Координаційна сполука кобальту біс(цитрато)станату з протигрипозною дією

Реферат: Винахід належить до області медицини, а саме фармакології, і стосується кобальту біс(цитрато)станату, який має протигрипозну активність і може застосовуватися для лікування грипу. В основу винаходу поставлена задача створення нової низькотоксичної різнометальної сполуки кобальту біс(цитрато)станату, який має протигрипозну активність і усуває недоліки існуючих засобів для тієї ж мети. Поставлена задача вирішується тим, що згідно з винаходом, розроблена нова протигрипозна речовини, а саме кобальт біс(цитрато)станат формули [Co(H 2O)6][Sn(HCitr)2]•4H2O, Μ=735,7: O C O C [Co(H2O)6] O H2C H2C O C C O O Sn HO C O CH2 C O O O 4H2O OH CH2 O . C C O , який має протигрипозну активність. Таким чином, у порівнянні з прототипом, заявлене технічне рішення - новий вітчизняний засіб кобальту біс(цитрато)станат виявляє виразну противірусну активність відносно вірусу грипу людини штамів А/Гонконг/1/68 (Η3Ν2) та A/PR/8/34 (H1N1), а також вірусу грипу птахів Η5Ν3 на обох застосованих моделях. Крім того він виявляє значно меншу токсичність, що дає перспективу для подальшого дослідження та впровадження в медичну практику. O C C [Co(H2O6] ) O H2C O H2C C O C O O Sn H O C O O C O O CH2 C O O CH2 C O H . 4H2O UA 113069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Винахід належить до області медицини, а саме фармакології, і стосується кобальту біс(цитрато)станату, який має протигрипозну активність і може застосовуватися для лікування грипу. Грип - гостра антропонозна вірусна інфекція дихальних шляхів, яка реєструється у всіх регіонах планети й проявляється у вигляді сезонних спалахів та епідемій [1]. Щорічні епідемії грипу та післягрипозні ускладнення призводять до загибелі значно більшої кількості людей, ніж від усіх відомих інфекційних захворювань, а також призводять до загострення хронічних захворювань [3]. Протягом 10-15 останніх років віруси грипу птахів в результаті мутацій змінили свої біологічні властивості та набули можливості безпосередньо інфікувати людей і викликати дуже тяжкі клінічні форми захворювання, значний відсоток яких закінчується летально [4]. Нові штами вірусів грипу птахів H5N1, H7N9 та свиней H1N1, які з'явились в людській популяції, є небезпечними патогенами для людини. Існує великий ризик виникнення пандемічного штаму вірусу грипу внаслідок реасортації циркулюючих штамів. Переважна більшість людських ізолятів вірусів грипу швидко набувають стійкості до дії найбільш розповсюджених протигрипозних препаратів - ремантадину, озельтамівіру [5]. З метою запобігання формування резистентності слід не тільки поширювати арсенал протигрипозних засобів, але й застосовувати препарати з різним механізмом противірусної дії. Тому пошук і розробка противірусних засобів серед сполук з різними складом і структурними характеристиками є вкрай важливим завданням. В даний час досить інтенсивно вивчаються властивості металокомплексів з метою виявлення їх біологічних властивостей для створення нових лікарських засобів. Більшість координаційних сполук з іонами металів проявляє фармакологічну активність щодо бактерій. Пошук металокомплексів, які будуть проявляти противірусну активність, є актуальним, оскільки існує перспектива їх використання у медицині [6]. Є всі підстави вважати, що біологічна активність металокомплексів щодо вірусів реалізується завдяки особливостям складу, структури їх молекул, просторового розташування в них функціональних груп та іншим характеристикам. Металокомплекси можуть діяти на вірус різними шляхами: інактивувати вірус, зайнявши на його поверхні активні центри; проникати через клітинну мембрану; перешкоджати розмноженню вірусу в клітині; руйнувати вірус поза клітиною. Найбільш близьким до заявленого технічного рішення є референс-препарат таміфлю (озельтамівір), який відноситься до інгібіторів вірусного ферменту нейрамінідази та володіє протигрипозною дією [5]. Однак він є токсичним, викликає головні болі, безсоння, запаморочення, діарею, порушення функції нирок та психічні розлади. Крім того, є свідчення того, що прийом таміфлю в деяких випадках знижує здатність до вироблення власних антитіл до вірусу грипу. В основу винаходу поставлена задача створення нової низькотоксичної різнометальної сполуки кобальту біс(цитрато)станату, який має протигрипозну активність і усуває недоліки існуючих засобів для тієї ж мети. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з винаходом, розроблена нова протигрипозна речовина, а саме кобальту біс(цитрато)станат формули [Co(H2O)6][Sn(HCitr)2]•4H2O, Μ=735,7: O C C [Co(H2O)6] O H2C O H2 C O Sn HO C O O O C CH2 O O CH2 C . 4H2O OH C O 45 C O O C , який має протигрипозну активність. Як вихідні речовини в роботі використовували: тетрахлорид стануму SnCl4 "ч", ацетат кобальту(П) Со(СН3СОО)2•4Н2О "ч.д.а." та лимонну кислоту (H4Citr) "ч.": 1 UA 113069 C2 OH O O C CH2 C CH2 HO OH C HO 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 C O . Синтез гетерометалічного кобальту біс(цитрато)станату: у 60 мл гарячої води розчиняли 0,03 моль (6,3 г) лимонної кислоти (вихідна концентрація ліганду повинна бути не менше 0,5 М), додавали 0,015 моль (1,73 мл) тетрахлориду стануму і доводили рН розчином аміаку до 1. Отриманий розчин гріли протягом 10 хвилин при температурі 60-70 °C, охолоджували до кімнатної температури і додавали водний розчин Со(СН3СОО)2•4Н2О в мольному співвідношенні Sn:Co=1:2. Через 2 доби випадав осад комплексу [Co(H 2O)6][Sn(HCitr)2]•4H2O рожевого кольору. Вихід продукту 65 %. Нова сполука (порівняння з аналогами) більш активна та менш токсична, токсичність кобальту біс(цитрато)станату складає LD50=1836,76 мг/кг при пероральному прийомі. Згідно з класифікацією і загальними вимогами безпеки, сполука належить до малотоксичних (IV клас) [7]. Елементний аналіз сполуки виконаний на напівавтоматичному C,N,H-аналізаторі. Вміст стануму та кобальту визначали методом атомно-емісійної спектроскопії з індуктивно зв'язаною плазмою на приладі "Optima 2000DV" фірми "Perkin Elmer". 14 спектри поглинання -1 (400-4000 см ) ліганду і комплексу записували на спектрофотометрі "Frontier" фірми "Perkin Elmer". Peнтгеноструктурний аналіз (РСА) проводили на автоматичному дифрактометрі Bruker SMART APEX II. За даними елементного аналізу (обчислено/знайдено %: Sn-16.13/16.08, Со-8.00/7.98, С19.56/19.52, Н-4.07/4.12), встановлено брутто-формулу сполуки C12H30O24SnCo, в якій реалізується мольне співвідношення Sn:цитрат:Co=1:2:1. При терморозкладі комплексу спочатку в інтервалі температур 70-230 °C відбувається дегідратація, після 260 °C - декарбоксилування, окисна деструкція сполуки і утворення кінцевого продукту - суміші СоО і SnO2 (1000 °C). Результати ІЧ-спектроскопії коригують з даними термогравіметрії. В них присутні смуги, що відповідають коливанням карбонілу і карбоксилатних іонів, характерних для нерівноцінних -1 -1 карбоксильних груп: вакантної ν(C=O)~1722 см і зв'язаних νas(COO )=1692, 1599 см , -1 -1 νs(COO )=1418, 1360 см . Зафіксовано також смуги коливань ν(Sn-O)=550 см , -1 -1 -1 ν(Co-O)=499 см , ν(C-O)=1078 см та δ(Η2Ο)=1639 см . За даними РСА, сполука побудована з центросиметричних октаедричних катіонів 2+ 2[Со(Н2О)6] , аніонів [Sn(HCitr)2] та кристалізаційних молекул води. У кристалах комплексні катіони і аніони об'єднані безпосередньо між собою і через кристалізаційні молекули води водневими зв'язками в тривимірний каркас [8]. Перед вивченням противірусної активності кобальту біс(цитрато)станату визначали ступінь токсичності сполуки на клітинних моделях, на яких у подальшому планувалось дослідження специфічної дії проти вірусів грипу людини та птахів. Для попередньої оцінки токсичності препарату використовували біотестування за допомогою інфузорій Colpoda steinii (виробник ООО "Відродження М", м. Одеса), оскільки у цьому випадку визначається можливий рівень токсичності водночас як на клітинному, так і на рівні цілого організму [9]. Вказаний спосіб був запатентований як корисна модель для визначення ступеня цитотоксичності біологічно активних препаратів і фармакологічних сполук. Критерієм визначення токсичності є час від початку дії досліджуваного зразку на культуру інфузорій Colpoda steinii до загибелі більшості (90 % і більше) інфузорій, яка констатується на підставі повного припинення руху інфузорій та наявності їх розпаду. В контрольній пробі всі інфузорії повинні залишатися рухливими. Було визначено й рівень токсичності кобальту біс(цитрато)станату на культурі тканини хоріон-алантоїсних оболонок (ХАО) 11-14-добових курячих ембріонів. Готували розведення препарату на глюкозо-желатиновому підтримуючому середовищі, вносили їх до лунок полістиролових панелей, де розміщували фрагменти хоріон-алантоїсних оболонок на шкаралупі, використовуючи по 4 лунки на одне розведення. Контролем були лунки, що містили фрагменти хоріон-алантоїсних оболонок на шкаралупі, а також глюкозо-желатинове підтримуюче середовище. Панелі розміщували в термостаті при 37 °C та перевіряли стан клітинного шару на протязі 48 годин, відмічаючи наявність чи відсутність дегенерації клітин ХАО 2 UA 113069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 візуально. Мінімальною токсичною дозою була найменша концентрація сполуки, що викликала загибель 50 та більше відсотків фрагментів ХАО. Також визначали максимально переносиму концентрацію (МПК) кобальту біс(цитрато)станату з використанням культури клітин MDCK. В дослідах застосовували не менш десяти рядів лунок у плашках з культурою клітин для кожного розведення препарату в поживному середовищі. Плашки з культурами клітин інкубували при 37 °C з подачею 5 % СО2 протягом 5 днів. Щодня проводили вивчення дослідних та контрольних культур з метою встановлення наявності або відсутності цитопатичної дії (ЦПД). За максимально переносиму концентрацію (МПК) сполуки приймали його найбільшу кількість, яка не викликала дегенерацію клітин. Протигрипозну активність кобальту біс(цитрато)станату досліджували відносно штамів вірусу грипу А/Гонконг/1/68 (H3N2) і A/PR/8/34 (H1N1), а також вірусу грипу птахів H5N3, з використанням культури тканини хоріоналантоїсних оболонок (ХАО) 11-12 добових курячих ембріонів, оскільки цю культуру можна вважати найбільш наближеною до рівня цілого організму, яким є курячий ембріон. Крім того, використання культури тканини ХАО є більш економічним методом у порівнянні з використанням курячих ембріонів для визначення противірусної дії препаратів. Кобальту біс(цитрато)станат розчиняли у глюкозо-желатиновому підтримуючому середовищі. Після доведення рН розчину до фізіологічного значення рН 7,2-7,4 визначали протигрипозну активність препарату. Вірус-вміщуючу рідину, з попередньо визначеним інфекційним титром, розводили у глюкозо-желатиновому середовищі, що містила (дослід) або не містила досліджувану сполуку (контроль). Фрагменти ХАО, прикріплені до шкаралупи та розміщені у лунках полістиролових панелей, інфікували розведеннями вірус-вміщуючої рідини на глюкозо-желатиновому підтримуючому середовищі ХАО не нижче за 100 ТІД 50 (дози, яка викликає інфікування 50 та більше відсотків фрагментів тканини ХАО). Після термостатування на протязі 24 год. при 37 °C контрольні та дослідні зразки окремо поєднувались, і в них визначали титр інфекційного вірусу. Тобто, визначали найбільше розведення вірус-вміщуючої рідини, при якому відбувається репродукція вірусу. З цією метою десятикратними розведеннями цих зразків інфікували фрагменти ХАО, розміщені в лунках полістиролових панелей. Панелі розташовували в термостаті при 37 °C. Після 48 годин термостатування наявність вірусу в лунках визначали за результатами реакції гемаглютинації (РГА). Розрахунок ТІД50 (дози, яка викликає інфікування 50 та більше відсотків фрагментів тканини ХАО) в експериментах in vitro проводили за методом Кербера в модифікації Ашмаріна за формулою: lg ТІД50=L-d (S-0,5), де L - початкове розведення у досліді; d - різниця між послідовними lg розведень; S - сума пропорцій тест-об'єктів, які дали позитивний результат. Оцінку противірусної активності препарату з використанням методу гальмування розвитку вірус-індукованого цитопатичного ефекту проводили відповідно до загально прийнятої методики. Моношарову культуру клітин MDCK, яку вирощували на протязі 24 год. у 96-лункових планшетах, двічі відмивали від ростового середовища фізіологічним розчином. В лунки вносили серійні десятикратні розведення вірус-вміщувальної рідини на підтримуючому середовищі, яке містило (дослід) або не містило (контроль) досліджувану сполуку. Оцінку противірусної активності проводили через 48 год. за реакцією гемаглютинації з використанням курячих еритроцитів. Виявлено, що максимальна переносима концентрація кобальту біс(цитрато)станату (МПК) на культурі інфузорій Colpoda steinii, тканинній культурі ХАО та культурі клітин MDCK була 7 мг/мл, 7 мг/мл та 368 мкг/мл, відповідно. Тому для визначення протигрипозної активності сполуки відносно штаму вірусу грипу А/Гонконг/1/68 (H3N2) на тканинній культурі ХАО були відібрані наступні дози: 7000 мкг/мл, 3500 мкг/мл та 735 мкг/мл. Результати досліджень наведені в таблиці 1. Крім того, в таблиці 1 наведені дані порівняння протигрипозної дії референс-препарату таміфлю фірми виробника Хоффманн-Ля Рош (Швейцарія), міжнародна назва - осельтамівір. 55 60 3 UA 113069 C2 Таблиця 1 Речовини Кобальту біс(цитрато)станат [Со(Н2О)6] [Sn(HCitr)2] •4Η2Ο Таміфлю (озельтамівір) - референспрепарат 5 10 Пригнічення Молярна маса, Досліджувана концентрація, репродукції г/моль мкг/мл (відповідно в Молях) вірусу H3N2 в lg -2 4,33 7000 мкг/мл (110 М) -2 735 2,5 3500 мкг/мл (0,510 М) -3 1,75 735 мкг/мл (110 М) -3 410 мкг/мл (110 M) 410 4,17 Результати дослідження свідчать про те, що сполука у концентрації 7000 мкг/мл повністю пригнічувала репродукцію штаму вірусу грипу А/Гонконг/1/68 (H3N2) на тканинній культурі ХАО в порівнянні з контролем. У концентраціях 3500 мкг/мл та 735 мкг/мл кобальту біс(цитрато)станат статистично значуще пригнічував репродукцію вірусу грипу - на 2,5 та 1,75 lg ТІД50, відповідно. Референс-препарат (Таміфлю) в кінцевій концентрації 410мкг/мл пригнічував репродукцію вірусу повністю на 4,17 lg ТІД50. Враховуючи отримані відносно штаму вірусу грипу А/Гонконг/1/68 (H3N2) результати, були вибрані наступні концентрації для визначення антивірусної активності кобальту біс(цитрато)станату проти штаму вірусу грипу A/PR/8/34 (H1N1): 1750 мкг/мл, 184 мкг/мл, 410 мкг/мл. Наведені в таблиці 2 результати свідчать про те, що сполука у концентраціях 1750 мкг/мл та 184 мкг/мл значною мірою пригнічувала репродукцію вірусу - на 3,08 та 3,33 lg ТІД50, відповідно. При цьому референс-препарат (таміфлю) у кінцевій концентрації 410 мкг/мл пригнічував репродукцію вірусу повністю на 4,17 lg ТІД50. 15 Таблиця 2 Речовини Кобальту біс(цитрато)станат [Со(Н2О)6] [Sn(HCitr)2] •4Η2Ο Таміфлю (озельтамівір) - референспрепарат Пригнічення Молярна маса, Досліджувана концентрація, репродукції г/моль мкг/мл (відповідно в Молях) вірусу H3N2 в lg -2 3,08 1750 мкг/мл (0,2510 М) 735 -3 3,33 184 мкг/мл (0,7510 M) -3 410 мкг/мл (110 M) 410 4,17 Відносно штаму пташиного грипу H5N3 отримані результати (табл. 3), які свідчать про противірусну активність кобальту біс(цитрато)станату на рівні референс-препарату (таміфлю). Таблиця 3 Речовини Кобальту біс(цитрато)станат [Со(Н2О)6] [Sn(HCitr)2] •4Η2Ο Таміфлю (озельтамівір) - референспрепарат Молярна маса, г/моль 735 Пригнічення Досліджувана концентрація, репродукції мкг/мл (відповідно в Молях) вірусу H5N3 в lg -2 4,25 1750 мкг/мл (0,2510 М) -3 4,08 368 мкг/мл (0,510 M) -3 410 мкг/мл (110 Μ) 410 3,75 20 25 У концентраціях 1750 мкг/мл та 368 мкг/мл сполука повністю пригнічувала репродукцію штаму вірусу грипу птахів H5N3 на тканинній культурі ХАО - на 4,25 та 4,08 lg ТІД50, відповідно, в той час, як дія таміфлю у кінцевій концентрації 410 мкг/мл була на рівні 3,75 lg ТІД 50. Аналогічним чином кобальту біс(цитрато)станат діяв і на моделі клітинної культури (MDCK). Оскільки його МПК на цій моделі була нижчою (368 мкг/мл), протигрипозну дію речовини вивчали саме у цій концентрації (табл. 4). 4 UA 113069 C2 Таблиця 4 Препарат Кобальту біс(цитрато)станат [Со(Н2О)6] [Sn(HCitr)2] •4Η2Ο Таміфлю (озельтамівір) референс-препарат 5 10 15 20 25 30 35 Молекулярна маса Максимальна нетоксична доза препарату на MDCK 735 0,510 M (368 мкг/мл) 410 110 М(410 мкг/мл) -3 Діюча доза препарату -3 0,510 M Пригнічення репродукції вірусу H3N2 в lg Пригнічення репродукції вірусу H1N1 в lg 2,2 1,6 4,33 3,33 -3 -3 0,510 M(205 мкг/мл) Репродукція вірусу грипу людини штамів А/Гонконг/1/68 (H3N2) пригнічувалась на 2,2 lg ТІД50 проти дії референс-препарату, яка складала 4,33 lg ТІД50 - відносно штаму A/PR/8/34 (H1N1), інгібування репродукції було дещо нижчим і складало 1,6 lg ТІД 50 проти дії референспрепарату, а саме 3,33 lg ТІД50. Але в обох випадках гальмування репродукції було статично значущим. Таким чином, у порівнянні з прототипом, заявлене технічне рішення - новий вітчизняний засіб кобальту біс(цитрато)станат виявляє виразну противірусну активність відносно вірусу грипу людини штамів А/Гонконг/1/68 (H3N2) та A/PR/8/34 (H1N1), а також вірусу грипу птахів H5N3 на обох застосованих моделях. Крім того він виявляє значно меншу токсичність, що дає перспективу для подальшого дослідження та впровадження в медичну практику. ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ: 1. Карпухин Г.И. Грипп / Г.И.Карпухин (Руководство для врачей) -СПб.: Гиппократ, 2001. 360 с. 2. Risk factors of influenza transmission in households / C. Viboud, P.Y. Bolle, S. Cauchemez [at all] // Br. J. Gen. Prac. - 2004. - № 54 (506). - P. 684-689. 3. Sturm-Ramirez K.M. Re-emerging H5N1 influenza viruses in Hong Kong in 2002 are higly pathogenic to ducks / K.M.Sturm-Ramirez, T.Ellis, B.Bousfield [et al.] // J.Virol. - 2004. - № 78. - P. 4892-4901. 4. Whitley R. J. Oral oseltamivir treatment in children / R.J.Whitley, F.G.Hayden, K.S.Reisinger//Ped. Inf. Dis. - 2001. - N 2. - P. 127-133. 5. Bright R.A. Adamantane resistance among influenza A voruses isolated early during the 20052006 influenza season in the Unated States / R.A.Bright, D.Shay, B.Shu [et al.] // Jornal of the American Medical Association. - 2006.-vol.295 (doi:10.1001/jama.295.8.joc60020). 6. Ершов Ф.И. Лекарственные средства, применяемые при вирусных заболеваниях. / Ершов Ф.И., Романцов М.Г - М.: "Гэотар-Медиа", 2007. - 320 с. 7. Доклинические исследования лекарственных средств: метод. Рекомендации / под. ред. чл.- кор. АМН Украины А.В.Стефанова - К. Авіцена. 2002. - 567 с. 8. Марцинко Е.Э., Миначева Л.Х., Чебаненко Е.А., Сейфуллина И.И. и др. Условия образования гетерометаллических комплексов в системах GeCl4 (SnCl4) - лимонная кислота М(СНЗСОО)2 - Н2О. Кристаллическая и молекулярная структура [M(H2O)6][Ge(HCit)2]•4H2O (M=Mg, Μn, Со, Сu, Ζn) и [M(H2O)6][Sn(HCit)2]-4H2O (M=Mg, Co, Ni) // Журн. неорган. химии. 2013. - Т. 58, № 5. - С. 588-595. 9. Пат. 15629 А Україна, МПК G01N 33/15, C12Q 1/18. Спосіб оцінки ступеня цитотоксичності біологічно активних сполук та фармакологічних препаратів / Лозицький В.П., Григорашева І.Μ., Федчук А.С. [та ін.]; заявник-патентоутримувач Український наук. - досл. Протичумний ін. - т, ТОВ "Відродження М". - № u2005 12542; заявл. 26.12.05; опубл. 17.07.06, Бюл. № 7. 40 5 UA 113069 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ [Co(H2O)6][Sn(HCitr)2]•4H2O, M=735,7 O C O C [Co(H2O)6] O H2C H2C O C C O O Sn HO C O O C O O CH2 CH2 O . 4H2O OH C O5 C , який має протигрипозну дію. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6