Перещеплювана клітинна лінія з тканин черепахи, tf (testudo fibroblasts)

Реферат: UA 114779 U UA 114779 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі загальної та прикладної вірусології, а саме до модельних систем для дослідження взаємодії вірус-клітина, і може бути використана для вивчення ролі холоднокровних наземних хребетних тварин у епідемічних та епізоотичних процесах та ланцюгах; в якості модельної системи для репродукції повільно ростучих вірусів, вивчення взаємодії та репродукції вірусів ссавців у нехарактерних клітинних системах під дією температурних факторів, що відрізняються від звичайних; в якості модельної системи для виділення та вивчення вірусів-збудників захворювань рептилій та амфібій; вивчення екології та еволюції вірусів. А також може слугувати модельною системою для токсикологічних, цитогенетичних, біохімічних та інших досліджень. У світі відомо усього декілька перещеплюваних клітинних ліній, отриманих з тканин рептилій, зокрема Gekko lung-1 (ATCC CCL-111), IgH-2 (АТСС CCL-108), ТН-1, Subline B1 (ATCC CCL-50) VH 2 (ATCC CCL-140) вони отримані Кларком з колегами (H.F. Clark) [1-7] в період з 1965 по 1968 pp. та задепоновані у Американській типовій колекції клітинних культур ATCC (American Type Culture Collection). Але, деякі з них взагалі не підлягають продажу як, наприклад, культура клітин коробчатої черепахи (ТН-1), а усі інші потребують отримання CITES (Convention on the International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora, U.S. Fish and Wildlife Service) дозволу на експорт в Україну. Окрім цього, їх придбання не завжди є економічно виправданим через дуже високу вартість самих культур клітин та проблемне і дороге транспортування. А отже, такі закордонні клітинні лінії є майже недоступними для вітчизняних лабораторій та дослідників. Також, у літературі зустрічаються повідомлення різних авторів про отримання клітинних ліній рептилій, як первинних, так і їх субкультур. Але більшість з них стосується отримання клітинних ліній від морських черепах, таких як Бісса або справжня каретта (Eretmochelys imbricata) [8, 9], логерхед (Caretta caretta) [10], оливкової черепахи (Lepidochelys olivacea) [11] та зеленої морської черепахи (Chelonia mydas) [12]. Ці клітинні лінії отримувались, переважним чином, для дослідження фібропапіломатозу морських черепах. Також, кілька клітинних ліній, окрім тих, що зазначено вище, було отримано з тканин ящірок. А саме: з зеленого аноліса (Anolis carolinensis) [13], кількох австралійських водяних агам [14], а також короткоживучі культури клітин крові від різних видів рептилій для проведення цитогенетичних досліджень [1517]. Але жодна з цих ліній не була паспортизована та задепонована, а отже не має документального підтвердження своїх характеристик, що є важливим при плануванні та проведенні експериментів. Для проведення досліджень можливо використовувати первинні культури клітин, але це має цілий ряд суттєвих недоліків: необхідність постійно мати джерело тканин для отримання первинних культур клітин, значна ресурсовитратність даного процесу (умертвіння тварин, розтин, механічна дезагрегація, трипсинізація, центрифугування, посів суспензії клітин, заміна середовища та пересіви і т.д., що передбачає значну трудомісткість та витрата великої кількості реактивів), висока вірогідність бактеріальної та вірусної контамінації, відмінності у ростових та інших властивостях, необхідність постійного контролю на чутливість та якість отримуваних клітин внаслідок нестандартності біологічного матеріалу. Перещеплювані культури клітин мають суттєві переваги перед первинними культурами, оскільки дають можливість працювати у стандартних умовах, мати банк еталонних зразків клітин, де кожен зразок володіє стабільними параметрами росту культури, і, як наслідок, отримувати стабільні результати при проведенні досліджень або у промисловому виробництві. Але, не дивлячись на значну кількість вже наявних перещеплювальних клітинних ліній, для ряду вірусних інфекцій і досі не знайдені відповідні стандартні біологічні моделі для вивчення і накопичення вірусу в системі in vitro. У зв'язку з цим проблема пошуку нових пермісивних до вірусів стабільних клітинних систем різного видового та тканинного походження, безперечно, є актуальною. Особливо актуальним це є для ветеринарних вірусологічних лабораторій, оскільки останнім часом гостро постають питання емерджентних вірусних інфекції, певна частина з яких, до того ж є зооантропонозами. І питання діагностики та дослідження таких хвороб потребує відповідних модельних систем і культура клітин є «золотим стандартом» у вирішенні даного питання. Для дослідження та діагностики вірусних захворювань амфібій та рептилій зараз використовують клітинні культури інших класів тварин, зокрема, риб і, у деяких випадках, ссавців (наприклад, культуру клітин з нирки зеленої мавпи - Vero), але температурний діапазон культивування таких ліній лежить поза межами температурних оптимумів життя більшості наземних пойкілотермних хребетних. Більшість клітинних культур риб вирощують при температурі від 18 до 22 °С, клітини ссавців - при 37 °С, але, зазвичай, температурні оптимуми вирощування вірусів такі самі, як температура тіла тварин, у яких вони викликають захворювання (їх хазяїв). Для більшості амфібій зоною оптимальних температур існування є діапазон 18-25 °С, а для рептилій 25-32 °С, а отже реплікація вірусів відбувається за 1 UA 114779 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 температури відмінної від температурних оптимумів росту культур клітин тварин інших класів. Окрім того для вивчення механізмів реплікацї, генетичних, еволюційних особливостей збудників вірусних захворювань необхідні пермісивні клітинні моделі. І оптимальним джерелом їх отримання є саме ті класи тварин, для яких дані захворювання є характерними. На сьогодні з літературних джерел відомо про дві культури клітин, які отримані з прісноводних черепах. Одна з них отримана з серця коробчатої черепахи {Terrapene Carolina) (Clark and Karzon, 1967) паспортизована та задепонована у АТСС під номером АТСС CCL-50, але не підлягає продажу. Про отримання іншої клітинної культури з прісноводної м'якопанцирної черепахи (Pelodiscus sinensis) повідомили у 2012р тайванські вчені [18]. Але дана культура клітин є первинною, була отримана для дослідження поксвірусної інфекції прісноводних черепах, не паспортизована і не задепонована у жодному клітинному банку, а отже її морфологічні, генетичні, культуральні та вірусологічні властивості не підтверджені. До того ж температура культивування становить 37°С, а отже культивування вірусів, реплікація яких відбувається за більш низьких температур не завжди буде можливою. Окрім того оптимальним поживним середовищем для цієї лінії визначено середовище L-15, яке є менш широко вживаним на відміну від DMEM та RPMI-1640, які є оптимальними для отриманої нами клітинної лінії. Задачею запропонованої корисної моделі є створення нового стабільного вітчизняного штаму перещеплюваної культури клітин черепахи, культивування якого здійснюватиметься на доступних поживних середовищах та являтиме собою нову модельну систему для вірусологічних, токсикологічних, генетичних та еволюційних досліджень. Поставлена задача вирішується тим, що перещеплювана культура клітин пула внутрішніх паренхіматозних органів черепахи червоновухої (Trachemys scripta elegans), TF (Testudo fibroblasts) для вірусологічних, цитогенетичних, токсикологічних, еволюційних, екологічних та інших видів досліджень. Культура депонована у Клітинному банку ліній з тканин людини та тварин, Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Перещеплювана культура була отримана з первинної, започаткованої з внутрішніх паренхіматозних органів новонародженої черепахи червоновухої. Після первинної механічної та ферментативної дезагрегації, збору загального пулу клітин та їх підрахунку за загальноприйнятою методикою [19], отримана клітинна суспензія була доведена культуральним 5 2 ростовим середовищем до посівної концентрації 0,5·10 кл/см . Після чого висіяна у культуральні флакони. Склад ростового середовища для первинної культури клітин був наступним: поживне середовище DMEM - 85 %, FBS - 15 %, з додаванням гентаміцину 3 3 3 сульфату (0,2 мг/см ) пеніциліну (500 Од/см ), стрептоміцину сульфату (0,5 мг/см ), 3 флуконазолу (0,01 мг/см ). Інкубацію проводили за температури 28-30±0,5°С, через дві доби проводили заміну ростового середовища. В подальшому заміну ростового середовища проводили один раз на тиждень. Перший пасаж - розсів 1:2 - здійснено через 28 днів від посіву первинної культури. Другий пасаж через 7 днів , коефіцієнт пересіву 1:3. З третього по сьомий пасажі коефіцієнт пересіву дорівнював 1:5, з періодом субкультивування 5-7 днів. З 9 по 15 пасажі коефіцієнт пересіву знизився до 1:1,5-1:1, а період пересіву - до 10-14 днів (період кризи клітинної культури). Для стимулювання проліферації та переведення культури у перещеплювану застосовували композицію двох поживних середовищ DMEM 60 % та RPMI3 1640 15 %, FBS 15 %, а також додаткові ростові компоненти: L-глутамін 2 мМ/см та кондиціоноване середовище від активноростучих культур (після стерилізації шляхом фільтрування), у кількості 10-20 % від загального об'єму ростового середовища, яке вносили у культуральні флакони. Заміну середовища у культуральних флаконах проводили один раз на тиждень, по досягненні моношару клітини розсівали з коефіцієнтом 1:1, а деякі - 1:2 Через три пасажі були відібрані флакони які демонстрували найкращі ростові характеристики, мали рівномірно виповнений моношар та не утворювали конгломератів. З 25 пасажу склад ростового середовища став наступним: композиція поживних середовищ DMEM та RPMI-1640 4:1 - 88 %, 3 FBS 12 %, L-глутамін 2 мМ/см . Даний склад ростового середовища для підтримання росту клітинної лінії TF зазначено у паспорті як оптимальний для вирощування культури клітин та збереження її ростових, культуральних та морфологічних характеристик. На момент паспартизації культура TF пройшла 52 пасажі, на момент депонування - 58 пасажів. Контроль контамінації. За даними мікробіологічного контролю шляхом посіву на набор селективних середовищ було встановлено, що клітини лінії TF вільні від бактеріальної та грибкової контамінації. 2 UA 114779 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Каріологічна характеристика. За результатами каріологічного аналізу клітин лінії TF визначені наступні її властивості: 1. Видова приналежність. Аналіз проведено на метафазних хромосомах (Фіг. 1). Встановлено: каріотип відповідає виду - Trachemys scripta elegans. 2. Розподіл клітин за числом хромосом. Проаналізовано 1000 клітин на препаратах, приготовлених без вижигання фіксатору на склі та пофарбованих азур-еозином. Кількість хромосом варіює від 48 до 56, модальне число 2n=50, серед них 14 пар мета-, субмета- та акроцентричних хромосом та 22 мікрохромосоми (Фіг. 2), що відповідає даним літератури [15, 16]. Кількість поліплоїдних клітин складає менше 2%. Морфологічна характеристика клітин культури TF. Клітини видовжені, веретеноподібної форми, ядро розташоване відцентрово. Ядра овальні різного розміру. Ядерця крупні від одного до трьох у ядрі (Фіг. 3). Стандартні умови культивування: Для вирощування культури клітин TF використовують композицію поживних середовищ DMEM та RPMI-1640 4:1 - 88 %, з додаванням 12 % FBS, 2 3 3 3 мМ/см L-глутаміну та пеніциліну - 100 Од/см і стрептоміцину - 0,1 мг/см . Температура культивування: 28-30±0,5°С. Культуральні властивості. Клітини TF мають фібробластоподібну морфологію, їм притаманний адгезивний (моношаровий) тип росту, формують нещільний моношар, який характеризується формуванням різноспрямованих «потоків» росту і формуванням характерного для фібробластоподібних клітин 5 2 малюнку на субстраті (Фіг. 4). Посівна концентрація складає 0,510 кл/см . Кратність розсіву: 1:2-1:3. Клітини пасажують з частотою 3-4 доби. Для зняття клітин ростове середовище з флакону зливають, моношар ополіскують розчином версену 0,02 %, після чого у культуральний флакон додають композицію 0,02 % розчину версена та 0,25 % розчину трипсину в співвідношенні 3:1 у такій кількості, щоб ледь вкрити моношар і залишають за кімнатної температури на 1-1,5 хв. Коли клітини починають відшаровуватись від субстрату - додають невелику кількість ростового середовища з сироваткою і знімають шляхом піпетування. Спосіб кріоконсервації. Для кріоконсервації клітин використовується ростове середовище, 30 % сироватки теляти, 6 3 10 % ДМСО. Концентрація клітин 3-410 /см . Заморожування клітин здійснюють шляхом пониження температури на 1 °С/хв.. до -24 °С, з послідуючим перенесенням їх у пари рідкого азоту, а через 20-30 хв. у рідкий азот. Життєздатність після розморожування не менше 75-80 %. Спосіб ревіталізації. Розморожування проводять безцентрифужним методом. Кріопробірку виймають з кріосховища і одразу вміщують у воду, підігріту до 30 °С, коли вміст починає відтавати переносять у стерильний бокс. Вміст кріопробірки стерильною піпеткою переносять у культуральний флакон із заздалегідь підігрітим до 30 °С ростовим середовищем та поміщають в інкубатор за температури 28-30 °С для культивування. Через добу проводять заміну середовища і продовжують культивування до утворення моношару. З вищезазначеного видно, що клітинна лінія TF, отримана з пулу внутрішніх паренхіматозних органів черепахи червоновухої, стабільна і володіє якостями та ознаками, притаманними перещеплюваним культурам, і у порівнянні з відомими аналогічними лініями має наступні переваги. Запропонована клітинна лінія TF адаптована до росту на стандартних поживних середовищах, розроблених для культур клітин ссавців. На теперішній час є єдиною вітчизняною перещеплюваною культурою клітин рептилій. Аналогічних клітинних ліній не має жоден клітинний банк як в Україні, так й у країнах СНД. Отримана культура клітин може бути використана як модельна система для дослідження вірусів-збудників захворювань рептилій та амфібій, для вивчення екології та еволюції вірусів а також для токсикологічних досліджень. Джерела інформації 1. Clark H.F., et all. Characterization of reptilian cell lines established at incubation temperatures of 23 to 36 degrees// Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1970. - 133. - PP.1039-1047. 2. Clark H.F., Karzon D.T. Terrapene heart (TH-1), a continuous cell line from the heart of the box turtle (Terrapene Carolina)// Exp. Cell Res. - 1967. - 48. - pp. 263-268. 3. Cohen M.M., et al. The somatic chromosomes of 3 lizard species: Gekko gecko, Iguana iguana, and Crotaphytus collaris// Experientia. - 1967. - 23. - pp.769-771. 4. Clark H.F., Karzon D.T. Acquired tolerance to elevated temperatures in a poikilothermic cell line (terrapene heart, TH-1)// Exp. Cell Res. - 1967. - 48. - pp.269-275. 5. Biology of amphibian tumors/ Ed Merle Mizell. - N.Y.: Springer-Veralg - 1967. - pp. 112-115. 6. Huang C.C., Clark H.F. Chromosome changes in cell lines of the box turtle (Terrapene Carolina) grown at two different temperatures// Can. J. Genet. Cytol. - 1967. - 9. - pp. 449-461. 3 UA 114779 U 5 10 15 20 25 30 35 7. Clark H.F., et al. Comparative characterization of a C-type virus-producing cell line (VSW) and a virus-free cell line (VH2) from Vipera russelli// J. Nat. Cancer Inst. - 1973. - 51. - pp. 645-654. 8. Takeshita S., Matsuda N., Kodama S., at al. In Vitro Thermal Effects on Embryonic Cells of Endangered Hawksbill Turtle (Eretmochelys imbricata)// Zoological Science. - 2013. - 30. - pp. 10381043. 9. Fukuda Т., Kurita J., Saito Т., at al. Efficient Establishment of Primary Fibroblast Cultures from the Hawksbill Sea Turtle (Eretmochelys imbricata)ll In Vitro Cell. Dev. Biol. - 2012. - 48. - pp. 660-665. 10. Webb J.S., Zychowski V.G., Bauman W.S., et al. Establishment, Characterization, and Toxicological Application of Loggerhead Sea Turtle (Caretta caretta) Primary Skin Fibroblast Cell Cultures//Environ. Sci. Technol. - 2014. - 48. - pp. 14728-14737. 11. Fukuda Т., Katayama M, Kinoshita K., et al. Primary Fibroblast Cultures and Karyotype Analysis for the Olive Ridley Sea Turtle (Lepidochelys olivaced)ll In Vitro Cell. Dev. Biol. - 2013. - 48. pp. 660-665. 12. Moore K.M., Work M.Т., Balazs H.G., et al. Preparation, Cryopreservation, and Growth of Cells Prepared from the Green Turtle (Chelonia mydas)ll Methods in Cell Science. - 1997. - 19. - pp. 161-168. 13. Simpson S.B., Cox P.G. Vertebrate regeneration system: culture in vitro// Science. - 1967. 157. - pp. 1330-1332. 14. Ezaz Т., A O'Meally D., Quinn A., et al. A Simple Non-Invasive Protocol to Establish Primary Cell Lines from Tail and Toe Explants for Cytogenetic Studies in Australian Dragon Lizards (Squamata: Agamidae)// Cytotechnology. - 2008. - 58. - pp. 135-139. 15. Cleiton F., Giuliano-Caetano L. Cytogenetic Characterization of Two Turtle Species: Trachemys dorbigni and Trachemys scripta elegansll Caryologia. - 2008. - 61(3). - pp. 253-257. 16. Kasai F., O'Brien S., Ferguson-Smith M., et al. Extensive Homology of Chicken Macrochromosomes in the Karyotypes of Trachemys scripta elegans and Crocodylus niloticus Revealed by Chromosome Painting despite Long Divergence Times// Cytogenetic and Genome Research. - 2012. - 136. - pp. 303-307. 17. Rohilla M.S., Rao R.J., Tiwari P.K., et al. Use of Peripheral Blood Lymphocyte Culture in the Karyological Analysis of Indian Freshwater Turtles: Lissemys punctata and Geoclemys hamiltonill Current Science. - 2006. - 90(8). -pp. 25-28. 18. Pan-Chen Liu, Chi-Young Wang, Shiun-Long Lin, et al. Establishment of a Soft Shell Turtle (Pelodiscus sinensis), Embryo Primary Cell Culture for Studies of Soft Shell Turtle Poxvirus-Like Virus Replication and Characteristics// African Journal of Microbiology Research. - 2012. - 6(5). - pp. 960967. 19. Сюрин B.H. Ветеринарная вирусология/ Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. - М.: Колос, 1984. 372 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Перещеплювана культура клітин пула внутрішніх паренхіматозних органів черепахи червоновухої (Trachemys scripta elegans), TF (Testudo fibroblasts) для вірусологічних, цитогенетичних, токсикологічних, еволюційних, екологічних та інших видів досліджень. 4 UA 114779 U 5 UA 114779 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6