Кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації сечовини у водних розчинах

Реферат: Кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації сечовини у водних розчинах, складається з двох пар золотих гребінчастих електродів, на першу пару з яких нанесена робоча мембрана на основі рекомбінантної уреази, селективної до сечовини, на другу пару електродів нанесена референтна мембрана. UA 107618 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пропонований винахід належить до галузі медицини та охорони здоров'я і може бути використаний з метою перевірки функціональності нирок, печінки, а саме для визначення концентрації сечовини під час процедури гемодіалізу та в сироватці крові хворих на ниркову недостатність, а більш конкретно до кондуктометричного біосенсора для визначення концентрації сечовини у водних розчинах. Сечовина це головний і кінцевий продукт обміну білків, синтез якої відбувається в печінці з діоксиду вуглецю та амонію в результаті дезамінування амінокислот. З печінки сечовина потрапляє в кров, а далі в нирки, де і відбувається її фільтрація та виведення з сечею [1]. Фізіологічний рівень сечовини знаходиться в межах 2,5-7,5 мМ залежно від харчування [2]. Дуже високий рівень сечовини в сироватці крові пов'язаний з тяжкою нирковою дисфункцією і називається синдромом уремії. В такому випадку необхідно проводити гемодіаліз чи трансплантацію нирки. Значне підвищення концентрації сечовини спостерігається під час хронічної та гострої форм ниркової недостатності (50-70 та 120-150 мМ відповідно). Такий патологічний рівень сечовини можна понизити до 10 мМ за рахунок гемодіалізу чи перитоніального діалізу. Рівень сечовини у діалізаті може варіювати від 3 до 16 мМ [3]. Гемодіаліз це виведення продуктів розпаду з організму пацієнта, що забезпечує підтримку життя хворим на ниркову недостатність. Існує жорстка кореляція між смертністю та виживаністю пацієнтів в залежності від адекватності процедури гемодіалізу, тому даний процес повинен жорстко контролюватись [4, 5]. Для моніторингу сечовини найчастіше використовують колориметричні методи аналізу. Для сечовини колориметричними реагентами є діацетилмонооксим, фталальдегід, нафтилетилендіамін, хромотропова кислота [6]. Всі ці методи складні у використанні: необхідний контроль температури, рН, що значно сповільнює аналіз. Окрім, колориметричного визначення сечовини існує друга група методів більш специфічних, які ґрунтуються на ферментативних реакціях з колориметричною детекцією. Всі сучасні ферментативні методи ґрунтуються на використанні ферменту уреази. Метод складається з двох етапів. На першому при гідролізі сечовини утворюється іон амонію, концентрацію якого (другий етап) визначають з використанням послідовних ферментативних реакцій, потенціометричних методів чи технології "сухої хімії" [7]. Не зважаючи на те, що ферментативні оптичні методи є специфічними і чутливими, їх застосування для визначення сечовини обмежене нестійкістю ферментів при зберіганні та експлуатації, складністю методики аналізу, а також високою вартістю обладнання та затратних матеріалів, крім того, необхідна наявність висококваліфікованого персоналу. На сьогоднішній день створено цілу низку уреазних біосенсорів, де як чутливий елемент виступає фермент уреаза: амперометричних [8], потенціометричних [9], кондуктометричних [10] та оптичних [11]. Але, не зважаючи, на бурхливий розвиток біосенорів для моніторингу сечовини, автори дуже рідко підкреслюють недоліки пов'язані з їх практичним застосуванням. Головним недоліком таких біосенсорів є вузький лінійний діапазон визначення, тому перед вимірюванням необхідно значно розводити біозразки. В роботі [12] описано потенціометричний біосенсор на основі рН-чутливих польових транзисторів та рекомбінантної уреази для визначення сечовини, що складається з потенціометричного перетворювача на основі іон-селективних польових транзисторів. Відповідно, його подальше масове виробництво буде більш дорогим порівняно з біосенсорами на основі дешевих кондуктометричних перетворювачів. Крім того, даний потенціометричний біосенсор характеризуються повільними відгуками на субстрат порівняно з кондуктометричними біосенсорами, що витікає у більші затрати часу на проведення всього аналізу. В роботі [10] описано кондуктометричний біосенсор на основі звичайної уреази для визначення сечовини, що складається з двох електродів на основі вольфраму, покритих полімерною плівкою, на один з яких наносилась ферментна мембрана на основі звичайної уреази селективної до сечовини. Він характеризується лінійним діапазоном роботи, зміщеним до низьких концентрацій, порівняно з біосенсорами на основі рекомбінантної уреази. Відповідно, при роботі з таким біосенсором необхідно сильно розводити пробу, що призводить до великої похибки вимірювання. В основу запропонованого винаходу поставлено задачу створення такого кондуктометричного біосенсору для визначення концентрації сечовини у водних розчинах, який би дозволив більш швидко та більш точно визначати концентрацію сечовину та був би більш перспективним і дешевим для подальшого масового виробництва. Поставлена задача вирішується запропонованим кондуктометричним біосенсором для визначення концентрацій сечовини у водних розчинах, який відповідно до пропозиції, складається з двох пар золотих гребінчастих електродів, на першу пару з яких нанесена робоча 1 UA 107618 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мембрана на основі рекомбінантної уреази, селективна до сечовини, на другу пару електродів нанесена референтна мембрана, а вказаний біосенсор призначений для підключення до експериментальної установки для кондуктометричних вимірювань. Використання в роботі запропонованого біосенсора на основі кондуктометричного перетворювача, дозволило проводити більш швидкий аналіз біозразків, а сам біосенсор став більш перспективним та більш дешевим для подальшого виробництва. В іншу чергу застосування в складі біоселективного елемента біосенсора рекомбінантної уреази підвищило точність аналізу. В основі роботи кондуктометричного біосенсора для визначення концентрацій сечовини у водних розчинах лежить наступна ферментативна реакція: Рекомбінантна уреаза + Сечовина + 2Н2О  2NH4 +НСО3 В процесі проходження ферментативної реакції рекомбінантна уреаза розщеплює сечовину, при цьому змінюється концентрація заряджених іонів в робочій мембрані, яку і можна реєструвати за допомогою кондуктометричного перетворювача [13]. Суть пропонованого винаходу пояснюється графічними матеріалами, де: на фіг. 1 показано схематичний та реальний зовнішній вигляд кондуктометричного біосенсора для визначення концентрації сечовини у водних розчинах; на фіг. 2 показана блок-схема експериментальної установки для кондуктометричних вимірювань; на фіг. 3 наведено калібрувальні графіки залежності величини відгуків біосенсорів на основі звичайної та рекомбінантної уреази від концентрації сечовини; на фіг. 4 продемонстровано принцип роботи кондуктометричного біосенсора для визначення сечовини на реальному прикладі проведення експерименту. Кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації сечовини у водних розчинах складається з двох золотих гребінчастих пар електродів 1 та 2 /ГЕ/ (фіг. 1). На одну пару електродів 1 /ГЕ/ нанесена робоча мембрана 3 /РМ/. На другу пару електродів 2 /ГЕ/ нанесена референтна мембрана 4 /РфМ/. Згаданий біосенсор підключений до експериментальної установки для кондуктометричних вимірювань [13]. Робоча мембрана 3 /РМ/ містить у собі фермент рекомбінантну уреазу, селективну до впливу сечовини. Експериментальна установка для кондуктометричних вимірювань (фіг. 2) містить блок для реєстрації сигналів біосенсора 5 /РБ/, низькочастотний генератор сигналів 6 /ГС/ (типу Г3-118 /Україна/), входи якого підключені до відповідних електродів кондуктометричного біосенсора. Виходи генератора сигналів 6 /ГС/ підключені до входу фазочутливого нановольтметра 7 /НВ/. Виходи нановольтметра 7 /НВ/ підключені до реєстраційного блоку 5 /РБ/, призначеного для реєстрації сигналів з біосенсора. Окрім того, установка забезпечена опорами навантаження 9 /ОН/, призначеними для відображення сигналів з відповідних пар електродів. При цьому входи нановольтметра 7 /НB/, через диференційний підсилювач 8 /ДП/, підключені до відповідних пар електродів біосенсору, які розташовані у вимірювальній комірці 10 /К/. Пропонований кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації сечовини у водних розчинах працює наступним чином. На робочу поверхню однієї пари електродів 1 /ГЕ/ кондуктометричного біосенсора наносили вихідну суміш для створення робочої мембрани 3 /РМ/ (об'єм 30 нл), яку вносили в пари глутарового альдегіду (ГА) на 10-40 хвилин. Цю робочу мембрану готували із 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): 3-5 Рекомбінантна уреаза, 3-6 сироватковий альбумін бика (БСА), 8-18 гліцерин. На другу пару електродів 2 /ГК/ наносили вихідну суміш для створення референтної мембрани 4 /РфМ/ (30 нл), яку вносили в ГА на 10-40 хвилин, цю мембрану формували з 20 мМ фосфатного буфера. рН 7,4, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): 6-12 БСА, 8-18 гліцерин. З генератора 6 /ГС/ на диференційні пари електродів 1 та 2 /ГЕ/ біосенсора, що знаходяться в комірці 10 /К/ з розчином, що досліджується, подавали змінну напругу з частотою 100 кГц та амплітудою 10 мВ. При цьому із згаданих електродів 1 та 2 /ГЕ/ отримували сигнали, які знімалися з опорів навантаження 9 /ОН/ (Rн = 1 кОм) та надходили через диференційний підсилювач /типу Unipan-233-6 (Польша)/ 8 /ДП/ до селективного нановольтметра /типу Unipan233 (Польша)/ 7 /НВ/. Після нановольтметра 7 /НВ/ сигнал подавали до реєстраційного блока 5 /РБ/ для реєстрації сигналу біосенсора, в якому відбувалося перерахування даних та отримання сигналу, який відповідає концентрації сечовини у досліджуваному розчині. Пропоновану систему використовували наступним чином. 2 UA 107618 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Попередньо виготовляли біоселективні мембрани. Створення біосенсора: виготовляли робочу мембрану 3 /РМ/. Для цього готували розчин з вмістом 5 % рекомбінантної уреази, 5 % БСА та 10% гліцерину у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,4. Референтну мембрану 4 /РфМ/ виготовляли таким же чином, але замість наважки ферменту брали лише 10 % БСА. Гліцерин у складі мембран 3, 4 використовувався для стабілізації ферменту при іммобілізації та запобігання передчасному підсиханню розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. В свою чергу, БСА в складі робочої мембрани 3 /РМ/ відігравав роль стабілізуючого агенту для ферменту. Для створення мембран біосенсора, відповідно, 3 та 4, краплю ферментної суміші (30 нл) наносили на одну частину чутливої поверхні перетворювача 1, а на іншу 2 - референтний розчин на основі лише БСА без ферменту. Для іммобілізації мембран датчики розміщували в атмосфері насичених парів глутарового альдегіду (ГА) на 10-40 хв. і потім підсушували на повітрі й відмивали від надлишку ГА у буферному розчині протягом 10-15 хв. Протокол біосенсорного аналізу сечовини в модельних розчинах. Перед початком роботи датчики з іммобілізованими мембранами деякий час (приблизно 10-15 хв.) відмивали від надлишків незв'язаного ГА до стабілізації базової лінії. Концентрацію субстрату змінювали, додаючи певні аліквоти вихідних концентрованих розчинів сечовини. Після отримання кожного відгуку біосенсор відмивали від продукту, змінюючи робочий буфер мінімум 3 рази кожні 2 хв. Шляхом додавання різної кількості модельних розчинів сечовини було побудовано калібрувальну криву для визначення концентрації сечовини (Фіг.3). Для порівняння па Фіг.3, також, зображена калібрувальна крива біосенсора на основі звичайної уреази, яка характеризувалась іншим лінійним діапазоном визначення. Час, за який було отримано один біосенсорний відгук складав 70-90 секунд (Фіг.4). що в 5 разів швидше, ніж у відомому потенціометричному біосенсорі - 210 секунд [12]. Визначення концентрації сечовини в аналізованих зразках діалізату та крові здійснювали за калібрувальною кривою. Додавали аліквоту проби до вимірювальної комірки та отримували відгуки. Далі за калібрувальними кривими вираховували концентрацію сечовини в невідомій пробі. За умов подальшої стандартизації запропонованого кондуктометричного біосенсора для визначення концентрації сечовини у водних розчинах ціна аналізу однієї проби діалізату або крові буде щонайменше, у 4 рази дешевше, ніж у відомих біосенсорів. З прикладу роботи біосенсора для визначення концентрації сечовини у водних розчинах та за допомогою калібрувальної кривої (Фіг.3) і типових сигналів біосенсора (Фіг.4) видно, що пропонований кондуктометричний біосенсор є функціонально придатним і дозволяє набагато швидше та дешевше отримувати результати аналізу сечовини в реальних розчинах порівняно з відомими біосенсорами. Список літератури: 1. Березов Т.Т., Коровин Б.Φ., Биологическая химия. - Μ.: Медицина, 1998. - С. 448-451. 2. Dhawan G., Sumana G., Malhotra B.D., Recent development in urea biosensors // Biochemical Engineering Journal. - 2009. - Vol. 44. P. 42-52. 3. Koncki R.. Recent development in potentiometric biosensors for biomedical analysis // Analytica Chimica Acta. - 2007. - Vol. 599. - P. 7-15. 4. Bhusana Premanode, Chris Toumazou, A novel, low power biosensor for real time monitoring of creatinine and urea in peritoneal dialysis // Sensor and Actuators B. - 2007. - Vol. 120. - P. 732-735. 5. Anna Radomska, Robert Koncki, Krystyna pyrzynska, Stanislaw Glab, Bionanalytical system for control of hemodialysis treatment based on potentiometric biosensor for urea and creatinine // Analytica Chimica Acta. - 2004. - Vol. 523. P. 193-200. 6. Jurkiewicz M., Alegret S., Almirall J., Garcia M., Fabregas E., Development of a biparametric bioanalyser for creatinine and urea. Validation of the determination of biochemical parameters associated with hemodialysis// Analyst. 1998. Vol. 123. P. 1321-1327. 7. http://www.terramedica.spb.ru/1d4_2007/slepushiva.htm 8. Stred'ansky M., Pizzariello Α., Stred'anska S., Miertus S., Amperometric pH-sensing biosensor for urea, penicillin, and oxalacetate // Analytica Chimica Acta. - 2000. - Vol. 415. - P. 151-157. 9. Rajesh V. Bisht, Takashima W., Kaneto K., Development of a potentiometric urea biosensorbased on copolymer poly(N-3-aminopropyl pyrrole-co-pyrrole) film // React. Funct. Polym. 2005. - Vol. 62. - P. 51-59. 10. Castillo-Ortega M.M., Rodriguez D.E., Encinas J.C., Plascencia M., Mendez-Velarde F.A., Olayo R., Conductometric uric acid and urea biosensor prepared from electroconductive polyanilinepoly(n-butyl methacrylate) composites // Sens. Actuators B. - 2005. - Vol. 85. - P. 19-25. 11. Koncki R., Lenarczuk Т., Radomska Α., Glab S., Optical biosensor based on Prussian Blue films// Analyst. - 2001. - Vol. 126. - P. 1080-1085 3 UA 107618 C2 5 12. A.P. Soldatkin, J. Montoriol, W. Sant, С. Martelet, N. Jaffrezic-Renault, A novel urea sensitive biosensor with extended dynamic range based on recombinant urease and ISFETs // Biosensor and Bioelectronics. - 2003. - Vol. 19. - P. 131-135. 13. Дзядевич С.В. Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування.// Біополімери і клітина 2005. - 21, - с. 91-106. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 Кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації сечовини у водних розчинах, який відрізняється тим, що складається з двох пар золотих гребінчастих електродів, на першу пару з яких нанесена робоча мембрана на основі рекомбінантної уреази, селективної до сечовини, на другу пару електродів нанесена референтна мембрана. 4 UA 107618 C2 5 UA 107618 C2 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6