Спосіб прогнозування результатів лікування чоловічої неплідності

Реферат: Спосіб прогнозування результатів чоловічої неплідності шляхом визначення фрагментації ДНК. Непошкоджений та непрепарований свіжий - не більше 1 год. 30 хв. від моменту забору зразок еякуляту розчиняють у фосфатному буфері до концентрації сперматозоїдів 5-10 млн/мл, після чого 25 мкл клітинної суспензії наносять на предметне скельце, оброблене агарозним мікрогелем при температурі 22 °C. Далі занурюють скельця з препаратом у кислотний розчин розчин соляної кислоти з концентрацією в діапазоні від 0,1 N до 0,3 N для денатурації ДНК сперматозоїдів. Після легуючим розчином - суміш розчинів хлориду натрію в концентрації у діапазоні між 2 М і 3 М, дитіотреїтолу в концентрації між 0,01 М і 0,8 М, 2-аміно-2(гідроксиметил)-1,3-пропандіол у концентрації від 0,01 М до 0,4 М та ТритонаХ-100 в концентрації від 0,5 до 1,5 %, доводячи рН до значень 7-7,5, при цьому видаляють більшість нуклеопротеїнів і, за відсутності масивного пошкодження ДНК, утворюють ядра з великими ореолами від петель ДНК. Оцінку результату тесту здійснюють за допомогою флюорисцентної мікроскопії, підраховуючи мінімум 200 сперматозоїдів із кожного зразка та розраховуючи відсоток форм із фрагментацією ДНК, якщо менше 30 % клітин мають фрагментовану ДНК, це є позитивним прогностичним чинником для настання клінічної вагітності жінки. UA 80325 U (12) UA 80325 U UA 80325 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме, до урології, і може бути використана для прогнозування результатів лікування чоловічої неплідності. На Україні, за різними оцінками, з 15 мільйонів партнерських пар труднощі з тим, щоб завести дитину, мають від 1 до 3 мільйонів пар. За даними ВООЗ, на планеті від 60 до 80 млн. пар (кожна четверта-п'ята) страждають на безпліддя. Зменшення частоти бездітних шлюбів можна розглядати як один з резервів підвищення народжуваності. Найважливішим досягненням у лікуванні неплідності стало впровадження в клінічну практику методів допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ), зокрема екстра-корпорального запліднення (ЕКЗ) з використанням інтрацитоплазматичного введення сперматозоїда в яйцеклітину (ICSI). ДРТ дали можливість реалізувати функцію дітонародження при абсолютній трубній неплідності, гіпергонадотропній формі аменореї у жінок і при обтураційній і секреторній неплідності у чоловіків, а також при ідіопатичній неплідності та інших репродуктивних проблемах, що раніше вважалися безперспективними [Кулаков В.И., Корнеева И.Е. Диагностика и лечение женского бесплодия // Практическая гинекология. / Под ред. В.И. Кулакова и В.Н. Прилепской. - М.: МЕДпресс-информ, 2001. - C. 298-317]. Ефективність EKЗ/ICSI на сьогодні ще досить низька, а близько третини всіх вагітностей переривається на ранніх термінах. Існуючі критерії потенціалу фертильності чоловіка обмежуються параметрами спермограми, рекомендованими ВООЗ, використання яких не завжди є результативним для виявлення чоловічої неплідності, бо навіть за умови нормозооспермії, інших нормальних клініко-лабораторних показників і того, що партнерка чоловіка здорова, у пари можуть бути проблеми з тим, щоб завести дитину. В такому разі ставиться діагноз ідіопатичної неплідності, чим підтверджується проблема недостатності сучасного рівня діагностики та нерозуміння всієї суті даної патології. Відтворення диплоїдного набору хромосом (злиття материнського та батьківського гаплоїдних наборів генетичного матеріалу) - ключовий момент у зародженні нового людського організму. Отже, логічним буде висновок про те, що цілісність ДНК статевих клітин - основний показник можливості утворення та розвитку потомства. Особливо важливим цей висновок є в епоху ДРТ, коли функції переносу генетичного матеріалу, а саме, здатності сперматозоїдів до рухливості та потрапляння всередину яйцеклітини, вже можуть бути виконані штучно в умовах клінік репродуктивної медицини. Накопичилось досить багато експериментального матеріалу на користь того, що саме зрілі чоловічі статеві клітини тримають лідерство за частотою порушень генетичного матеріалу в порівнянні з іншими клітинами. Такі порушення можуть бути пов'язані з генними мутаціями, мікроделеціями хромосом, анеуплоїдією, епігенетичними порушеннями, порушенням компактизації хроматину і пошкодженням (фрагментацією) спермальної ДНК [Останин А.А., Айзикович Б.И., Айзикович И.В., Черных Е.Р. Прогностическая модель оценки эффективности лечения бесплодия с помощью ЭКО // Проблемы репродукции. - 2006. - № 4. - C. 63-69; Яманова М.В., Светлаков А.В., Салмина А.Б., Пожиленкова Е.А., Гончарова Л.Л. Микроокружение ооцитов при эндокринномбесплодии // Проблемы репродукции. - 2004. - № 4. C. 46-49]. Фрагментація ДНК характеризується одно- або дволанцюговими розривами подвійної спіралі ДНК; це явище широко розповсюджене серед чоловіків зі зниженим потенціалом фертильності. Фрагментація ДНК (ФД) відносно недавно відкрила причину чоловічої неплідності, що останнім часом досить інтенсивно досліджується. Логічними є припущення, що ФД сперматозоїдів негативно впливатиме на можливість запліднення та ембріональний розвиток з його початкових етапів [Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П., Пиняев В.И., Грищенко Н.Г. Использование фолликулярной жидкости человека на этапе культивирования гамет и эмбрионов // Проблемы репродукции.-1999. - №. - с. 34-37], а також, що в неплідних чоловіків процент ФД буде більшим, ніж у фертильних чоловіків [Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция клеток животных. - М.: ВИНИТИ, 1989. - 170 с]. Оскільки при ICSI можливе запліднення яйцеклітини дефектним батьківським генетичним матеріалом, вивчення даної проблеми стає дедалі актуальнішим в умовах ДРТ, що стрімко розвиваються. Серед сперматозоїдів фертильного чоловіка процент їх з ФД складає 12-14 % [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение прикладных программ STATISTICA. - M: МедиаСфера, 2002. - C. 312]. За іншими даними - може перевищувати 20 % [Репродуктивная эндокринология // Под ред. С.С.К. Йена, Р.Б. Джаффе. М.: Медицина, 1998]. Проте, якщо більше 30 % сперматозоїдів мають ФД, настання нормальної вагітності не можливе [Хонина Н.А., И.В. Айзикович, Е.Я. Шевела и др. Регуляторные факторы и цитокины в сыворотке и фолликулярной жидкости у женщин при контролируемой овариальной 1 UA 80325 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гиперстимуляции // Цитокины и воспаление.-2005. - № - C. 22-28]. За даними ж іншого автора індекс ФД 27 %, отриманий за допомогою SCSA-аналізу, - негативний прогностичний чинник для настання вагітності. Відомо спосіб для визначення фрагментації ДНК в сперматозоїдах тварин, який полягає в тому, що здійснюють обробку зразка, який містить сперматозоїди, денатуруючим ДНК розчинним. Для екстракції ядерних білків здійснюють обробку лізуючим розчином, вільним від детергентів, денатуруючих білки, в одну стадію. Після цього візуально визначають цілісність хроматину/ДНК сперматозоїдів шляхом фарбування на підставі вимірювання розміру гало сперматозоїдів [RU № 2373288 С2, C12Q1/68, 2009]. Цей спосіб призначено для спрощення і однозначного підвищення точності визначення цілісності хроматину/ДНК у сперматозоїдах тварин. Найближчим до корисної моделі, що заявляється, є спосіб діагностики чоловічої неплідності на основі поглибленого лабораторного дослідження, згідно з яким визначають ступінь компактизації хроматину сперматозоїдів і відносний вміст дефектних клітин в еякуляті, а також рівень інгібіну В у сироватці крові, потім обчислюють діагностичний індекс фрагментації ДНК, виходячи зі значення якого діагностують безпліддя у чоловіків або відсутність патології [RU № 2362167 С1, G01N33/52, 2009]. У зазначеному способі, як і у попередньому аналогу, немає прогнозування лікування чоловічої неплідності, не виконано досліджень щодо впливу фрагментації ДНК на результати лікування, зокрема за допомогою EKЗ/ICSI. Крім того, в способі необхідно діагностувати сироватку крові для визначення індексу фрагментації ДНК. В основу корисної моделі поставлена задача створити спосіб прогнозування лікування чоловічої неплідності, який би включав прогнозування потенціалу чоловічої фертильності, а отже і результату лікування неплідності, методами ДРТ, який би був досить чутливим і дозволив би суттєво зменшити матеріальні витрати шляхом підвищення ефективності і зменшення кількості циклів ЕКЗ. Поставлена задача вирішується тим, що в способі прогнозування лікування чоловічої неплідності шляхом визначення фрагментації ДНК, згідно з корисною моделлю, непошкоджений та непрепарований свіжий - не більше 1 год. 30 хв. від моменту забору зразок еякуляту розчиняють у фосфатному буфері до концентрації сперматозоїдів 5-10 млн/мл, після чого 25 мкл клітинної суспензії наносять на предметне скельце, оброблене агарозним мікрогелем при температурі 22 °C, далі виконують занурення скельця з препаратом у кислотний розчин розчин соляної кислоти з концентрацією в діапазоні від 0,1 N до 0,3 N для денатурації ДНК сперматозоїдів, після цього лігуючим розчином - суміш розчинів хлориду натрію в концентрації у діапазоні між 2 М і 3 М, дитіотреїтолу в концентрації між 0,01 М і 0,8 М, 2-аміно-2(гідроксиметил)-1,3-пропандіол у концентрації від 0,01 М до 0,4 М та ТритонаХ-100 в концентрації від 0,5 до 1,5 %, доводячи рН до значень 7-7,5, при цьому видаляється більшість нуклеопротеїнів і, за відсутності масивного пошкодження ДНК, утворюються ядра з великими ореолами від петель ДНК, оцінку результату тесту здійснюють за допомогою флюорисцентної мікроскопії, підраховуючи мінімум 200 сперматозоїдів із кожного зразка та розраховуючи відсоток форм із фрагментацією ДНК, якщо менше 30 % клітин мають фрагментовану ДНК, це є позитивним прогностичним чинником для настання клінічної вагітності жінки. При олігозооспермії перед розведенням зразок еякуляту центрифугують при 400 об. центрифуги протягом 15 хвилин. Спосіб, що заявляється, дозволяє більш адекватно прогнозувати форми чоловічого безпліддя, обумовлені порушеннями структурної організації генетичного матеріалу чоловічих статевих клітин, тим самим суттєво зменшує матеріальні витрати шляхом підвищення ефективності та зменшення кількості циклів ICSI. В способі оцінюється стан хроматину сперматозоїдів, виконані дослідження щодо впливу фрагментації ДНК на результати лікування, зокрема за допомогою EKЗ/ICSI. Корисна модель пояснюється графіком, на якому зображено дисперсію хроматину сперматозоїдів. На графіку схематично зображено вигляд сперматозоїдів після виконання тесту. Показано форми в порядку підвищення рівню фрагментованої ДНК (зліва - направо): без фрагментації ДНК (1, 2) та з фрагментацією ДНК (3-5). В правій частині графіка показано приклад сортування сперматозоїдів за показником фрагментації ДНК в зразку еякуляту. Спосіб здійснюється наступним чином. Непошкоджений та непрепарований свіжий (не більше 1 год. 30 хв. від моменту забору зразок еякуляту розчиняють у фосфатному буфері до концентрації сперматозоїдів 5-10 млн/мл (при олігозооспермії перед розведенням зразок еякуляту центрифугують при 400 об. 2 UA 80325 U 5 10 15 20 25 центрифуги протягом 15 хвилин), після чого 25 мкл клітинної суспензії наносять на предметне скельце, оброблене агарозним мікрогелем при температурі 22 °C, далі виконують занурення скельця з препаратом у кислотний розчин - розчин соляної кислоти з концентрацією в діапазоні від 0,1 N до 0,3 N для денатурації ДНК сперматозоїдів, після цього лігуючим розчином - суміш розчинів хлориду натрію в концентрації у діапазоні між 2 М і 3 М, дитіотреїтолу в концентрації між 0,01 М і 0,8 М, 2-аміно-2-(гідроксиметил)-1,3-пропандіол у концентрації від 0,01 М до 0,4 М та ТритонаХ-100 в концентрації від 0,5 до 1,5 %, доводячи рН до значень 7-7,5, при цьому видаляється більшість нуклеопротеїнів і, за відсутності масивного пошкодження ДНК, утворюються ядра з великими ореолами від петель ДНК. При ФД ореол дисперсії навколо ядра відсутній або мінімальний. Оцінку результату тесту здійснюють за допомогою флюорисцентної мікроскопії, підраховуючи мінімум 200 сперматозоїдів із кожного зразка та розраховуючи відсоток форм із фрагментацією ДНК. Суть корисної моделі пояснює креслення. Проведено аналіз 40 зразків сперми, що використана у процедурі ICSI. У 19 зразків еякуляту (або 47,5 %) ФД була менша за 30 %, а в 21 випадку (52,5 %) ФД перевищувала встановлену межу норми (30 %). Усього в результаті процедури ICSI спостерігалося 25 клінічно підтверджених випадків настання вагітності. З них близько 95 % (18 з 19) випадків при ФД < 30 %, та 33 % (7 з 21) при ФД ≥ 30 %. (р