Рослина цукрового буряку, стійка до гліфосату

1. Рослина цукрового буряку, в тому числі її нащадки, яка експресує фермент з 5енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтазною активністю, одержуваною з Agrobacteria sp.СР-4, яка відрізняється тим, що ПЛР-амліфікація з використанням як матриці її геномної ДНК приводить до ампліфікації фрагменту ДНК, розміром 739 пар основ, при використанні пари нуклеотидних праймерів з послідовностями, представленими в SEQ ID NO: 18 і SEQ ID NO: 21. 2. Рослина за пунктом 1, яка відрізняється тим, що її ДНК, що характеризується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 27, утворює частину рослинного геному. 2 (19) 1 3 85364 4 cp4/epsps, регенерацію паростків у присутності гліфосату, передачу паростків для укорінення у ґрунті в теплиці; обробку сходів глі фосатом, візуальну оцінку життєвої сили рослини та хлорозу листя за шкалою від 0 до 9, відбір рослин з життєвою силою та хлорозом листя тих рослин, котрі одержали 9 балів, розмноження відібраних рослин за допомогою звичайних методів розмноження. 12. Спосіб за пунктом 11, який відрізняється тим, що вектор, який кодує білок cp4/epsps, є вектором, який містить ділянку ДНК, яка має нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 5. 13. Спосіб за пунктом 11, який відрізняється тим, що регенеровані паростки аналізують за допомогою ПЛР на присутність ДНК, яка кодує cp4/epsps. 14. Толерантна до гліфосату рослина цукрового буряку, в тому числі її нащадки, отримана Agrobacterium-опосередкованою трансформацією, разом з геном, що дозволяє експресувати cp4/epsps в рослинах, яка відрізняється тим, що у вказаній рослині відсутні як ліві, так і праві Т-ДНК граничні послідовності. Даний винахід стосується трансгенних рослин цукрового буряка, які виявляють толерантність до обробки гербіцидом з гліфосатом як активним інгредієнтом. Бур'яни на ланах цукрового буряка є головною проблемою для фермера. Вони пригнічують культурні рослини і, таким чином, знижують урожайність цукрового буряка. У наш час жоден поодинокий гербіцид не здатний ефективно впливати на всі бур'яни без пошкодження, власне, самих рослин цукрового буряка [Miller та ін., J.Sugar Beets Res.26: 3-4, 1989]. На практиці фермери використовують суміш з гербіцидів, яка також знижує урожайність цукрового буряка. Тим часом, кількість видів бур'янів, що виробляють в собі стійкість до цих гербіцидів, продовжує зростати [Schweizer та ін., J.Sugar Beets Res.28: 1-23, 1991] збільшуючи, таким чином, проблему знищення бур'янів на ланах цукрового буряка. Гербіцид Roundup® є препаратом широкого спектру дії, якому надають перевагу з екологічної точки зору, але який затримує не тільки ріст бур'янів, а й рослин цукрового буряка. Згідно з даним винаходом один літр розчину гербіциду Roundup® містить 360г активного інгредієнта (а.і.) гліфосату (загальна назва N-фосфонметилгліцин), який поглинається листям. До цього часу, протягом 20 років його використання, не було виявлено розвитку стійкості бур'янів до нього [Holt та ін, Annu. Rev. Plant Physiol., 1993]; також не було виявлено ніяких природних ознак звикання цукрового буряка до застосування гліфосату. Однак, досходова обробка площ гербіцидом Roundup® здається більш ефективною для ліквідації бур'янів, ніж комбінація гербіцидів, які часто використовуються в агротехнології цукрового буряка, яка складається з фенмедіфану, метамітрону та етофумесату [Madsen та ін., Weed Res. 35: 105-111, 1995]. бур'янів, пожовтіння листя, а згодом, і перехід жовтого кольору у коричневий, пошкодження тканини рослини та загнивання кореневої системи. Щоб надати культурним рослинам стійкості до дії гліфосату, уся увага була зосереджена на введенні в культурні рослини генів epsps, ,які здатні підвищити стійкість до гліфосату. Крім рослин, бактерії та грибки природно виявляють ферментативну активність epsps. Було виявлено, що ген cp4/epsps з Agrobacterium sp. CP4 підвищує стійкість рослин до гліфосату [Barry et al., "Inhibitors of Amino Acid Biosynthesis: Strategies for Imparting Glyphosate Tolerance to Crop Plants", в :Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acid in Plants, під редакцією Singh et al. (eds), American Society of Plant Physiologists, pages 139145, 1992]. Введення гена cp4/epsps у сою та олійні культури рапсу підвищили стійкість до обробки листя рослин гербіцидом в польових умовах [Delannay та ін.,Сrор Sci.35: 1461-1467, 1995; Padgette та ін., Crop Sci. 35: 1451-1461, 1995]. Редуктаза оксидази гліфосату (дох), що виділена з Achromobacter sp. штам LBAA (Barry та ін., описано вище) розщеплює гліфосат до амінометилфосфонової кислоти, речовини не токсичної для рослини. Комбінація генів cp4/epsps та оксидази гліфосату (дох) була успішно використана для отримання трансгенної пшениці [Zhou та ін., Plant Cell Rep. 15: 159-163, 1995], яка є стійкою до дії гліфосату. Об'єктом даного винаходу є отримання рослин цукрового буряка які є несприйнятливими до гліфосату у дозах, достатньо великих для виявлення оптимальної гербіцидної дії. Такі рослини, у подальшому, можуть бути поліпшені завдяки зворотному схрещуванню з елітними лініями цукрового буряка, щоб оптимізувати його агрономічні властивості, такі як урожайність, стійкість до патогенних впливів і таке інше. Рослини цукрового буряка можуть бути трансформовані за допомогою Agrobacterium tumefaciens - опосередкованої трансформації [Fry et al, Third international congress of plant mol.biol., Tuscon, Ari zona, USA; D'Halluin et al, Віо/TесhnоІоgу 10: 309-314, 1992; Konwar, J. Plant Biochem & Biotech 3: 37-41, 1994]. Аgrоbасtеrіumопосередкована трансформація часто призводить до інтеграції більш ніж однієї копії Т-ДНК в геном Гліфосат затримує біосинтез амінокислот ароматичного ряду через незворотне зв'язування з 5-енолпірувілшікімате-З-фосфат синтазою (epsps). Всередині хлоропласту цей ензим прискорює реакцію шікімате-3-фосфату та фосфоенолпірувату, з утворенням 5-енолпірувілшікімате-З-фосфату та фосфа ту. Приблизно через тиждень після застосування гербіциду можна візуально виявити результати обробки у вигляді пригнічування сходів 5 85364 рослини. Ген, який потрібно інтегрувати, краще вводити у Т-ДНК таким чином, щоб він розмістився близько до правого краю Т-ДНК, який, в протилежність лівому краю, майже завжди переноситься в рослину. Згідно з даним винаходом, рослини культури цукрового буряка несприйнятливі до обробки дозою майже 3´6 літрів гербіциду Roundup® на гектар (тобто майже 18 літрів на гектар). Стандартна доза для отримання добрих результатів від впливу гербіциду на бур'яни коливається у межах 4-6л на гектар, в залежності від ступеню засміченості поля бур'янами. За умов використання цих концентрацій гербіциду не виявлено його впливу на міцність рослин культури та хлорозу листя. Ця несприйнятливість рослин, відповідно до даного винаходу, надана трансгенно експерованою активністю ферменту cp4/epsps. Краща реалізація цього винаходу була депонована у [National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland UK) 24 жовтня 1997 року, номер згідно з каталогом 97087006/2]. Таким чином, даний винахід відноситься до рослин цукрового буряка, включаючи їх нащадків, які експресують активність фермента cp4/epsps. Більш конкретно, винахід стосується рослин цукрового буряка включаючи нащадків, нечутливи х до обробки їх гербіцидом Roundup® у об'ємах від 4 до приблизно 18л на гектар. Відповідно до цього винаходу рослини отримують звичайною Аgrоbасtеrіum-опосередкованою трансформацією, використовуючи вектор трансформації, який містить між правими та лівими ТДНК граничними послідовностями частину ДНК, описану в SEQ ID NO:5, яка кодує активний інградієент cp4/epsps. У межах цього винаходу було несподівано виявлено, що у випадку події трансформації (RRMax) при відсутності лівої та правої Т-ДНК послідовностей всередині трансгенного генома, що призводить до делеції значної частини вектора трансформації ДНК при збереженні ДНК, що кодує фермент cp4/epsps, забезпечується найвища несприйнятливість до гліфосату. Зокрема частина ДНК, яка характеризується у SEQ ID NO:1, була виявлена інтегрованою у зону генома з високим ступенем повторів, одночасно заміщуючи частину вказаної повторюваної зони геномної послідовності. Геномна ДНК, безпосередньо прилегла до тієї частини трансгенної послідовності, яка у векторі трансформації, що використовували, зв'язана з ТДНК послідовністю правого краю, має послідовність, представлену в SEQ ID NO:2. Геномна ДНК, що безпосередньо прилягає до другого кінця інтегрованої трансгенної ДНК, має послідовність, представлену в SEQ ID NO:3. Повна послідовність нової утвореної геномної ДНК представлена в SEQ ID NO:4. Згідно із вказаним вище, даний винахід відноситься до рослин цукрового буряка разом з їх нащадками, в яких ДНК, яка характеризується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:1, складає частину геному рослини, та вказана нуклеотидна послідовність переважно заміщує ДНК 6 послідовності з високим ступенем повторів всередині геному рослини. В зв'язку з цим, перевага надається рослині цукрового буряка разом з нащадками, у яких ці частини геному, безпосередньо зв'язані із вказаною нуклеотидною послідовністю, характеризується нуклеотидними послідовностями SEQ ID NO:2 та SEQ ID NO:3 відповідно. Ще більша перевага надається рослині цукрового буряка разом з нащадками, де частина геному рослини утворена ДНК, що характеризується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:4. Несприйнятливість до впливу гербіциду, яка вбудована в транс генні насіння та рослини, що згадувались вище, передаються статевим шляхом або вегетативно і, таким чином, може бути збережена та розмножена в наступних поколіннях рослин. У загальному випадку, збереження та розмноження рослин проводиться за відомими методами агротехнології, розробленими для досягнення специфічних цілей, таких як обробка землі, сівба або збирання врожаю. Оскільки вирощування врожаю супроводжується втратами, які викликаються комахами або інфекціями, і вживаються заходи для впливу на хвороби рослин, комах, нематоди та інші несприятливі фактори, щоб підвищити урожайність культури. Ці заходи містять механічні методи, такі як обробка ґрунту або видалення уражених рослин, а також застосування агрохімікатів, таких як фунгіциди, гаметоциди, нематициди, регулятори росту, речовини для дозрівання та інсектициди. Використання толерантности до гербіцидів трансгенних рослин та їх насіння, згідно з винаходом, може бути надалі поширено на розвиток рослин з покращеними якостями, такими як несприйнятливість до шкідників, гербіцидів або стресу, поліпшення харчової цінності, підвищення врожаю або покращення структури рослини, яка б викликала менші втрати від полягання та ламкості рослини. Різні етапи виведення, такі як селекція ліній для зхрещування, направлене запилення батьківських ліній або селекція підходящих поколінь рослин широко відомі і давно використовуються людиною. В залежності від бажання отримати ті чи інші властивості, вибирають різні методи виведення. Придатні методики добре відомі і включають без обмежень гібридизацію, інбридінг, зворотне схрещування, багатолінійне розмноження, міжвидове змішування, міжвидову гібридизацію, анеплоїдні методи ι таке інше. Таким чином, трансгенні рослини та їх насіння, згідно із цим винаходом, можуть використовуватись для виведення покращених ліній рослин, які, наприклад, збільшують І ефективність звичайних обробок, таких як обробка гербіцидами, пестицидами або дозволяють обходитись взагалі без них завдяки своїм і модифікованим генетичним властивостям. Крім того, можна одержувати нові культури рослин з підвищенною толерантністью до стресу завдяки їх оптимізованому генетичному 'обладнанню' та отримати якісніші врожаї, ніж врожаї культур, які нездатні протистояти схожим шкідливим умовам навколишнього середовища. 7 85364 У насіннєвому виробництві якість проростання та однаковість насіння є головними характеристиками, в той час, як якість проростання та однаковість насіння, зібраного та проданого фермером врожаю, не є важливими. Оскільки важко тримати культур у рослини окремо від інших культур та насіння бур'янів, то щоб запобігти захворюванням насіння та виробити насіння з доброю схожістю, у насіннєвому виробництві виробниками, які мають досвід у вирощуванні, підтримці, та продажу чистого насіння, розроблені досить екстенсивні та добре визначені практичні методи. Так, для сільгоспвиробників загальною практикою є купівля сертифікованого насіння, яке відповідає специфічним стандартам якості, замість використання насіння зі своєї власної рослинної культури. Насіннєвий матеріал звичайно оброблюють захисними речовинами, які містять гербіциди, інсектициди, фунгіциди, бактерициди, нематициди, молюскоциди, або суміші з цих названих препаратів. Захисні покриття, які звичайно використовують, містять суміші, такі як каптан, карбоксин, тірам (TMTD®) металаксил (Apron®) та пиримифос-метил (Actellic®). При бажанні суміші об'єднують з носіями, сурфактантами або з ад'ювантами, що полегшують процес обробки, і які звичайно використовують при виготовленні препаратів, щоб забезпечити захист від пошкодження бактеріями, грибками або тваринами-шкідниками. Захисні покриття можуть застосовува тись у вигляді імпрегнуючого матеріалу у рідкій консистенції або ж комбінованого матеріалу з вологою чи сухою консистенцією. Можливе також застосування інших методів, таких як обробка рослини на стадії розвитку та плодоношення. Є ще один аспект цього винаходу - забезпечення нових агротехнологічних методів, таких як методи, наведені вище, що характеризуються використанням трансгенних рослин, трансгенного рослинного матеріалу або трансгенного насіння відповідно до цього винаходу. У іншому втіленні цей винахід стосується клітини трансгенних рослин, рослинної тканини, органів, насіння або частин рослин, що отримані від трансгенної рослини. У межі винаходу включені також трансгенні нащадки рослини, також як і трансгенні рослинні клітини, тканини, органи, насіння, та частини рослин, отримані від їх нащадків. Крім того, цей винахід також стосується комерційного пакету, який містить толерантне до гербіциду Roundup® насіння, здатне експресувати ген cp4/epsps, а також інструкцію щодо його використання. Кращим в межах цього винаходу є комерційний пакет, в якому знаходиться насіння трансгенних рослин, що містять стійко інтегрований в їх геном фрагмент ДНК, що має нуклеотидну послідовність, описану у SEQ ID NO:1. Методологію трансформації, яка застосовувалась, можна узагальнити у такий спосіб: а) трансформація сім'ядолей, що виросли in vitro, за допомогою Agrobacterium tumefaciens, з вектором, який містить такий фрагмент ДНК, що кодує cp4/epsps так, як описано в SEC ID NO:5; б) паросткова регенерація в присутності гліфосату; 8 в) пересадка паростків в ґрунт в теплиці; г) обробка сходів глі фосатом; д) візуальна класифікація міцності рослин та хлорозу листя; е) селекція повністю нормальних рослин з нормальною міцністю та листям, що не піддалися впливу від обробки гліфосатом; є) розмноження відібраних рослин з використанням звичайних те хнологій розмноження рослин. Звичайно паростки регенерують у присутності від приблизно 0,1 до приблизно 10мМ, краще при близько 1мМ гліфосату через 8-12 тижнів після селекції. Кожний трансгенний паросток надалі розмножується на 10 копій, які можна, за бажанням, проаналізувати на присутність трансгена cp4/epsps, використовуючи для цього полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), перед передачею його у теплицю для укорінення. Умови освітлення в теплиці такі: 16 годин освітлення та 8 годин затемнення за умов температури 22±2°С. На етапі появи четвертого листка паростки обприскують водяним розчином Roundup® при дозі від 0,1 до 20 літрів (оптимально 1л) на гектар. Візуальні оцінки пошкодження міцності рослини та хлорозу листя базуються на шкалі оцінок від 0 (нежива рослина) до 9 (повністю непошкоджена рослина), які проводяться через 2 тижні після обробки їх гліфосатом. Оцінки 0 - 3 вказують на чутливі рослини. Оцінки від 3 до 7 - на рослини, що мають від низького до середнього рівня толерантності і оцінки 8 та 9 вказують на добрий рівень толерантності до гліфосату. В загальному вигляді оцінки характеризуються у такий спосіб: 9 - Неушкоджена рослина, ідентична необробленому контролю; 8 - Мають місце дуже невеликі некрози у верхівках листя; менше, ніж 5% площі листя піддалися впливу і пожовтіли; 7 - Мають місце дуже невеликі некрози у верхівках листя, яке почало скручуватися; менше, ніж 5% площі листя піддалися впливу і пожовтіли; 6, 5, 4 - Збільшення некрозів та скручування листя, листя стає меншим, ніж у звичайних рослин; 3, 2 - Ніякого росту листя або дуже обмежений ріст; все листя покручене і піддане некрозу; 1 - Ніякого росту рослини; залишається зеленим не більше 5% рослини; 0 - Рослина нежива. Щоб зібрати дані про рослини з нормальною міцністю і неуражених при розробці гліфосатом в польовим випробуваннях (оцінка 9), їх надалі 1 розмножували за звичайними технологіями. Трансформацію переважно виконують з використанням Ті - вектору, що містить фрагмент ДНК з послідовністю, представленою у SEQ ID NO:5, яка несе гени cp4/epsps та gох, які, як показано, надають толерантності до гліфосату у визначених видах рослини, і, репортений ген uidA, що кодує фермент β-глюкуронідазу. Підсилений промотор 35S (Odell та ін., Nature 313: 810-812, 1985) зв'язаний з геном uidA, промотор віруса мозаїки ранника (FMV) [Gouwda та ін., J. Cell. Biochem.Suppl. 13D: 9 85364 301, 1989] – з генами cp4/epsps та gох. Вище генів cp4/epsps та gох вставлений транзитний пептид [Gasser та ін., J. Biol. Chem. 263: 4280-4289, 1988] для того, щоб обидва білки дістались до хлоропласту. Був виявлений один випадок трансформації рослини, проведений згідно з цим винаходом, коли несподівано було виявлено, що на рослину не подіяли дози до 3´6 (близько 18 літрів) гербіциду Roundup® на гектар. Молекулярний аналіз показує, що: в один локус інтегрована одна копія трансгенної ДНК; інтегрована ДНК кодує cp4/epsps та відповідає урізаній ДНК вектору; інтегрована ДНК заміщує частину геномної ДНК і має послідовність, показану у SEQ ID NO:1; геномна ДНК безпосередньо прилягає до вставленої ДНК і характеризується послідовностями у SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:3, призводячи до нової організації геномної послідовності SEQ ID NO:4; гени cp4/epsps та uidA є цілими, тоді як ген gох є узрізаним; інші векторні послідовності відсутні в трансгенних рослинах. Далі, після одержання такої інформації, рослини, одержані завдяки одному із специфічних випадків трансформації, можуть бути легко виділені від інших рослин цукрового буряка за допомогою ПЛР. Відповідні комбінації праймерів дозволяють специфічно ідентифікувати послідовності геномної ДНК, які присутні тільки в рослинах, які безпосередньо або опосередковано походять від ідентичних випадків трансформації. Такі випадки ні в якому разі не обмежуються тими, що отримані за допомогою Agrobacteriumопосередкованої трансформації, але можуть також бути результатом біолітичних експериментів з трансформації рослин. Цей винахід надалі стосується рослин цукрового буряка з їх нащадками які характеризуються тим, що ампліфікація в ПЛР з використанням їх геномної ДНК як матриці призводить до ампліфікації: фрагменту ДНК в 739п.н. коли використовується пара олігонуклеотидних праймерів, що характеризуються послідовностями SEQ ID NO:B та SEQ ID NO:а; або фрагменту ДНК в 834п.н. коли використовується пара олігонуклеотидних праймерів, що характеризуються послідовностями SEQ ID NO:D та SEQ ID NO:е; або фрагменту ДНК в 1057п.н. коли використовується пара олігонуклеотидних праймерів, що характеризуються послідовностями SEQ ID NO:А та SEQ ID NO:b; або фрагменту ДНК в 1224п.н. коли використовується пара олігонуклеотидних праймерів, що характеризуються послідовностями SEQ ID NO:С та SEQ ID NO:f. Приклади Надані приклади описують матеріали та методи, використані у виконанні дослідів згідно з винаходом, та отримані результатів. Ці приклади подаються у вигляді ілюстрацій, і їх перелік не слід 10 розглядати як якесь обмеження щодо цього винаходу. Приклад 1. Трансформація цукрового буряка Цукровий буряк генотипу А1012 трансформували вектором, що несе гени cp4/epsps та gох, які здатні надати толерантність до гліфосату, ген nptll, який надає стійкість до антибіотика канаміцину, та репортерний ген uidA, що кодує β-глюкуронідазу (GUS). Гени nptll та uidA функціонально зв'язані з підсиленим промотором 35S [Odell та ін., Nature 313: 810-812, 1985], тоді як гени cp4/epsps та gох знаходяться під контролем промотора віруса мозаїки ранника (FMV) [Gouwda та ін., J.Cell. Biochem. Suppl. 13D: 301, 1989]. Крім того, гени cp4/epsps та gох зв'язані з транзитним пептидом [Gasser та ін., J.Biol. Chem. 263: 4280-4289, 1988], орієнтованим 5'-кінцем, щоб скерувати обидва білки до хлоропласту. Гени cp4/epsps та uidA використовують Е9 3' термінаторну послідовність, тоді як гени gох та nptll використовують відповідну NOS 3' послідовність. Вирощена in vitro культура цукрового буряка (Beta vulgaris. L) трансформується використанням A. tumefaciens. Рослини регенерують, як описано [Fry та ін. у праці 'Genotype-independent transformation of sugarbeet using Agrobacterium tumefaciens', Third international congress of plant mol.biol.,Tuscon, Таскон, Arizona, USA, 1991 та Konwar J.Plant Biochem & Biotech 3: 37-41, 1994], використовуючи гліфосат з концентрацією 1mM як селективний агент. Щоб видалити A. Tumefaciens, сім'ядолі тричі інкубували в MS-середовищі, що містив 500мг/л цефотаксиму (60 хвилин при 4550об./хв.). Регенеровані паростки аналізували після 8-12 тижнів селекції з 1mМ гліфоса, 500мГ/л цефотаксиму, включаючи переніс до свіжого середовища через кожні три тижні. Кожний трансгенний паросток розділяли на 10 мікрокопій, аналізували на присутність трансгена та передавали в теплицю для укорінення в ґрунті. Щоб перевірити присутність гена cp4/epsps, використовували полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Двадцять міліграмів рослинного матеріалу збирали у пробірку Еппендорф з регенерованих in vitro паростків. Загальну ДНК екстрагували в основному згідно з [Таі та ін., Plant Моl. ВіоІ. Rep. 8: 297-303, 1990]. Незначними модифікаціями були: додавання 500μл (мкл) 100мМ Tris-HCI pH8.0, що містить 50мМ Na-EDTA, 1,25% SDS (вага/об'єм в/о), 0,38% Na-Bisulfite (в/о) та 200мкг/мл протеїнази K, і витримування цієї суміші при температурі 65°С протягом двох годин. Нерозчинений листовий матеріал видаляли, а загальну ДНК осаджували та заморожували на 2 години при -20°С. ПЛР виконували згідно з інструкціями до набору PerkinElmer Gene-Amp PCR Kit (Perkin-Elmer Corp.), використовуючи модифікований десятикратний реакційний буфер, який містить 100мМ Tris-HCI pH8.3, 500мМ КСІ, 30mM MgCI2, 1,0% Nonidet P-40 (в/о), 0,4μΜ крезолу червоного у 24% сахарозі (в/о) та Taq Start Antibody (Clontech). Для ампліфікації послідовностей cp4/epsps застосовувалися такі праймери [Shah та ін., Science 233: 478-471, 1986]: 5'-САС CGG ТСТ ТТТ GGA AGG TGA AG-3' (SEQ ID NO:6) та 11 85364 5'-ААС GAG АСС CAT ААС GAG GAA GC-3' (SEQ ID NO:7). Для ампліфікації внутрішньої геномної контрольної послідовності (surA, surB) використовувалися такі праймери: 5'-ААА CAG ТСС CGT GCA ТСС ССА АС-3' (SEQ ID NO:8) та 5'-GAC GCT СТС СТТ GAT ТСТ GTC СС-3' (SEQ ID NO:9). Ніяких змін ефективності! трансформації між різними бінарними плазмідами не виявлено. Мікророзмножені паростки переносили у ґр унт в теплицю. Світлові умови в теплиці - 200μmol м2 сек, (Osram Power Star HQI-Z, 400ват), 16 годин освітлення, 8 годин затемнення, та температура 22±2°С. На стадії розвитку 3-4 листки, паростки, які були отримані від 260 незалежних трансформантів, піддавали обробці Roundup®. Застосовували калібрований розпилювач для нанесення водного розчину гербіциду у дозі 1л на гектар (360г активного інгредієнта на літр). Візуальні оцінки фітотоксичних ефектів основані на шкалі від 0 (повний некроз листя) до 9 (видимих ефектів не виявлено) проводили для кожної рослини через два тижні після обробки гліфосатом. Для 75 різних трансформантів діапазон фітотоксичних ефектів за вказаною шкалою знаходився у межах 0-6. Інші 185 (71%) трансформантів мали рівень фітотоксичних пошкоджень, який відповідав 7 або більше за вказаною шкалою, що означало, що вони мають незначні, або не мають видимих пошкоджень після обробки їх гербіцидом. Ці рослини надалі схрещувались з нетрансгенним цукровим буряком, щоб утворити F1 покоління для наступної оцінки у польових випробуваннях. Польові випробування проводились для оцінки різних випадків трансформації. Ділянки складались з трьох рядків, кожний 9 метрів завдовжки, з відстанню між ними 0,5 метра. Кожний індивідуальний трансформант висаджували на свою ділянку. Після первинної обробки гербіцидом Roundup® 1л/га, (360г а.і./л)), на стадії сім'ядолі, щоб видалити нетрансгенні розділяючі рослини, рядки проріджували вручн у, після чого рослини були розташовані на відстані 20см одна від одної. Кожну ділянку ділили на три частини, які обробляли незалежно одна від одної. Одну ділянку обробляли звичайними гербіцидами - метамітроном - 0,1кг а.і./га, фенмедіфаном - 0,2кг а.і./га та етофумесатом - 0,1кг а.і./га. Іншу ділянку обробляли двічі 2л/га ( 1440г а.і./л) гербіцида Roundup® і третю ділянку обробляли двічі - 4л/га ( 2880г а.і./л) гербіцида Roundup®. Рослини обробляли на стадіях двох та чотирьох листків. Через два тижні після останньої обробки, рослини оцінювали за станом фітотоксичних ефектів від гербіцидів. Виявили симптоми від повної чутливості до повної толерантності. Спостерігали різницю між оцінками в теплиці та оцінками польових випробувань. Різниця, ймовірно, виникла через різні умови навколишнього середовища, зокрема через те, що в теплиці було відсутнє ультрафіолетове світло, що не проходило крізь скло теплиці. Не було виявлено ніяких морфологічних або фізіологічних відмін між рослинами з ділянок, оброблених різними дозами 12 гербіциду Roundup®, та з обробками сумішшю звичайних гербіцидів. Два трансформанти виявили високу толерантність до Roundup® після подвійних обробок двома та чотирма літрами на гектар. Після розпилення гербіциду Roundup®, толерантність оцінювали за ступенем міцності рослини та хлорозу листя (Tr.chl). Різні ступені мають такі значення: 9 - Неуражена рослина, ідентична до необробленого контролю; 8 - Мають місце дуже невеликі некрози у верхівках листя; менше, ніж 5% площі листя піддалися впливу і пожовтіли; 7 - Мають місце дуже невеликі некрози у верхівках листя, яке почало скручуватись; менше, ніж 5% площі листя піддалися впливу і пожовтіли; 6, 5, 4 - Збільшення некрозів та скручування листя, листя стає меншим, ніж у звичайних рослин; 3, 2 - Ніякого росту листя або дуже обмежений рост; все листя покручене і піддане некрозу; 1 - Ніякого росту рослини; залишається зеленим не більше 5% рослини; 0 - Рослина нежива. 22 різних випадки трансформації (номери 122) та один нетрансгенний контроль (номер 23) обприскували 1+4+4л на гектар гербіциду Roundup® (загалом 9л/га). Результати візуальної оцінки пошкоджень рослин наведені нижче в таблиці. №№ по Оцінка Оцінка хлоропорядку міцності зу листя 1 9 9 (RRMax) 2 6 7 3 2 3 4 5 7 5 9 8 6 3 3 7 7 7 8 7 8 9 4 6 10 5 6 11 5 5 12 4 5 13 9 9 14 3 5 15 4 4 16 2 3 17 1 1 18 2 2 19 6 8 20 7 5 21 4 5 22 5 7 23 0 0 (нетрансгенний контроль) Приклад 2. Кількість копій інтегрованої трансгенної ДНК Кількість копій інтегрованої трансгенної ДНК, інтегрованої всередину геному трансформанту з найвищою толерантністю до гліфосату (RRMa x), визначали за допомогою Саузент-блот аналізу 13 85364 рестрикційних фрагментів, що простягаються за правою та лівою граничними послідовностями вектора трансформації, що використовується. Геномну ДНК з RRMax та нетрансгенної рослини з тією самою генетикою, ізолювали з 250мг ліофілізованого листя цукрового буряка, за SaghaiMaroof та ін., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 80148018, 1984]. ДНК вектора трансформації, що використовується, виступає у ролі позитивногоконтроля. ДНК у кількості 15мкг перетравлювали 120 одиницями рестриктази протягом 4 годин при температурі 37°С у загальному об'ємі 400мкл. Рестриктовану ДНК осаджували і знову розчиняли у загальному об'ємі 50мкл. Рестриктовану ДНК, позитивний плазмщний контроль та маркер стандартів молекулярного розміру (Lambda, перетравлена EcoRI та Hindlll) розділяли на 0,8% гелі агарози. ДНК візуалізовували етидієм броміду і фотографували разом з прикладеною лінійкою. Надалі ДНК переносили на мембрану Hybond N+ і гібридизували із зондом, як описано у [Ausubel та ін., (eds) у праці "Current protocols in molecular biology", Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York, 1987]. Зонди, комплементарні до пар 975-1766 послідовності гена cp4/epsps (SEQ ID NO:5) і до пар 7108-7535 послідовності гена gox SEQ ID NO:5) готували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), в якій вектор трансформації, що використовується, служить матрицею ДНК для реакції. Зонд cp4/epsps використовували, щоб визначити кількість вставок, що фланкують район правої границі. Зонд gох використовували, щоб визначити кількість вставок, що фланкують район лівої границі. Продукти ПЛР чистили за допомогою Geneclean II® Kit of BIO 101 (La Jolla, CA). Для мічення зонду фосфором 32Р використовували систему мічення ДНК Megaprim™ фірми Amersham International (Little Chalfont, UK). Визначення кількості копій може проводитись за допомогою аналізу геномної ДНК, що фланкує район правого краю границі. Геномну ДНК перетравлювали ферментом рестрикції Ncol, який розрізає послідовності, які походять від плазміди, між промотором 35S та геном uidA всередині генома цукрового буряка. Мембрана зондується внутрішнім фрагментом ПЛР від гена cp4/epsps. Після перетравлювання з Ncol та гібридизації з зондом cp4/epsps, виявлена одиночна смуга 4,7kb у 14 RRMax. Це свідчи ть про передачу однієї копії ДНК в один локус. Визначення кількості копій можна також проводити за допомогою аналізу геномної ДНК, що фланкує район лівої границі. Геномну ДНК перетравлювали ферментом рестрикції Hmdlll, який розрізає послідовності, що походять від плазміди, між 3'-термінатором Е9 гена uidA ι промотором FMV гена gох та у середині геному цукрового буряка. Після переварювання з Hindlll та гібридизації з зондом gох, у трансформанта RRMax виявляли одну смугу приблизно 2,0kb. Оскільки мінімально очікуваний розмір фрагменту більше або дорівнює 4,4kb, то даний результат вказує на урізання плазмідної ДНК при переносі її в геномну ДНК рослини. Не дивлячись на це, одержаний результат підтверджує, що тільки одна копія ДНК інтегрується в один локус. Приклад 3 Аналіз послідовності сайту інтеграції RRMax Геномну ДНК RRMax виділяли з 250мг ліофілізованого листового матеріалу цукрового буряка згідно з методикою Saghai-Maroof та ін., що описана вище. Створена бібліотека фагів lFIXII з розмірами вставки 9 - 23kb у сайт клонування Xhol (замовлено з Stratagene), що перевірена, з зондами генів cp4/epsps та gох, щоб провести скринінг на можливу наявність клонів, що перекривають місце інтеграції. Всього виявлено 25 фагів, які гібридизувались з генами cp4/epsps та gох. Були вибрані два клони, які гібридизувались з генами cp4/epsps та gох, відповідно. Один з них очищували [Fritch та ін., 1987] і надалі оцінювали за допомогою Саузерна-блот аналізу та ПЛР. Він містить 15-16kb вставки геномної ДНК, що включає трансгенну ДНК та фланкуючі послідовності цукрового буряка. Вказані фланкуючі послідовності ампліфікували в ПЛР, використовуючи праймер, що відповідав послідовностям промотору FMV або гена gох. У комбінації з праймером, що узгоджувався з послідовністю у lFIXII клонуючій касеті (докладний опис послідовностей наведений нижче у Таблиці 1). Повні ділянки з'єднання ДНК/цукровий буряк секвенували за допомогою термінації ланцюга дідеоксінуклеотидами (метод Сенгера), використовуючи Applied Biosystems, Model 373A, Version 2.1.1. Праймери, що використовувались для секвенування, наведені у Таблиці 2. 15 85364 Аналіз послідовностей виявив, що трансгенна ДНК, інтегрована вгеном RRMax має нуклеотидну послідовність, представлену SEQ ID NO:1. Стартова точка інтеграції лежить між правою граничною послідовністю та промотором FMV і закінчується на 897п.н. нижче старт-кодону гена gох. Трансляційні стоп-кодони для урізаного гена gох можуть бути знайдені у 130 та 235п.н. нижче сайту з'єднання. Сайт Hindlll ідентифікували на 210п.н. нижче, а транскрипційний термінального сигналу (ААТААА) - на 650п.н. нижче старт-кодону гена gох. Послідовність SEQ ID NO:2 описує послідовність ДНК геномної ДНК безпосередньо зв'язаної з правою граничною ділянкою трансгенної ДНК, а послідовність SEQ ID NO:3 описує послідовність ДНК, геномної ДНК безпосередньо зв'язаної з лівою граничної ділянкою трансгенної ДНК. Приклад 4 Характеристика трансгенної ДНК, інтегрованої RRMax Щоб надалі охарактеризувати праву граничну ділянку, геномну ДНК RRMax та вектор трансформації ДНК перетравлювали одним з ферментів рестрикції ВаmНІ, Hindlll, Bcll або EcoRI. У Саузерн-блот аналізі порізана ДНК зондується фрагментом ПЛР гена cp4/epsps, описаним у Прикладі 2. Незалежно від того, яку рестриктазу використовували, одержували один фрагмент в Саузернблоті. Розмір визначених фрагментів представлений у Таблиці 3. Наведені дані свідчать, що одинарна копія ДНК була перенесена до рослини, і що переніс ДНК в рослину цукрового буряка призвів до повного переносу ген у cp4/epsps. Результати знаходяться у відповідності зі результатами визначення числа копій у прикладі 2 та аналізу нуклеотидноїі послідовності прикладу 3 Таблиця 3 Розміри фрагментів в Саузерн-блоті Фермент RRMax Вектор трансфомації 16 ВаmНІ Hindlll Bcll EcoRI >10kb 2,4kb 3,2kb 1,8kb 9,7kb 2,4kb 2,9kb 1,8kb Щоб надалі характеризувати фрагмент інтегрованої ДНК, геномну ДНК з RRMax перетравлювали будь-яким з ферментів рестрикції Ncol, BamHI або Hindlll. Для контролю ДНК трансформаційного вектора перетравлювали разом з тими ж рестриктазами. Блот зондували фрагментом ДНК, ампліфікованим в ПЛР, що простягається від 3796 до 4837п.н. гена uidA у SEQ ID NO:5. Визначені розміри фрагмента показані у Таблиці 4. Незалежно від того, який фермент рестрикції використовували, перетравлення будь-яким з них призводить до утворення одиночного сигналу на радіоавтографічній плівці, що вказує на те, що вставлена ДНК має ті ж самі параметри, що і внутрішня ДНК вектора трансформації, що використовується. Таблиця 4 Розміри фрагментів в Саузерн-блоті Фермент Ncol BamHI Hindlll Вектор трансфомації 3,4kb 3,2kb 3,2kb RRMax 3,4kb 3,2kb 3,2kb Для подальшої характеристики лівої граничної зони, геномна ДНК RRMax та ДНК вектора трансформації перетравлюють з будь-яким з ферментів рестрикції Ncol, BamHI, Hindlll або EcoRI. У Саузерн-блот аналізі порізана ДНК зондується фрагментом gох ПЛР, який описаний у прикладі 2. Незалежно від того, яку рестриктазу використовували, перетравлення будь-якою рестриктазою призводить до утворення сигналу одного фрагмента на радіоавтографічній плівці. Рестрик 17 85364 ція будь-яким з ферментів рестрикції Ncol, BamHI або EcoRI можлива для ідентифікації внутрішнього фрагменту відомого розміру. Однак, жоден з цих ферментів рестрикції не дає такого внутрішнього фрагменту очікуваного розміру. Це вказує на те, що сайти рестрикції для Ncol, BamHI або EcoRI відсутні в трансгенній рослині. Дані результати повністю узгоджуються з результатами секвенування, в якому було виявлено, що ген gох був тільки частково інтегрований у рослину. Перетравлення з ферментом рестрикції Hindlll призвело до утворення фрагменту приблизно 2kb, додатково підтверджуючи дані секвенування, де сайт Hindlll розміщений нижче гена gох у геномі. Результати також свідчать, що в рослину була перенесена одиночна копія трансгенної ДНК. Ці результати добре корелюють з попередніми результатами визначення кількості копій з прикладу 2 та аналізом нуклеотидної послідовності прикладу 3. Одиночна копія інтегрується в рослинний геном, оскільки ген gох є частково видаленим. Таблиця 5 Розміри фрагментів Саузерн-блота Фермент Ncol BamHI Hindlll EcoRI Вектор Трансформації 2,5kb 2,9kb 9,5kb 1,6kb T9100152 3,0kb >10,0kb 2,0kb 3,6kb Приклад 5.Відсутність інших послідовностей ДНК вектора Щоб перевірити відсутність послідовностей oriV, ori-322, aad та nptll у трансформаційній події, може бути проведений Саузерн-блот аналіз RRMax з використанням комбінацій фермент рестрикції/зонд, що перекривають oriV, ori-322, aad та nptll. ДНК вектора трансформації перетравлвали ферментом рестрикції Nspl, який розрізає плазміду по 17 сайтах. З метою такого аналізу фрагмент Nspl, що перекриває oriV, та фрагмент, що перекриває ori-322 і aad очищували та використовували для Саузерн-блот аналізу. Фрагмент, ампліфікований в ПЛР, який має нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO:26, використовували для зондування послідовностей nptll. Всі фрагменти очищували за допомогою набору Geneclean II® Kit BIO 101 (LaI Jolla, CA). Мічення фосфором 32Р проводили за допомогою систем Megaprime ™ DNA labelling system Amersham International (Little Chalfont, UK). 18 Геномна ДНК RRMax перетравлювалась з ферментом рестрикції BamHI, який розрізає ДНК вектора трансформації по трьох сайтах, розташованих на парах нуклеотидів 2321, 5544 та 8413 в SEQ ID NO:5. Гібридизація відповідної мембрани Саузерна - переносу з зондом, що перекриває oriV, не виявляє відповідного сигналу. Виходячи з цього, можна зробити висновок, що oriV не присутнє в RR Max. Гібридизація відповідної мембрани Саузерна переносу з зондом, що перекриває ori-322, та aad, не виявляє відповідного сигналу. Виходячи з цього, можна зробити висновок, що ori-322 та aad не присутні в RRMa x. Гібридизація відповідної мембрани Саузерна переносу з зондом, що перекриває nptll, також не виявляє відповідного сигналу. Ви ходячи з цього, можна зробити висновок, що nptll не присутнє в лінії RRMax. Приклад 6 Стабільність лінії RRMax Перетравлення геномної ДНК ферментом рестрикції Bell та Саузерн - блот аналіз з використанням гена cp4/epsps як зонда, проводили згідно з описанням прикладу 2. Для цього аналізу використовували 4 рослини від 2 та 3 покоління та 5 рослин з 4 покоління. До того ж, 3 нетрансгенні рослини використовували як негативний контроль. Аналіз первинного випадку трансформації виявив один фрагмент розміром 3,2kb. Саузерн - блот аналіз поколінь нащадків також виявив один фрагмент розміром 3,2kb. Якщо введена ДНК стабільно успадковується від покоління до покоління, то той самий фрагмент розміром 3,2kb очікується в усі х рослинах. Перетравлення геномної ДНК з ферментом рестрикції Hindlll і Саузерн - блот аналіз, який використовує вн утрішній фрагмент гена gох які зонд, проводили, як це описано у прикладі 2. Аналіз випадку первинноїтрансформації виявив один фрагмент розміром 2,0kb. Саузерн - блот аналіз поколінь нащадків також виявив один фрагмент розміром 2,0 kb, що вказує на стійке успадкування даної риси. Приклад 7 ПЛР-характеристика RRMax. Геномну ДНК лінії RRMax. виділяли, як це описано в прикладі 2. Близько 0,5мкг ДНК використовували як матрицю ДНК в ПЛР, де використовували специфічні комбінації праймерів, які характеризуються послідовностями, представленими у таблиці 7. В залежності від комбінації праймерів, температуру відпалювання у межах 55-65°С застосовували в кожному з 30-35 циклів ампліфікації. 19 85364 Таблиця 7 Специфічні комбінації праймерів Комбінація А+а А+b А+с В+а В+b В+с С+е C+f D+e D+f Розміри амплікону 757bр 1057bр 2352bр 739bp (SEQ ID NO:27) 1039bp 2334bp 888bp 1224bp 834bp 1178bp Перелік послідовностей 1. ЗАГАЛЬН А ІНФОРМАЦІЯ: 20 1.1. ЗАЯВНИК: A. НАЗВА: NOVARTIS AG B. ВУЛИЦЯ: Schwarzwaldallee 215 C. МІСТО БАЗЕЛЬ Ε. КРАЇН А Швейцарія F. Почтовий код (ZIP) 4058 G. Теле фон +41 61 324 11 11 Н. Телефакс +41 61 322 75 32 1.2. НАЗВА ВИНАХОДУ: Трансгенні рослини 1.3. КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 27 1.4. ФОРМА ЗДАТН А ДО ЧИТАННЯ НА КОМП'ЮТЕРІ: а) НОСІЙ ІНФОРМАЦІЇ: Гнучкий диск (флопідиск) б) КОМП'ЮТЕР: Сумісний з IBM PC в) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS г) ПРОГРАМНЕ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (ЕРО) 21 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO:1: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 8012 пар нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Два г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 85364 22 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: (генома) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема 2.5. ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO:1 23 85364 24 25 85364 26 27 85364 28 29 ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 2: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 89 пар нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Два 85364 30 г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 2: GGATTGTGTT TGGGTITTGT CTGTGTGTTT AATGTGTTTA AGGGATGAAT TAGAATCCTC TTAATC AACC TACAGCIX3AT TTGGAOCGG 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NО:3: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 697пар нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота 60 89 в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Два г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема 31 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NО:4: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 8798 пар нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота 85364 32 в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Два г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема 33 85364 34 35 85364 36 37 85364 38 39 85364 40 41 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 5: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 8418 пар нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота 85364 42 в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮПВ: Два г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема 43 85364 44 45 85364 46 47 85364 48 49 85364 50 51 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 6: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 23 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO:6: CACCGGTCTT TTGGAAQGTG AAG 23 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO:7: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 23 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ; Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛЩОВНОСТI SEQ ID NO:7: AACGAGACCC ATAACGAGGA AGC 23 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 8: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 23 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ·SEQ ID NO: 8: AAAC AGTOCC GTOC ATOCCC AAC 23 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 9: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: 85364 52 а) ДОВЖИНА: 23 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 9: GACGCTCTCC TTGATTCTCT COC 23 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 10: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 20 пар нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 10: CAAGAAGGTT GGTATOGCTG 20 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 11: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 23 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 11: TCTITTGTGG TCGTCACTGC GTT 23 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 12: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 24 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота 53 в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 12: GCGAGCTCTA ATACGACTC A CTAT 24 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 13: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 23 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 13: CGOGAGCTC A АТТААСССГС ACT 23 1 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 14: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 20 пар нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 14: TCTGTACCCT GACCTTGTTG 20 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 15: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 20 пар нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 15: CGTGGATACC AC ATOGTGAT 20 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 16: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 19 пар нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 16: ACCTTGGCTT GAAGTACTC 19 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 17: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 23 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один 85364 54 г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 17: ТСААССТАСА GCTGATTTGG АСС 23 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 18: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 22 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 18: GGACCGGAAC GAC AATCTGA ТС 22 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 19: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 22 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 19: CTAGGGAAGT CCAMTCAGC CG 22 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 20: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 23 базових пари б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 20: TTTQGACCGG AACTTTCCAG AAG 23 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 21: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 23 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 21: CTAACTTGCG CCATCQGAGA AAC 23 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 22: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 23 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 55 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 85364 56 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 22: GACTTCTCAC CTQGAATACG GAC 23 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 23: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 23 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 23: ATTCTTGAGC TC ATC AAGC A GCC 23 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 24: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 22 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 24: AAGGTTCGTA TCGCTGGAGC ТG 22 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 25: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 23 пари нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Один г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема ОПИСАННЯ ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 25: ТСТССАСААТ GGCTTCCTCT АТG 23 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 26: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 671 пара нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Два г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема 2. ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 27: 2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: а) ДОВЖИНА: 739 пар нуклеотидів б) ТИП: Нуклеїнова кислота в) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ: Два г) ТОПОЛОГІЯ: Лінійна 2.2. МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: ДНК (геномна) 2.3. ГІПОТЕТИЧНА: Нема 2.4. АНТИ-ЗМІСТОВА: Нема 57 Комп’ютерна в ерстка Т. Чепелев а 85364 Підписне 58 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601