Фармацевтична композиція для зниження рівня n-оксиду триметиламіну

Реферат: Застосуваання фармацевтичної композиції для профілактики або лікування ниркової недостатності шляхом зниження вмісту N-оксиду триметиламіну в людському організмі, що містить 3-(2,2,2-триметилгідразиній)пропіонат (мельдоній) як активний інгредієнт та фармацевтично прийнятний носій. UA 109944 U (12) UA 109944 U UA 109944 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме, застосування фармацевтичної композиції, яка містить мельдоній (дигідрат 3-(2,2,2-триметилгідразинію)пропіонату) або його фармацевтично прийнятні солі. Рівень техніки Однією з нерозв'язаних медичних проблем є лікування пацієнтів з нирковою недостатністю, зокрема, на термінальних стадіях хвороби, коли пацієнти потребують постійного гемодіалізу. Загальновідомо, що такі пацієнти часто страждають від серцево-судинних хвороб (CVD) додатково до основної хвороби. Відомо, що в організмі таких пацієнтів можливе накопичення N-оксиду триметиламіну (TMANO) (М.А. Bain, R. Faull, G. Fornasini, R.W. Milne, A.M. Evans. Accumulation of trimethylamine and trimethylamin-N-oxide in end-stage renal disease patients undergoing haemodialysis. Nephrol Dial Transplant (2006) 21: 1300-1304). Однак лише у 2011 p. було виявлено існування позитивної кореляції між рівнем у крові пацієнта N-оксиду триметиламіну з одночасним захворюванням на одну, дві або три CVD (Z. Wang, Ε. Klipfell, B.J. Bennet, R. Koeth, B.S. Levison, B. DuGar, A.E. Feldstein, E.A. Britt, Xiaoming Fu, Yoon-Mi Chung, Yuping Wu, P. Schauer, J.D. Smith, H. Alleayee, W.H. Wilson Tang, J.A. DiDonato, A.J. Lusis, S.L. Hazen. Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease. Nature, 412, 57-63, (2011)). Таким чином, проблемою фактично стало винайдення медикаменту, здатного знижувати рівень TMANO у крові людини, запобігаючого розвитку CDV, що прямо не стосується ліпідного обміну. Хоча відомо, що рівень TMANO у крові тварин може знижуватися через застосування широкого спектра антибіотиків, таке лікування не набуло широкого застосування для пацієнтів з хронічними CVD через проблему резистентності до антибіотиків та можливі негативні побічні ефекти, а також через те, що не було доведено, що цей підхід може знижувати рецидиви CDV (CM. O'Connor et al., Azithromycin for the secondary prevention of coronary heart disease events-the WIZARD study: a randomized controlled trial. J. Am. Med. Assoc, 290, 1459-1466 (2003); C.P. Cannon et al., Antibiotic treatment of Chlamydia pneumonia after acute coronary syndrome. N.Engl.J.Med. 352, 1646-1654 (2005); R. Andraws, J.S. Berger, D.L. Brown. Effects of antibiotic therapy on outcomes of patients with coronary artery disease: a meta-analysis of randomized controlled trials. J.Am.MedAssoc. 293, 2641-2647 (2005)). Альтернативний підхід включає застосування пробіотичних мікроорганізмів (F.P. Martin et al., Probiotic modulation symbiotic gut microbial-host metabolic interactions in humanized microbiome model. Моl Syst.Biol, 4, 157 (2008)), однак цей підхід досі не було клінічно затверджено, а це є дуже важливим, оскільки кишкова мікрофлора людини за своїм складом суттєво відрізняється від кишкової мікрофлори гризунів. Таким чином, до нинішнього часу немає відомостей про медикамент, здатний знижувати рівень N-оксиду триметиламіну в організмі людини, який може застосовуватись як профілактичний медикамент для підтримання здоров'я людей, які споживають їжу тваринного походження у великій кількості. Таким чином, фактична проблема є пов'язаною з визначенням фармацевтичної композиції, яка може забезпечувати суттєве й стійке зниження TMANO в організмі, таким чином, захищаючи від підвищеного ризику CVD, а також усуненням негативного впливу на здоров'я підвищеного рівня TMANO в результаті інших хвороб, наприклад, для пацієнтів з нирковою недостатністю. Авторами несподівано було виявлено, що серцево-судинний медикамент мельдоній, який вже є відомим як такий, що впливає на енергетичний обмін, може суттєво знижувати рівень Nоксиду триметиламіну в людському організмі завдяки тому, що вводиться у відносно низьких дозах. Мельдоній є серцево-судинним медикаментом, який широко застосовується у країнах колишнього СРСР, і механізм дії якого при лікуванні CVD ґрунтується на інгібуванні гамабутиробетаїн гідроксилази та пов'язаною з ним зміною рівня карнітину як у крові, так і у тканинах (Dambrova Μ., Liepinsh Ε., Kalvinsh I., Mildronate. Cardioprotective Action through CarnitineLowering Effect, Trends Cardiovasc. Med, 2002: 275-279). Зниження рівня карнітину пов'язане зі зниженням швидкості β-окиснення жирних кислот та економією кисню в ішемічних тканинах, що позитивно впливає на лікування пов'язаних з ішемією хвороб, таких, як серцева недостатність та стенокардія. Також відомо про дослідження, в яких описувався вплив мельдонію на метаболізм цукру (Liepinsh Ε, Vilskersts R, Zvejniece L, Svalbe B, Skapare E, Kuka J, Cirule H, Grinberga S, Kalvinsh I, Dambrova M. Protective effects of mildronate in an experimental model of type 2 diabetes in Goto-Kakizaki rats. Br. J. Pharmacol. 2009, 157(8), 1549-1556). Подібним чином є свідчення того, що мельдоній може впливати на синтез оксиду азоту в різних тканинах (Sjakste N, Gutcaits A, Kalvinsh I. Mildronate: an antiischemic drug for neurological indications. CNS Drug Rev. 2005; 11 (2): 151-68). З літератури є відомими дані стосовно того, що мельдоній знижує 1 UA 109944 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 утворення атеросклеротичних бляшок у проатеросклеротичних тварин, що є пов'язаним з впливом мельдонію на метаболізм жирних кислот (Vilskersts R, Liepinsh E, Mateuszuk L, Grinberga S, Kalvinsh I, Chlopicki, Dambrova M. Mildronate, a regulator of energy metabolism, reduces atherosclerosis in apoE/LDLR-/- mice. Pharmacology, 2009, 83(5), P. 287-293). Однак нічого не відомо про те, чи викликає застосування мельдонію такі зміни у рівні в людському організмі метаболітів, які не є пов'язаними з енергетичним обміном або регульованими NO процесами в людському організмі. Авторами несподівано було виявлено, що результатом перорального введення протягом 7 послідовних днів фармацевтичної композиції, яка містить мельдоній (двічі на день дозою 500 мг), людині, яка споживає багату на TMANO їжу (WJ. Dyer, Amines in Fish Muscle. VI. Trimethylamine Oxide Content of Fish and Marine Invertebrates, Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 1952, 8c(5): 314-324, 10.1139/f50-020), є статистично значуще зниження рівня TMANO на 47 % порівняно з рівнем TMANO до застосування мельдонію. Водночас авторами було виявлено статистично значуще й суттєве (близько 25 %) збільшення кількості екскретованого з сечею TMANO. Це означає, що мельдоній забезпечує збільшення екскреції TMANO або самовиведення цього несприятливого продукту обміну речовин, концентрація якого в організмі корелює з одночасним захворюванням на кілька CVD (Z. Wang, Ε. Klipfell, B.J. Bennet, R. Koeth, B.S. Levison, B. DuGar, A.E. Feldstein, E.A. Britt, Xiaoming Fu, Yoon-Mi Chung, Yuping Wu, P. Schauer, J.D. Smith, H. Alleayee, W.H. Wilson Tang, J.A. DiDonato, A.J. Lusis, S.L. Hazen. Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease. Nature, 472, 57-63, (2011)). Стосовно надзвичайно низької токсичності мельдонію та низького рівня негативних побічних ефектів у пацієнтів наше відкриття забезпечує спосіб застосування мельдонію для зниження рівня TMANO у здорових суб'єктів, а також у пацієнтів, механізм патогенезу хвороби, у яких може бути пов'язаний з підвищеним рівнем цього метаболіту в крові, таких як пацієнти з нирковою недостатністю або тих, хто піддавався гемодіалізу під час лікування від основної хвороби. Мельдоній може бути особливо корисним як профілактичний медикамент для пацієнтів з кількома CVD. Мельдоній може застосовуватись як засіб профілактики підвищення рівня TMANO для суб'єктів, які споживають багаті на фосфатидилхолін, бетаїн та триметиламін продукти, а також інші поживні речовини, метаболізм яких веде до утворення N-оксиду триметиламіну (В.А. Seibel, P.J. Walsh. Trimethylamine oxide accumulation in marine animals: relationship to acylglycerol storage. J Exp Biol. 205, 297-306, (2002)). Це особливо стосується категорій людей, які споживають велику кількість продуктів тваринного походження, наприклад, спортсменів. Корисна модель пояснюється на представлених нижче прикладах. До дослідження було залучено вісім здорових добровольців: 4 жінки та 4 чоловіки. Дослідження здійснювали згідно з Гельсінкською декларацією та біоетичними нормами, затвердженими Центральним комітетом з медичної етики. Усіма учасниками дослідження було підписано форми інформованої згоди. Критеріями виключення з дослідження були: застосування харчових добавок, куріння, вагітність та алкоголізм. На початку дослідження записували інформацію про вік учасника, вживання ним медикаментів, зріст та вагу. Перед дослідженням учасники не вживали риби та рибних продуктів протягом 7 днів. Потім у учасників дослідження брали зразки венозної крові та вечірні та ранкові зразки сечі. На першому етапі експерименту всі учасники на сніданок раз на день протягом 7 днів отримували 150 г риби, які служили джерелом підвищеного утворення TMANO в організмі (W.J. Dyer. Amines in Fish Muscle. VI. Trimethylamine Oxide Content of Fish and Marine Invertebrates, Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 8c(5): 314-324,10.1139/f50-020,1952). Протягом наступного етапу експерименту для визначення впливу мельдонію на концентрацію TMANO у плазмі крові та сечі, додатково до багатого на триметиламін джерела крові, фармацевтичну композицію, яка містила 500 мг мельдонію, вводили кожному учасникові дослідження протягом 7 днів двічі на день (вранці та ввечері). Зразки крові брали після 7 днів багатої на триметиламін дієти і після 7 днів багатої на триметиламін дієти, яка супроводжувалася введенням фармацевтичної композиції з вмістом мельдонію. Зразки сечі збирали щодня вранці та ввечері протягом усіх 14 днів дослідження. Зразки сечі та плазми зберігали при -20 °C до дослідження. Концентрацію TMANO у зразках плазми та сечі визначали з застосуванням способу ультрависокоефективної рідинної хроматографії тандемної мас-спектрометрії. Хроматографічне відокремлення зразків здійснювали з застосуванням хроматографічної системи Acquity (Waters) з колонкою Acquity HILIC ВЕН (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм) (Waters). Рідинна фаза: ацетонітрил - 10 мМ ацетату амонію (рН4) з лінійним градієнтом від 75 % до 55 % 2 UA 109944 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ацетонітрилу, швидкістю потоку 0,25 мл/хв, об'єм введення 5 мкл. Виявлення та визначення кількості TMANO здійснювали з застосуванням спектрометра Quattro Micro™ (Micromass) зі спостереженням іонної реакції (іонний перехід TMANO m/z 75,8 > m/z 58,3, іонний перехід IS m/z 175,4 > m/z 86,0) у режимі позитивного електророзпилення (напруга на конусі 26 В, енергія співударяння 14 еВ, газ для співударяння - аргон). Збирання та обробку даних здійснювали за допомогою програми MassLynx V4.1 (Waters). Зразки плазми крові учасників (25 мкл) додавали до 500 мкл внутрішнього стандарту (IS) розчину 3-(2,2-диметил-2-проп-1-іл-гідразиній)пропіонату (200 нг/мл) у суміші ацетонітрилу / метанолу (3:1) і після центрифугування зразка (10 хв, 13000 об/хв) супернатант відокремлювали від осаду і вводили у хроматографічну систему. Зразки сечі перед аналізом розводили деіонізованою водою у співвідношенні 1:50. Розведені зразки (100 мкл) додавали до 700 мкл внутрішнього стандарту (IS) розчину 3-(2,2диметил-2-проп-1-іл-гідразиній)пропіонату (200 нг/мл) у суміші ацетонітрилу / метанолу (3:1) і після центрифугування зразка (10 хв, 13000 об/хв) супернатант відокремлювали від осаду і вводили у хроматографічну систему. Концентрацію TMANO у зразку розраховували, використовуючи лінійне співвідношення площі під піком TMANO / площі під піком IS - концентрація TMANO з застосуванням програми обробки даних QuanLynx V4.1 (Waters). Виявлення креатиніну у зразках сечі Концентрацію креатиніну розраховували з застосуванням дещо модифікованого способу Яффе (Jaffe M. Ueber die Niederschlag, welchen Pikrinsaure in normalem Ham erzeugt und uber eine neue Reaction des Kreatinins. Ζ physiol Chem 1886; 10: 391-400). 135 мкл реакційної суміші, яка складалася з 1 частини 0,6 % водного розчину пікринової кислоти та 5 частин 1М NaOH (змішаних безпосередньо перед вимірюванням) додавали до 15 мкл розведених зразків сечі або стандартних розчинів креатиніну (0-0,2 мг/мл). Після 10 хв інкубації при кімнатній температурі вимірювали оптичну густину при 492 нм з застосуванням мікроскопаспектрофотометра з багатолунковим планшетом Quant™ (Biotek Instruments, США). Дані представлено як середній показник ± стандартна середня похибка (SEM). Для порівняння груп застосовували t-критерій Ст'юдента для випробування надійності результатів. Загальну кількість сечової екскреції TMANO протягом 7 днів виявляли, розраховуючи концентрацію TMANO в сечі за загальною площею під кривою. Результати вважають надійними, якщо значення ρ є меншим за 0,05. Збирання даних та статистичний аналіз здійснювали з застосуванням програм Microsoft Excel 2003, GraphPad Prism 3.0 (GraphPad Software Inc, США) та SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, США). Опис фігур Фіг. 1. Концентрація TMANO у плазмі крові здорових добровольців. Концентрацію TMANO вимірювали перед дослідженням, після багатої на джерело TMANO дієти (через 7 днів після початку дослідження) і після багатої на джерело TMANO дієти з одночасним введенням мельдонію (1 г/день) (через 14 днів після початку дослідження). Фіг. 2. Загальна кількість TMANO, який екскретується з сечею протягом 7 днів. Концентрацію TMANO у сечі вимірювали двічі на день перед дослідженням, після багатої на джерело TMANO дієти (через 7 днів після початку дослідження) і після багатої на джерело TMANO дієти з одночасним введенням мельдонію (1 г/день) (через 14 днів після початку дослідження). Виявлення концентрації TMANO За результатами аналізів було виявлено, що концентрація TMANO у плазмі крові учасників дослідження перед експериментом або у початковий момент становила 4,9±1,3 нмоль/мл. Після 7 днів багатої на джерела триметиламіну дієти концентрація TMANO зазнавала статистично значущого підвищення до 81,5±8,6 нмоль/мл. Нами було виявлено, що у разі споживання багатої на джерело TMANO їжі разом з введенням мельдонію показники концентрації TMANO у плазмі зазнавали статистично значущого зниження на 47 % до 43,0±3,8 нмоль/мл (Фіг. 1, Таблиця 1) 3 UA 109944 U Таблиця 1 Концентрація TMANO у плазмі крові учасника дослідження Перед дослідженням TMANO TMANO + мельдоній 5 10 TMANO, нмоль/мл 4,9±1,3 81,5±8,6* # 43,0±3,8* Застосовуючи вимірювання концентрації TMANO у сечі учасників дослідження, визначали загальну кількість екскретованого TMANO. Перед експериментом учасники дослідження екскретували у середньому 2,8±0,6 мкмоль TMANO на 1 мг креатиніну *7 д. Після багатої на джерело триметиламіну дієти середня кількість екскретованого за 7 днів TMANO мала вищу статистичну значущість (18,2±2,2 мкмоль на 1 мг креатиніну *7 д). Для порівняння: після багатої на джерело триметиламіну дієти та одночасного введення мельдонію середня кількість екскретованого за 7 днів TMANO мала ще вищу статистичну значущість (24,3±1,5 на 1 мг креатиніну *7 д.) (Фіг. 2, Таблиця 2). Таблиця 2 Загальна екскретована з сечею кількість TMANO протягом 7 днів Перед дослідженням TMANO TMANO + мельдоній 15 20 25 30 35 40 TMANO, мкмоль/мг креатинін *7 д. 2,8±0,6 18,2±2,2* # 24,3±1,5* Таким чином, авторами несподівано було виявлено, що фармацевтична композиція, яка містить мельдоній, знижує рівень TMANO у крові і може застосовуватися для профілактики та лікування хвороб, патогенез яких є пов'язаним з підвищеним рівнем TMANO. До таких хвороб обов'язково належать атеросклероз, зокрема, форми артеріосклерозу, які не супроводжуються значними змінами рівня холестерину. Також відомо, що для пацієнтів на термінальній стадії ниркової недостатності, які отримують лікування з застосуванням гемодіалізу, фармацевтичні композиції, що містять мельдоній, можуть застосовуватися для зниження рівня TMANO та пов'язаного з ним ризику захворювання на одну або кілька серцево-судинних хвороб. Крім того, фармацевтичні композиції, що містять мельдоній, також можуть застосовуватися у профілактиці для зниження ризику розвитку однієї або кількох CVD у людей, які споживають їжу тваринного походження, багату на бетаїн, триметиламін або інші компоненти, що підвищують рівень TMANO. Композиції, що містять мельдоній, також можуть вводитися людям, які споживають інші сполуки, що підвищують рівень TMANO, або мають зміни обміну речовин, які призводять до підвищення рівня TMANO, також для забезпечення підвищеної екскреції TMANO. Таким чином, фармацевтична композиція згідно з цією корисною моделлю дозволяє забезпечувати значне й стійке зниження концентрації TMANO в організмі, таким чином, запобігаючи ризикові розвитку CVD, а також запобігаючи негативному впливові на здоров'я людини високого рівня TMANO, який є результатом інших хвороб, наприклад, у пацієнтів з нирковою недостатністю. Оскільки мельдоній легко розчиняється у воді, для зниження рівня TMANO можуть застосовуватися легкі у приготуванні ін'єкційні форми мельдонію, у воді або у фізіологічних розчинах NaCl, глюкозі або буферних розчинах. Завдяки своїй структурі бетаїнового типу, мельдоній також відносно легко поглинається крізьшкірно. Таким чином, також можуть готуватися фармацевтичні композиції згідно з корисною моделлю для крізьшкірного або місцевого застосування у формі пластирів, мазей, кремів, гелів, желе, емульсій, розчинів або інших прийнятних фармацевтичних форм. Згідно корисної моделі, до прийнятних фармацевтичних композицій мельдонію для перорального або сублінгвального введення, крім інших, можуть належати вкриті або невкриті 4 UA 109944 U 5 10 15 20 25 капсули, каплети, таблетки, гранули, пігулки або розчин, сироп або інші дозовані форми для перорального введення, які зазвичай застосовують у даній галузі. Ці дозовані форми можуть виготовлятися з застосуванням відомих спеціалістам у даній галузі традиційних способів виготовлення фармацевтичних композицій. Корисна модель також розкриває фармацевтичні композиції, які містять як активний агент принаймні одну з негігроскопічних солей мельдонію та фармацевтично прийнятний твердий та/або рідкий формоутворювач, який зазвичай застосовують для виготовлення дозованих форм. Згідно з корисною моделлю перевагу віддають композиціям для виготовлення пероральних дозованих форм, а також сиропам та розчинам, які містять сполуки згідно з корисною моделлю та/або їх фармацевтично прийнятні солі та похідні та фармацевтично прийнятні носії. Наприклад, одна з типових фармацевтичних композицій згідно з корисною моделлю , яку застосовують для виготовлення таблеток, включає: мельдоній 500 мг крохмаль 40 мг тальк 20 мг стеарат кальцію 2 мг Разом 562 мг Одна з типових фармацевтичних композицій згідно з корисною моделлю, яку застосовують для виготовлення капсул, містить: мельдоній 500 мг лактозу 122 мг крохмаль 52 мг тальк 14 мг стеарат кальцію 6 мг Разом 694 мг У разі, якщо мельдоній або його фармацевтично прийнятну сіль вводять у формі композиції для ін'єкцій або краплі, сироп або напій для перорального введення, фармацевтична композиція може містити дигідрат мельдонію або його фармацевтично прийнятну сіль згідно з корисною моделлю загальною кількістю від 0,5 % до 60 % за масою та фармацевтично прийнятний розчинник, яким, наприклад, може бути, крім інших, дистильована вода, ізотонічний, глюкозний або буферний розчин. У разі, якщо композицію, яка містить активну речовину згідно з корисною моделлю, вводять у формі таблеток, каплет, пігулок, гранул, порошків або капсул, вони можуть містити мельдоній або його фармацевтично прийнятну сіль або похідну загальною кількістю від 0,5 до 5 г на таблетку, каплету, драже, капсулу або одну дозу порошку або гранул. Якщо активну речовину вводять крізьшкірно, вона може міститись у мазі або пластирі кількістю від 0,5 до 40 % за масою. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 40 45 1. Застосування фармацевтичної композиції для профілактики або лікування ниркової недостатності шляхом зниження вмісту N-оксиду триметиламіну в людському організмі, що містить 3-(2,2,2-триметилгідразиній)пропіонат (мельдоній) як активний інгредієнт та фармацевтично прийнятний носій. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція містить мельдоній у формі дигідрату 3-(2,2,2-триметилгідразиній)пропіонату. 3. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція містить мельдоній у формі фармацевтично прийнятної солі. 4. Застосування за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція призначається для перорального або сублінгвального введення і виготовляється у формі вкритих або невкритих таблеток, капсул, каплет, драже, пігулок, гранул, порошку, розчину або сиропу, які містять активний інгредієнт кількістю від 0,1 до 5,0 г на одну дозу у разі твердої форми і кількістю 0,5-40 % за масою у разі рідкої форми. 5. Застосування за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція призначається для парентерального введення і виготовляється у формі стерильного розчину, який містить активний інгредієнт кількістю від 0,1 до 5,0 г на одну дозу разом з фармацевтично прийнятним розчинником, вибраним з групи, до якої належать фізіологічний розчин NaCl, розчин глюкози та буферний розчин фармацевтично прийнятної концентрації. 6. Застосування за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція призначається для черезшкірного введення і виготовляється у формі пластиру, мазі, крему, 5 UA 109944 U 5 гелю, емульсії або розчину, що містить активний інгредієнт кількістю від 0,1 до 1,0 г на одну дозу. 7. Застосування за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція містить від 100 до 2500 мг мельдонію. 8. Застосування за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція призначається для парентерального введення і виготовляється у формі ін'єкційного розчину, який містить мельдоній кількістю від 50 до 400 мг/мл. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6