Профілактична вакцина від туберкульозу

Реферат: Винахід належить до застосування імунотерапевтичного засобу, що містить фрагменти клітинної стінки комплексу Mycobacterium tuberculosis (MTB-C), для одержання лікарського засобу для профілактичного лікування туберкульозу, в якому вказаний засіб одержаний з використанням способу, що включає культивування вірулентного штаму МТВ-С протягом періоду, який дорівнює або більший ніж три тижні, з наступною гомогенізацію культури клітин в присутності неіонної поверхнево-активної речовини. UA 104126 C2 (12) UA 104126 C2 UA 104126 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки Даний винахід стосується застосування імунотерапевтичного засобу, основаного на фрагментах клітинної стінки вірулентного штаму комплексу Mycobacterium tuberculosis, для одержання лікарського засобу для профілактичного лікування туберкульозу. Попередній рівень техніки Туберкульоз являє собою хронічне інфекційне захворювання, що викликається бацилами комплексу Mycobacterium tuberculosis (МТВ-С), який в цей час включає види М. tuberculosis, Μ. bovis, Μ. microti і Μ. africanum. Відповідно до даних Всесвітньої організації охорони здоров'я у всьому світі кожний рік реєструється 8000000 нових випадків розвитку захворювання, і близько 3000000 людей вмирають. Передбачають, що у всьому світі інфіковано більше ніж 2000000000 людей, і що кожний рік з'являється близько 90-100 мільйонів нових хворих. Існуюча в цей час вакцина, яку використовують в профілактичному лікуванні туберкульозу, основана на бактеріях штаму, що називається БЦЖ (BCG) (Bacillus Calmette-Guerin), ослабленого варіанта М. bovis. У галузі техніки описані різні вакцини проти туберкульозу, основані на фрагментах клітинної стінки вірулентних або авірулентих штамів Mycobacterium. Також описано, що добавка, що використовується в композиції вакцини, істотно впливає на її ефективність. В Е. Ribi et al., Nature, 1963, 198, стр. 1214-1215, описані дослідження імунізації, що проводиться за допомогою композиції, що включає фрагменти клітинної стінки авірулентного штаму БЦЖ і мінеральне масло. Вказані фрагменти одержують гомогенізацією культури згаданого штаму в мінеральному маслі. Композиція є більш ефективною ніж звичайна вакцина (БЦЖ). Однак в тій же самій статті описано, що фрагменти клітинної стінки не викликають жодної імунологічний відповіді при їх одержанні гомогенізацією у воді і за відсутності мінерального масла. В D.P. Pal et al., Indian J. Med. Res. 1977, 65, стр. 340-345, описана вакцина, одержана з фрагментів клітинної стінки вірулентного штаму H37RV і мінерального масла. У такому випадку фрагменти клітинної стінки одержують за допомогою гомогенізації мертвих клітин у водній фазі і згодом до композиції додають мінеральне масло. Також описано, що фрагменти клітинної стінки, гомогенізовані у водній фазі, не є імуногенними, і, щоб вакцина була ефективною, необхідна присутність мінерального масла. В G.K. Khuller et al., Folia Microbiol., 1992, 37, стр. 407-412, описана захисна ефективність різних фракцій клітинної стінки авірулентного штаму H 37Rv M. tuberculosis, рецептованих з неповним ад'ювантом Фрейнда, який також включає мінеральне масло. В Е.М. Agger et al., Scand.J.Immunol., 2002, 56, стр. 443-447, описані вакцини, що включають фрагменти клітинної стінки вірулентного штаму H37Rv, які є ефективними, коли містять як ад'ювант катіонну поверхнево-активну речовину бромід диметилдіоктадециламонію. Також описано, що дослідження, які проводяться з гомогенізованими бактеріями М. tuberculosis, які не містили згаданого ад'юванту, не створювали стійкості проти туберкульозу в моделі на мишах. В І.М. Orme Vaccine, 2006, 24, стр. 2-19, яка є останньою оглядовою статтею про нові вакцини проти туберкульозу, описано, що звичайна вакцина БЦЖ є по суті неефективною в захисті дорослих людей від туберкульозу. У тій же статті вказано, що проаналізовані і чекають подальших розробок декілька кандидатів різних типів вакцин (субодиничні вакцини з білками, вакцини з ДНК, вакцини, комбіновані з вірусом, вакцини з рекомбінантними штамами). Отже, необхідно мати профілактичну вакцину для запобігання інфекціям, викликаним М. tuberculosis, яка більш ефективна, ніж існуючі в даний час вакцини на основі ослабленого штаму БЦЖ. Мета винаходу Метою даного винаходу є застосування імунотерапевтичного засобу, що включає фрагменти клітинної стінки вірулентного штаму МТВ-С, для одержання лікарського засобу для профілактичного лікування інфекцій, викликаних М. tuberculosis. Докладний опис винаходу У патентній заявці ES2231037-A1 описаний метод одержання імунотерапевтичного засобу, що включає фрагменти клітинної стінки вірулентного штаму комплексу Mycobacterium tuberculosis (МТВ-С). У ній також описані композиції, що містять його, і їх терапевтичне застосування для комбінованого лікування туберкульозу в поєднанні з іншими лікарськими засобами. Автори даного винаходу знайшли застосування вказаного імунотерапевтичного засобу для одержання лікарського засобу для профілактичного лікування туберкульозу. 1 UA 104126 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Отже, метою даного винаходу є застосування імунотерапевтичного засобу, який містить фрагменти клітинної стінки вірулентний штаму комплексу Mycobacterium tuberculosis (МТВ-С), для одержання лікарського засобу для профілактичного лікування туберкульозу, де вказаний засіб одержують методом, що включає наступні стадії: культивування вірулентного штаму МТВ-С протягом періоду, який дорівнює або більше ніж три тижні, і потім гомогенізування культури клітин в присутності неіонної поверхнево-активної речовини. Вірулентним штамом може бути будь-який вірулентний штам МТВ-С. Одним з штамів, найбільш використовуваним дослідниками в цій галузі, є H 37Rv, який, наприклад, може бути легко одержаний з Національної колекції типів культур (NCTC), Лондон, Великобританія (номер зберігання NC007416). Вірулентний штам може бути культивований шляхом інокуляції в культуральному середовищі, добре відомому фахівцеві в галузі техніки, наприклад, агар Middlebrook 7H10 або 7Н11, середовище Sauton або середовище Proskauer-Beck. Культивування вірулентного штаму проводили протягом періоду, який дорівнює або більше ніж три тижні, що переважно становить від 3 до 4 тижнів. Температуру культивування переважно підтримували між 34°С і 38°С. При завершенні культивування клітини виділяли з використанням методик, таких, як описані, наприклад, в патентній заявці ES2231037-A1. Гомогенізацію живих клітин проводили в присутності неіонної поверхнево-активної речовини переважно в забуференому середовищі при нейтральному рівні рН, наприклад при рН, що становить від 6 до 8, наприклад, представленому буфером PBS (фосфатний буферний розчин). Гомогенізацію можна провести за допомогою обробки ультразвуком або з використанням невеликих кульок приблизно 1 мм в діаметрі, наприклад, кульок діоксиду кремнію або цирконію/діоксиду кремнію, разом з механічним гомогенізатором. Механічним гомогенізатором, який може бути використаний, наприклад, є модель BioSpec BeadBeatero. Клітини МТВ-С руйнують за допомогою такого процесу гомогенізації і одержують дрібні уламки клітинної стінки. Тип неіонної поверхнево-активної речовини, що використовується в процесі гомогенізації, переважно вибирають з групи, що складається з етоксилатів алкілфенолу, етоксилатів складних ефірів сорбіту і їх сумішей. Більш переважно, неіонну поверхнево-активну речовину вибирають з групи, що складається з етоксилатів октилфенолу. Більш переважно, використовують етоксилати октилфенолу із вмістом етиленоксиду, що становить від 7 до 8 моль, такі поверхнево-активні речовини можуть бути виявлені на ринку під найменуванням Triton X-114®. Вміст неіонної поверхнево-активної речовини на стадії гомогенізації становить переважно між 1 і 10% по масі відносно загальної маси гомогенату, більш переважно, між 3% і 6 мас.%. Гомогенізовану масу, що містить фрагменти клітинної стінки, піддають звичайній обробці для відділення і видалення нефрагментованих клітин і розчинених компонентів. Наприклад, можуть бути використані центрифугування при різній швидкості і промивання буферним розчином, як описано в патентній заявці ES2231037-A1. Осад, що містить фрагменти клітинної стінки, одержують після проведення згаданого процесу очищення. Вказаний осад диспергують в буфері PBS і піддають звичайній обробці для забезпечення повної інактивації клітин МТВ-С, які можуть залишатися життєздатними після процесу фрагментації і очищення. Згаданою обробкою може бути хімічний процес, наприклад, обробка формальдегідом, або фізичний процес, наприклад, автоклавірування або обробка пастеризацією. Дисперсія фрагментів клітин в PBS буфері, одержана після інактиваційної обробки, для полегшення зберігання може бути ліофілізована. Для цього дисперсія може бути вміщена у флакони і ліофілізована при температурі між -15°С і -25°С і у вакуумі, що становить від 0,1 до 0,4 мбар. Флакони, одержані після процесу ліофілізації, містять імунотерапевтичний засіб, що включає фрагменти клітинної стінки МТВ-С, і їх звичайно зберігають при дуже низьких температурах, наприклад при -70°С. Як указано раніше, метою винаходу є застосування імунотерапевтичного засобу, що включає фрагменти клітинної стінки вірулентного штаму МТВ-С, для одержання лікарського засобу для профілактичного лікування туберкульозу, тобто для одержання профілактичної вакцини від туберкульозу. Лікарський засіб для профілактичного лікування туберкульозу включає імунотерапевтичний засіб, оснований на фрагментах клітинної стінки і, необов'язково, фармацевтично прийнятні 2 UA 104126 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розріджувачі, ад'юванти і/або допоміжні речовини. Лікарський засіб може бути в формі фосфатного буферного розчину, водного розчину, емульсії або в формі ліпосом. Лікарський засіб переважно знаходиться в формі ліпосом. Ліпосоми можуть бути одержані з використанням звичайних допоміжних ліпідів і методик, добре відомих фахівцеві в галузі техніки, таких як описані в патентній заявці ES2231037-А1. Ліпосоми звичайно включають фосфоліпіди з нейтральним і/або негативним сумарним зарядом і стерини. Використовуваними фосфоліпідами можуть бути, наприклад, фосфатіділхолін, фосфатіділсерин і фосфатіділінозитол. Основним компонентом ліпосом звичайно є фосфатіділхолін, який може бути синтезований або виділений з природних джерел. Часто використовуваним комерційним продуктом є соєвий лецитин, який являє собою комплексну суміш фосфоліпідів, що включає фосфатіділхолін. Стеринами, які використовують в одержанні ліпосом, можуть бути, серед інших, холестерин і солі жовчних кислот. Ліпосоми переважно одержують з використанням суміші соєвого лецитину і холату натрію. Ліпосоми можуть, необов'язково, містити добавки, поліпшуючі їх стабільність, наприклад, вітамін Е, який діє як ліпідний антиоксидант. Одержані ліпосоми звичайно мають розподіл за розміром, в якому 99,9% менше, ніж 1 мікрон. Ліпосоми можуть бути піддані ліофілізації для одержання таким чином імунотерапевтичного засобу в формі ліофілізованих ліпосом. Лікарський засіб може бути введений в формі разової дози або декількох доз, за допомогою повторення з певними часовими інтервалами. Переважно вводять дві дози, розділені періодом, що становить від 2 до 5 тижнів, переважно від 3 до 4 тижнів. Лікарський засіб може вводитися через слизові, наприклад, слизову очей, носа, порожнини рота, шлунка, кишечнику, піхви або сечового тракту, або парентерально, наприклад, підшкірно, внутрішньошкірно, внутрішньом'язово, внутрішньовенно або інтраперитонеально. Парентеральне введення є переважним. Відповідна доза залежить від декількох параметрів, включаючи серед них спосіб введення і пацієнта, одержуючого лікування, але переважно доза становить від 1 мкг до 1000 мкг, більш переважно від 25 до 700 і ще більш переважно від 50 мкг до 200 мкг. Лікарський засіб, що включає фрагменти клітинної стінки вірулентного штаму МТВ-С, може вводитися в комбінації з іншими профілактичними вакцинами від туберкульозу, такими як згадані в S.H.E. Kaufmann, Nature Rev. Immunol. 2006, 6, 699-704, як наприклад, вакцина БЦЖ, субодиничні вакцини або рекомбінантні вакцини БЦЖ. Комбінація вакцин може бути одночасною, або це може бути зроблено в два введення, розділених за часом. Період між вакцинаціями може бути тривалістю навіть декілька років. У випадку якщо вакцинації розділені у часі, переважно спочатку вводять профілактичну вакцину від туберкульозу, а потім вводять лікарський засіб, що включає фрагменти клітинної стінки вірулентного штаму МТВ-С, який діє як рестимулюючий (додатковий) засіб спочатку введеної вакцини. Несподівано було виявлено, що введення лікарського засобу, що включає імунотерапевтичний засіб на основі фрагментів клітинної стінки вірулентного штаму МТВ-С, здатне індукувати відповідь типу Th1 з виділенням інтерферону- проти антигенів, специфічних для М. tuberculosis. Вказані антигени включають Ag85B i Ag85A, які є частиною комплексу Ag85, що складається з сімейства низькомолекулярних білків, що відіграють вирішальну роль в біосинтезі клітинної стінки і продукованих в значних кількостях, коли культивування бактерій знаходиться в лог-фазі. Було виявлено, що звичайна вакцина БЦЖ не створює імунозахисної відповіді проти антигенів комплексу Ag85, що може являти собою більш низьку захисну здатність. Також було виявлено, що кількість живих бацил, присутніх в легенях мишей, вакцинованих вказаним імунотерапевтичним засобом і згодом інфікованих вірулентним штамом H 37Rv, була меншою, ніж кількість живих бацил, присутніх в контрольній групі мишей, і вказана кількість була порівнянною з такою для мишей, вакцинованих звичайною вакциною БЦЖ. Нижче показані приклади для забезпечення фахівця в галузі техніки докладним поясненням специфічних варіантів здійснення винаходу. Приклад 1. Ефективність імунотерапевтичного засобу як профілактична вакцина від інфекції, викликаної М. tuberculosis Імунотерапевтичний засіб, що використовується в цьому прикладі, одержували відповідно до методу, описаного в прикладі 2 патентної заявки ES2231037-A1. 3 UA 104126 C2 5 10 15 20 Ефективність імунотерапевтичного засобу, основаного на фрагментах клітинної стінки вірулентного штаму МТВ-С, досліджували у самок мишей типу C57BL/6 у віці від 6 до 8 тижнів і які не мають специфічних патогенів. Мишей ділили на три групи по 12 тварин в кожній і піддавали наступному протоколу вакцинації: 1) без вакцинації (контрольна група) 2) підшкірно вводили дві дози по 285 мкг імунотерапевтичного засобу, одержаного в прикладі 2 патентної заявки ES2231037-A1, на 3-й і 6-й тижні експерименту. 6 3) підшкірно вводили дозу 210 колонієутворюючих одиниць Датського штаму БЦЖ (Statens Serum Institute, Denmark) на 0-й тиждень експерименту.) Для інфікування використали вірулентний штам Mycobacterium tuberculosis (H37Rv Pasteur), який культивували в середовищі Proskauer-Beck до середньої лог-фази і зберігали в аліквотах по 1 мл при температурі -70°С до використання. Мишей інфікували вказаним вірулентний штамом за допомогою аерозолю на дев'ятому тижні експерименту шляхом поміщення їх в прилад для аерозольного інфікування Middlebrook, який забезпечував введення в легені мишей приблизно 10-50 живих бацил. Кількість живих бацил в легенях визначали через 3 тижні після аерозольного інфікування тварин (12-ий тиждень експерименту), інкубуючи серійне розведення гомогенату легенів в агарі Middlebrook 7H11 протягом 4 тижнів при 37°С. Легені гомогенізували в присутності 1 мл двічі дистильованої води. Результати таблиці 1 виражають логарифм колонієутворюючих одиниць (КУО) на мл, які виявляли в легенях. Таблиця 1 Група мишей Вакцина 1 Немає (контрольна група) 2 Інкапсульований в ліпосомах імунотерапевтичний засіб 3 БЦЖ 25 30 35 40 45 50 Log10KYO/мл 6,42±0,24 5,72±0,30 5,71±0,58 Відмінності між результатами групи мишей, які не були вакциновані, і результатами вакцинованих груп були статистично значущими. Виявлено, що в легенях групи мишей, вакцинованих інкапсульованим в ліпосоми імунотерапевтичним засобом, визначалася менша кількість живих бацил, ніж в легенях невакцинованих мишей, і по суті така ж кількість, як у мишей, вакцинованих звичайною вакциною БЦЖ. Отже, вакцинація імунотерапевтичним засобом, основаним на фрагментах клітинної стінки вірулентного штаму МТВ-С, дає захист проти інфекцій, викликаних М. tuberculosis. Приклад 2. Ефективність імунотерапевтичного засобу як генератора Th1 відповіді, специфічної проти інфекції, викликаної Μ. tuberculosis Імунотерапевтичний засіб, що використовується в даному прикладі, одержували відповідно до способу, описаного в прикладі 2 патентної заявки ES2231037-A1. Ефективність імунотерапевтичного засобу, основаного на фрагментах клітинної стінки вірулентного штаму МТВ-С, оцінювали в експерименті ex vivo у самок мишей C57BL/6 у віці від 6 до 8 тижнів і які не мають специфічних патогенів. Мишей ділили на групи по 4 тварини в кожній і піддавали наступній схемі вакцинації: 1) підшкірне введення фізіологічного розчину на 3-й і 6-й тижні експерименту (контрольна група); 2) підшкірне введення двох доз по 285 мкг імунотерапевтичного засобу, одержаного в прикладі 2 патентної заявки ES2231037-A1, на 3-й і 6-й тижні експерименту; 6 3) підшкірне введення дози 210 колонієутворюючих одиниць Датського штаму БЦЖ (Statens Serum Institute, Denmark) на 0-й тиждень експерименту і фізіологічного розчину на 3-й і 6-й тижні експерименту; 6 4) підшкірне введення 210 колонієутворюючих одиниць вірулентного штаму Mycobacterium tuberculosis (H37Rv Pasteur) на 3-й тиждень експерименту і фізіологічного розчину на 6-й тиждень експерименту. Мишей умертвляли на 7-й тиждень, і їх селезінки екстрагували і занурювали в пробірки, що містять 5 мл L-глютамін-RРМІ (Gibco). Пробірки зберігали на льоду до кінця експерименту. Селезінки механічно руйнували і суспензію фільтрували через нейлонове сито з діаметром 70 мкм. Потім їх центрифугували протягом 10 хвилин при 300g. Осади відновлювали 15 мл 4 UA 104126 C2 5 10 15 20 розчину, що складається з Tris і хлориду амонію в двічі дистильованій воді, для проведення лізису клітин. Після 8 хвилин їх промивали 20 мл L-глютамін-RРМІ і центрифугували протягом 10 хвилин при 300g. Одержані осади ресуспендували 5 мл L-глютамін-RРМІ і суспензію фільтрували через нейлонове сито з діаметром 70 мкм. Клітини рахували в камері Н'юбауера. 5 Клітини селезінок мишей сіяли на чашки в співвідношенні 110 клітина/комірка і культивували з 200 мкл повного культурального середовища (ССМ), що складається з Lглютамін-RРМІ, доповненого інактивованою фетальною сироваткою телят, пеніциліном, стрептоміцином, піруватом натрію і 2-меркаптоетанолом, або 200 мкл повного культурального середовища (ССМ), доповненого антигенами M. tuberculosis: 10 мкг/мл антигену PPD (Statens Serum Institut, Denmark) і 5 мкг/мл ESAT-6, Ag85A i Ag85B (Lionex Diagnostics and Therapeutics GmbH, Federal Republic of Germany).) Клітини інкубували при 37°С в атмосфері з 5% СО 2. Через 96 годин чашки центрифугували протягом 10 хвилин при 300g і з кожної з них збирали надосадову рідину. Надосадові рідини заморожували і після того, як їх залишали у вказаному стані протягом щонайменше 24 годин, аналізували вміст інтерферону-, застосовуючи методику подвійного сендвіча ELISA і з використанням моноклонального антитіла, специфічного до мишачого інтерферону- (Diaclone). У таблиці II показані середні концентрації інтерферону-, виражені як Log10 пг/мл, які були індуковані в кожній з груп мишей проти антигенів М. tuberculosis: Таблиця 2 Група 1 2 3 4 25 30 35 40 Вакцина Контроль Імунотерапевтичний засіб, інкапсульований в ліпосомах БЦЖ H37Rv Антигени Контроль PPD ESAT-6 Ag85B Ag85A 0 0 0 0 0 0 0 0 2,57 0 (1) 2,69 2,53 (1) (3) 2,01 0 0 0 (3) (2)(3) (3) (3) 3,06 2,86 2,76 2,50 (1) Статистично значущі відмінності між групою 2 і групою 3 (2) Статистично значущі відмінності між групою 2 і групою 4 (3) Статистично значущі відмінності між групою 3 і групою 4 Результати Таблиці II показують, що дві вакцинації, проведені імунотерапевтичним засобом на основі фрагментів клітинної стінки вірулентного штаму М. tuberculosis, інкапсульованим в ліпосомах, здатні індукувати продукцію інтерферону- проти М. tuberculosis. Це означає, що вони можуть індукувати захисну відповідь типу Th1. Зокрема, відповідь, індукована в групі мишей, вакцинованих імунотерапевтичним засобом, інкапсульованим в ліпосомах, проти антигенів PPD, Ag85B і Ag85A, не показує статистично значущих відмінностей при порівнянні з відповіддю в групі мишей, яким вводили вірулентний штам H37Rv M. tuberculosis. Вказана відповідь була кращою, ніж відповідь в групі мишей, вакцинованих штамом БЦЖ, який є звичайною вакциною, оскільки вона також індукує відповідь проти PPD і не проти Ag85B і Ag85A. Тільки група мишей, вакцинована вірулентним штамом, була здатна індукувати відповідь проти антигену ESAT-6. Отже, імунотерапевтичний засіб на основі фрагментів клітинної стінки вірулентного штаму М. Tuberculosis, здатний індукувати захисну відповідь типу Th1 проти антигенів, специфічних для М. tuberculosis, що є показником того, що він може бути ефективно використаний для профілактики інфекцій, викликаних Μ. tuberculosis. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 50 1. Застосування імунотерапевтичного засобу, що включає фрагменти клітинної стінки вірулентного штаму комплексу Mycobacterium tuberculosis (MTB-С), для одержання лікарського засобу для профілактичного лікування туберкульозу, де вказаний засіб одержують способом, який включає наступні стадії: культивування вірулентного штаму МТВ-С протягом періоду, який дорівнює або більший ніж три тижні, і потім 5 UA 104126 C2 5 10 15 20 25 30 гомогенізація культури клітин в присутності неіонної поверхнево-активної речовини. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що період культивування становить від 3 до 4 тижнів. 3. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що неіонну поверхнево-активну речовину вибирають з групи, яка складається з етоксилатів алкілфенолу, етоксилатів складних ефірів сорбіту і їх сумішей. 4. Застосування за п. 3, яке відрізняється тим, що неіонну поверхнево-активну речовину вибирають з групи етоксилатів октилфенолу. 5. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що неіонну поверхнево-активну речовину вибирають з етоксилатів октилфенолу із вмістом етиленоксиду, що становить від 7 до 8 моль. 6. Застосування за будь-яким з пп. 1-5, яке відрізняється тим, що гомогенізацію проводять в забуференому середовищі при нейтральному рівні рН. 7. Застосування за будь-яким з пп. 1-6, яке відрізняється тим, що спосіб додатково включає наступні стадії: відділення нефрагментованих клітин і розчинених компонентів за допомогою центрифугування, піддання фрагментів клітинної стінки хімічній або фізичній обробці для інактивації можливих клітин вірулентних штамів, які вони, ймовірно, містять, і сушіння одержаного імунотерапевтичного засобу за допомогою ліофілізації. 8. Застосування за будь-яким з пп. 1-7, яке відрізняється тим, що лікарський засіб знаходиться в формі ліпосом. 9. Застосування за будь-яким з пп. 1-8, яке відрізняється тим, що лікарський засіб вводять в формі разової дози або декількох доз. 10. Застосування за п. 9, яке відрізняється тим, що лікарський засіб вводять в двох дозах. 11. Застосування за п. 10, яке відрізняється тим, що дози вводять, розділені періодом, що становить від 2 до 5 тижнів. 12. Застосування за будь-яким з пп. 1-11, яке відрізняється тим, що лікарський засіб вводять в комбінації з іншими профілактичними вакцинами проти туберкульозу. 13. Застосування за п. 12, яке відрізняється тим, що вакцини комбінують в два введення, розділених у часі. 14. Застосування за п. 13, яке відрізняється тим, що спочатку вводять профілактичну вакцину від туберкульозу і потім вводять лікарський засіб, що містить фрагменти клітинної стінки вірулентного штаму МТВ-С. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6