Спосіб прогностичної діагностики чоловічої неплідності різної етіології

Реферат: Винахід належить до медицини, а саме до сексопатології, і може бути використаний для прогностичної діагностики чоловічої неплідності різної етіології. Спосіб передбачає визначення особливостей експресії протеїну Claudin 11 в структурних елементах біоптата яєчка за імуногістохімічним коефіціентом, який отримують перемноженням значень розповсюдженості та інтенсивності забарвлення, які оцінюють напівкількісним методом у балах. За показниками UA 102955 C2 (12) UA 102955 C2 імуногістохімічних коефіцієнтів експресії Claudin 11 в цитоплазматичній мембрані клітин Сертолі та ендотелію гемокапілярів визначають наявність або відсутність імунного компонента, що з урахуванням результатів морфологічного дослідження дозволяє вибрати спосіб лікування неплідності та зробити прогноз щодо відновлення фертильності. UA 102955 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить належить до галузі медицини, а саме до сексопатології, і може бути використаний для прогностичної діагностики чоловічої неплідності різної етіології. В чоловічій репродуктивній системі існує гематотестикулярний бар'єр, утворений щільними контактами між клітинами Сертолі (головний компонент) та структурами, які відокремлюють зрілі сперматозоїди від периферійної крові і запобігають їх взаємодії з імунокомпетентними клітинами. Різні фактори, що порушують цей бар'єр, призводять до виникнення імунних реакцій з утворенням в крові антитіл до епітелію сім'яних канальців та розвитку аутоімунної неплідності, оскільки сперматозоїди з'являються під час статевого дозрівання вже після того, як сформувалась імунна толерантність до власних тканин організму. Лабораторна діагностика імунної неплідності на сьогоднішній день включає в себе дослідження крові та сім'яної рідини на антиспермальні антитіла-імуноглобуліни G, А та М, які при взаємодії зі сперматозоїдами здатні їх іммобілізувати, аглютинізувати, блокувати процес пенетрацї (проникнення) в яйцеклітину, унеможливлюючи процес запліднення, або блокувати процес імплантації ембріона, навіть при використанні допоміжних репродуктивних технологій. Порушення гематотестикулярного бар'єру завжди супроводжуються утворенням антиспермальних антитіл. Крім того, гематотестикулярний бар'єр виконує трофічну функцію, а також забезпечує в канальцях специфічне гормональне середовище, необхідне для сперматогенезу, в зв'язку з цим, порушення гематотестикулярного бар'єру - важливий чинник виникнення порушень сперматогенезу (оліго-, терато- і азооспермії). Тому, стан гематотестикулярного бар'єру важливий діагностичний і прогностичний фактор, який необхідно враховувати в лікуванні чоловічої неплідності. Молекулярними дослідженнями останніх років встановлено, що білки сімейства claudins складають основу щільних замикальних контактів, це трансмембранні білки. Нещодавні дослідження - нанотехнології - показали, що Claudin 11, який експресує переважно в щільних контактах між клітинами Сертолі та Осcludin - мембранний протеїн, який експресує в щільних контактах різних клітин, відіграють важливу роль в регуляції стану гематотестикулярного бар'єру та можуть слугувати як прогностичні маркери стану гематотестикулярного бар'єру та сперматогенезу. Відомий спосіб визначення імуногістохімічної експресії протеїнів екстра-целюлярного матриксу та морфометричних показників в тканині яєчка (1), прийнятий нами за прототип, який полягає в імуногістохімічному визначенні експресії протеїнів flbronectin, vimentin, laminin, collagen type IV позаклітинного матриксу та морфометричних показників в перитубулярній тканині яєчка. Недоліком даного способу: є те, що визначають імуногістохімічні особливості протеїнів позаклітинного матриксу та морфометричні показники в перитубулярній тканині яєчка. В основу винаходу поставлено задачу удосконалити спосіб прогностичної діагностики чоловічої неплідності різної етіології шляхом визначення імуногістохімічних особливостей експресії протеїну Claudin 11 у структурних елементах біоптата яєчка за імуногістохімічним коефіціентом, який отримують перемножуванням значень розповсюдженості і інтенсивності забарвлення, які оцінюють в балах, і при наявності зрілих сперматозоїдів в канальцях визначають екскреторно-обтураційну форму неплідності, при їх відсутності - секреторну, та при значеннях імуногістохімічного коефіцієнта в цитоплазматичній мембрані клітин Сертолі та ендотелію гемокапілярів 5,3±0,42 бали і нижче діагностують імунний компонент, що потребує додаткової корекції імунних та секреторних порушень сперматогенезу, хворі же на секреторну неплідність, при значенні імуногістохімічного коефіцієнта в цитоплазматичній мембрані клітин Сертолі 0,8±0,6 бали і нижче, мають несприятливий прогноз щодо відновлення сперматогенезу. Поставлена задача вирішується тим, що в способі прогностичної діагностики чоловічої неплідності різної етіології, що включає визначення морфометричних показників та імуногістохімічної експресії протеїнів в тканині яєчка, згідно з винаходом, імуногістохімічні особливості експресії протеїну Claudin 11 в структурних елементах біоптата яєчка визначають за імуногістохімічним коефіціентом, який отримують перемноженням значень розповсюдженості і інтенсивності забарвлення, які оцінюють в балах за Таблицею 1, та при наявності зрілих сперматозоїдів в канальцях визначають екскреторно-обтураційну форму неплідності, при їх відсутності - секреторну, та при значеннях імуногістохімічного коефіцієнта в цитоплазматичній мембрані клітин Сертолі та ендотелію гемокапілярів 5,3±0,42 балів і нижче діагностують імунний компонент, що потребує додаткової корекції імунних та секреторних порушень сперматогенезу, хворі же на секреторну неплідність, при значенні імуногістохімічного коефіцієнта в цитоплазматичній мембрані клітин Сертолі 0,8±0,6 бали і нижче, мають несприятливий прогноз щодо відновлення сперматогенезу. 1 UA 102955 C2 5 10 15 20 25 Запропонований спосіб виконують наступним чином: для гістологічного дослідження біоптати тканини яєчка фіксують в рідині Буена і заливають в парафін, з парафінових блоків виготовляють зрізи завтовшки 5 мкм, які фарбують гематоксилін-еозином; імуногістохімічний аналіз здійснюють з використанням стандартного авідин-біотинового (ABC) методу, при цьому біоптати фіксують у 12 % забуференому формаліні, заливають в парафін і виготовляють зрізи, які після депарафінізації в ксилолі і дегідратації в батареї спиртів, для блокади активності ендогенної пероксидази, вміщують на 5 хвилин у 0,3 % розчин перекису водню, розведеному на фосфатному буфері (рН 7,4). Після промивання дистильованою водою зрізи інкубують у мікрохвильовій печі при температурі 98° С в 0,1 М цитратному буфері (рН 6,0) протягом 30 хв і негайно охолоджують. Далі зрізи преінкубують протягом 15 хв. у 1 % розчині конячого сироваткового альбуміну, розведеного на фосфатному буфері, інкубують з первинними антитілами Claudin 11 в розведенні 1:50 протягом 18 годин при температурі 4° С Далі зразки інкубують із вторинними кролячими поліклональними антитілами у вологій камері 30 хвилин при кімнатній температурі. Після чого зрізи інкубують в авідин-біотиновому комплексі (ABC) 30 хвилин при кімнатній температурі, який готують за 30 хвилин до використання. Кожний етап закінчують триразовим промиванням по 5 хв у фосфатному буфері. Після проявлення 1-2 хв у 0,05 % розчині діамінбензидину зрізи дофарбовують гематоксиліном та заключають в канадський бальзам. Як позитивний контроль використовують зрізи тканин із відомим заздалегідь високим вмістом протеїну Claudinll, як негативний - служать зрізи без обробки первинними антитілами. В кожному випадку для імуногістохімії аналізують 12-16 зрізів. Імуногістохімічну реакцію оцінюють за розповсюдженістю та інтенсивністю забарвлення і визначають імуногістохімічним коефіцієнтом, який вираховують за напівкількісним методом в балах, представленими в таблиці 1. Загальний результат імуногістохімічної реакції визначають за показниками імуногістохімічного коефіцієнта від 0 до 9 балів, який одержують перемножуванням оцінок розповсюдженості та інтенсивності забарвлення. Проводять статистичний аналіз отриманих результатів. Таблиця 1 Показники імуногістохімічної реакції в балах Показники Розповсюдженість Інтенсивність 30 35 40 45 50 Бали 0 Відсутність забарвлення Відсутність забарвлення 1 2 Забарвлено клітин 10 %