Кондуктометричний біосенсор на основі гексокінази для визначення концентрації аденозин-5′-трифосфату у водних розчинах

Реферат: Пропонований винахід належить до галузі біотехнології та молекулярної біології і може бути використаний, зокрема, для визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату (АТФ) в біотехнологічних зразках та наукових препаратах, а більш конкретно до кондуктометричних UA 112141 C2 (12) UA 112141 C2 біосенсорів (КБ). КБ складається з двох пар кондуктометричних електродів, на одну з яких нанесена одноферментна мембрана на основі гексокінази, чутлива до аденозин-5`трифосфату, на другу нанесена референтна мембрана на основі сироваткового альбуміну бика. Робочі області біосенсора знаходяться у робочій комірці для досліджуваного розчину. Виходи електродів під'єднані до кондуктометричної установки, яка в свою чергу під'єднана до персонального комп'ютера. Використання даного винаходу дозволить більш селективно та більш точно визначати АТФ у розчинах. UA 112141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Пропонований винахід належить до галузі біотехнології та молекулярної біології і може бути використаний, зокрема, для визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату в біотехнологічних зразках та наукових препаратах, а більш конкретно до кондуктометричного біосенсора на основі гексокінази для визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату у водних розчинах. Аденозин-5'-трифосфат (АТФ) є нуклеозидтрифосфатом, що складається з аденіну, рибози та трьох залишків фосфорної кислоти. АТФ слугує тимчасовим переносником енергії в усіх живих клітинах, тому він є поширеною речовиною в будь-якому організмі. В клітинах відбувається одночасне утворення нових молекул АТФ (під час розпаду органічних речовин) та використання АТФ (розщеплення до АДФ та фосфатної групи) під час біосинтетичних процесів. Також АТФ є одним з джерел енергії для функціонування насосів у клітинній мембрані, попередником важливого вторинного посередника - циклічного аденозинмонофосфату, алостеричним регулятором низки білків тощо [1,2]. Визначення концентрації АТФ дозволяє оцінити енергетичний стан клітин та тканин. Перспективним є використання АТФ для діагностики хвороб серцевого м'язу. Також, визначення АТФ може бути корисним в медицині для вивчення біохімічних процесів, в яких він бере участь, а саме: регулювання скорочення м'язів і агрегація тромбоцитів, підтримка судинного тонусу, нейротрансмісія та регуляція діяльності нервової системи. Зміна концентрації АТФ може впливати на вивільнення трансміттерів, синаптичну пластичність, взаємодію нейроглії, цикли сну і неспання, респіраторні та локомоторні ритми; викликати тривогу, депресію та агресію [3, 4]. Крім того, визначення концентрації АТФ може бути ефективно використане при розробці ліків, зокрема таких, що базуються на інгібіторах кіназ. Найдавнішим методом визначення концентрації АТФ є люциферазний метод, який полягає у вимірюванні світла, яке випромінюється ферментом люциферазою при розщепленні АТФ [5]. Цей метод є селективним та відносно чутливим, але його недоліком є обмежені можливості щодо вимірювань в режимі реального часу та in vivo. Сучасні стандартні методи високоточного визначення АТФ, такі як спектрофотометрія та рідинна хроматографія, потребують наявності кваліфікованого персоналу та складного і дорогого обладнання. Ще одним недоліком наведених вище методів є необхідність в досить складній попередній підготовці проб для аналізу [6, 7]. Флуоресцентні, біо- та хемілюмінесцентні методи позбавлені частини наведених недоліків, проте також часто не відповідають потребам моніторингу АТФ [8]. Тому сьогодні дуже актуальним є питання створення більш зручного, точного, швидкого, селективного та дешевого методу визначення вмісту АТФ в біотехнологічних та дослідницьких зразках. На сьогодні існує ряд лабораторних біосенсорів для визначення АТФ. В їх основі лежать рНчутливі польові транзистори [9], амперометричні скловуглецеві електроди [10], амперометричні платинові мікроелектроди [11]. Відомі біосенсори на основі фотодетекції зв'язування АТФ з різними рецепторними молекулами [12, 13, 14]. Недоліками ряду створених біосенсорів є складна будова електрода [9, 10], що обумовлює високу собівартість виготовлення таких біосенсорів. Методика вимірювання концентрації АТФ афінними біосенсорами не дозволяє проводити вимірювання концентрації АТФ у реальному часі [10, 12, 14]. Суттєвим недоліком відомих біосенсорів є вплив інтерферентів на вимірювання, оскільки одночасно відбувається отримання сигналів, що викликаються АТФ та інтерферентами. Крім того, для деяких біосенсорів селективність та вплив інтерферуючих речовин були недостатньо досліджені [12, 13, 14]. Відомий амперометричний біосенсор для визначення концентрації АТФ у водних розчинах, який має один амперометричний електрод, на який нанесена робоча мембрана на основі глюкозооксидази-гексокінази, а сам біосенсор призначений для підключення до амперметричної установки [15]. Однак, описаний пристрій є складний за будовою та через чутливість до глюкози менш селективним. В основу запропонованого винаходу поставлено задачу створення такого кондуктометричного біосенсора на основі гексокінази для визначення концентрації аденозин-5'трифосфату у водних розчинах, який би базувався на простих за структурою кондуктометричних перетворювачах і дозволив би більш селективно та більш точно визначати АТФ у розчинах. Поставлена задача вирішується запропонованим кондуктометричним біосенсором на основі гексокінази для визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату у водних розчинах, що складається з двох пар кондуктометричних електродів, на одну з яких нанесена одноферментна мембрана на основі гексокінази чутлива до аденозин-5'-трифосфату, на другу нанесена референтна мембрана на основі сироваткового альбуміну бика, робочі області біосенсора 1 UA 112141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 знаходяться у робочій комірці для досліджуваного розчину, виходи електродів під'єднані до кондуктометричної установки, яка в свою чергу під'єднана до персонального комп'ютера. В основі роботи кондуктометричного біосенсора на основі гексокінази для визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату у водних розчинах лежить ферментативна реакція фосфорилювання глюкози, що протікає в ферментативній мембрані, яка реєструється кондуктометричним перетворювачем: ГЕК D-глюкоза + АТФ  D-глюкозо-б-фосфат + АДФ (1), де ГЕК - гексокіназа. Після додавання до робочої комірки досліджуваного зразка, в робочому буфері опиняється АТФ і інтерферуючі речовини. За відсутності в розчині глюкози, відгук біосенсора пропорційний концентрації інтерферуючих речовин. Після додавання до робочого розчину глюкози, в мембрані біосенсора починається реакція (1) і, як наслідок, генерується відгук біосенсора, який пропорційний концентрації АТФ. Суть пропонованого винаходу пояснюється кресленнями, де на фіг. 1 схематично показано кондуктометричний біосенсор на основі гексокінази для визначення концентрації аденозин-5'трифосфату у водних розчинах; на фіг. 2 показана блок-схема кондуктометричної установки; на фіг. 3 продемонстровано принцип роботи кондуктометричного біосенсора на основі гексокінази для визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату у водних розчинах на реальному прикладі проведення експерименту; а на фіг. 4 наведено калібрувальний графік залежності відгуку біосенсора від концентрації аденозин-5'-трифосфату. Кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату у водних розчинах складається з двох пар електродів 1 та 2 (фіг. 1). На одну пару електродів 1 нанесена робоча одноферментна мембрана 3. На другу пару електродів 2 нанесена референтна мембрана 4. Згаданий біосенсор підключений до кондуктометричної установки (фіг. 2). Робоча мембрана 3 містить у собі фермент гексокіназу. Кондуктометрична установка містить блок для реєстрації сигналів біосенсора 5 /РБ/, низькочастотний генератор сигналів 6 /ГС/ (типу ГЗ-118 /Україна/), входи якого підключені до відповідних електродів кондуктометричного біосенсора. Виходи генератора сигналів 6 /ГС/ підключені до входу фазочутливого нановольтметра 7 /НВ/. Виходи нановольтметра 7 /НВ/ підключені до реєстраційного блока 5 /РБ/, призначеного для реєстрації сигналів з біосенсора. Окрім того, установка забезпечена опорами навантаження 8 /ОН/, призначеними для зняття сигналів з відповідних пар електродів. При цьому входи нановольтметра 7 /НВ/ через диференційний підсилювач 9 /ДП/ підключені до відповідних пар електродів біосенсора, які розташовані у вимірювальній комірці 10 /ВК/. Пропонований кондуктометричний біосенсор на основі гексокінази для визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату (АТФ) у водних розчинах працює так. На робочу поверхню однієї пари електродів 1 кондуктометричного біосенсора наносили вихідну суміш для створення робочої мембрани 3 (об'єм 100 нл), після чого електроди залишали на повітрі за кімнатної температури для проведення іммобілізації на 20-30 хвилин. Цю робочу мембрану готували із 20 мМ фосфатного буфера, рН 6,5, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): 10 гексокінази (ГЕК) 5 сироватковий альбумін бика (БСА) 10 гліцерин 0,4 глутарового альдегіду. На другу пару електродів 2 наносили вихідну суміш для створення референтної мембрани 4 (100 нл), яку залишали на повітрі за кімнатної температури на 20-30 хвилин, цю мембрану формували з 20 мМ фосфатного буфера, рН 6,5, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): 15 БСА, 10 гліцерин, 0,4 глутарового альдегіду З генератора 6 на електроди біосенсора 1 та 2, що утворюють диференційну пару і знаходяться в комірці 10 з розчином, що досліджується, подавали змінну напругу з частотою 100 кГц та амплітудою 10 мВ. При цьому із згаданих електродів 1 та 2 отримували сигнали, які знімалися з опорів навантаження 9 (Rн=1 кОм) та надходили через диференційний підсилювач / типу Unipan-233-6 (Польща)/8 до селективного нановольтметра / типу Unipan-233 (Польща)/7. Після нановольтметра 7 сигнал подається до реєстраційного блока 5 для реєстрації сигналу біосенсора кондуктометричної вимірювальної установки, в якій відбувалося перерахування 2 UA 112141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 даних та отримання сигналу, який відповідає концентрації поверхнево активних речовин у досліджуваному водному розчині. Пропоновану систему використовували наступним чином. Попередньо виготовляли біоселективні мембрани. Створення ферментного біосенсора: виготовляли робочу мембрану 3. Для цього готували розчин з вмістом 10 % ГЕК, 5 % БСА та 10 % гліцерину у 20 мМ фосфатному буфері, рН 6,5. Референтну мембрану 4 виготовляли таким же чином, але замість наважки фермента брали лише 15 % БСА. Гліцерин у складі мембран 3, 4 використовувався для стабілізації ферменту при іммобілізації та запобігання передчасному підсиханню розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. В свою чергу, БСА в складі робочої мембрани 3 відігравав роль стабілізуючого агента для ферменту. Для створення мембран біосенсора, відповідно, 3 та 4, краплю суміші ГЕК-БСА (100 нл) наносили на одну частину чутливої поверхні перетворювача 1, а на іншу 2 - розчин БСА без ферменту (це був датчик порівняння). Для іммобілізації мембран датчики розміщували на повітрі за кімнатної температури на 20-30 хв. і потім відмивали від незв'язаних компонентів мембрани у буферному розчині протягом 10-15 хв. Приклад аналізу вмісту АТФ в розчині. Спочатку отримували залежність відгуків біосенсора від різних концентрацій АТФ (при сталій концентрації глюкози) - одержували калібрувальний графік (фіг. 4). Для перевірки роботи пропонованого кондуктометричного біосенсора з реальними зразками, готували розчин з умовно невідомою концентрацією АТФ. Потім до вимірювальної комірки додавали аліквоту даного розчину. Оскільки АТФ є зарядженою речовиною, то спостерігається неселективний відгук біосенсора. Після стабілізації сигналу, до робочої комірки додавали аліквоту модельного розчину АТФ і визначали величину відгуку біосенсора. В залежності від цієї величини, по калібрувальному графіку отримували концентрацію АТФ, яка співпадала з умовно невідомою концентрацією АТФ у розчині. З прикладу видно, що пропонований кондуктометричний біосенсор на основі гексокінази для визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату у водних розчинах є простішим та дешевшим за будовою (ціна запропонованого біосенсора зменшилася в 10 разів порівняно з відомим) і дозволив із меншим впливом глюкози та інших сторонніх речовин проводити аналіз концентрації АТФ в розчинах (похибка вимірювання при роботі із запропонованим біосенсором може зменшитись на 100 %, порівняно з роботою відомого прототипу). Джерела інформації: 1. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия Человека: В 2-х томах. T. 1. Пер. с англ.: - М.:Мир, 1993. 2. Страйер Л. Биохимия: В 3-х т. Т. 2. Пер. с англ. - М.:Мир, 1985. 3. G. Burnstock. Historical review: ATP as a neurotransmitter // Trends in Pharmacological Sciences, V. 27, 2006, P. 166-176. 4. B. G Frenguelli, G. Wigmore, E. Llaudet, N. Dale. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus // Journal of Neurochemistry, V. 101, 2007, P.1400-1413. 5. McElroy, W.D. The Energy Source for Bioluminescence in an Isolated System // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, V. 33, 1947, P. 342-345. 6. H.U. Bergmeyer. Methods of Enzymatic Analysis (3rd ed.) // Deerfield Beach, VCH Publishers, 1984, 340 pp. 7. Υ. Kawamoto, Κ. Shinozuka, M. Kunitomo, J. Haginaka. Determination of ATP and Its Metabolites Released from Rat Caudal Artery by Isocratic Ion-Pair Reversed-Phase HighPerformance Liquid Chromatography // Analytical Biochemistry, V. 262, 1998, P. 33-38. 8. S. V. Khlyntseva, Ya. R. Bazel', A. B. Vishnikin, V. Andruch. Methods for the Determination of Adenosine Triphosphate and Other Adenine Nucleotides // Journal of Analytical Chemistry, V. 64, 2009, P. 657-673. 9. M. Gotoh, E. Tamiya, I. Karube, Y. Kagawa. A microsensor for adenosine-5'-triphosphate pHsensitive field effect transistors // Analytica Chimica Acta, V. I87, 1986, P. 287-291. 10. W. Wen, T. Bao, J. Yang, M.-Z. Zhang, W. Chen, H.-Y. Xiong, X.-H. Zhang, Y.-D. Zhao, S.-F. Wang. A novel amperometric adenosine triphosphate biosensor by immobilizing graphene/duallabeled aptamers complex onto poly(o-phenylenediamine) modified electrode // Sensors and Actuators B: Chemical, V. 191, 2014, P. 695-702. 11. B. A. Patel, M. Rogers, T. Wieder, D. O'Hare, M.G. Boutelle. ATP microelectrode biosensor for stable long-term in vitro monitoring from gastrointestinal tissue // Biosensors and Bioelectronics, V. 26, 2011, P. 2890-2896. 3 UA 112141 C2 5 10 12. Y. He, J. Tian, K. Hu, J. Zhang, S. Chen, Y. Jiang, Y. Zhao, S. Zhao. An ultrasensitive quantum dots fluorescent polarization immunoassay based on the antibody modified Au nanoparticles amplifying for the detection of adenosine triphosphate // Analytica Chimica Acta, V. 802, 2013, P. 6773. 13. A.-M.Alam, M. Kamruzzaman, S. H. Lee, Y. H. Kim, H. J. Jo, S. H. Kim, S.-R. Park. Sensitive determination of adenosine disodium triphosphate in soil, milk, and pharmaceutical formulation by enoxacin-europium (III) fluorescence complex in solution // Journal of Luminescence, V. 132, 2012, P. 789-794. 14. Y. Miao, J. Liu, F. Hou, C. Jiang. Determination of adenosine disodium triphosphate (ATP) 3+ using norfloxacin-Tb as a fluorescence probe by spectrofiuorimetry // Journal of Luminescence, V. 116, 2006, P. 67-72. 15.О.О. Soldatkin, O.M. Schuvailo, S. Marinesco, R. Cespuglio, A.P. Soldatkin. Microbiosensor based on glucose oxidase and hexokinase co-immobilised on platinum microelectrode for selective ATP detection // Talanta, V.78, 2009, P.1023-1028. 15 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 Кондуктометричний біосенсор на основі гексокінази для визначення концентрації аденозин-5'трифосфату у водних розчинах, що складається з двох пар кондуктометричних електродів, на одну з яких нанесена одноферментна мембрана на основі гексокінази, чутлива до аденозин-5'трифосфату, на другу нанесена референтна мембрана на основі сироваткового альбуміну бика, робочі області біосенсора знаходяться у робочій комірці для досліджуваного розчину, виходи електродів під'єднані до кондуктометричної установки, яка в свою чергу під'єднана до персонального комп'ютера. 4 UA 112141 C2 5 UA 112141 C2 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6