-стійкість” використовуються взаємозамінно і мають на увазі еквівалентне значення і еквівалентний об’єм. Також, "імідазоліноно-стійкий" і "імідазоліноно-стійкість" використовуються взаємозамінно і мають на увазі еквівалентне значення і еквівалентний об’єм як і терміни "імідазоліноно-толерантний" і "імідазоліноно-толерантність", відповідно. Винахід включає гербіцидо-стійкі полінуклеотиди AHASL і гербіцидо-стійкі білки AHASL. Під "гербіцидо-стійким полінуклеотидом AHASL" мається на увазі полінуклеотид, який кодує білок, що проявляє гербіцидо-стійку AHAS активність. Під "гербіцидо-стійким білком AHASL" мається на увазі білок або поліпептид, який проявляє гербіцидо-стійку AHAS активність. Надалі, визнають, що гербіцидо-толерантний або гербіцидо-стійкий білок AHASL може бути введений в рослину за допомогою трансформації рослини або попередника його нуклеотидною послідовністю, що кодує гербіцидо-толерантний або гербіцидо-стійкий білок AHASL. Такі 8 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гербіцидо-толерантні або гербіцидо-стійкі білки AHASL кодуються гербіцидо-толерантними або гербіцидо-стійкими полінуклеотидами AHASL. Альтернативно, гербіцидо-толерантний або гербіцидо-стійкий білок AHASL може бути присутнім в рослині в результаті природно виникненої або індукованої мутації в ендогенному гені AHASL в геномі рослини або її попередника. Даний винахід передбачає рослини, тканини рослин, рослинні клітини і клітини хазяїна з підвищеною стійкістю або толерантністю щонайменше до одного гербіциду, особливо імідазолінонового або сульфонілсечовинного гербіциду. Краща кількість або концентрація гербіциду це "ефективна кількість" або "ефективна концентрація." Під "ефективною кількістю" і "ефективною концентрацією" мається на увазі кількість і концентрація, відповідно, яка достатня для знищення або інгібування росту подібної, дикого типу, рослини, тканини рослини, рослинної клітини, або клітини хазяїна, але вказана кількість не знищує або значно інгібує ріст гербіцидостійких рослин, тканин рослин, рослинних клітин і клітин хазяїна даного винаходу. В основному, ефективна кількість гербіциду - це кількість, яка звичайно використовується в агрокультурних виробничих системах для знищення цікавлячих бур'янів. Така кількість відома із рівня техніки або може легко визначатися, використовуючи відомі з рівня техніки методи. Гербіциди за даним винаходом протидіють активності ферменту AHAS і зменшують активність AHAS. Такі гербіциди позначаються далі як "AHAS-інгібуючі гербіциди" або просто "інгібітори AHAS". Використаний "AHAS-інгібуючий гербіцид" або "інгібітор AHAS" не означає обмеження одним гербіцидом, який протидіє активності ферменту AHAS. Тому, у відсутності протилежного, "AHAS-інгібуючий гербіцид" або “інгібітор AHAS” може бути одним гербіцидом або сумішшю двох, трьох, чотирьох або більше гербіцидів, кожний з яких протидіє активності ферменту AHAS. Під "подібною, дикого типу, рослиною, тканиною рослини, рослинною клітиною або клітиною хазяїна " мається на увазі рослина, тканина рослини, рослинна клітина, або клітина хазяїна, відповідно, яка не містить гербіцидо-стійкі характеристики та/або специфічний полінуклеотид за винаходом, який тут розкритий. Використання терміну "дикий тип" не має на увазі, що рослина, тканина рослини, рослинна клітина або інші клітини хазяїна не містять рекомбінантну ДНК в їх геномі, та/або не прояляють гірбіцидо-стійкі характеристики, які відмінні від розкритих тут. Використаний тут, за відсутності протилежного, термін "рослина" означає рослину на будьякій стадії розвитку, також як і будь-яку частину або частини рослини, яка може бути приєднана або відділена від цілої непошкодженої рослини. Такі частини рослини включають, без обмеження перерахованим, органи, тканини, і клітини рослини. Приклади специфічних частин рослини включають стебло, листя, коріння, суцвіття, бутон, квітку, плід, квітоніжку, плодоніжку, тичинку, пильовик, рильце, пестик, яєчник, пелюстку, чашолистик, плодолистик, верхівку коріння, кореневий чохлик, кореневу волосину, листкову волосину, волосину насіння, пилкове зерно, мікроспору, сім'ядолю, гіпокотиль, епікотиль, ксилему, флоему, паренхіму, ендосперму, клітину-супутник, замикаючу клітину і будь-які інші відомі органи, тканини і клітини рослини. До того ж, визнають, що насіння - це рослина. Рослини даного винаходу включають як нетрансгенні рослини так і трансгенні рослини. Під "нетрансгенною рослиною" мається на увазі рослина, яка не містить рекомбінантну ДНК в своєму геномі. Під "трансгенною рослиною" мається на увазі рослина, що містить рекомбінантну ДНК в своєму геномі. Така трансгенна рослина може бути отримана за допомогою введення рекомбінантної ДНК в геном рослини. Коли така рекомбінантна ДНК є включеною в геном трансгенної рослини, нащадок рослини може також містити рекомбінантну ДНК. Нащадок рослини, який містить щонайменше частину рекомбінантної ДНК мінінмум одного попередника трансгенної рослини є також трансгенною рослиною. Для цілей даного винаходу, за відсутності протилежного, “нащадок рослини” це будь-яка рослина за винаходом, що походить щонайменше від однієї рослини за винаходом і включає, без обмеження перерахованим, потомків першого, другого, третього, четвертого, п'ятого, шостого, сьомого, восьмого, дев'ятого і десятого покоління рослини за винаходом. Краще, такий нащадок або потомки володіють підвищеною стійкістю щонайменше до одного гербіциду у порівнянні із рослиною дикого типу. Більш краще, такий нащадок або потомки володіє підвищеною стійкістю до щонайменше одного імідазолінонового гербіциду у порівнянні із рослиною дикого типу. Навіть більш краще, такий нащадок або потомки володіють гербіцидостійкими характеристиками рослини з ATCC патентним депозитарним номером PTA-6325, і/ або гербіцидо-стійкий білок AHASL, що містить ізолейцин в положенні амінокислоти 188 або еквівалентному положенні. Даний винахід передбачає гербіцидо-стійку лінію соняшнику, позначену далі як MUT9. Депоновано щонайменше 2375 насінини лінії соняшнику RHA266 MUT-9-1-1-2 (позначену далі як "MUT9") в Патентованому Депозитарії Американської Колекції Типових Культур (ATCC), 9 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Manassas, США VA 20110 розробленої 22 листопада 2004 і призначений ATCC патентний депозитарний номер PTA-6325. Завдяки браку насіння лінії MUT9, менш ніж 2500 насінин лінії MUT9 було спочатку представлено до ATCC. На 4 лютого 2005, Заявники дали додатковий завдаток 125 насінин до ATCC, щоб досягти в сумі щонайменше 2500 насінин. Депонування лінії соняшнику MUT9 було зроблено строком щонайменше на 30 років і щонайменше 5 років після самого недавнього запиту на надання депонованого зразка ATCC. Депонування захищається умовами Будапештського Договору про Міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для патентних цілей. Депонування лінії соняшнику MUT9 зроблено строком щонайменше на 30 років і щонайменше 5 років після самого недавнього запиту на надання депонованого зразка ATCC. Додатково, Заявники задовольнили всі вимоги 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809, включаючи забезпечення вказівки життєздатності зразка. Даний винахід передбачає гербіцидо-стійкі рослини соняшнику лінії MUT9, яка отримується завдяки мутаційної селекції. Рослини соняшнику дикого типу піддавалися мутації завдяки дії мутагену на рослини, особливо хімічного мутагену, а саме етилметансульфонату (EMS). Проте, даний винахід не обмежується гербіцидо-стійкими рослинами соняшнику, які отримані завдяки методу мутагенезу, що включає хімічний мутаген EMS. Будь-який метод мутагенезу, відомий з рівня техніки, може використовуватися для отримання гербіцидо-стійких рослин соняшнику за даним винаходом. Такі методи мутагенезу можуть включати, наприклад, використання одного або більше наступних мутагенів: випромінювання, наприклад рентгенівське випромінювання, гамма випромінювання (наприклад, кобальт 60 або цезій 137), нейтрони, (наприклад, продукт ядерного розпаду урану 235 в атомному реакторі), бетта випромінювання (наприклад, випромінюване радіоізотопами, як наприклад фосфором 32 або вуглецем 14) і ультрафіолетове випромінювання (краще від 2500 2900 нм), і хімічний мутагени, наприклад аналог основи (наприклад, 5-бромоурацил), пов'язані суміші (наприклад, 8-етоксикофеїн), антибіотики (наприклад, стрептонігрін), алкілуючі агенти (наприклад, сірчаний іприт, азотистий іприт, епоксиди, етиленаміни, сульфати, сульфонати, сульфони, лактони), азід, гідроксиламін, азотна кислота, або акрідини. Гербіцидо-стійкі рослини можуть також бути отриманні за допомогою використання методів селекції рослинних клітин, що містять гербіцидо-стійкі мутації, а потім генерацію таких гербіцидо-стійких рослин. Див., наприклад, Патенти США № 5,773,702 і 5,859,348, які повністю включені сюди як посилання. Подальші деталі мутаційної селекції можуть бути знайдені в “Principals of Cultivar Development” Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company, розкриття якої включено сюди як посилання. Аналіз гена AHASL1 рослини соняшнику лінії MUT9 показав, що мутація в результаті заміни ізолейцину на треонін знаходиться в положенні амінокислоти 188 в амінокислотній послідовності AHASL1 дикого типу у SEQ ID NO 4. Тому, даний винахід розкриває, що заміна іншою амінокислотою треоніну в положенні 188 може викликати у рослини соняшнику підсилення стійкості до гербіциду, особливо імідазолінонового та/або сульфонілсечовинного гербіциду. Як показано в Прикладі 5 нижче, треонін в положенні амінокислоти 188 належить до консервативної зони білків AHASL. Так само були відкриті заміни амінокислот в інших консервативних зонах білків AHASL, які, як відомо, надавали стійкість до гербіциду рослині, яка містила такий білок AHASL. Відповідно, гербіцидо-стійкі рослини соняшнику за винаходом включають, без обмеження перерахованим, такі рослини соняшнику, які містять в своїх геномах щонайменше одну копію AHASL полінуклеотиду, що кодує гербіцидо-стійкий білок AHASL, який містить ізолейцин в положенні амінокислоти 188 або еквівалентному положенні. Рослини соняшнику за винаходом окрім того включають рослини, які містять, відносно білку AHASL дикого типу, ізолейцин або іншу ніж треонін амінокислоту в положенні амінокислоти 188 або еквівалентному положенні та одну або більше додаткових амінокислотних замін в білку AHASL порівняно з білком AHASL дикого типу, де така рослина соняшнику має підвищену стійкість щонайменше до одного гербіциду у порівнянні із рослиною соняшнику дикого типу. Такі рослини соняшнику містять білки AHASL, які містять щонайменше один представник, вибраний з групи, що складається з: треоніну в амінокислотному положенні 107 або еквівалентному положенні; аланін, треонін, гістидин, лейцин, аргінін, ізолейцин, глутамін або серин в амінокислотному положенні 182 або еквівалентному положенні; аспартат або валін в амінокислотному положенні 190 або еквівалентному положенні; лейцин в амінокислотному положенні 559 або еквівалентному положенні; і аспарагін, треонін або фенілаланін в амінокислотному положенні 638 або еквівалентному положенні. Даний винахід передбачає білки AHASL з амінокислотними замінами в специфічних амінокислотних положеннях в межах консервативної зони білків AHASL соняшнику, розкритих тут. До того ж, середні спеціалісти визнають, що такі амінокислотні положення можуть мінятися в залежності від того, чи приєднані або вилучені амінокислоти з, наприклад, N-термінального 10 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кінця амінокислотної послідовності. Тому, винахід включає амінокислотні заміни в описаному положенні або еквівалентному положенні (наприклад, "положення амінокислоти 188 або еквівалентне положення"). Під "еквівалентним положенням" мається на увазі положення, яке є в межах такої консервативної зони як і проілюстроване амінокислотне положення. Такі консервативної зони відомі з рівня техніки (див. Таблицю 6 нижче) або можуть бути визначені багаторазовими порівняннями послідовності як відкритими тут, так і методами, відомими з рівня техніки. Крім того, даний винахід передбачає AHASL поліпептиди, що включають амінокислотні заміни, що, як відомі, надають рослинам стійкість щонайменше до одного гербіциду, особливо імідазолінонового гербіциду та/або сульфонілсечовинного гербіциду. Такі AHASL поліпептиди включають, наприклад, такі, що включають щонайменше один представник, вибраний з групи, що складається з: ізолейцину або іншої амінокислоти, окрім треоніну, в амінокислотному положенні 188 або еквівалентному положенні; треонін в амінокислотному положенні 107 або еквівалентному положенні; аланін, треонін, гістидин, лейцин, аргінін, ізолейцин, глутамін або серин в амінокислотному положенні 182 або еквівалентному положенні; аспартат або валін в амінокислотному положенні 190 або еквівалентному положенні; аспартат або валін в амінокислотному положенні 190 або еквівалентному положенні; лейцин в амінокислотному положенні 559 або еквівалентному положенні; і аспарагін, треонін або фенілаланін в амінокислотному положенні 638 або еквівалентному положенні. Винахід окрім того передбачає ізольовані полінуклеотиди, що кодують такі AHASL поліпептиди, також як і касети експресії, вектори трансформації, трансформовані клітини хазяїна, трансформовані рослини і способи, що включають такі полінуклеотиди. Даний винахід передбачає способи для підсилення толерантності або стійкості рослини, тканини рослини, рослинної клітини або клітини хазяїна щонайменше до одного гербіциду, який протидіє активності AHAS ферменту. Краще, такий AHAS-інгібуючий гербіцид - це імідазоліноновий гербіцид, сульфонілсечовинний гербіцид, триазолпіримідиновий гербіцид, піримідинілоксибензоатний гербіцид, сульфоніламіно-карбонілтриазоліновий або їх суміш. Більш краще, такий гербіцид являє собою імідазоліноновий гербіцид, сульфонілсечовинний гербіцид або їх суміш. Для даного винаходу, імідазолінонові гербіциди включають, без обмеження перерахованим, PURSUIT® (імазетапір), CADRE® (імазапік), RAPTOR® (імазамокс), SCEPTER® (імазаквін), ASSERT® (імазетабенз), ARSENAL® (імазапір), похідна будь-якого з вищезазначених гербіцидів, і суміш двох або більше вищезазначених гербіцидів, наприклад, імазапір/імазамокс (ODYSSEY®). Особливо краще, імідазоліноновий гербіцид може бути вибраний з, без обмеження перерахованим, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3-хінолінкарбонової кислоти, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти, 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинової кислоти і суміші метил 6-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-м-толуату та метил 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-oксо-2-імідазолін-2іл)-п-толуату. Застосування 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти та 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинової кислоти є кращим. Застосування 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинової кислоти є особливо кращим. За даним винаходом сульфонілсечовинні гербіциди включають, але не обмежуються перерахованим, хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлорімуронетил, трифенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, нікосульфурон, етаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примісульфуронметил, циносульфурон, амідосульфурон, флазасульфурон, імазосульфурон, піразосульфуронетил, галосульфурон, азимсульфурон, циклосульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флупірсульфуронметил, форамсульфурон, йодсульфурон, оксасульфурон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон, похідну будь-якого з вищезазначених гербіцидів і суміш двох або більше вищезазначених гербіцидів. Тіазолопіримідинові гербіциди за винаходом включають, але не обмежуються перерахованим, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам і пеноксулам. Піримідинілоксибензоатні гербіциди за винаходом включають, але не обмежуються перерахованим, біспірибак, піритіобак, піримінобак, пірибензоксим і пірифталід. Сульфоніламіно-карбонілтріазолінові гербіциди включають, але не обмежуються перерахованим, флукарбазон і пропоксикарбазон. Визнано, що піримідинілоксобензоатні гербіциди тісно пов'язані з піримідинілтіобензоатними гербіцидами і узагальнені заголовком останньої назви Weed Science Society of America. Тому, за 11 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 відсутності протилежного, піримідинілтіобензоатні гербіциди даного винаходу включають, але не обмежуються перерахованим, піримідинілоксобензоатні гербіциди, піримідинілтіобензоатні гербіциди і їх суміші. Також, піримідинілоксобензоатні гербіциди даного винаходу включають, але не обмежуються перерахованим, піримідинілоксобензоатні гербіциди, піримідинілтіобензоатні гербіциди і їх суміші. Даний винахід передбачає способи для посилення активності AHAS в рослині, що включає трансформовану рослину з полінуклеотидною конструкцією, що містить промотор функціонально функціонально зв’язаний з нуклеотидною послідовністю AHASL1 за винаходом. Способи включають введення полінуклеотидної конструкції за винаходом щонайменше в одну рослинну клітину і регенерацію з неї трансформованої рослини. Способи включають використання промотору, який здатний до стимулювання експресії гену в рослинній клітині. Краще, такий промотор - це конструктивний промотор або краще тканинний промотор. Методи знайшли застосування у підсиленні або зростанні стійкості рослини щонайменше до одного гербіциду, який протидіє каталітичній активності AHAS ферменту, особливо до імідазолінонового гербіциду. Даний винахід передбачає касети експресії для експресії полінуклеотидів за винаходом в рослинах, тканинах рослини, рослинних клітинах і інших клітинах хазяїна. Касети експресії містять промотор експресуючийся в рослині, тканині рослини, рослинній клітині або інших клітинах хазяїна, що цікавлять, функціонально функціонально зв’язаний з полінуклеотидом за винаходом, який включає нуклеотидну послідовність, що кодує або первинний (тобто, включаючи хлоропластний транзитний пептид), або зрілий білок AHASL1 (тобто без хлоропластного транзитного пептиду). Якщо експресія є бажаною в пластидах або хлоропластах рослин або рослинних клітинах, касета експресії може також містити функціонально зв’язану хлоропласт-націлювану послідовність, яка кодує хлоропластний транзитний пептид. Касети експресії за винаходом знайшли використання в способі для підсилення толерантності до гербіциду рослини або клітини хазяїна. Спосіб включає трансформацію рослини або клітини хазяїна касетою експресії за винаходом, де касета експресії містить промотор, який є експресуючимся в рослині або клітині хазяїна, що цікавить, і зв'язаним з полінуклеотидом за винаходом, який включає нуклеотидну послідовність, що кодує імідазоліноно-стійкий білок AHASL1 за винаходом. Застосування терміну "полінуклеотині конструкції" не має на увазі, щоб обмежити даний винахід, полінуклеотидні конструкції, що містять ДНК. З рівня техніки визнають, що полінуклеотидні конструкції, особливо полінуклеотиди і олігонуклеотиди, складаються з рибонуклеотидів і комбінацій рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів, можуть також використовуватися в способах, розкритих тут. Тому, полінуклеотидні конструкції даного винаходу заключають всі полінуклеотидні конструкції, що можуть використовуватися в способах даного винаходу для трансформації рослин, включаючи, але не обмежуючись, які складаються з дезоксирибонуклеотидів, рибонуклеотидів, і їх комбінації. Такі дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди включають як молекули природно походження, так і синтетичні аналоги. Полінуклеотидні конструкції також заключають всі форми полінуклеотидних конструкцій, включаючи, але не обмежуючись, одноланцюгові форми, дволанцюгові форми, шпильки, структури типу стовбур-петля, і подібні. До того ж, як зрозуміло з рівня техніки, кожні нуклеотидні послідовності, розкриті тут, також заключають в себе комплементарну нуклеотидну послідовність, наведену у прикладі. До того ж, визнають, що способи за винаходом можуть використовувати полінуклеотидну конструкцію, що здатна до регулювання в трансформованій рослині експресії щонайменше одного білку, або щонайменше однієї РНК, як наприклад, антисмисловоїу РНК, що є комплементарною до щонайменше частини мРНК. Звичайно така полінуклеотидна конструкція складається з кодуючої послідовності білку або РНК, функціонально зв’язаної з з 5' і 3' транскрипційними регулярними зонами. Альтернативно, також визнано, способи винаходу можуть використовувати полінуклеотидну конструкцію, що не здатна до регулювання в трансформованій рослині експресії білку або РНК. Надалі, визнано, що для експресії полінуклеотидів за винаходом в клітині хазяїна, що цікавить, полінуклеотид звичайно функціонально зв’язується з промотором, який здатний до стимулювання експресії гену в клітині хазяїна, що цікавить. Способи експресії полінуклеотидів в клітині хазяїна за винаходом не залежать від специфічного промотора. Способи заключають використання будь-якого промотора, відомого з рівня техніки і здатного до стимулювання експресії гену в клітині хазяїна, що цікавить. 12 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід заключає полінуклеотидні молекули AHASL та фрагменти і їх варіанти. Полінуклеотидні молекули, які є фрагментами цих нуклеотидних послідовностей, також заключаються даним винаходом. Під "фрагментом" мається на увазі частина нуклеотидної послідовності, що кодує білок AHASL винаходу. Фрагмент нуклеотидної послідовності AHASL винаходу може кодувати біологічно активну частину білку AHASL, або може бути фрагментом, який може використовуватися як зонд гібридизації або праймер PCR, використовуючи методи, розкриті нижче. Біологічно активна частина білку AHASL може бути приготовлена за допомогою ізоляції частини однієї з нуклеотидних послідовностей AHASL винаходу, експресії кодуючої частини білку AHASL (наприклад, рекомбінантна експресія in vitro), і оцінювання активності кодуючої частини білку AHASL1. Полінуклеотидні молекули, які є фрагментами нуклеотидної послідовності AHASL, містять щонайменше приблизно 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, або 1700 нуклеотидів, або до числа нуклеотидів, наявного в первинній нуклеотидній послідовності, розкритій тут (наприклад, 1684 і 1706 нуклеотидів для SEQ ID NOS: 1 і 3, відповідно) залежать від використовування за призначенням. Фрагмент нуклеотидної послідовності AHASL, яка кодує біологічно активну частину білку AHASL винаходу, кодуватиме щонайменше приблизно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, або 550 суміжних амінокислот, або до загального числа амінокислот, представленого в первинному білку AHASL1 винаходу (наприклад, 561 і 568 амінокислот для SEQ ID NOS: 2 і 4, відповідно). Фрагменти нуклеотидної послідовності AHASL1, що є корисні як зонди гібридизації для PCR праймерів, загалом не повинні кодувати біологічно активну частину білку AHASL1. Полінуклеотидні молекули, які є варіантами нуклеотидних послідовностей, розкритих в даному описі, також охоплюються даним винаходом. "Варіанти" нуклеотидних послідовностей AHASL за винаходом включають такі послідовності, які кодують білки AHASL, розкриті тут, але які відрізняються консервативно через дегенеративність генетичного коду. Ці алельні варіанти природного походження можуть бути ідентифіковані із застосуванням добре відомих молекулярних методів біології, таких як полімеразна ланцюгова реакція (PCR) і методи гібридизації, як накреслено нижче. Варіант нуклеотидних послідовностей також включає синтетично отримані нуклеотидні послідовності, які генеруються, наприклад, за допомогою використання сайт-специфічного мутагенезу, але які все ще кодують білок AHASL1, розкритий в даному винаході нижче. Загалом, варіанти нуклеотидної послідовності винаходу матимуть щонайменше приблизно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, або 99% ідентичності до специфічної нуклеотидної послідовності, розкритої тут. Варіант нуклеотидної послідовності AHASL кодуватиме білок AHASL, відповідно, який має амінокислотну послідовність, що має щонайменше приблизно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, або 99% ідентичності до амінокислотної послідовності білку AHASL, розкритого тут. Крім того, кваліфікований спеціаліст буде приймати до уваги, що зміни можуть вводитися мутацією в нуклеотидній послідовності за винаходом, і таким чином приводити до змін в амінокислотній послідовності кодованих білків AHASL без зміни біологічної активності білків AHASL. Тому, ізольована полінуклеотидна молекула, що кодує білок AHASL, має послідовність, яка відрізняється від SEQ ID NOS: 1 або 3, відповідно, може створюватися за допомогою введення однієї або більше нуклеотидних замін, приєднань або делецій у відповідній нуклеотидній послідовності, розкритій тут, таким чином одна або більше амінокислотних замін, приєднань або делецій введені в кодований білок. Мутації можуть вводитися стандартними методами, наприклад сайт-специфічним мутагенезом та PCR-опосередкованим мутагенезом. Такий варіант нуклеотидних послідовностей також заключається даним винаходом. Наприклад, краще, консервативні амінокислотні заміни можуть виконані в одному або більше передбачених, краще замінних амінокислотних залишках. "Замінний" амінокислотний залишок - це залишок, який може бути змінений у послідовності білку AHASL дикого типу (наприклад, послідовність SEQ ID NOS: 2 і 4, відповідно) без зміни біологічної активності, тоді як "незамінний” амінокислотний залишок є потрібним для біологічної активності. "Консервативна амінокислотна заміна" - це одна в якій амінокислотний залишок замінений на амінокислотний залишок, що має подібний бічний ланцюг. Родини амінокислотних залишків, що мають подібні бічні ланцюги, були визначені в рівні техніки. Ці родини включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова та глутамінові кислоти), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серін, треонін, тирозин, цистеїн), 13 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бетта-розгалудженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Такі заміни не робляться для консервативних амінокислотних залишків, або для амінокислотних залишків, що знаходяться в межах консервативної області. Білки за винаходом можуть змінюватися різними шляхами, включаючи амінокислотні заміни, делеції, усічення і вставки. Способи таких маніпуляцій загальновідомі з рівня техніки. Наприклад, варіанти амінокислотної послідовності білків AHASL можуть бути отримані за допомогою мутацій в ДНК. Способи мутагенезу та змін нуклеодиної послідовності добре відомі з рівня техніки. Див., наприклад, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel та ін. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; патент США № 4,873,192; Walker та Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) і посилання, процитовані там. Керівництво щодо відповідних амінокислотних замін, які не впливають на біологічну активність білку може бути знайдено в моделі Dayhoff та ін. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) включеної як посилання. Консервативні заміни, як наприклад обмін однієї амінокислотою з іншою, що має подібні властивості, можуть бути кращими. Альтернативно, варіант нуклеотидних послідовностей AHASL може бути отриманий за допомогою введення мутацій випадково уздовж всієї або частини AHASL кодуючої послідовності, як наприклад насичений мутагенез, і мутанти, що отримуються в результаті, можуть демонструвати AHAS активність для ідентифікування мутантів, які зберігають AHAS активність, включаючи гербіцидо-стійку AHAS активність. Пройшовши мутагенез, кодований білок може бути рекомбінанто експресовним, і активність білку може бути визначена, використовуючи стандартні методи дослідження. Тому, нуклеотидні послідовності за винаходом включають послідовності, розкриті тут, також як і фрагменти та їх варіанти. Нуклеотидні послідовності AHASL за винаходом, та фрагменти і їх варіанти, можуть використовуватися як зонди та/або праймери для ідентифікування та/або клонування гомологічних AHASL в інших рослинах. Такі зонди можуть використовуватися для виявлення копії або геномних послідовностей, що кодують такі ж самі або ідентичні білки. В цій формі, методи, як наприклад PCR, гібридизація, і подібні можуть використовуватися, щоб ідентифікувати такі послідовності, які мають суттєву ідентичність до послідовностей винаходу. Див.. наприклад, Sambrook і інші. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) та Innis, та ін. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). Ізольовані нуклеотидні послідовності AHASL базуються на ідентичності їх послідовності до нуклеотидних послідовностей AHASL1, представлених тут, або до фрагментів і їх варіантів, охоплені даним винаходом. В методі гібридизації, вся або частина відомої нуклеотидної послідовності AHASL може використовуватися для скринінгу кДНК або геноних бібліотек. Методи для конструкції таких кДНК і геномних бібліотек загальновідомі з рівня техніки і розкриті в Sambrook та ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY). Так звані зонди гібридизації можуть бути фрагментами геномної ДНК, фрагментами кДНК, фрагментами РНК або іншими олігонуклеотидами, і можуть бути міченими за виявляємою 32 групою, як наприклад P, або будь-який інший виявляючий маркер, як наприклад інші радіоізотопи, флуоресцентні сполуки, фермент, або ко-фактор ферменту. Зонди для гібридизації можуть бути міченими синтетичними олігонуклеотидами, що базуються на відомій нуклеотидній послідовності AHASL, розкритої тут. Вироджені праймери, розроблені на основі консервативних нуклеотидів або амінокислотних залишків у відомій нуклеотидній послідовності AHASL або кодованій амінокислотній послідовності, можуть додатково використовуватися. Зонд звичайно включає область нуклеотидної послідовності, яка гібридизується у жорстких умовах щонайменше приблизно 12, краще приблизно 25, більш краще приблизно 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, або 1700 послідовних нуклеотидів AHASL нуклеотидної послідовності за винаходом або фрагмента або його варіанту. Приготування зондів для гібридизації загальновідомо з рівня техніки і розкриті в Sambrook і інші (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), включені як посилання. Наприклад, повна послідовність AHASL, розкрита тут, або один чи більше її частини, може використовуватися як зонд, здатний до специфічної гібридизації, до відповідних послідовностей AHASL і інформаційних РНК. Методи гібридизації включають скринінгову гібридизацію висіяних 14 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 на чашки ДНК (або кожну бляшку або колонію; див, наприклад, Sambrook і інші (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Гібридизація таких послідовностей може здійснюватися у жорстких умовах. Під "жорсткими умовами" або "жорсткими умовами гібридизації" маються на увазі умови, в яких зонд гібридизується з його націлюваною послідовністю у вищому ступені, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше 2-кратне збільшення ніж в рівні техніки). Жорсткі умови є послідовність-залежними і будуть різними при різних обставинах. Звичайно, жорсткі умови - це такі при яких концентрація солі менш ніж приблизно 1.5 М іона Na, звичайно приблизно іонна концентрація від 0.01 до 1.0 М Na (або інших солей) при pH від 7.0 до 8.3 і температурі щонайменше 30 °C для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) і щонайменше при 60 °C для довгих зондів (наприклад, більше, ніж 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть також бути досягнуті додаванням дестабілізаційних агентів, наприклад формаміду. Типові умови низької жорсткості включають гібридизацію в буферному розчині 30-35 % формаміду, 1 М NaCl, 1% SDS (додецилсульфату натрію) при 37 °C, і відмивання 1X-2X SSC (20X SSC = 3.0 М NaCl/0.3 М тринатрієвого цитрату) при 50 - 55 °C. Типові умови помірної жорсткості включають гібридизацію в 40-45 % формаміді, 1.0 М NaCl, 1% SDS при 37 °C, і відмивання 0.5X - 1X SSC при 55 - 60°C. Типові умови високої жорсткості включають гібридизацію в 50 % формаміду, 1 М NaCl, 1% SDS при 37 °C, і відмивання 0.1X SSC при 60 - 65 °C. Необов'язково, буфери для відмивання можуть містити від приблизно 0.1% до приблизно 1% SDS. Тривалість гібридизації є загалом менша за приблизно 24 години, звичайно від приблизно 4 до приблизно 12 годин. Специфічність - це звичайно функція постгібридизаційного відмивання критичних чинників, що створюють іонну силу і температуру заключного розчину відмивання. Для гібридів ДНК-ДНК, Tm може бути наближеною з рівняння Meinkoth і Wahl (1984). Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (% GC) - 0.61 (% форма) - 500/L; де М - це молярність моновалентних катіонів, % GC - це відсоток гуанозинових та цитозинових нуклеотидів в ДНК, % форма - це відсоток формаміду в розчині гібридизації, і L - це довжина гібрида в парах основ. Tm - це температура (при певній іонній силі і pH), при якій 50 % комплементарної націлюваної послідовності гібридизується з відповідним зондом. Tm зменшується на приблизно 1 °C для кожного 1% невідповідності; тому, Tm, гібридизації, та/або умови відмивання можуть бути скореговані для гібридизації послідовностей бажаної ідентичності. Наприклад, щоб досягти послідовностей з >90% ідентичністю, Tm може бути знижена на 10 °C. Загалом, жорсткі умови вибраються приблизно при 5 °C нижче теплова температура плавлення (Tm) для специфічної послідовності і її комплементу при певній іонній силі і pH. Проте, суттєво жорсткі умови можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при 1, 2, 3, або 4 °C нижче, ніж теплова температура плавлення (Tm); помірно жорсткі умови можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при 6, 7, 8, 9, або 10 °C нижче, ніж теплова температура плавлення (Tm); низькі умови жорсткості можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при 11, 12, 13, 14, 15, або 20 °C нижче, ніж теплова температура плавлення (Tm). Використовуючи рівняння, гібридизацію та відмивання композицій і бажану Tm, добре відомих з рівня техніки, буде зрозуміло, що різноманіття в жорсткості гібридизації та/або розчинів відмивання є по суті описаними. Якщо бажаний ступінь невідповідності приводить до Tm менше ніж 45°C (водний розчин) або 32°C (розчину формаміду), вважають за кращим збільшити концентрацію SSC таким чином, щоб вища температура могла бути використана. Поширений показник гібридизації нуклеїнових кислот знайдено в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Нуклеїнові Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); and Ausubel та ін., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing та Wiley-Interscience, New York). See Sambrook та ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Визнано, що полінуклеотидні молекули і білки за винаходом заключають полінуклеотидні молекули і білки, що містять нуклеотидну або амінокислотну послідовність, яка є достатньо ідентичною до нуклеотидної послідовності SEQ ID NOS: 1 та/або 3, або до амінокислотної послідовності SEQ ID NOS: 2 та/або 4. Термін "достатньо ідентична" використовується для посилання на першої амінокислотної або нуклеотидної послідовності, яка містить достатню або мінімальну кількість ідентичних або еквівалентних (наприклад, з подібним бічним ланцюгом) амінокислотних залишків або нуклеотидів, до другої амінокислотної або нуклеотидної послідовності, так, що перші і другі амінокислотні або нуклеотидні послідовності мають загальну структурну область та/або загальну функціональну активність. Наприклад, амінокислотні або нуклеотидні послідовності, які містять загальну структурну область, яка має щонайменше 15 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приблизно 45 %, 55 %, або 65 % ідентичності, краще 75 % ідентичності, більш краще 85 %, 95 %, або 98 % ідентичності, визначаються як досить ідентичні. Для визначення проценту ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїнових кислот, послідовності розміщуються в оптимальних умовах порівняння. Процент ідентичності між двома послідовностями - це функціональне число ідентичних положень, розділених послідовностями (тобто, процент ідентичності = число ідентичних положень/загальне число положень (наприклад, частково перекриваючі положення)  100). В одному втіленні, дві послідовності однакової довжини. Процент ідентичності між двома послідовностями може визначатися, використовуючи методи, подібні описаним нижче, з або без передбачених інтервалів. При обчисленні проценту ідентичності, звичайно чітко перераховуються пари. Визначення проценту ідентичності між двома послідовностями може виконуватися з використанням математичного алгоритму. Кращий, необмежуючий приклад математичного алгоритму, що використовується для порівняння двох послідовностей - це алгоритм Karlin і Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. США 87:2264, модифіковані як в Karlin і Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. США 90:5873-5877. Такий алгоритм об'єднаний в програми NBLAST і XBLAST Altschul і ін. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. BLAST нуклеотидні пошуки можуть бути виконані в програмі NBLAST, мітка = 100, довжина слова = 12, щоб отримати нуклеотидні послідовності, гомологічні до полінуклеотидних молекул за винаходом. BLAST білкові пошуки можуть бути виконані в програмі XBLAST, мітка = 50, довжина слова = 3, щоб отримати амінокислотні послідовності, гомологічні до молекул білку за винаходом. Щоб отримати проміжки порівняння для цілей порівняльного аналізу, Gapped BLAST може використовуватися як описано в Altschul і ін. (1997) Нуклеїнові Acids Res. 25:3389. Альтернативно, PSI-BLAST може використовуватися, щоб виконувати повторний пошук, який знаходить віддалений зв’язок між молекулами. Див. Altschul і ін. (1997) вище. При використанні BLAST, Gapped BLAST, і PSI-BLAST програм, параметри, що використовуються за умовчанням відповідних програм (наприклад, XBLAST і NBLAST) може використовуватися. Див. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Інший кращий, необмежуючий приклад математичного алгоритму, що використовується для порівняння послідовностей - це алгоритм Myers і Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Такий алгоритм об'єднаний в ALIGN програму (версія 2.0), яка є частиною пакету програми порівняння послідовності GCG. При використанні ALIGN програми для порівняння амінокислотних послідовностей, PAM120 таблиця маси залишку, пошкодження довжини проміжку 12, і пошкодження проміжку 4 може використовуватися. Порівняння може також виконуватися вручну експертизою. За відсутності протилежного, значення ідентичності/схожості послідовності, надані тут, відсилають до значення, отриманого, при використанні первинної послідовності за винаходом і використовуючи багаторазове порівняння завдяки алгоритму Clustal W (Нуклеїнові Acid Research, 22(22):4673-4680, 1994), використовуючи програму AlignX, що входить в комплект програмного забезпечення Вектора NTI Набір Версія 7 (InforMax, Inc., Bethesda, MD, USA), що використовує параметри, які приймають значення за умовчанням; або будь-яку рівноцінну їй програму. Під "рівноцінною програмою" мається на увазі будь-яка програма порівняння послідовності, що, для будь-яких двох послідовностей в запиті, генерує порівняння, що має ідентичний нуклеотид або пари амінокислотних залишків і однаковий процент ідентичності послідовності при порівнянні з відповідним порівнянням, що генерується AlignX в комплекті програмного забезпечення Вектора NTI Набір Версія 7. Нуклеотидні послідовності AHASL за винаходом включають як нативні послідовності, так і мутантні форми, особливо мутантні форми, які кодують AHASL білки, що проявляють гербіцидостійку активність AHAS. Також білки за винаходом охоплюють як білки природного походження, так і варіанти, і їх модифіковані форми. Такі варіанти продовжують проявляти бажану AHAS активність. Очевидно, мутації, які створюватимуть в ДНК кодуючий варіант, не повинні містити послідовність зовні рамки зчитування і краще не створювати комплементрані області, які могли б породжувати вторинну структуру мРНК. Див., публікацію EP патентної заявки № 75,444. Не очікували, що делеції, вставки, і заміни послідовностей білку, що їх включає, приводять до радикальних змін в характеристиках білку. Проте, коли важко передбачити точний результат заміни, делеції або вставки наперед, так що, фахівець в даній галузі розуміє, що результат буде оцінюватись звичайними скринінговими методами. Тобто, активність може оцінюватися дослідженнями AHAS активності. Див., наприклад, Singh і інші. (1988) Anal. Biochem. 171:173179, включений сюди як посилання. Різні нуклеотидні послідовності і білки також включають послідовності і білки, отримані в процесі мутагенезу і рекомбінантному процесі, як наприклад ДНК транзиція. В такому процесі, один або більше різних кодуючих послідовностей AHASL може маніпулювати створення нового 16 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білку AHASL, що проявляє бажані властивості. В цій формі, бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів генеруються від популяції пов'язаних полінуклеотидих послідовностей, що включають області послідовності, які мають істотну ідентичність послідовності і можуть бути гомологічно ремобінантними in vitro або in vivo. Наприклад, використовуючи цей підхід, фрагменти послідовності, що кодують цікавлячу область, можуть пересуватися між геном AHASL за винаходом і іншими відомими генами AHASL, щоб отримати новий ген, що кодує білок з поліпшеною цікавлячою властивістю, як наприклад збільшення Км у разі ферменту. Стратегії для такого пересування ДНК відомі з рівня техніки. Див, наприклад, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri та ін. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore та ін.. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang та ін. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri та ін. (1998) Nature 391:288-291; та патент США № 5,605,793 and 5,837,458. Нуклеотидні послідовності за винаходом можуть бути використані для ізолювання відповідних послідовностей з інших організмів, особливо інших рослини, більш особливо інших дводольних рослин. З цією цілью, методи, наприклад PCR, гібридизація, і подібні можуть використовуватися для ідентифікування таких послідовностей, засновані на гомології їх послідовності до послідовностей, представлених тут. Ізольовані послідовності базуються на ідентичності їх послідовності до повних полінуклеотидних послідовностей AHASL, представлених тут або до їх фрагментів, охоплених даним винаходом. Тому, ізольовані полінуклеотидні послідовності, які кодують білок AHASL і які гібридизуються в жорстких умовах з послідовністю, розкритою тут, або з їх фрагментами, охоплюються даним винаходом. В підході PCR, олігонуклеотидні праймери можуть розроблятися для використання у PCR реакціях, щоб збільшити відповідність послідовностей ДНК з кДНК або геномною ДНК, екстрагованої з цікавлячої рослини. Методи конструювання праймерів PCR і PCR клонування загальновідомі з рівня техніки і розкриті в Sambrook і ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Див. також Innis і ін., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis та Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); та Innis і Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Відомі методи PCR включають, але не обмежуються перерахованим, методи, що використовують розташовані парою праймери, вмонтовані праймери, одиничні специфічні праймери, вироджені праймери, ген-специфічні праймери, вектор-специфічні праймери, праймери, що частково-спарені, і подібне. Полінуклеотидні послідовності AHASL за винаходом готуються в касетах експресії для експресії в цікавлячій рослині. Касета включатиме 5' і 3' регулярні послідовності, зв'язані з полінуклеотидною послідовністю AHASL за винаходом. Під "зв'язаним" мається на увазі функціональне з'єднання між промотором і другою послідовністю, яка ініціює послідовність промотору і є посередником транскрипції послідовності ДНК, що відповідає другій послідовності. Загалом, зв'язаний означає, що послідовності нуклеїнової кислоти будучи зв'язаними є суміжними і, необхідними для приєднання двох областей кодування білку, суміжних і в тій же рамці зчитування. Касета може додатково містити як мінімум один додатковий ген, який є котрансформованим в організмі. Альтернативно додатковий ген(и) може забезпечувати множину касет експресії. Така касета експресії забезпечує множину сайтів рекстрикції для вставки полінуклеотидної послідовності AHASL яка регулюється транскрипційними регуляторними областями. Касета експресії може додатково містити вибирані маркерні гени. Касета експресії включатиме транскрипцію в 5'-3' напрямі, область ініціації транскрипції і трансляції (тобто, промотор) полінуклеотидної послідовності AHASL за винаходом, та транскрипційну і трансляційну функціональну область (тобто, область термінації) в рослинах. Промотор може бути природнім або схожим, або чужерідним або ксеногенним, до рослини хазяїна та/або полінуклеотидної послідовності AHASL за винаходом. Додатково, промотор може бути природної послідовності або альтернативно синтетичної послідовності. Коли промотор є "чужорідним" або "ксеногенним" до рослини хазяїна, мається на увазі, що промотор не знайдений у місцевій рослині, в яку промотор введений. Коли промотор є "чужорідним" або "ксеногенним" до полінуклеотидної послідовності AHASL за винаходом, мається на увазі, що промотор не є природнім або нативним промотором для функціонально зв’язаної з AHASL полінуклеотидної послідовності за винаходом. Використаний тут, химерний ген включає кодуючу послідовність, функціонально зв’язану з областю ініціації транскрипції, яка є ксеногенною до кодуючої послідовності. Тоді як переважно для експресії полінуклеотидів AHASL за винаходом використовуються ксеногенні промотори, природні промоторні послідовності. Такі конструкції змінюють рівні 17 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресії білку AHASL в рослині або рослинній клітині. Тому, змінюється фенотип рослини або рослинної клітини. Область термінації може бути природною з областю ініціації транскрипції, може бути природною із зв'язаною AHASL послідовністю, може бути природною з рослиною хазяїном, або може бути отриманою з іншого джерела (тобто, чужорідна або ксеногенна до промотору AHASL полінуклеотидної послідовності, рослини хазяїна, або будь-які їх комбінації). Придатні області термінації існують в Ti-плазміді A. tumefaciens, як наприклад області термінації октопінсинтази і нопалінсинтази. Див. також Guerineau та ін. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon та ін. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen та ін. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe та ін. (1990) Gene 91:151-158; Ballas та ін. (1989) Нуклеїнові Acids Res. 17:7891-7903; та Joshi та ін. (1987) Нуклеїнові Acid Res. 15:9627-9639. Визначено, ген(и) може оптимізуватися для підвищеної експресії в трансформованій рослині. Тобто, гени можуть бути синтезовані, використовуючи рослино-переважні кодони для поліпшеної експресії. Див., наприклад, Campbell і Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 для обговорення кращого для хазяїна використовування кодону. Методи доступні з рівня техніки для синтезованих рослино-кращих генів. Див., наприклад, Патенти США № 5,380,831, і 5,436,391, і Murray і інші (1989) Нуклеїнові Acids Res. 17:477-498, включені як посилання. Додаткові модифікації послідовності відомі для збільшення експресії гену в клітині хазяїна. Вони включають елімінацію послідовностей, що кодують фіктивні сигнали поліаденилювання, сигнали місця з’єднання екзон-інтрон, транспозон-подібні дублікації, і інші такі добре-описані послідовності, які можуть бути шкідливі для експресії гена. Вміст G-C послідовності може бути скорегований до рівнів середньої величини для взятої клітини хазяїна, як розраховано відносно до відомих генів, експресованих в клітині хазяїна. Коли можливо, послідовність модифікується, щоб уникати передбачених шпилькових вторинних структур мРНК. Нуклеотидні послідовності для підсиленої експресії гена можуть також використовуватися у векторах експресії рослини. Вони включають інтрони маїсу AdhI, інтрон1 гена (Callis та ін. Genes and Development 1:1183-1200, 1987), і лідерні послідовності, (W-послідовність) з Вірусу Тютюнової Мозаїки (TMV), Вірусу Хлорозної Цятки Маїсу і Вірусу Мозаїки Люцерни (Gallie та ін. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987 та Skuzeski та ін. Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990). Перший інтрон з морщиністого-1 локусу маїсу, показав зростання експресії генів в конструкціях химерного гену. Патенти США № 5,424,412 і 5,593,874 розкривають використання специфічних інтронів у конструкціях генної експресії, і Gallie і інші (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) також показують, що інтрони корисні для регулювання експресії гена на основі специфіки тканини. Щоб окрім того підсилити або оптимізувати експресію гену великої субодиниці AHAS, вектори експресії рослини за винаходом можуть також містити послідовності ДНК, що містять області прикріплення матриці (MARs). Рослинні клітини, трансформовані такими модифікованими системами експресії, можуть демонструвати підвищену експресію або конститутивну експресію нуклеотидної послідовності за винаходом. Касети експресії можуть додатково містити 5' лідерні послідовності в конструкції касети експресії. Такі лідерні послідовності можуть впливати на підсилення трансляції. Лідерні послідовності трансляції відомі з рівня техніки і включають: піконавірусні лідерні послідовності, наприклад, лідерна послідовність EMCV (5' некодуюча область енцефаломуокардіоміоцитна) (Elroy-Stein та ін. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); потівірусні лідерні послідовності, наприклад, TEV лідерна послідовність (Вірус Тютюнової Гравіровки) (Gallie і інші. (1995) Gene165(2):233-238), MDMV лідерна послідовність (Вірус Карликової Мозаїки Маїсу) (Virology 154:9-20), і білок, що зв’язує важкий ланцюг імуноглобуліну людини (BiP) (Macejak та ін. (1991) Nature 353:90-94); нетранслюючу лідерну послідовність покривного білку мРНК вірусу мозаїки люцерни (AMV RNA 4) (Jobling ті ін. (1987) Nature 325:622-625); лідерну послідовність вірусу тютюнової мозаїки (TMV) (Gallie та ін. (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), сс. 237-256); лідерну послідовність вірусу хлорозної цятки маїсу (MCMV) (Lommel та ін. (1991) Virology 81:382-385). Див. також Della- Cioppa і інші 1987) Plant Physiol. 84:965-968. Інші відомі методи для підсилення трансляції можуть також використовуватися, наприклад, інтрони і подібні. При приготуванні касети експресії різні фрагменти ДНК можуть маніпулюватися для забезпечення послідовностей ДНК характерного напрямку і, відповідно, характерної рамки зчитування. У напрямі цього кінця, адаптери або лінкери можуть використовуватися для приєднання фрагментів ДНК або інших маніпулювань, що можуть приводити до збереження придатних сайтів рестрикції, видалення зайвої ДНК, видалення сайтів рестрикції або подібне. З цією ціллю, можуть залучатися мутагенез in vitro, репарація праймера, рестрикція, гібридизація, повторне заміщення, наприклад, транзиція і трансверсія. 18 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цілий ряд праймерів може використовуватися в практиці за винаходом. Праймери можуть вибиратися базуючись на бажаному результаті. Нуклеїнові кислоти можуть об'єднуватися з конструктивними, тканино-переважними, або іншими промоторами для експресії в рослинах. Такі конструктивні промотори включають, наприклад, ядерний промотор Rsyn7 промотора і інші конструктивни промотори, розкриті в WO 99/43838 і патенті США № 6,072,050; 35S ядерний CaMV промотор (Odell та ін. (1985) Nature 313:810-812); актин рису (McElroy та ін. (1990) Plant Cell 2:163-171);убікитин (Christensen та ін. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 and Christensen та ін. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last та ін. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten та ін. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); ALS промотор (Патент США 5,659,026) і подібне. Інші конструктивні промотори включають, наприклад, Патенти США № 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; і 6,177,611. Тканино-переважні промотори можуть використовуватися для підсилення експресії AHASL1 в межах специфічної тканини рослини. Такі тканино-переважні промотори включають, але не обмежуються перерахованим, листя-переважні промотори, коріння-переважні промотори, насіння-переважні промотори і стебло-переважні промотори. Тканино-переважні промотори включають Yamamoto і інші . (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata та ін. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen та ін. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp та ін. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini та ін. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto та ін. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco та ін. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka та ін. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; та Guevara-Garcia та ін. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Такі промотори можуть змінюватися, за необхідності, для слабкої експресії. В одному втіленні, цікавлячі нуклеїнові кислоти служать мішенню для експресії в хлоропласті. В цьому способі, в якому нуклеїнова кислота безпосередньо не вбудовується в хлоропласт, касета експресії додатково містить хлоропласт-націлювану послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, яка кодує хлоропласний транзитний пептид, для спрямування генного продукту до хлоропластів. Такі транзитні пептиди відомі з рівня техніки. Щодо хлоропласт-націлюваних послідовностей, "функціонально зв'язаний" означає, що послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує транзитний пептид (тобто, хлоропласт-націлювану послідовність), зв'язана з AHASL полінуклеотидом за винаходом так, що дві послідовності є суміжними в одній рамці зчитування. Див., наприклад, Von Heijne та ін. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark та ін. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa та ін. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer та ін. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; та Shah та ін. (1986) Science 233:478-481. Тоді як білки AHASL за винаходом включають природний хлоропластний транзитний пептид, будь-який хлоропластний транзитний пептид, відомий з рівня техніки, може приєднуватись до амінокислотної послідовності сформованого білку AHASL за винаходом за допомогою зв'язування хлоропласт-націлюваної послідовності з 5'-кінцем нуклеотидної послідовності, кодуючої зрілий білок AHASL за винаходом. Хлоропласт-націлювані послідовності відомі з рівня техніки і включають малу субодиницю хлоропластної рибулозо-1,5-бісфосфат карбоксилази (Rubisco) (de Castro Silva Filho та ін. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell та ін. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5(енолпірувіл)шикімат-3-фосфат синтазу (EPSPS) (Archer та ін. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); триптофансинтазу (Zhao та ін. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); пластоцианін (Lawrence та ін. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); хлорісматсинтазу (Schmidt та ін. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); і світлозбираючий зв'язуючий білок хлорофілу a/b (LHBP) (Lamppa та ін. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Див. також Von Heijne та ін. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark та ін. (1989) J. Biol. Chem. 264:1754417550; Della-Cioppa та ін. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer та ін. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; and Shah та ін. (1986) Science 233:478-481. Способи трансформації хлоропластів відомі з рівня техніки. Див., наприклад, Svab та ін. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab та Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab та Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Спосіб залежить від корпускулярна доставки ДНК, що містить селектуючий маркер і націлює ДНК до генома плазміди через гомологічну рекомбінацію. Додатково, трансформація плазміди може досягатися трансактивацією плазмід-внесеного трансгену мовчання за допомогою тканино-переважної експресії кодованою ядерном і плазмідо-направленою РНК полімеразою. Така система була розкрита в McBride та ін. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305. Нуклеїнові кислоти, які служать мішенню хлоропластам, можуть оптимізуватися для експресії в хлоропласті для пояснення відмінностей між ядром рослини і цією органелою у 19 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 використанні кодону. В цією метою, нуклеїнові кислоти можуть бути синтезовані з використанням хлоропласт-переважних кодонів. Див., наприклад, патент США, включений як посилання. Як розкрито, нуклеотидні послідовності AHASL за винаходом знайшли застосування в підсиленні толерантності рослин до гербіциду, які включають в своїх геномах ген, що кодує гербіцидо-толерантний білок AHASL. Такий ген може бути ендогенним геном або трансгеном. Крім того, в деяких втіленнях, нуклеїново кислотні послідовності даного винаходу можуть компонуватися з будь-якою комбінацією полінуклеотидних послідовностей, щоб створити рослини з бажаним фенотипом. Наприклад, полінуклеотиди за даним винаходом можуть компонуватися з будь-якими іншими полінуклеотидами. що кодують поліпептиди, які проявляють пестицидні та/або інсектицидні активності, як такі, наприклад, токсичні білки Bacillus thuringiensis (розкриті в патентах США № 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; та Geiser і інші (1986) Gene 48:109). Комбінації, що генеруються, можуть також включати багато копії будь-якого одного з полінуклеотидів. Визнають, що ці нуклеотидні послідовності, антисмислові конструкції, комплементарні до щонайменше частини матричної РНК (мРНК), можуть конструюватися для полінуклеотидних послідовностей AHASL. Антисмислові нуклеотиди конструюються для гібридизації з відповідною мРНК. Модифікації антисмислових послідовностей можуть робитися доки послідовності гібридизуються та до зіткнення з експресією відповідної мРНК. В цією метою, використовуються антисмислові конструкції, що мають 70%, краще 80%, більш краще 85% ідентичності послідовності до відповідних антисмилових послідовностей. До того ж, частини антисмислових нуклеотидів можуть використовуватися для порушення експресії цільового гена. Загалом, можуть бути використані послідовності щонайменше 50 нуклеотидів, 100 нуклеотидів, 200 нуклеотидів або більше. Нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть також використовуватися в значенні орієнтиру для пригнічення експресії ендогенних генів в рослинах. Способи пригнічення експресії гена в рослинах, використовуючи нуклеотидні послідовності в значенні орієнтиру, відомі з рівня техніки. Загалом способи включають трансформацію рослин ДНК конструкцією, що включає промотор, який стимулює експресію в рослині, функціонально зв’язану з щонайменше частиною нуклеотидної послідовності, яка відповідає копії ендогенного гена. Звичайно, така нуклеотидна послідовність має суттєву ідентичність послідовності до послідовності копії ендогенного гена, краще більший, ніж приблизно 65% ідентичності послідовності, більш краще вище, ніж приблизно 85% ідентичності послідовності, найбільш краще вище, ніж приблизно 95% ідентичності послідовності. Див., патент США № 5,283,184 і 5,034,323; включені як посилання. В той час, гербіцидо-стійкі AHASL1 полінуклеотиди за винаходом знайшли застосування як селектуючі маркерні гени для рослинної трансформації, касети експресії за винаходом можуть включати інший селектуючий маркерний ген для селекції трансформованих клітин. Селектуючі маркерні гени, включаючи такі за даним винаходом, використовуються для експресії трансформованих клітин або тканин. Маркерні гени включають, але не обмежуються перерахованим, генами, що кодують стійкість до антибіотика, як наприклад ті, що кодують неоміцинфосфотрансферазу II (NEO) і гідроміцинфосфотрансферазу (HPT), також як і гени, що надають стійкість до гербіцид них сполук, як наприклад глуфосінату амонію, бромоксиліну, імідазолінонів та 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-D). Див. загалом, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson та ін. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao та ін. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley та ін. (1980) in The Operon, сс. 177-220; Hu та ін. (1987) Cell 48:555-566; Brown та ін. (1987) Cell 49:603-612; Figge та ін. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle та ін. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst та ін. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle та ін. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines та ін. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow та ін. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti та ін. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim та ін. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski та ін. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb та ін. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt та ін. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen та ін. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva та ін. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka та ін. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill та ін. (1988) Nature 334:721-724. Такі розкриття включені як посилання. Згаданий вище перелік селектуючих маркерних генів не мається на увазі обмеженим. Будьякий селектуючий маркерний ген може використовуватися в даному винаході. 20 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ізольовані полінуклеотидні молекули, що включають нуклеотидну послідовність, яка кодує білки AHASL за винаходом, можуть використовуватися у векторах для трасформування рослин таким чином, що створені рослини проявляють підсилену стійкість до гербіцидів, особливо імідазолінонових гербіцидів. Ізольовані полінуклеотидні молекули AHASL за винаходом можуть використовуватися тільки у векторах або в комбінації з нуклеотидною послідовністю, що кодує малу субодиницю ферменту AHAS (AHASS), в наданні стійкості рослин до гербіциду. Див., патент США № 6,348,643; включений як посилання. Винахід також стосується вектора експресії рослини, що включає промотор, що стимулює експресію в рослині, функціонально функціонально зв’язаний з ізольованою полінуклеотидною молекулою за винаходом. Ізольована полінуклеотидна молекула включає нуклеотидну послідовність, що кодує білок AHASL, особливо білок AHASL, що містить амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO 2, 4, 6, або 8, або функціональний фрагмент та її варіант. Вектор експресії рослини за винаходом не залежить від специфічного промотору, за винятком того, що такий промотор здатний до стимулювання експресії гена в рослинній клітині. Кращі промотори включають конструктивні промотори та тканино-переважні промотори. Вектори трансформації за винаходом можуть використовуватися для виведення рослини, трансформованих цікавлячим геном. Вектор трансформації буде включати селектуючий маркерний ген за винаходом і цікавлячий ген буде вводитися і звичайно експресуватися в трансформованій рослині. Такий селектуючий маркерний ген включає гербіцидо-стійкий AHASL полінуклеотид за винаходом, функціонально функціонально зв’язаний з промотором, що стимулює експресію в клітині хазяїна. Для використовування в рослинах і рослинних клітинах, вектор трансформації включає селектуючий маркерний ген, що містить гербіцидо-стійкий полінуклеотид AHASL за винаходом, функціонально функціонально зв’язаний з промотором, що стимулює експресію в клітині рослини. Гени за винаходом змінюються залежно від бажаного результату. Наприклад, різні зміни в фенотипі можуть представляти цікавість, включаючи модифікацію жирно-кислотного складу в рослині, зміну амінокислотного вмісту рослини, зміну комах рослини та/або механізмів захисту від патогенів тощо. Ці результати можуть досягатися за допомогою забезпечення експресії ксеногенних продуктів або підвищеної експресії ендогенних продуктів в рослинах. Альтернативно, результати можуть досягатися за допомогою забезпечення зниження експресії одного або більше ендогенного продуктів, особливо ферментів або кофакторів в рослині. Ці зміни приводять до зміни в фенотипі трансформованої рослини. В одному втіленні винаходу, гени включають гени стійкості до комах, як наприклад, гени токсичного білку Bacillus thuringiensis (Патенти США № 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; та Geiser та ін. (1986) Gene 48:109). Білки AHASL або поліпептиди за винаходом можуть бути очищеними, наприклад, рослин соняшнику, і можуть використовуватися в композиціях. Також, ізольована полінуклеотидна молекула, що кодує білок AHASL за винаходом, може використовуватися для експресії AHASL білку за винаходом у мікроорганізмі такому як E. coli або дріжджі. Експресований AHASL білок може бути очищеним з екстрактів E. coli або дріжджі будь-яким методом, відомим середньому спеціалісту з рівня техніки. Винахід також стосується способу створення трансгенної рослини, яка стійка до гербіцидів, включаючи трансформовану рослину з вектором експресії рослини, що включає промотор, який стимулює експресію в рослині, функціонально функціонально зв’язаний з ізольованою полінуклеотидною молекулою за винаходом. Ізольована полінуклеотидна молекула включає нуклеотидну послідовність, що кодує AHASL білок за винаходом, особливо білок AHASL, що містить: амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO 2, амінокислотну послідовність, кодовану SEQ ID NO 1, або функціональний фрагмент і варіант оговорених амінокислотних послідовностей. Винахід також стосується нетрансгенної рослини соняшнику, трансгенних рослин, утворених способами за винаходами, і нащадка і інших нащадків таких нетрансгенних і трансгенних рослин, які експонують підсилену або збільшену стійкість до гербіцидів, які протидіють ферменту AHAS, особливо імідазолінонових та сульфонілсечовинних гербіцидів. AHASL полінуклеотиди за винаходом, особливо ті, що кодують гербіцидо-стійкі білки AHASL, знайшли застосування в способах підсилення стійкості гербіцидо-толерантних рослин. В одному втіленні винаходу, гербіцидо-толерантні рослини включають гербіцидо-толерантний або гербіцидо-стійкий AHASL білок. Гербіцидо-толерантні рослини включають як рослини, трансформовані гербіцидо-толерантними нуклеотидними послідовностями AHASL, так і рослини, які включають в їх геномах ендогенний ген, який кодує гербіцидо-толерантний AHASL білок. Нуклеотидні послідовності, що кодують гербіцидо-толерантні AHASL білки і гербіцидо 21 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 толерантні рослини, що включають ендогенний ген, який кодує гербіцидо-толерантний білок AHASL, включають полінуклеотиди і рослини за даним винаходом, які відомі з рівня техніки. Див., наприклад, патенти США № 5,013,659, 5,731,180, 5,767,361, 5,545,822, 5,736,629, 5,773,703, 5,773,704, 5,952,553 та 6,274,796; всі включені як посилання. Такі способи підсилення стійкості гербіцидо-толерантних рослин, включають трансформацію гербіцидо-толерантної рослини щонайменше однією полінуклеотидною конструкцією, що включає промотор, який стимулює експресію в клітині, функціонально функціонально зв’язаний з гербіцидо-стійким AHASL полінуклеотидом за винаходом, особливо полінуклеотид, що кодують гербіцидо-стійкий білок AHASL, представлений в SEQ ID NO 1, полінуклеотиди, що кодують амінокислотні послідовності, представлену в SEQ ID NO 2, і фрагменти і варіанти сказаних полінуклеотидів, які кодують поліпептиди, що проявляють гербіцидо-стійку активність AHAS. Численні вектори трансформації рослини і способи трансформування рослин є доступними. Див., наприклад, An, G. та ін. (1986) Plant Pysiol., 81:301-305; Fry, J., та ін. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl Genet.76:767-774; Hinchee, та ін. (1990) Stadler. Genet. Symp.203212.203-212; Cousins, та ін. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494; Chee, P. P. та Slightom, J. L. (1992) Gene.118:255-260; Christou, та ін. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; D'Halluin, та ін. (1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir, та ін. (1992) Plant Physiol. 99:81-88; Casas та ін. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant; 29P:119-124; Davies, та ін. (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J. A. та Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148; Franklin, C. I. та Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167; Golovkin, та ін. (1993) Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078; Asano, та ін. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. та Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo, та ін. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker, та ін. (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska та ін. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapen та ін. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman, та ін. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, та ін. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325; та Wan, Y. C. та Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748. Способи за винаходом включають введення полінуклеотидної конструкції в рослину. Під "введенням" мається на увазі, презентація рослині полінуклеотидної конструкції таким чином, що конструкція отримує доступ до внутрішньої частини клітини рослини. Способи за винаходом не залежать від специфічного способу введення полінуклеотидної конструкції до рослини, за винятком того, що полінуклеотидна конструкція отримує доступ до внутрішньої частини щонайменше однієї рослинної клітини. Способи введення полінуклеотидної конструкції в рослини відомі з рівня техніки, включаючи, але не обмежуючись, способами стійкої трансформації, способи нестійкої трансформації і вірус-асоційовані способи. Під "стійкою трансформацією" мається на увазі, що полінуклеотидна конструкція, введена в рослину, об'єднується з геномом рослини і здатна до успадковування її нащадком. Під "нестійкою трансформацією" мається на увазі, що полінуклеотидна конструкція, введена в рослину, не об'єднується з геномом рослини. Для трансформації рослин і рослинних клітин, нуклеотидні послідовності за винаходом включаються, використовуючи стандартні методи, в будь-який вектор, відомий з рівня техніки, який є придатним для експресії нуклеотидних послідовностей в рослині або клітині рослини. Селекція вектора залежить від переважної техніки трансформації і різновидів цільової рослини, яка буде трансформована. У втіленні винаходу, нуклеотидна послідовність AHASL1 функціонально зв’язується з промотором рослини, відомий для високорівневої експресії в рослинній клітині, і ця конструкція потім вводиться в рослину, яка сприйнятлива до імідазолінонового гербіциду. і трансформовану рослину відтворюють. Трансформована рослина толерантна до впливу рівня імідазолінонового гербіциду, який зруйнував би або істотно пошкодив нетрансформовану рослину. Цей спосіб може застосовуватися будь-якими різновидами рослини; проте, найбільш вигідно, коли застосовується для культурних рослин. Методика створення рослинних касет експресії та введення чужорідних нуклеїнових кислот в рослини є загальновідомою і описаною у літературі даної галузі науки. Наприклад, чужорідну ДНК можна вводити до рослини, використовуючи пухлино-індукуючі (Ti) плазмідні вектори. Інші методи впровадження чужорідної ДНК, включають зміну протопласту, що медіюється ПЕГ, електропорацію, мікроін’єкцію ниток ДНК, і біолістику або бомбардування мікрочастинок для прямого введення ДНК у необхідну область. Ці методи описані (Патент США № 5,405,765 to Vasil та ін.; Bilang та ін. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid та ін., (1991) Mol. Gen. Genet., 228: 104112; Guerche та ін., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause та ін., (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein та ін., (1987) Nature 327: 70-73; Howell та ін., (1980) Science 208:1265; Horsch та ін., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock та ін., (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach та Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) та Methods in 22 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Plant Molecular Biology (Schuler та Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989). Метод трансформації залежить від клітини рослини, яку трансформують, стабільності векторів, рівень експресії генних продуктів та інших параметрів. Інші відповідні методи введення нуклеотидних послідовностей до рослинних клітин і подальшого включення у геном рослини включають мікроін’єкції, як описано у Crossway та ін.(1986) Biotechniques 4:320-334, електропорацію, як описано у Riggs та ін.(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, Agrobacterium-медіїовану трансформацію як описано y Townsend та ін., патенті США № 5,563,055, Zhao та ін., патенті США №5,981,840, неопосередковане переміщення гену, як описано у Paszkowski та ін.(1984) EMBO J. 3:2717-2722, балістичне прискорення часток, як описано у, наприклад, Sanford та ін., патенті США № 4,945,050; Tomes та ін., патенті США № 5,879,918; Tomes та ін., патенті США № 5,886,244; Bidney та ін., патенті США №5,932,782; Tomes та ін.(1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," у Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg та Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe та ін.(1988) Biotechnology 6:923-926); та Lec1 трансформації (WO 00/28058), Weissinger та ін.(1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford та ін.(1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (цибуля); Christou та ін.(1988) Plant Physiol. 87:671-674 (соя); McCabe та ін.(1988) Bio/Technology 6:923-926 (соя); Fine та McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (соя); Singh та ін.(1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (соя); Datta та ін.(1990) Biotechnology 8:736-740 (рис); Klein та ін.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (маїс); Klein та ін.(1988) Biotechnology 6:559-563 (маїс); Tomes, патенті США № 5,240,855; Buising та ін., патентах США № 5,322,783 та 5,324,646; Tomes та ін.(1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (маїс); Klein та ін.(1988) Plant Physiol. 91:440-444 (маїс); Fromm та ін.(1990) Biotechnology 8:833-839 (маїс); Hooykaas-Van Slogteren та ін.(1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al., патенті США №5,736,369 (злаки); Bytebier та ін.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet та ін.(1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman та ін.(Longman, New York), сс. 197-209 (пильца); Kaeppler та ін.(1990) Plant Cell Reports 9:415-418 та Kaeppler та ін.(1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (частинково-асоційована трансформація); D'Halluin та ін.(1992) Plant Cell 4:1495-1505 (електропорація); Li та ін.(1993) Plant Cell Reports 12:250-255 та Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (rice); Osjoda та ін.(1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (маїс via Agrobacterium tumefaciens); дана література наводиться як посилання. Полінуклеотиди за винаходом, можна вводити до рослини шляхом взаємодії рослин з вірусом або нуклеїновими кислотами вірусу. Загалом, такі методи представляють собою об'єднання полінуклеотидних конструкцій, представлених у винаході, у молекулі ДНК або РНК вірусу. Визначено, що AHASL білок, що представлений у винаході, можна спочатку синтезувати як частину полібілку вірусу, а потім провести vivo або vitro протеоліз для отримання необхідного рекомбінантного білку. Також визначено, що промотори, що представлені у винаході, також включають промотори, що використовуються при транскрипції РНК полімерази вірусу. Також відомі методи введення полінуклеотидної конструкції у рослину і експресії білку, який там кодується, залучаючи молекули ДНК або РНК вірусу. Див. наприклад патенти США № 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367 and 5,316,931; література наводиться як посилання. Клітини, які були трансформовані, можуть зростати відповідним чином у рослині, як наведено, наприклад, у McCormick та ін.(1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Ці рослини можуть далі зростати, і або обпилюватися таким самим трансформованим штамом, або різними штамами, і результуючий гібрид буде мати конститутивну експресію з визначеними бажаними характеристиками фенотипу. Необхідно виростити два або більше покоління, щоб гарантувати, що бажані характеристики фенотипу стійко укорінилися і успадкувалися, щоб гарантувати, що експресія бажаних характеристик фенотипу була досягнута, утворене насіння збирають. Таким чином, даний винахід представляє зміну насіння (також згадується як “трансгенне насіння”), що має полінуклеотидну конструкцію, яка представлена у винаході, наприклад, касету експресії, що представлена у винаході, яка стійко з'єднується у їх геномі. Даний винахід можна використовувати для трансформації будь-яких видів рослин, які включають, але не обмежені, однодольні та дводольні. Прикладами видів рослин можуть бути, але не обмежуються ними, зерно або маїс (Zea mays), Brassica sp. (наприклад, B. napus, B. rapa, B. juncea), особливо ті види Brassica,які є джерелом рослинної олії, люцерна (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), жито (Secale cereale), сорго (Bicolor сорго, Sorghum vulgare), просо (наприклад, африканське просо Pennisetum glaucum, просо звичайне Panicum miliaceum, просо італійське Setaria italica, дагусса Eleusine coracana), соняшник (Helianthus annuus), сафлор (Carthamus 23 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 tinctorius), пшениця (Triticum aestivum, T. Turgidum ssp. durum), соя (Glycine max), тютюн (Nicotiana tabacum), картопля (Solanum tuberosum), арахіс (Arachis hypogaea), бавовну (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutumsweet), солодка картопля (Ipomoea batatus), маніока (Manihot esculenta), кава (Coffea spp.), кокос (Cocos nucifera), ананас (Ananas comosus), цтрусові (Citrus spp.), какао (Theobroma cacao), чай (Camellia sinensis), банан (Musa spp.), авокадо (Persea americana), інжир (Ficus casica), гуава (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), маслина (Olea europaea), папайя (Carica papaya), кеш’ю (Anacardium occidentale), макадамія (Macadamia integrifolia), мигдаль (Prunus amygdalus), цукровий буряк (Beta vulgaris), цукровий очерет (Saccharum spp.), вівс, ячмінь, овочі, декоративні та хвойні рослини. Бажано, згідно винаходу, використовувати культурні рослини, (наприклад, соняшник, Brassica sp., бавовна, цукор, буряк, соя, арахіс, люцерна, сафлор, тютюн, зерно, рис, пшениця, жито, ячмінь, тритикале, сорго, просо і т.д.). Стійкі до дії гербіциду рослини, представлені у винаході, можуть використовуватися у методах контролю бур'янів. Отже, даний винахід також представляє метод контролю бур'янів у околі зростання гербіцидо-стійкої рослини за винаходом. Метод включає застосування ефективної кількості гербіциду до бур'янів і гербіцидо-стійких рослин, де рослини більш стійкі до дії як мінімум одного гербіциду, особливо імідазолінонового або сульфонілсечовинного гербіциду, порівняно з рослинами дикого типу. Такий методи контролю бур'янів за допомогою гербіцидо-стійких рослин, що представлені у винаході, краще застосовувати до сільськогосподарських рослин, включаючи, але не обмежуючись, соняшник, люцерну, Brassica sp., сою, бавовну, сафлор, арахіс, тютюн, помідор, картоплю, пшеницю, рис, маїс, сорго, ячмінь, жито, просо, і т.д. Завдяки створенню рослин більш стійких до дії гербіцидів, особливо імідазолінонових та сульфонілсечовинних гербіцидів, можна застосовувати різноманітні методи захисту рослин від бур'янів з метою збільшення приросту рослин і зменшення конкурентів у споживанні живильних речовин. Гербіцид можна застосовувати у передсходовому, після сходовому контролю та контролю під час зростання бур'янів на ділянках, що оточують рослини, наведені вище, причому імідазоліновий гербіцид можна застосовувати як без домішок так і у вигляді гербіцидного складу з різними добавками. Гербіцид можна також використовувати для обробки насіння. Ефективну концентрацію або ефективну кількість гербіциду, або композиції, що включає ефективну концентрацію або ефективну кількість гербіциду, можна застосовувати безпосередньо до насіння до або під час засівання. У складах імідазолінонового або сульфонілсечовинного гербіциду, або композиціях, що включають інші гербіциди, можуть міститися детергенти, активатори, ліофільні агенти, стабілізуючі агенти, клейкі агенти і т.д. добавки. Гербіцидний склад може бути у рідкій або твердій формі і може включати (але не обмежується наведеними прикладами) порошкоподібні розпушувачі, емульговані та рідкі концентрати. Гербіцид і гербіцидний склад можна застосовувати відповідно до наведених вище методів, наприклад, за допомогою оприскування, іригації, розпилювання, напилювання і т.п. Даний винахід представляє нетрансгенне та трансгенне насіння з більшою стійкістю до дії як мінімум одного гербіциду, особливо AHAS-інгібуючих гербіцидів. Під таким насінням можуть мати на увазі, наприклад, нетрансгенне насіння соняшнику, якому притаманна така ж стійкість до дії гербіциду як у рослини з ATCC патентий депозитарний номер PTA-6325, і трансгенне насіння, що включає молекулу полінуклеотиду згідно винаходу, який кодує AHASL1 гербіцидостійкий білок. Даний винахід представляє методи створення гербіцидо-стійкої рослини, особливо гербіцидо-стійкої рослини соняшнику, шляхом генеративного розмноження. Методи включають схрещування однієї рослини, яка стійка до дії гербіциду з другою рослиною, яка не стійка до дії гербіциду. Перша рослина може бути будь-якою рослиною, що є стійкою до дії гербіциду згідно винаходу, наприклад, трансгенну рослину, що включає як мінімум один з полінуклеотидів даного винаходу, який кодує стійкий до дії гербіциду AHASL білок рослини соняшнику і нетрансгенну рослину, якій притаманна стійкість до дії гербіциду рослини соняшнику з ATCC патентним депозитарним номером PTA-6325. Друга рослина може бути будь-якою рослиною, яка здатна продукувати життєздатні рослини (тобто, насіння) при схрещенні з першою рослиною. Зазвичай, але не обов'язково, перша і друга рослина однакового виду. Методи винаходу окрім того дозволяють залучити одну або декілька генерацій рослини зворотного схрещення, рослин, що утворені першим схрещуванням та рослин тієї ж лінії або того ж генотипу як перша або друга рослина. Або рослин, які утворені першим схрещуванням або будь-яким подальшим схрещуванням можуть схрещуватися з третьою рослиною іншої лінії або іншого генотипу ніж перша або друга рослина. Методи винаходу можуть додатково включати селекціонування рослин за допомогою особливостей першої рослини, яка стійка до дії гербіциду. 24 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід крім того представляє методи підвищення гербіцидо-стійкості у рослин, особливо у рослин соняшнику шляхом генеративного розмноження. Методи включають схрещування першої рослини, яка стійка до дії гербіциду з другою рослиною, яка може бути а може не бути стійкою до дії гербіциду, або може бути стійкою до дії іншого гербіциду або гербіцидів. Перша рослина може бути будь-якою стійкою до дії гербіциду рослиною згідно даного винаходу, наприклад, трансгенною рослиною, що включає як мінімум один з полінуклеотидів даного винаходу, який кодує стійкий до дії гербіциду AHASL білок рослини соняшнику і не трансгенну рослину, якій притаманна стійкість до дії гербіциду рослини соняшнику з ATCC патентим депозитарним номером PTA-6325. Друга рослина може бути будьякою рослиною, яка здатна продукувати життєздатні рослини при схрещенні з першою рослиною. Зазвичай, але не обов'язково, перша і друга рослина однакового виду. Утворені методом даного винаходу нащадки рослин, мають більшу стійкість до дії гербіциду порівняно з першою або другою рослиною або обома рослинами. Коли перша і друга рослини стійкі до дії різних гербіцидів, утворені рослини матимуть поєднані властивості стійкості до дії гербіциду першої і другої рослини. Методи винаходу крім того дозволяють залучити одну або декілька генерацій рослини зворотного схрещення, рослин, що утворені першим схрещуванням та рослин тієї ж лінії або того ж генотипу як перша або друга рослина. Альтернативно, нащадки, які утворені першим схрещуванням або будь-яким подальшим схрещуванням можуть схрещуватися з третьою рослиною іншої лінії або іншого генотипу ніж перша або друга рослина. Методи винаходу можуть додатково включати селекціонування рослин за допомогою особливостей першої рослини, другої рослини або обох рослин, що стійкі до дії гербіциду. Рослини даного винаходу можуть бути трансгенними або нетрансгенними. Прикладами нетрансгенних рослин соняшнику, у яких збільшилася стійкість до гербіцидів імідазолінонового та/або сульфонілсечовинного, включає рослину (MUT9) соняшнику з ATCC патентним депозитарним номером PTA-6325; або мутантну, рекомбінантну, чи створену способами генної інженерії похідну рослини з ATCC патентним депозитарним номером PTA-6325; або будь-який нащадок рослини з ATCC патентним депозитарним номером PTA-6325; або рослина, яка походить від будь-якої з цих рослин; або рослина, якій притаманна стійкість до дії гербіциду рослини з ATCC патентним депозитарним номером PTA-6325. Даний винахід також представляє рослини, органи рослин, тканини рослин, клітини рослин, насіння, і клітини-хазяїна, які не відносяться до людських, трансформовані як мінімум однією молекулою полінуклеотиду, касетою експресії, або трансформаційним вектором згідно винаходу. Такі трансформовані рослини, органи рослин, тканини рослин, клітини рослин, насіння, і клітини-хазяїна, які не відносяться до людських, мали більшу стійкість до як мінімум одного гербіциду, вибраного з тих гербіциду, що знищують або уповільнюють ріст незміненої рослини, тканини рослини, клітини рослини або клітини-хазяїна, яка не відноситься до людської. Бажанішими є трансформовані рослини, органи рослин, тканини рослин, клітини рослин та насіння Arabidopsis thaliana і культурних рослин. Даний винахід представляє методи, які включають використання AHAS-інгібуючого гербіциду. Згідно цих методів, AHAS-інгібуючий гербіцид може застосовуватися будь-яким способом, відомим у цій галузі науки, але не обмежуючись цими способами, для обробки насіння, ґрунту і листя. Також AHAS-інгібуючий гербіцид можна застосовувати у формі , наприклад розчину, емульсії, суспензії, пилу, порошку, пасти і гранул. Форма використання вибирається в залежності від мети, яку хочуть досягнути; але в кожному випадку має забезпечуватися рівномірне розподілення суміші згідно винаходу. Різні можливі форми гербіциду готуються відомими методами даної галузі (див. наприклад US 3,060,084, EP-A 707 445 (для рідких концентратів), Browning, ”Agglomeration”, Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry’s Chemical Engineer’s Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57 and et seq. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 and Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 07514-0443-8), наприклад додаванням активних сполук разом з добавками, відповідними для даної агрохімічної форми, як, наприклад, розчинники та/або носії, за потреби емульсифікатори, ПАР і диспергатори, консерванти, антипінні речовини, антифрізи, для форм, які будуть використовуватися для обробки насіння також можливе але необов'язкове застосування барвників та/або зв’язуючих речовин та/або згущувачів. 25 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Прикладами відповідних розчинників є вода, ароматичні розчинники (наприклад продукти ароматичної фракції нафти, ксилол), парафіни (наприклад, фракція мінеральних олій), спирти (наприклад метанол, бутанол, пентанол, бензиловий спирт), кетони (наприклад, циклогексанон, гамма-бутиролактон), пиролідони (NMP, NOP), ацетати (гліколь діацетат), гліколі, диметиламіди жирних кислот, жирні кислоти і ефіри жирних кислот або суміші розчинників. Прикладами відповідних наповнювачів є природні мінерали ґрунту(наприклад каолін, глина, тальк, крейда) і синтетичні мінерали ґрунту (наприклад сильно диспергований кремнезем, силікати). Відповідні емульсифікатори - неіонні і аніонні емульсифікатори (наприклад ефіри жирних спиртів, поліоксіетилен, алкілсульфонати і арилсульфонати). Приклади диспергаторів - лігнін-сульфітні залишки і метилцелюлоза. Відповідні ПАР - це лужні метали, лужно-земельні метали і амонійні солі лігносульфонової кислоти, нафталінсульфонова кислота, фенолсульфонова кислота, дибутилнафталінсульфонова кислота, алкіларилсульфонати, алкіл сульфати, алкілсульфонати, сульфати жирних спиртів, жирні кислоти і сульфатовані жирні спирти, ефіри гліколів, конденсат сульфунованого нафталіну і похідні нафталіну з формальдегідом, конденсат нафталіну або нафталінсульфонової кислоти з фенолом і формальдегідом, ефір поліоксіетилену, октілфенол, етоксіiзооктілфенол, октілфенол, нонілфенол, ефіри алкілфенол полігліколю, ефір трибутилфеніл полігліколю, ефір тристеарилфеніл полігліколю, алкіларіл поліетерні спирти, конденсат оксиду етилену спиртів і жирних спиртів, етоксі похідні касторової олії, ефіри поліоксіетиленалкілу, етоксільовані поліоксіпропілени, ефір ацеталю лаурилового спирту полігліколю, ефіри сорбітолу, відроблений розчин лігносульфіту і метилцелюлоза. Речовини, які можуть використовуватися при утворенні розчинів для розприскування, емульсій, паст або дисперсій у олії, - це фракції мінеральних олій з температурою кипіння від середньої до високої, як, наприклад гас або дизельне паливо, також кам’яновугільні смоли, та рослинні олії або масла тваринного походження, аліфатичні, циклічні і ароматичні вуглеводні, наприклад толуол, ксилол, парафін, тетрагідронафталін, алкілований нафталін або інші його похідні, метанол, етанол, пропанол, бутанол, циклогексанол, циклогексанон, ізофорон, сильно полярні розчинники, наприклад диметилсульфоксид, N-метилпіролідин або вода. Також до різних форм гербіциду можна додавати антифризи, як наприклад, гліцерин, етиленгліколь, пропіленгліколь і відповідні бактерицидні речовини. Антипінні речовини можуть бути на основі кремнію або стеарату магнію. В якості консервантів можна застосовувати, наприклад, дихлорофен та ензилгеміформний спирт . Різні форми гербіциду для обробки насіння можуть додатково містити барвники та/або зв’язуючі речовин . Зв’язуючі речовин можуть додаватися, щоб збільшити ступінь налипання активних речовин на насіння після обробки. Відповідні зв’язуючі речовин - це кополімери EO/PO ПАР, полівінілові спирти, полівінілпіролідини, поліакрилати, поліметакрилати, полібутени, поліізобутилени, полістирол, поліетиленаміни, поліетиленаміди, поліетиленіміди (Lupasol®, Polymin®), поліетери, поліуретани, полівінілацетат, тилоза і кополімери, які отримають з цих полімерів. Також до форм можуть входити барвники. Відповідними барвниками для форм, що призначені для обробки насіння, можуть бути родамін B, C.I. Pigment Red 112, C.I. Solvent Red 1, pigment blue 15:4, pigment blue 15:3, pigment blue 15:2, pigment blue 15:1, pigment blue 80, pigment yellow 1, pigment yellow 13, pigment red 112, pigment red 48:2, pigment red 48:1, pigment red 57:1, pigment red 53:1, pigment orange 43, pigment orange 34, pigment orange 5, pigment green 36, pigment green 7, pigment white 6, pigment brown 25, basic violet 10, basic violet 49, acid red 51, acid red 52, acid red 14, acid blue 9, acid yellow 23, basic red 10, basic red 108. Прикладом згущувачу є караген (Satiagel®) Порошки, форми для розприскування і продукти розпилення можна виготовляти шляхом змішування з можливим подальшим подрібненням активної речовини з твердим носієм. Гранули, наприклад гранули з зовнішнім покривом, імпрегнованні гранули або однорідні гранули, можуть бути виготовленні шляхом зв’язування активної речовини з твердим носієм Прикладами твердих носіїв є силікагель, силікати, тальк, каолін, аттаклей, вапняк, вапно, крейда, валок, льос, глина, доломіт, діатоміт, сульфат кальцію, сульфат магнію, оксид магнію, синтетичні матеріали ґрунту, мінеральні добрива, як наприклад, сульфат амонію, фосфат амонію, нітрат амонію, сечовина і продукти рослинного походження, як наприклад перемелені злаки, перемелена кора дерев, перемелена деревина і перемелені горіхові шкарлупки, порошок целюлози і інші тверді носії. 26 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Взагалі, форма включає AHAS-інгібуючого гербіциду від 0.01 до 95% ваги всієї суміші, краще від 0.1 до 90% ваги всієї суміші. Чистота AHAS-інгібуючих гербіцидів, що використовуються, становить від 90% до 100% ваги, краще від 95% до 100% ваги (згідно ЯМР спектру). Для обробки насіння, відповідні форми можуть бути розбавлені у 2-10 разів, тобто концентрація буде становити від 0.01 до 60% активної речовини від загальної ваги суміші, краще від 0.1 до 40% ваги. AHAS-інгібуючий гербіцид можна застосовувати як у формі складу так і у спеціальній формі композиції для розприскування, порошку, суспензії або дисперсії, емульсії, дисперсії в олії, пасти, пилоподібного складу, композиції для розпилення або гранул, що наносяться шляхом обприскування, розприскування, розпилювання або розливання. Форма використання вибирається в залежності від мети, яку хочуть досягнути; але в кожному випадку має забезпечуватися рівномірне розподілення гербіциду згідно винаходу. Водні форми можуть виготовлятися з концентратів емульсії, паст або змочувальних порошків (порошки, придатні для розприскування, дисперсії в олії) шляхом додавання води. Щоб підготувати емульсії, пасти або дисперсії в олії, речовини або розчини в олії або розчиннику, гомогенізують з водою за допомогою змочувачу, речовин, що надають клейкість, дисперсанту або емульгатору. Також можна утворити концентрати, що складаються з активної речовини, змочувачу, речовин, що надають клейкості, дисперсанту або емульгатору і, за необхідності, розчиннику або олії, і такі концентрати потім можна розбавляти водою. Концентрація активних складових у формах готових для використання може змінюватися у відносно широких межах від 0.0001 до 10%, краще від 0.01 до 1% ваги. AHAS-інгібуючий гербіцид може також використовуватися у формах, що включають понад 95% ваги активної речовини, або навіть застосуватися як активна речовина без добавок. Далі наводяться приклади форм: 1. Продукт, що потребує розбавлення водою для обробки листя. Для обробки насіння такий продукт може застосовуватися як розбавленим так і не розбавленим. A) Водорозчинний концентрат (SL, LS) Десять частин від загальної ваги концентрату AHAS-інгібуючого гербіциду розчиняють у 90 частинах води або розчиннику, який розчинний у воді. Як альтернативу, можна додати змочувачі або інші добавки. AHAS-інгібуючий гербіцид розчиняють у воді, утворюючи форму з 10 % (м/м) AHAS-інгібуючого гербіциду. B) Дисперсні концентрати (DC) Двадцять частин від загальної ваги концентрату AHAS-інгібуючого гербіциду розчиняють у 70 частинах циклогексанону з додаванням10 частин дисперсанту, наприклад полівінілпіролідину. При розбавленні водою утворюється форма-дисперсія з 20% (м/м) AHASінгібуючого гербіциду. C) Концентрат емульсія (EC) П'ятнадцять частин від загальної ваги концентрату AHAS-інгібуючого гербіциду розчиняють у 7 частинах ксилолу з додаванням додецилбензолсульфонату кальцію і етоксилату касторової олії (по 5 частин одного та іншого від загальної ваги). При розбавленні водою утворюється форма-емульсія з 15% (м/м) AHAS-інгібуючого гербіциду. D) Емульсії (EW, EO, ES) Двадцять-п'ять частин від загальної ваги емульсії AHAS-інгібуючого гербіциду розчиняють у 7 частинах ксилолу з додаванням додецилбензолсульфонату кальцію і етоксилату касторової олії (по 5 частин одного та іншого від загальної ваги). Цю суміш вводять у воду у кількості 30 частин за допомогою машини-емульгатору (наприклад Ultraturrax)і перемішують з утворенням однорідної емульсії. При розбавленні водою утворюється форма-емульсія з 25% (м/м) AHASінгібуючого гербіциду E) Суспензія (SC, OD, FS) До шарової дробарки завантажують 20 частин від загальної ваги суспензії AHAS-інгібуючого гербіциду і роздроблюють з додаванням 10 частин дисперсантів, змочувачів і 70 частин води або органічного розчиннику, щоб отримати суспензію AHAS-інгібуючого гербіциду. При розбавленні водою утворюється стійка суспензія AHAS-інгібуючого гербіциду, яка є формою, що містить 20% (м/м) AHAS-інгібуючого гербіциду. F) Вододисперсійні і розчинні у воді гранули (WG, SG) П'ятдесят частин AHAS-інгібуючого гербіциду змелюють з 50 частинами дисперсантів та змочувачів і за допомогою технічних устаткувань формують вододисперсійні або розчинні у воді гранули (наприклад екструзією, у башті з розпилюючим зрошенням, у киплячому шарі). При розбавленні водою утворюється стійка дисперсія або розчин AHAS-інгібуючого гербіциду, що являє собою форму з 50% (м/м) AHAS-інгібуючого гербіциду. 27 UA 99095 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 G) Вододисперсійні і розчинні у воді порошки (WP, SP, SS, WS) Сімдесят-п'ять частин на вагу AHAS-інгібуючого гербіциду змелюють з 25 частинами дисперсантів, змочувачів і силікагелем у ротор-статорному млині. При розбавленні водою утворюється стійка дисперсія або розчин AHAS-інгібуючого гербіциду, що являє собою форму з 75% (м/м) AHAS-інгібуючого гербіциду. I) Гель-форма (GF) До шарової дробарки завантажують 20 частин AHAS-інгібуючого гербіциду і подрібнюють разом з 10 частинами дисперсантів, 1 частиною змочувальних та гель-утворюючих речовин і 70 частин води або органічного розчиннику, щоб утворилася суспензія AHAS-інгібуючого гербіциду. При розбавленні водою утворюється стійка суспензія AHAS-інгібуючого гербіциду, яка є формою, що містить 20% (м/м) AHAS-інгібуючого гербіциду. Така гель-форма підходить для обробки насіння. 2. Продукт, який застосовують до листя не розчиняючи. Для обробки насіння ці продукти можна розчиняти. A) Пилоподібні порошки (DP, DS) П'ять частин AHAS-інгібуючого гербіциду змішують і подрібнюють з 95 частинами дрібно помеленого каоліну. Утворюється пилоподібний продукт, що містить 5% (м/м) AHAS-інгібуючого гербіциду. B) Гранули (GR, FG, GG, MG) Півчастини від загальної маси форми AHAS-інгібуючого гербіциду дрібно подрібнюють з 95.5 частинами носіїв, AHAS-інгібуючий гербіцид асоціюється на носіях з утворенням форми з 0.5% (м/м) AHAS-інгібуючого гербіциду. У виробництві використовують методи екструзії, сушки з розпилюванням або киплячого шару. Таким чином, утворюються гранули, які застосовують до листя без розчинення. Звичайними формами для обробки насіння є, наприклад, рідкі концентрати FS, розчини LS, порошки для сухої обробки DS, водно дисперсні порошки для обробки суспензією WS, розчинні у воді порошки SS, емульсії ES і EC і гель-форми GF. Ці форми можна застосовувати до насіння розчинюючи або ні. Обробка зерен здійснюється перед засіванням, або насіння обробляють безпосередньо. Перевага надається втіленню винаходу, згідно якого для обробки насіння використовують форму FS. Зазвичай, форма FS може включати 1-800 г/л активної речовини, 1-200 г/л ПАР, від 0 до 200 г/л антифризу, від 0 до 400 г/л зв’язуючої речовини, 0 200 г/л барвнику і до 1 літра розчиннику, бажано води. Нетрансгенне та трансгенне насіння гербіцидо-стійких рослин, представлене у винаході, що включає, наприклад, нетрансгенне насіння соняшнику, яке має якості гербіцидо-стійкоїрослини соняшнику з ATCC патентним депозитним номером PTA-6325, і трансгенне насіння , що включає молекулу полінуклеотиду, представлену у винаході, яка кодує AHASL1 білок стійкий до дії гербіциду. Для обробки насіння, насіння гербіцидо-стійких рослин, що представлене у винаході, обробляється гербіцидами, бажано гербіцидами, які вибирають з групи, що складається з AHAS-інгібуючих гербіцидів, як наприклад амідосульфурону, азимсульфурону, бенсульфурону, хлорімурону, хлорсульфурону, кіносульфурону, циклосульфамурону, етаметсульфурону, етоксісульфурону, флазасульфурону, флупірсульфурону, fфорамсульфурону, галосульфурону, імазосульфурону, йодосульфурону, мезосульфурону, метсульфурону, нікосульфурону, оксасульфурону, прімісульфурону, просульфурону, піразосульфурону, римсульфурону, сульфометурону, сульфосульфурону, тифенсульфурону, триасульфурону, трибенурону, трифлоксісульфурону, трифлусульфурону, тритосульфурону, імазаметабенз, імазамокс, імазапік, імазапір, імазахін, імазатапір, хлорансулам, діклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пеноксулам, біспірібак, пірімінобак, пропоксікарбазон, флукарбазон, пірибензоксім, пірифталід, піритіобак і їх суміши або з формуою, що включає AHAS-інгібуючий гербіцид. Термін обробка насіння включає всі відповідні методи обробки насіння, відомі у цій галузі, як наприклад дезінфекція насіння, дражирування насіння, нанесення гербіцидного пилу на насіння, насичування насіння і здобрювання насіння. Відповідно до одного втілення даного винаходу, метод обробки ґрунту шляхом введення до нього, зокрема за допомогою сіялки: або гранульованої форми, що містить AHAS-інгібуючий гербіцид у вигляді склад/форми, наприклад, гранульована форма, що включає необов'язково один або декілька твердих або рідких сільськогосподарсько прийнятних носіїв та/або необов'язково один або більше сільськогосподарсько прийнятних ПАР. Цей метод бажано використовувати, наприклад, при обробці насаджень злаків, маїсу, бавовни і соняшнику. 28