Моноклональне антитіло, гібридомна клітинна лінія, поліпептид (варіанти), фрагмент днк (варіанти), фармацевтична композиція, спосіб одержання моноклонального антитіла

1. Моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность FR и CDR легкой цепи (19) UA (11) 40621 (13) C2 (21) 95125376 (22) 19.12.1995 (24) 15.08.2001 (31) 94120165.9 (32) 20.12.1994 (33) DE (46) 15.08.2001, Бюл. № 7, 2001 р. (72) Мітжанс Франческ, ES, П'юлатс Жом, ES, Розель Елізабет, ES, Адан Жом, ES, Гудмен Саймон, GB, Хан Діан, US Ю 40621 и тяжелой цепи , 5. Моноклональное антитело по п.1, отличающееся тем, что предназначено для производства лекарственного средства, направленного против опухолей, предпочтительно меланомы. 6. Моноклональное антитело по п.1, отличающееся тем, что предназначено для диагностики расположения и определения опухолевого роста. 7. Моноклональное антитело по любому из пунктов 1-3, отличающееся тем, что получено с помощью гибридомной клеточной линии DSM ACC2160. 8. Гибридомная клеточная линия, способная продуцировать моноклональное антитело по любому из пунктов 1-7, депонированная под регистрационным номером DSM ACC2160. 9. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность легкой цепи моноклонального антитела по п. 1, их мутанты и варианты, обладающие следующими свойствами: - реагируют только с αV-цепью αV-интегрином человека, - блокируют прикрепление клеток, содержащих αV-интегрин к субстрату интегрина, - нарушают установившееся взаимодействие клетка-матрикс, вызываемое αV-интегринами, - блокируют развитие опухоли и не проявляют цитотоксической активности. 2. Моноклональное антитело по пункту 1, отличающееся тем, что субстратом интегрина является витронектин, фибронектин или фибриноген. 3. Моноклональное антитело по пункту 1 или 2, отличающееся тем, что опухолью, рост клеток которой блокируется, является меланома. 4. Моноклональное антитело по любому из пунктов 1-3, отличающееся тем, что представляет собой F(ab') или F(ab')2, или одноцепочечный Fv, обладающие свойствами моноклонального антитела. 2 40621 или его функциональный фрагмент. 10. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи монокло нального антитела по п. 1, 3 40621 или его функциональный фрагмент. 11. Полипептид, отличающийся тем, что представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности по п.9 от положения 21. 12. Полипептид, отличающийся тем, что представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности по п. 10 от положения 20. 13. Фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь моноклонального антитела по п.1, имеющий ДНК последовательность или его мутанты и варианты, кодирующая FR и CDR легкой цепи вариабельного участка моноклонального антитела, обладающего свойствами, указанными в пункте 1. 14. Фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь моноклонального антитела по п.1, имеющий ДНК последовательность 4 40621 или его мутанты и варианты, кодирующие FR и CDR тяжелой цепи вариабельного участка моноклонального антитела, обладающего свойствами, указанными в пункте 1. 15. Фрагмент ДНК по п. 13, отличающийся тем, что содержит дополнительно лидерную последовательность 5 40621 16. Фрагмент ДНК по п. 14, отличающийся тем, что содержит дополнительно лидерную последо вательность 17. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что содержит моноклональное анти тело по любому из пунктов 1- 4 или 7 и фармацевтически приемлемый носитель. 6 40621 20. Способ получения моноклонального антитела по пункту 7, отличающийся тем, что включает иммунизацию мыши очищенным витронектином, отбор с помощью ELISA клонов, связывающихся с рецепторами очищенного витронектина, и получение в соответствии со стандартными технологиями клеточной линии как определено в пункте 6, которая производит указанное антитело. 18. Способ получения моноклонального антитела по любому из пунктов 1-4, отличающийся тем, что осуществляют иммунизацию мыши очищенным aVb3 интегрином, отбор с помощью ELISA клонов, связывающихся с очищенным, в отношении aVb3 - рецептором, и получение в соответствии со стандартными методиками специфической клеточной линии, которая продуцирует указанное антитело. 19. Способ по пункту 16, отличающийся тем, что интегрином является витронектин. ______________________________ ны классифицированы на четыре перекрывающихся семейства, содержащие b1, b2, b3 или aVцепи, и конкретная клетка может экспрессировать несколько различных интегринов из каждого подсемейства. В последнем десятилетии было показано, что интегрины являются основными рецепторами, участвующими в клеточной адгезии. Сообщения об интегринах представлены, например, E. Ruostahti (I. Clin. Invest., 1991, 87/, и Р.О. Hynes/Cеll, 1992, 69/, и таким образом, могут быть подходящей мишенью для терапевтического вмешательства. За исключением эритроцитов, все клетки человека экспрессируют один или более из интегринов. Их функции регулируются на многих уровнях, однако, прежде всего, их лигандо-специфичность зависит от того, какая a-цепь ассоциируется с каждой b-целью в гетеродимере, и от состояния активации интегринов (Hynes, 1992, Diamond and Springer 1994). На специфичность могут также влиять клеточный фон, на котором функционируют интегрины (Cham and Hemlеr, 1993) и сплайс-вариантная форма интегрина, который используют (Delwel et al., 1993). С учетом этих сложностей одним из немногих надежных указаний на специфичность интегринов является непосредственное нарушение функции интегрина и анализ того, на какую из клеточных реакций это оказывает воздействие. История исследования интегринов показала, что реагенты, которые могут специфически блокировать функцию интегринов, являются, решающими факторами в функциональных анализах, начиная от блокирующего функции CSAT-антитела, которое, прежде всего, определяет b1-цепь интегринов (Norr et al., 1982), до многочисленных важных поздних примеров (например, PLD6, PIB5) Wayner and Carter. 1987), P4C10 (Carter et al., 1990), A11B2 (Hall et al., 1990), ЗАЗ (Тurner et al., 1989), GOH3 (Sonnenberg et al., 1987) и LM609 (Cheresh and Spiro 1987)/: область абсолютно зависит от таких реагентов. В настоящее время aV-серия интегринов рассматривается как основное подсемейство, обладающее как классическими, так и новыми функциями. Наряду с классическим прикреплением и распространением клеток (Pytela et al., 1985, Cheresh, 1991), aV-интегрины ответственны за миграцию клеток (Seftor et al., 1992), за интернализацию рецепторов Panetti and McKeown Longo, 1993a), Panetti and McKeown Longo, 1993b), как вирусные ко-рецепторы, (Wickham et al., 1993), за организацию внеклеточных протеазных каскадов (de Настоящее изобретение относится к новому моноклональному антителу и гибридомной клеточной линии, продуцирующей указанное антитело. Моноклональное антитело, предпочтительный вариант которого назван 17Е6. отличается следующими характеристиками: – взаимодействует только с aV-цепями aVинтегринов человека, – блокирует прикрепление клеток, содержащих aV-интегрин, к субстрату интегрина, – нарушает установившееся взаимодействие клетка-матрикс, вызываемое aV-интегринами, – блокирует развитие опухоли, и – не обладает цитотоксической активностью. Поэтому целью настоящего изобретения является моноклональное антитело, обладающее указанными свойствами. Кроме того, целью настоящего изобретения является гибридомная клеточная линия, продуцирующая моноклональное антитело, обозначенная как 272–17Е6 и депонированная под регистрационным номером DS M ACC2160, а также моноклональное антитело, обладающее указанными ранее свойствами, которое можно получить с помощью указанной гибридомной клеточной линии. Более того, настоящее изобретение относится к ДНК последовательностям и аминокислотным последовательностям. ДНК последовательности кодируют антитело или его часть. Эти последовательности представлены на рис. 17а и 17b и в прилагаемом описании последовательности. И, наконец, целью настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая определенное ранее антитело. Предпосылки изобретения. Интегрины представляют собой супер-семейство адгезионных рецепторов клеточной поверхности, которые контролируют прикрепление клетки к твердому внеклеточному окружению – как к внеклеточной матрице (ЕСМ – extracollular matrix), так и к другим клеткам. Адгезия является основным важным свойством клеток, она обеспечивает связывание, сигналы для миграции и сигналы для роста и дифференциации. Интегрины непосредственно участвуют в многочисленных нормальных и патологических состояниях и, как таковые, являются преимущественными мишенями для терапевтических вмешательств. Интегрины представляют собой трансмембранные интегральные протеины, гетеродимеры, специфичность связывания которых зависит от того, какая из 14 a-цепей соединена с какой из 8 b-цепей. Интегри 7 40621 рессию интегринов aV-серий (Albelda et al., 1992, Gehlsen et al. 1992, Marshall et al., 1991) и кроме того, разрастающиеся кровеносные капилляры экспрессируют aVb3 в процессе антиогенеза опухоли (Brooks et al., 1994). Исследования ин виво также указывают на участие aVb3 в развитии меланомы. В системе с меланомой крыс В 16-F 10 экспериментальны метастазы легких оказалось возможным подавить за счет высоких уровней RGD-пептидов (Hardan et al., 1993, Hunphries et al., 1986), потенциальных блокаторов функций aV-интегрина. Позднее, Felding - Habermann с коллегами показали, что интегрины aV-серий промотируют рост подкожных опухолей М21 меланомы человека у иммунодефицитных мышей. Система М21 очень удачна и состоит из набора клеток, экспрессирующих различные aV-серии интегринов (Kiеffer et al, 1991, Felding–Habermann et al., 1992, Cheresh and Spiro, 1987). Исходная М21 экспрессирует aVb3 и aVb5 (Wayner et al., 1991), она присоединяется к витронектину и растет, как подкожная опухоль, М21-L, соматический вариант М21, не содержит детектируемых aV (Cheresh and Spiro, 1987), она не может связываться с витронектином и разрастается в медленно растущие опухоли. М21-L4 является трансфектантом М21-L, стабильно реэкспрессирующим полной длины aV-цепь; она связывается витронектином и быстро растет в виде подкожной опухоли (Felding-Habermann et al., 1992). Таким образом, наличие aV-интегринов клеточной поверхности непосредственно коррелирует с подкожным ростом М21. Однако М21 подвергалось чрезвычайному селекционному прессингу при установлении вариантов линий М21-L и M21-L4. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что функцию aV-интегринов нативной М21 популяции можно блокировать, и можно обнаружить удивительное воздействие на поведение клеток и развитие опухоли. Пептидные антагонисты могут быть легко синтезированы, однако, их использование ограничено из-за их слабой биодоступности, короткого срока полураспада ин виво и быстрого выведения из организма животных (Humphries et al., 1988). Сингенные антитела представляют интересную альтернативу пептидам. У них длительный срок существования ин виво (Tao and Morrison, 1989, Haba et al., 1985) и их специфичности связывания можно легко продемонстрировать с помощью стандартных методик. К сожалению, хотя и существуют такие удобные aV-специфичные антитела, как 1 М142 (Cheresh and Spiro, 1987), лишь немногие из них эффективно блокируют функции aV-интегринов. Специфичность и биологические функции членов aV-семейства вызывают множество споров главным образом из-за того, что до сих пор не существует реагента, который прекращал бы функции всего класса – не существует потенциального aV-блокирующего антитела. Обнаружение того факта, что классические рецепторы адгезии семейства интегринов поддерживают остальные менее обычные биологические функции, интенсифицировало поиски механизма их действия на молекулярном уровне. Эти поиски выявили Boer et al., 1993), и как регуляторы развития опухолей (Felding-Habermann et al., 1992). Специфичности пяти известных aV-серий интегринов, aVb1 (Zhang et al., 1993), - b3 (Pytela et al., 1985, Cheresh et al., 1987), - b5(Cheresh et al., 1989), b6 (Busk et al., 1992) и - b8 (Moylo et al., 1991), были частично определены, и, по-видимому, они распознают исключительно лиганды, содержащие RGD-/NH2-аргинин-глицин-аспарагиновая кислота СООН) трипептидные последовательности, включая те, которые имеются в витронектине /aVb1, aVb3, aVb5/, фибронектине /aVb1, aVb3, aVb5, aVb6/, и в факторе Willebrand, фибриногене, и остеопонтине /aVb3/ например, 1991, Busk et al., 1992, Zhang et al., 1993, Denhardt and Guo, 1993, Smith and Cheresh, 1990). Димеры с родственными специфичностями могут быть совместно экспрессированы на те же клетки (например, aVb3 и aVb5 - для витронектина на клетки М21) (Wayner et al., 1991), но могут контролировать независимые функции. Однако, перекрывающиеся лигандные специфичности внутри самого aV-семейства, а также между интегринами и aV- и b1-серий, означают, что отнесение функций к определенному рецептору в конкретном клеточном окружении проблематично. Блокирующие функции антитела оказались подходящими при выяснении функций aVb3 (Cherest and Spiro, 1987, Chuntharapai et al., 1993) и aVb5 Wayner et. al., 1991). Однако, для других aV-интегринов неизвестны антитела, которые определяют комплекс и нарушают функции. В частности, известны несколько реагентов, которые определяют aV-цепь комплекса и нарушают функцию интегрина для всего семейства. Lohmann et al., 1994) раскрыл aVbх антитело, которое не меняет на обратное взаимодействие клетка-матрица и не обладает активностью блокирования развития опухоли. Поэтому существует постоянный интерес к функциям интегринов серии aV в отношении развития опухолей. Злокачественная меланома человека представляет собой все возрастающий преимущественно агрессивный рак кожи. Повышенные уровни каждого из интегринов a2b1 (Danen et al., 1993, Etoh et al., 1992), a3b1 (Natali et al., 1993, Yoshinaga et al., 1993), a4b1 (Hart et al., 1991) и a6b1 (Hart et al., 1991) были вовлечены в развитие меланомы, но интегринами, которые вовлечены наиболее постоянно, являются интегрины aV-серий. В частности, как инвазия из первичной опухоли, так и находящиеся на расстоянии метастазы, с гистологической точки зрения отличаются повышенной экспрессией aVb3 интегрина, "витронектинового рецептора". Главным образом неинвазивные опухоли и незлокачественные меланиновые образования экспрессируют слабодетектируемый aVb3, рецептор, редко встречающийся в здоровых тканях (Brooks et al., 1994, Buck et al, 1990, Pignatolli et al., 1992, Lessey et al., 1992, Korhonen et al., 1991, Nesbitt et al., 1993). Иммуногистохимический анализ установившихся опухолей и метастазов показывает последовательное возрастание aVb3 для инвазивной стадии. (Albelda et al., 1990, Si and Hersey, 1994), причем скринирование меланомных линий постоянно выявляет высокую эксп 8 40621 Включенные ДНК- и аминокислотные последовательности включают также слегка измененные последовательности, или их варианты, такие, как мутанты и варианты, которые можно получить целенаправленно или произвольно за счет химических или физических процессов. Обычно включены все такие мутанты и варианты, которые демонстрируют описанные свойства и функции. Термин "антитело", как правило, включает также фрагменты антитела такие, как Fab', F/ab'/2 или одноцепочечный FVS. Эти фрагменты можно получить с помощью обычных стандартных методик. несколько непредсказанных участков на интегринах, которые аллостерически сообщают их активационное состояние, или, при лигировании, сами могут активировать функции интегринов. Ингибиторы функции интегринов, напротив, обычно включают в себя активный сайт, причем классическим примером такого поведения являются RGD-пептиды, которые реплицируют сайт распознавания интегринов многих лигандов интегринов aV-серий и a5b1. В настоящем изобретении описано такое новое блокирующее функции антитело, направленное против aV-интегриновой цепи человека, которое обозначено как 17Е66. Во многих сообщениях обсуждается необратимый характер взаимодействия между aVb3 и его лигандом, например, витронектином. Авторами было обнаружено, что 17Е6 быстро меняет на обратное это, так называемое, необратимое взаимодействие между интегринами aV- серий и их субстратами, что предполагает возможность терапевтического применения. В настоящем изобретении анализируется механизм действия 17Е6 и обнаружено, что он чрезвычайно слабо конкурирует с лигандом, связывающимся с aVb3, хотя активные сайты витронектина и FGD сильно конкурируют друг с другом из-за рецептора. И другие антитела сильно конкурируют из-за 17Е6. Так, 17Е6 действуeт как аллостерический ингибитор. Эксперименты по перекрестному связыванию выявили, что именно aVb3, а не aVb1 или aVb5 должны димеризоваться перед тем, как 17Е6 может осуществить блокировку. Это открытие показало, что 17Е6 действует по новому механизму, который включает манипуляцию по типу индуцированной интегрином сигнальной трансдукции. Антитело настоящего изобретения блокирует развитие опухоли, и, более того, не обладает цитотоксичностью. Материалы, рисунки, таблицы, сокращения. Микроорганизмы, клеточные линии, плазмиды, фагeмиды, промоторы, маркеры устойчивости, источники репликации или другие фрагменты векторов, которые указаны в настоящем описании, обычно коммерчески доступны каким-либо другим обычным образом. В некоторых случаях вышеуказанные материалы нельзя купить непосредственно. Однако, их используют здесь только для примеров, чтобы продемонстрировать свойства или действия настоящего изобретения, и они не существенны для осуществления требований изобретения. Как правило, их можно заменить другими подходящими обычными материалами и биологическими материалами. Моноклональное антитело 17Е6 представляет собой антитело, которое продуцирует гибридомная клеточная линия, обозначаемая как 272– 17Е6. Эта клеточная линия была депонирована под регистрационным номером DSM ACC2160 в Deutsche Sanmleung Für Mikroorganismom Braunschweig FRG. Методики и способы, которые существенны для осуществления настоящего изобретения, подробно раскрыты в описании. Другие методики, которые не раскрыты в описании, соответствуют известным стандартным методикам, хорошо известным специалистам, или более подробно описаны в приводимых ссылках и патентных заявках, а также в стандартной литературе. Abbreviations: Сокращения aIIbb3 integrin интегрин aVb1 integrin интегрин aVb3 integrin интегрин aVb5 integrin интегрин aVb6 integrin интегрин aVb8 integrin интегрин 10G2 Mab 1418 G2a Mab 14D9 F8 Mab 14E2 Mab 17E6 Mab 20A9 Mab 23G5 Mab 3A3 Mab 9.2.27 Mab ADCC antibody directed cellular cytotoxicity клеточная цитотоксичность, управляемая антителом AECM antibody and effector cell dependent cytostatis цитостаз, зависящий от антитела и эффекторных клеток АIIB2 Mab AP3 Mab ATCC American Type Culture collection Американская коллекция типовых культур B16F10 cell line клеточная линия СР8 Mab СSAT Mab cRGDfV cyclic peptide: Arg-Gly-Asp-DPhe-Val циклический пептид сRGDfK cyclic peptide: Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys циклический пептид EMM31 cell line клеточная линия GOH3 Mab GRGDSPK peptide: Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys пептид LM142 Mab LM609 Mab M21 cell line клеточная линия M21-L cell line клеточная линия M21-L-IIb cell line клеточная линия M21-L4 cell line клеточная линия MAb monoclonal antibody моноклональное антителоо MTT 3-(4-5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenytetrazolium biomide 3-/4-5-диметилтиазол-2-ил/-2,5-дифенил тетразолийбромид NBT-BCIP nitro Blue Tetrazolium-Bromochloroindolyl Phosphate нитро-Блю-тетразолий-Бромхлориндолил фосфат NP18 Cell line клеточная линия 9 40621 антител и контрольные М21 и M21L клетки меланомы человека. Клетки инкубируют с 10 мкг/мл первичных антител, окрашивают флуоресцентно мечеными вторичными антителами. Счетчик окрашивают проподиумиодидом, чтобы обеспечить дискриминационное окно для некротических клеток. И 10000 клеток из образца подвергают анализу. Открытый пик представляет интенсивность только антител второго слоя. Заштрихованный пик, интенсивность, характеризующую первичного и вторичного вместе. Вертикальная ось показывает количество клеток в канале, горизонтальная ось показывает log интенсивности флуоресценции в этом канале. М21 содержит поверхностный aV интегрин, М21-L не содержит. Характер окрашивания для альфа-V-группы антител близко соответствует LM142- (aV-специфичность) и L M609 (aVb3-специфичность) окрашиванию. Особенно они реагируют с М21, но номинально с М21-L. Антитело 9.2.27 реагирует с поверхностным протеогликаном. 14Е2 и 21Н6 распознают и неидентифицируемый другими способами 200 КДа протеин поверхности меланомы. Их характеры окрашивания отличаются от характера для альфа-V-группы. Особенно они реагируют аналогично как с М21, так и в М21-L. Рис. 2 Антитела альфа-V-группы иммуноосаждают аналогичные протеины. Жизнеспособные меланомы М21 (А) метят на поверхности клеток биотином, экстрагируют детергентом и иммуноосаждают и разделяют на невосстанавливающем 7,5% SDS–PAGE. Стандарты представлены на полосе а, а веса в КДа показаны слева. Осаждение осуществляли контрольными антителами LM142 (анти-aV: полоса b), и LM609 (анти- aVb3: полоса с), и 21Н6( полоса d), 10G2 (полоса е), 20А9 (полоса f), 23G5 (полоса g), 17E6 (полоса h), 14D9 (полоса i) и 14Е2 (полоса j). LM142 и LM609 осаждают одинаковым образом протеины 10G2, 20A9, 23G5 и 17E6, тогда как 21Н6 и 14Е2 осаждают полосу примерно 200 КДа. 14Д9 осаждает оба типа. Клетки М21 меланомы (В), М21-L aV-дефицитной меланомы (С) и UCLAP-3 (D) были мечены на поверхности биотином и подвергались иммуноосаждению как в (A). Осаждение осуществлялось антителами LM142 (анти-aV: полоса b),LM609 (анти-aVb3: полоса с), 17Е6 (полоса d), АР3 (анти-b3: полоса е) и 20А9 (полоса f). Маркеры молекулярного веса приведены в полосе а, а веса в КДа показаны слева. Указано положение полос aV, b1, b3, b5. Рисунок 3 17Е6 мешает начальному клеточному прикреплению к витронектину, скринируют серию клеточных линий меланомы (Mel) и клеточных линий карцином (Car), с помощью FACS (клеточный соотер с возбуждением флуоресценции) на предмет реакционной способности с 17Е6 Mab. FACS интенсивности представлены в таблице 2. Затем клеткам дают возможность присоединиться к субстратам, покрытым витронектином (0,5 мкг/мл покрытие) в присутствии гибридомной надосадочной жидкости от 17Е6 (открытые) или 14Е2 (заштрихованные). После промывки подсчитывают присоединившиеся клетки, как описано в разделе материалы и методы, полученные дан OG octyl-glucoside-(detergent) октил-глюкозид/детергент/ PID6 Mab PIH6 Mab P4C10 Mab P5H9 Mab PMSF Phenyl-methyl-sulphonyl-ftuoride фенилметил-сульфонил-фторид RGD Peptide: NH2-Arginine-Glycine-Aspartic acid: COOH Пептид: H2-аргинин-глицин-аспарагиновая кислота-СООН SDS-PAGE sodium-dodecyl-sulphate polyacrylmide gel electrophoresis Полиакриламидный гель с натрийдодецилсульфатом, электрофорез UCLAP-3 Cell line клеточная линия WM164 Cell line клеточная линия WM793 Cell line клеточная линия V+B2 Cell line клеточная линия Таблица 1 Антитела сравнивали в ELISA и клеточном ELISA. Реагенты и специфичности полностью обсуждаются в тексте. + обозначает положительную реакцию, – означает отсутствие реакции. Ключ: – Антитело: Антитела, охарактеризованные в этом исследовании (выделены жирным шрифтом), стандартные реагенты (римским шрифтом). Иммуноген: aVb5-иммобилизованный интегрин aVb3 плаценты человека. М21 = интактные клетки М21. Очищенные aVb3 и a11bb3 иммобилизованы на пластинах с 96 ячейками для ELISA-клеточные линии М21, М21-L и M21-L-11b и UCL AP3 были выращены и фиксированы на пластинах и тестированы на реактивность антитела в CELISA – Специфичность: (cм. текст) aV=aV -цепь интегринов млекопитающих. 200 КДа = неизвестный поверхностный протеин 200000 меланомных клеток. aVb5 = интегрин aVb5,. b1=b1 цепь интегрина. b3= b3 цепь интегрина. Таблица 2. Уровни реактивности по сравнению с контролем (только вторичное антитело) были оценены следующим образом: 1-2/-/, 2-4/+/, 4-9/++/, более 9/+++/. Так, например, на М21 относительная интенсивность флуоресценции контроля обычно составляет 30–50 единиц, а для LM142 связывание составляет 300–500 единиц, что дает среднюю относительную реактивность около 10 (400/40). /*/M21-L были сделаны проницаемыми за счет обработки 70% этанолом при -20оС. /D/M21-L содержит внутриклеточные пулы b3 цепи VNR интегрина. Таблица 3. M21 и M21-L клетки были собраны смесью трипсин/ЕДТА, инкубированы с антителом 17Е6 или контрольным антителом, промыты и инъектированыв хвостовую вену голой мыши. Спустя 7 недель животных умертвили и исследовали легкие на очаги поверхностной опухоли. Предварительная обработка 17Е6 уменьшает количество образовавшихся очагов. Аналогичное количество очагов развивается, если вводят M21-L клетки (без aV на поверхности клеток). * = сравнение с контролем не зависит от антитела. Рис.1 Анализ с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции альфа-V группы 10 40621 и строили график зависимости объема. Представлен типичный эксперимент. Прямоугольники ошибок демонстрируют среднеквадратичное отклонение для 8 животных в группе. По вертикальной оси отложен объем опухоли (мм3), по горизонтальной оси – количество дней после инъекции. С. Действие aV на М21 экспериментальные метастазы 0,32 х 106 /t, ¢/ или 1 х 106 /¯, q/ или М21 /t, ¯/ или М21L /¢, q/ клетки инъектировали в хвостовую вену голых мышей. В указанные моменты времени группы животных умерщвляли и исследовали легкие на предмет опухолевых узлов. Всех М21 мышей умертвили на 42 день. Для М21-L мышей по 3–6 мышей умерщвляли на каждую точку. Количество опухолевых узлов через 6 недель для М21 мышей было слишком велико для подсчета (много больше 250 на легкое), так что Тстатистические представлены в предположении, что М21-L группа дает ту же самую популяцию, что и для контрольной М21 группы на 42 день на уровне, менее 0,001 (**) или менее 0,02 (*). В тех случаях, когда обе группы (hi и lo) имеют одно и то же значение, представлена только одна группа. Прямоугольники показывают среднее количество опухолей на группу. По вертикальной оси отложено количество метастазов на легкое; по горизонтальной оси – дни после инъекции. Рис. 8 17Е6 не обладает цитотоксичностью. А. Действие 17Е6 на М21 клеточную пролиферацию. 5 х 104 М21 засевают в DMEM/FCS с носителем, /m/, или в присутствии 50 мкг/мл, 17Е6 /˜/ или 14Е2 /r/ антитела и число клеток подсчитывают ежедневно. Антитела не влияют на кинетику и увеличение плотности пролиферации. По вертикальной оси отложено количество клеток, по горизонтальной оси – число дней. В. 17Е6 – зависимый лизис М21 клеток микроглиальными клетками. Мечение тимидином М21 клетки смешали с BAL B/c – полученными микроглиальными мозговыми макрофагами, добавили сериально разбавленные антитела, и после инкубирования определяли выделение тимидина. Контроли: /r/ только М21 клетки, /t/ М21 + 17Е6 (100 нМ), /¯/ М21 + 14, 18 G2а: /p/ M21 + микроглия. Среднее + S. d. (н=6). Экспериментально: /˜/ M21 + микроглия + 17Е6; /q/ М21 + микроглия + 14, 18 G2a. 17Е6 не вызывает зависимого от антитела лизиса. Среднее ± S.d. (н=3). По вертикальной оси: цитотоксичность (%), по горизонтальной оси – концентрация антител (М). С. 17Е6 - зависимый цитостаз М21 клеток за счет микроглиальных клеток. Клетки М21 инкубируют с микроглиальными клетками и сериально разбавленными антителами, а затем обрабатывают [H3]-тимидином для оценки синтеза ДНК. Определяют включение тимидина ([H3]-thy). Символы как и в (В). Отмечается цитостатическая активность одних эффекторных клеток /p/. Наблюдение под микроскопом показывает, что в участках гомогенных микроглиальных клеток при 14, 18 G2a ³ 10-10 М нет выживших М21 клеток. По вертикальной оси: [H3]тимидина включение (имп. в минуту) х 10-3), по горизонтальной оси – концентрация антител (М). ные нормализуют по количеству присоединений в отсутствии антител. Отмечено, что за исключением В 16F10 (мышиная меланома), все клетки были человеческого происхождения. Malme 3 является фибробластной линией. Абсолютный процент клеток, присоединившихся в отсутствии антител был для М21 (70%), WM164 (68%), A375 (75%), EMM31 (67%), WM793 (65%), MalMe3 (67%), B16F10 (70%), UCLA-P3 (76%), NP-18 (65%), SW1116 (68%), HT29 (65%). По горизонтальной оси отложено количество присоединившихся клеток в % от контроля. Рисунок 4. 17Е6 нарушает адгезию, осуществляемую как aVb3 так и aVb5 интегринами. Очищенные моноклональные антитела (Mao) или мышиные асциты совместно инкубируют во время присоединения клеток к субстратам, покрытым витронектином (5 мг/мл-1). Клеточные линии (А, В) М21; (С, D/UCLAP-3; (E,F)WM793. Символы представляют следующие антитела (специфичности): /˜/ = 17E6 /aV/; /p/ = LM609 /aVb3/; /t/ = 14D9.F8 /aV/; /m/ = P4C10 /b1/; /q/ = P5H9 /aVb5/; /s/= P5H9 + LM609 (разбавление начинают при концентрации 10 мкг/мл) /aVb3+ aVb5/. По вертикальной оси отложено количество присоединившихся клеток (%). По горизонтальной оси: слева Mab (мкг/мл), справа: разбавление асцитов (1/x). Рисунок 5 17Е6 препятствует адгезии к витронектину, но не к другим компонентам матрикса. Действие 17Е6 /aV, ˜/ и Р4С10 /b1, m/ на присоединение клеток к витронектину (А), ламинину (В) или коллагену типа 1(С) было исследовано. Только на поверхностях, покрытых VN, 17Е6 блокирует прикрепление клеток. Только на коллагене типа I и ламинине Р4С10 блокирует клеточное присоединение. По горизонтальной оси отложено Р4С10 разбавление (1/x) (верхняя ось) и Mab (мкг/мл) (нижняя ось); вертикальные оси: % связанных клеток. Рисунок 6 17Е6 нарушает установившиеся контакты клетка-витронектин. Клеткам М21 меланомы дают возможность присоединяться в течение 24 часов к поверхностям, покрытым витронектином (VN-верхний ряд) или фибронектином (FN-нижний ряд). Клетки присоединяются в течение 30 минут, хорошо распределяются и пролиферируют в течение 24 часов (а,е), если 17Е6 добавлено к культуральной среде (b,f). После 30 минут на витронектине (b) клетки округляются, тогда как на фибронектине (f) они остаются раскрытыми. LM609 (c, g), и 14Е2 (d, h) оказывают мало влияния на любом субстрате. Концентрацию антител: (b): 0,1 мкг/мл/c, d, f – h): 100 мкг/мл. Рис. 7 Развитие М21 меланомы человека у BAL B/c голых мышей осуществляется за счет aV-интегринов. А.В. Влияние 17Е6 на подкожное развитие М21. 0,5 х 106 М21 (А) или М21-L (B) инкубировали с буфером /m/ 17Е6 /˜/ или 14Е2 /r/ антителами и подкожно инъектировали голым мышам. С течением времени измеряли размеры опухоли 11 40621 Рис. 9 17Е6 не влияет на синтез ДНК клетками М21. Культивируют клеточные линии (А) М21, (В) М21-L, (C) M21-14, (D) M21-L GpIIb, и добавляют указанные концентрации буфера /m/, для антител 17Е6 /˜/, L M609 или /p/ 14Е2 /r/. Для (В) и (D) показан рутинный позитивный контроль, таксол /¯/. Через 48 часов клетки обрабатывают [H3]-тимидином и определяют включенные радиоактивные метки. Антитела не влияют на синтез ДНК. Таксол полностью его подавляет (сравн. рис.8): 90 мкг/мл Mab = 600 нМ. По вертикальной оси: [H3]-тимидина включение (имп. в минуту х 10-3), по горизонтальной оси – концентрация Mab (мкг/мл). Рис. 10 ELISA 17E6 фрагментов на очищенных aVb3. Интактные 17Е6 /r/ их F/ab'/2 /m/ или F/ab'/ /q/ фрагменты в указанных концентрациях связываются на пластинах, покрытых aVb3 в концентрации 1 мг/мл, и определяют связанные антитела. По вертикальной оси: оптическая плотность (OD) на 450 нМ, по горизонтальной оси – (log10 мкг/мл). Рис. 11 Присоединение клеток за счет aVb1 и aVb5, но не за счет aVb3 блокируется 17Е6 F/ab'/. Клеткам, как указано, предоставляется возможность прикрепляться к покрытию витронектина в концентрации 5 мг/мл в присутствии указанных концентраций 17Е6, его F/ab'/2 или F/ab'/ фрагментов. 100% присоединение варьируется от примерно 85% WM164 (до примерно 50% (V + B2) от полного количества добавленных клеток. По вертикальной оси: % максимального присоединения клеток, по горизонтальной оси – концентрация антител (мкг/мл). Рис. 12 Присоединение М21 к витронектину блокируется перекрестным связыванием 17Е6 F/ab'/. Во время присоединения клеток М21 к витронектину (как на рис. 4,11) 17Е6 F/ab'/ фрагменты или интактные АР3 антитела в концентрациях 0/m/, 0,1/s/, 1,0/q/ или 10 мкг/мл /r/ совместно инкубируют с указанными концентрациями сшивающих анти-мышиных антител второго слоя. Кросо-линкер демонстрирует идентичное с ELISA сродство к 17Е6 F/ab'/ и АР3 (не показано). По вертикальной оси: оптическая плотность (OD) на 405 нм, по горизонтальной оси: концентрация козьих-антимышиных антител (мкг/мл). Рис. 13 Имитация активных сайтов лигандов и витронектин конкурируют друг с другом за связанные с aVb3 в прямом конкурентном анализе. Возрастающие концентрации витронектина /s/ или пептидов GRGDSPK /m, ˜/ или с RGDfV /t, ¯/ совместно инкубируют с биотинилированным витронектином (1 мкг/мл = 1,5 нМ) или биотинилированным cRGDfV производным (cRGDfK-био: 50 нМ) на пластинах, закрытых aVb3. Связанный биотин определяют за счет антибиотинового антитела. Рисунок предполагает, что среднее Мр одновалентного многомерного витронектина 0,65 МДа. По вертикальной оси: % связанного лиганда, по горизонтальной оси: пептид (VN/log/(мкМ). Рис. 14 17Е6 не конкурирует с витронектином за связывание с aVb3 в прямом конкурентном анализе. Возрастающие концентрации 17Е6 /˜/, другие ан ти-aVb3 антитела /q,¯, s, r/ или лиганды, имитирующие сRGDfV /t/ совместно инкубируют с биотинилированным витронектином (1 мкг/мл) на пластинах, покрытых aVb3. Связанный бистин определяют с помощью антибистинового антитела (см. график насыщения в тех же условиях покрытия для 17Е6: рис.10). По вертикальной оси: % связанных VN; по горизонтальной оси (Mao) мкг/мл – сRGD мкМ. Рисунок 15 Лиганды и имитаторы активных сайтов не конкурируют с антителами за связывание с aVb3 в конкурентных анализах с предварительным блокированием. Возрастающие концентрации витронектина /VN, m/ фибриногена /FG, s/ фибронектина /FN, q/ cRGDfV /66203, p/ или указанных антител /t/ предварительно инкубируют в течение 1 часа на пластинах, покрытых aVb3, а затем зондируют, добавляя (без промывки) биотинилированное антитело (1 мкг/мл), как показано. Определяют связанный биотин. Величина связывания антител на 100% указывает, что связывание антитела в присутствии концентрации представленных контрольных заражений такое же, что и для контроля без конкурента. Лиганды не влияют на связывание антител. По горизонтальной оси (левая и правая сторона): концентрация лиганда (мкг/мл). Рисунок 16 Антитела конкурируют друг с другом за связывание с aVb3 в конкурентном анализе с предварительным блокированием. Возрастающие концентрации антител 17Е6 /˜/, LM609 /s/, AP3 /q/ или 14D9.F8 /r/ в указанных концентрациях, предварительно инкубируют в течение 1 часа на покрытых aVb3 пластинах, а затем зондируют, добавляя (без промывки) биотинилированное антитело (1 мкг/мл), как показано на каждом рисунке. Определяют связанный биотин. Величина 100% связанного антитела указывает, что связывание антитела в присутствии указанных концентраций контрольных заражений оказывается таким же, что и в случае контроля без конкурента. Антитела конкурируют друг с другом в перекрестно конкур. По вертикальной оси: % связи зонд-антитело; по горизонтальной оси (левая и правая сторона): концентрация антител (мкг/мл). Рисунки 17 a, b. кДНК последовательность вариабельных (FV) участков Mab 17Е6. Легкая цепь: VL17E6 тяжелая цепь (а) и тяжелая цепь VH17E6 (b). Полная нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность вариабельных участков (включая лидерную последовательность) представлены. Лидерные последовательности показаны жирным шрифтом. CDR последовательности – латинским шрифтом. Тяжелая цепь имеет характеристическую структурную группу llB, а легкая цепь имеет структуру каппа группы V, в соответствии с классификацией Kabat. Рисунок 18. Схематическое представление процесса клонирования. мРНК, кодирующая FV домены тяжелой и легкой цепей 17Е6 антитела, были экстрагированы из 17Е6 гибридомных клеток, транскрибированы в кДНК, и PCR была использована для амплификации вариабельных участков. Эти участки были клонированы и секвенированы. 12 40621 REFERENCES ССЫЛКИ: Albelda, S.M., et al. (1990), Cancer Res. 50, 6757– 6764. Bhattacharya, S. et al., (1995) J. Biol. Chem. 270: 16781–16787 Brooks P.C. et al. (1994), Science 264, 569–571. Buck, C., et al., (1990), Cell Differ. Dev. 32, 189–202. Busk M. et al. (1992), J. Biol. Chem. 267, 5790–5796. Carter, W.G. et al. (1990), J. Cell Biol. 110, 1387– 1404. Chan, D.M. and Hemler, M.E. (1993), J. Cell Biol, 120, 537–543. Charo I.F. et al. (1990), J. Cell Biol. 111, 2795–2800. Cheng, Y.F. et al. (1991), Exp. Cell Res. 194, 69–77. Cheresh, D.A. et al. (1987), J. Cell Biol. 105, 1163– 1173. Cheresh, D.A. et al. (1989), Cell 57, 59–69. Cheresh, D.A. et al. (1991), Cancer Metastasis Rev. 10, 3–10. Cheresh, D.A. and Harper, J.R. (1987), J. Biol. Chem. 262, 1434. Cheresh, D.A. and Spiro, R.C. (1987), J. Biol. Chem. 262, 17703. Cherny R.C. et al. 1993, J. Biol. Chem. 268, 9725– 9729. Chirgwin, J.M. et al. (1979), Biochemistry 18, 5294– 5299. Chuntharapai, A. et al. (1993), Exp. Cell Res. 205, 345–352. Danen, E.H. et al. (1993), Int. J. Cancer 54, 315–321. de Boer, H.C. et. al. (1993), J. Biol. Chem. 268, 1279–1283. Delwel, G.O. et al. (1993), J. Biol. Chem. 268, 25865– 15875. Denhardt, D.T. and Guo, X. (1993), Faseb J. 7, 1475– 1482. Diamond, M.S. and Springer, T.A. (1994), Current Biology 4, 506 Dougall, W.C. 1994, Oncogene, 9: 2109–23 Etoh, T. et al. (1992), J. Dermatol. 19, 841–846. Felding-Habermann, В. et al. (1992), J. Clin. Invest. 89, 2018–2022. Fidler, I.J. (1986), Cancer Metastasis Rev. 5, 29–49. Fidler, I.J. (1988), Isr. Med. Sci. 24, 456–463. Furihata, K. et al. (1987), J. Clin. Invest. 80, 1624– 1630. Gehlsen, K.R. et al. (1992), Clin. Exp. Metastasis 10, 111–120. Goodman, S.L. et al. (1991), J. Cell Biol. 113, 931– 941. Gussow, D. and Clackson, T. (1989), Nucleic. Acids. Res. 17, 4000 Haba, S. et al. (1985), J. Immunol. 134, 3291–3297. Hall, D.E. et al (1990), J. Cell Biol. 110, 2175–2184. Hardan, I. et al. (1993), Int. J. Cancer 55, 1023–1028. Harel, W. et al. (1990), Cancer Res. 50, 6311–6315. Harlow, E. and Lane, D. (1988). Antibodies – a laboratory Manual (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory). Hart, I.R. et al Birch (1991), Cancer Metastasis Rev. 10, 115–128. Herlyn, D. et. al. (1985), Cell Immunol, 92, 105–114. Herlyn, D. et al. (1990), Cancer Res. 50, 2296–2302. Humphries, M.J. et al. (1986), Science 233, 467–470. Humphries, M.J. et al. (1988), J. Clin. Invest. 81, 782– 790. Hynes, R.O. (1992), Cell 69, 11–25. Jones, S.T. and Bendig, M.M. (1991), Biotechnology 9, 88–89. Kabat, E.A. et al. (1987), US dept. health and human services, US gouvernment Printing offices). Kazal, L.A. et al. (1963), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 989–994. Kieffer, N. et al. (1991), J. Cell Biol. 113, 451–461. Korhonen, M. et al. (1991), Lab. Invest, 65, 347–356. Landegren, U. (1984), J. Immunol. Methods 67, 379– 388. Lehmann, M. et al. (1994). Cancer Research 54, 2102–2107. Lessey, B.A. et al. (1992), J. Clin. Invest, 90, 188– 195. Liotta, L.A. et al. (1991), Cell 64, 327–336. Marshall, J.F. et al. (1991), Int. J. Cancer 49, 924– 931. Melvaer, K.L. and Fystro, D. (1982), Appl. Environ. Microbiol. 43, 493–494. Mosmann, T. (1983), Methods 65, 55–63. Moyle, M. et al. (1991), J. Biol. Chem. 266, 19650– 19658. Mujoo, K. et al. (1989), Cancer Res. 49, 2857–2861. Natali, P.G. et al. (1993), Int. J. Cancer 54, 68–72. Neff, N.T. et al. (1982), J. Cell Biol. 95, 654–666. Nesbitt, S. et al. (1993), J. Biol. Chem. 268, 16737– 16745. Orlando, R.A. and Cheresh, D.A. (1991), J. Biol. Chem. 266, 19543. Panetti, T.S. and McKeown Longo, P.J. (1993a), J. Biol. Chem. 268, 11988–11993. Panetti, T.S. and McKeown Longo, P.J. (1993b), J. Biol. Chem. 268, 11492–11495. Pаulsson, M. et al. (1987), Eur.J. Biochem. 166, 11– 19. Pignatelli, M. et al. (1992), Hum. Pathol. 23, 1159– 1166. Poste, G. et al. (1980), Cancer Res. 40, 1636–1644. Preissner, K.T. (1991), Annu. Rev. Cell Biol. 7, 275– 310. Pytela, R. et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5766–5770. Pytela, R. et al. (1986), Science 231, 1559–1562. Rodeck, U. et al. (1985), J. Immunology 134, 1300– 1304. Ruoslahti, E. et al. (1982), Methods Enzymol. 82 Pt A, 803–831. Ruoslahti, E. (1991), J. Clin. Invest. 87). Sambrook, J. et al. (1989), Molecular Cloning, a laboratоry manual (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Sanders, L.C. et al. (1992), Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 57, 233–240. Sanger, F. et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463. Seftor, R.E. et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1557. Si, Z. and Hersey, P. (1994), Pathology, 26, 6–15. Smith, J.W.et al. (1990), J. Biol. Chem. 265, 11008– 11013. Smith, J.W. and Cheresh, D.A. (1988), J. Biol. Chem. 263, 18726. Smith, J.W. and Cheresh, D.A. (1990), J. Biol. Chem. 265, 2168. Sonnenberg, A. et al. (1987), J. Biol. Chem, 262, 10376–10383. 13 40621 (рис. 2). В FACS анализах (рис.1) линия, экспрессирующая aV(M21), интенсивно реагирует с 17Е6, 14D9, F8, 20A9, 23G5 и с aV-определяющими антителами LM142 и LM609, умеренно с 10G2 и также с контрольными Mab 14Е2 и 21Н6 и с Mab 9.2.27. Напротив, aV-дефицитный вариант (М21L) слабо реагирует с альфа-V-группой и с LM142 и L M609, но демонстрируют такую же реакционную способность, что и M21 и с 14Е2, 21Н6 и 9.2.27. М21-L имеет внутриклеточный пул b3 субфрагментов, которые детектируются в FACS только, если клетки предварительно обработаны для того, чтобы они были проницаемы (таблица 2). В FACS анализах М21-L4/ aV-ретрансфектированные клетки М21L (Folding-habermana et al. 1992), альфа-V-группа реагирует также, как на М21. Контрольные векторные трансфектанты, М21-L12 и Gp11b трансфектанты, М21-L-11b (Kiеffer et al., 1991), не демонстрирует взаимодействие с альфаV-группой (таблица 1). UCL AP3-аденокарцинома реагирует с альфа-V-группой, с LМ142 и Р5Н9, но не с L М609. UCL AP3 не экспрессирует b3 (см. введение). Меланомные W M793 реагируют также, как и М21. В скринировании с иммуноосаждением клеток М21 альфа-V-группа иммуноосаждается также, как и L М142 (анти-aV), и L М609 (антиaVb3) (рис. 23). Сильная широкая полоса наблюдается при примерно 92 кДа, и слабая полоса примерно при 145 кДа, со слабыми сопровождающими полосами примерно у 100 кДа, ситуация, характерная для поверхностно меченых aVb3 и aVb5 интегринов (Wayner et al., 1991). Если сравнивать с характером осаждения на М21-1, ни одна из альфа-V-групп не осаждается (данные для 17Е6 и 20А9 представлены), не осаждаются также L M142 или L М609 (рис. 2с). b1-специфические антитела дают аналогичный характер осаждения для обеих клеточных линий. В М21-L, осаждение анти-b3 антителами дает полосу примерно на 92 кДа, за счет внутриклеточных b3-меченых в проницаемых (возможно, некротических) клетках. UCL AP3 (рис. 2о) не осаждается за счет L М609, но примерно 95 кДа/154 кДа комплекс осаждается как альфа-V-группой, так и L М142 (рис. 2d). В итоге, ELISA, CELISA, FACS анализы и иммуноосаждения, а также характер реакций позволяет с высокой степенью вероятности предположить, что Mab альфа-V-групп реагируют с внеклеточными доменами aV-интегриновых цепей человека. Mab 17Е6 является антителом, эффективно блокирующим функции. 17Е6 может модифицировать исходное присоединение клеток к aV-лигандам: aV-интегрины могут функционировать как рецепторы для витронектина, так что альфа-Vгруппа была скринирована по способности влиять на клеточное присоединение к витронектиновым субстратам. После FACS анализа интегрина клетки тестируют в анализах присоединения (табл. 2, рис. 3) в FACS, клеточные линии меланомы и карциномы человека реагируют одинаково с альфаV-группой. Реакция с 17Е6 представлена на рис.3. Начальное присоединение к витронектину клеток, реагирующих в FACS с 17Е6, существенно блокируется этим антителом, но лишь слабо подвержено воздействию контрольным антителом 14Е2 Sonnenberg, A. et al. (1988), Nature (London) 336, 487–489. Sonnenberg, A. et al. (1993), Curr. Top. Microbiol. Immunol, 184, 7–35. Stetler Stevenson, W.G. et al. (1993), Annu. Rev. Cell Biol. 9, 541. Stockmann, A. et al. 1993, J. Biol. Chem. 268: 22874–82. Sutter, A. et al. (1991), Pathobiology 59, 254–258. Takada, Y. et al. (1987), J. Cell. Biochem. 37, 385– 393. Tao, M.H. and Morrison, S.L. (1989), J. Immunol, 143, 2595–2601. Towbin, H. et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350–4354. Turner, D.C. et al. (1989), J. Neurosci. 9, 3287–3296. Wayner, E.A. et al. (1991), J. Cell Biol. 113, 919–929. Wayner, E.A. and Carter, W.G. (1987), J. Cell Biol. 105, 1873–1884. Wickham, T.J. et al. (1993), Cell 73, 309–319. Yatohgo, T. et al. (1988), Cell Struct. Funct. 13, 281– 292. Yoshinaga, I.G. et al. (1993), Melanoma. Res. 3, 435–441. Zambruno, G. et al. (1993), J. Cell Sci. 105, 179–190. Zhang, Z. et al. (1993), J. Cell Biol. 122, 235–242. Подробное описание изобретения Моноклональные антитела аaV-группы реагируют с aV-цепью интегрина. Антитела, скринированные с помощью ELISA на очищенных aVb3 и aVb3, демонстрируют пять клонов, 17Е6, 20А9, 14D9, F8, 10G2, которые специфически реагируют с 11вb3 (таблица 1). Эти Mab называют "альфа-V-группой". Все были IgGI изотипа. В том же ELISA анализе анти-интегриновые антитела известной специфичности против aVb3 комплекса (LM609), aV-цепей (LM142), aVb5 комплекса (Р5Н6), a11вb3 комплекса (CF8), b цепей (АР3) и b1 цепей (Р4С10), реагируют, как и предсказано в литературе (таблица 1). В ELISA на фиксированных клетках ("CELISA") с клетками, экспрессирующими aVb3 и aVb5 (М21), aVb5, но не aVb3 (UCL AP3), ни aVb3, ни aVb5(M21-L) и a11bb3(M21-L-11b), альфа-Vгруппа демонстрирует ход реакции, соответствующий их распознаванию цепи aV-интегрина, и заметно отличается от реакции с b3, b5, b1 или другими a-цепями (таблица 1). Эти результаты соответствуют данным с очищенными рецепторами. Mab co специфичностями к b3 и Gp11b также были получены при скринировании (данные не представлены), и они реагируют совершенно отличным способом от альфа-V-группы. 17Е6,14D9, F8, 20A9 и 23G5 связываются с aVb3 с аналогичной кажущейся афинностью, 50% связывания достигается при примерно 10–20 нг/мл (примерно 50–100 рМаналогично L M609). 10G2 связывается аналогично с L M142 c, по крайней мере, афинностью в 10 раз ниже). CF8, против a11bb3 и 14Е2 (см. далее), демонстрирует минимальное связывание с aVb3 при концентрациях вплоть до 100 нМ. Способность альфа-V-группы распознавать нативные aV-интегрины была тестирована с помощью FACS (Рис. 1, табл. 2) и с помощью иммуноосаждения с поверхностных меченых клеток 14 40621 диненные за счет aV) аналогично подвержены влиянию 17Е6 на поверхности витронектина, но не поверхности фибронектина, коллагена или ламинина. 17Е6 блокирует развитие опухоли М21 у голых мышей. В настоящем изобретении исследуется действие aV-блокирующих антител 17Е6 на подкожное развитие опухолей М21 у BAL B/c nu/nu мышей (рис. 7). Для моделей на животных, развитие М21 опухолей у голых мышей коррелирует с экспрессией на клеточной поверхности aV-серий интегринов (см. вступление). Подкожно вводят клетки М21 совместно с несодержащими эндотоксин антителами. 17Е6 устойчиво (4/4 эксперимента) блокируют подкожное развитие опухолей М21 (рис. 7а). Ни одной опухоли (0/32) не образовалось в присутствии 17Е6, и у животных даже теперь, по прошествии 6 месяцев нет опухолей. Образование опухолей у контрольных животных оценивается в 75–90% случаев. Неблокирующие антитета против самой aV-цепи и контрольные антитела против поверхности клеток меланомы демонстрируют переменный и неустойчивый эффект на развитие опухоли. У контрольных животных, обработанных 14Е2, процент образования опухолей снижается в зависимости от эксперимента до 30–60%, но оставшиеся опухоли растут так же, как и у необработанных контрольных животных, и, подобно контрольным, у этих животных обнаружены легочные микро-метастазы при исследовании легких в тканевой культуре. (Данные не представлены). Напротив, у животных, обработанных 17Е6 и умерщвленных спустя 6 месяцев, не обнаружены ни подкожные опухоли, ни метастазы в легких, печени, почках, селезенке, ободочной кишке, желудке и в брюшной полости. aVb3-дефицитная линия М21-L подкожно развивается более медленно, нежели М21, и на нее не действует 17Е6. Контрольные М21-L, обработанные 14Е2, отмечают уменьшение по сравнению с необработанными животными, аналогично тому, что наблюдается для М21 клеток (рис. 7b). Рост М21 и М21-L и действие антитела 17Е6 сравнивали в "экспериментальных метастазах" в модели инъекций в хвостовую вену. М21 образует множество колоний в дозо-зависимой манере, тогда как М21-L образует значительно меньшее количество колоний, но образует легочные узлы при введении в более высоких дозах (рис. 7с). Другими словами, рост опухоли в легких также усиливается за счет присутствия aV-интегринов клеточной поверхности и предварительное инкубирование М21 с 17Е6 снижает (на 90%) количество опухолевых колоний, которые образуются. Интересно, что уровень образования опухолей аналогичен уровню, достигаемому для М21-L клеток в том же эксперименте. Антитело не изменяет число животных, у которых образуется опухоль (табл. 3). Итак, присутствие aV на поверхности клеток промотирует образование М21 опухоли как в подкожных экспериментах, так и в модели экспериментальных метастазов, а aV-блокирующие и разрушающее антитело 17Е6 интенсивно подавляет рост М21. В модели экспериментальных метастазов с М21 клетками интенсивный рост М21 и слабый рост М21-L близко соответствует характе (рис. 3). Другие члены альфа-V-группы были менее эффективны (данные не представлены). На интенсивное присоединение мышиных клеток В16F10 на витронектин не влияет 17Е6 и В16F10 не взаимодействует с 17Е6 в FACS. Как было предсказано (Сheresh and Harper, 1987), присоединение В16F10 к витронектину оказывается чувствительным к микромолярным концентрациям RGD-пептидов, что предполагает наличие функциональной поверхности aVb3/SLG and B. Deifenbach). Так, 17Е6 и альфа-V-группа реагируют с человеческими, но не с мышиными aV. Было исследовано влияние 17Е6 на присоединение клеток. 17Е6 блокирует присоединение М21 (примерно 85%) к викронектину с IС50 примерно 0,1 мкг/мл (рис. 4а). Настоящее изобретение подтверждает предыдущие исследования (Wayner et al., 1991), показывая, что присоединение М21 слабо блокируется одними только антителами к aVb3/L M609) или aVb5(Р5Н9), но сильно блокируется, если они добавлены вместе (рис. 4а, b). Анти- b1 интегриновые антитела (Р4С10) не оказывают влияния на присоединение М21 к витронектину (рис. 4). Линии UCL AP3 и L M793 присоединены к витронектину, и это присоединение блокируется 17Е6, а также комплементарными aVb5 специфическими (Р5Н9) UCL AP3 (или aVb3-специфическими антителами (L М609/W M 793) (рис. 4с-f). На aVb5 (UCL AP3) 17Е6 имеет IC50 (ингибирующая концентрация ИК50) порядка 30 нг/мл. На L М 793 это значение составляет примерно 60 нг/мл, а для L М 609 IC50 составляет примерно 600 нг/мл. UCL AP3 экспрессируeт aVb5, но не aVb3/Wayner et al., 1991), тогда как W M793 экспрессирует высокие уровни aVb3 (табл. 1). Блокирующая специфичность 17Е6 подтверждается отсутствием его влияния на присоединение клеток к другим матриксным субстратам (рис. 5). Р4С10 (анти-b1) прекращает присоединение М21 к ламинину и коллагену. Адгезия клеток к этим двум субстратам может осуществляться за счет b1-серий интегринов (Sonnenberg et al. 1988, Takada et al., 1987). Наряду с биохимическими результатами эти результаты соответствуют теории, что 17Е6 связывает aV цепь различных комплексов интегринов и нарушает их взаимодействие с их лигандами. 17Е6: нарушает установившееся взаимодействие клетка-матрикс, осуществляемое за счет aV-интегринов. После этого исследовали, влияет ли 17Е6 на установившееся взаимодействие клетка-матрикс. Если 17Е6 в малых концентрациях (примерно 0,1 мкг/мл) добавляют к М21 клеткам, они вызывают интенсивное округление клеток через 0,5– 1 час при 37оС в М21 культурах даже через 24 часа присоединения (рис. 6). Этот эффект полностью обратим и после смыва клетки возвращаются в свое расправленное состояние в течение 48 часов. Напротив, антитела L М609 и 14Е2 влияют на морфологию лишь слегка, даже в высоких концентрациях (100 мкг/мл). Антитела не оказывают морфологического действия даже в концентрациях 100 мкг/мл на субстраты, покрытые фибронектином (рис. 6). М21-L (и другие клетки, присое 15 40621 ру роста подкожных опухолей, и рост М21 также подавляется за счет предварительной обработки 17Е6. Эти данные усиливают предположение о связи между aV-интегринами и развитием меланомы у человека. Действие 17Е6 не связано с цитотоксичностью. После наблюдения потенциального воздействия 17Е6 на присоединение, морфологию и развитие опухоли были предприняты попытки выяснения механизма его действия. 17Е6 тестировали на цитотоксичность (рис.8). На кинетику роста клеток и окончательно достигнутые плотности насыщения присутствие 17Е6 или контрольного антитела влияет незначительно (рис. 8а). Голые мыши являются иммунодефицитными. Из небольшого числа оставшихся иммунокомпетентных клеток макрофаги, по-видимому, наиболее вероятно управляют цитотоксичностью, реакцией за счет антител. Для проверки возможности предположения, что антитела управляют цитотоксичностью клеток (ADCC), мышинные макрофаги, сингенные с антителами, были тестированы в ADCC против М21 клеток. В качестве эффекторных клеток макрофаги мышиного мозга (микроглия) являются наиболее эффективными медиаторами ADCC (Sutter et al., 1991). Позитивный контроль, Mab 14, 18 G2a вызывает почти полный лизис М21 при концентрации менее 10-9 М, тогда как 17Е6 при концентрации вплоть до 10-7 М не является родственником ADCC (рис. 8о). Для того, чтобы оценить, могут ли 17Е6 проявлять цитотоксическую активность в присутствии эффекторных клеток, ДНК синтез М21 микроглиальных сокультур определяют в присутствии антител (рис. 8с). Для 10-10 М 14, 18 G2a вызывает большее или равное 90% ингибирование в [3H]-тимидиновом включении. Протестировав влияние на клеточную пролиферацию, ADCC и АЕСМ, исследовали, влияет ли Mao на уровни синтеза ДНК в М21 клетках. 17Е6, 14Е2 и L М609 при 0,5 мкМ не влияет на включение тимидина (рис. 9). ДНК-синтез М21-L, М21-L4 и М21-L-11b клетках также не подвержен влиянию антител. М21-L и М21-L-11b не реагируют ни с 17Е6, ни с L М609, но реагируют с 14Е2 (рис. 1). Многие другие меланомные клеточные линии также были тестированы, и было показано, что их ДНК-синтез, очевидно, не подвержен воздействию альфа-V-группы (данные не представлены). 17Е6 и 14Е2 являются IgGI изотипами, и не влияют на осуществляемый за счет комплемента лизис на М21 клетках (не представлен). Можно придти к заключению, что действие 17Е6 является специфичным по отношению к aV-интегринам и не оказывает сильного токсического действия на другие клеточные системы. Действие 17Е6 на клеточные aVb3, но не на aVb1 или aVb5 требует рецепторного перекрестного связывания. Во многих биологических системах трансмембранные сигналы инициируются за счет димеризации рецепторов. Действительно, мультимеризация aVb3 изменяет характер взаимодействия с фосфотирозином в HUVEC (Bhattacharya et al., 1995). Поэтому было проведено исследование возможности вовлечения рецепторной агрегации в процесс действия 17Е6. 17Е6 ингибирует клеточные интегрины aVb3, aVb5 aVb1 (рис. 4). Интактный 17Е6 и его F/ab'/2 и F/ab'/ фрагменты имеют аналогичные характеристики связывания в ELISA на изолированных aVb3 (рис. 10), причем 50% насыщение достигается при примерно 1 нг/мл (примерно 7 рН интактных Mab). Аналогичные ELISA кривые титрования предполагают одновалентное взаимодействие между 17Е6 и пластинами. Но в анализах на присоединение клеток фрагменты ведут себя по-разному, F/ab'/2 и интактные 17Е6 блокируют присоединение клеток за счет aVb1(V + B2 клетки) и aVb5(UCL AP3 клетки) (IC50 примерно 0,1 мкг/мл: примерно 700 рМ), и aVb3 присоединение (W M164 и M21 клетки) (IC50 примерно 0,5 мг/мл: примерно 3 нМ), и F/ab'/ фрагмент оказывается столь же активным, как и димерные антитела на aVb1 и aVb5 (рис. 11). Однако, F/ab'/ фрагмент, по крайней мере, в 104 раз активнее как на aVb1, так и на aVb5, нежели на aVb3, где он блокирует только 25+10% при самых высоких из тестированных концентрациях (50 мкг/мл: IC50 много больше 50 мкг/мл: много больше 400 нМ) – при таких уровнях не относящиеся к делу антитела также обеспечивают аналогичную степень блокирования (данные не представлены), что дает возможность предположить, что этот маргинальный эффект не является специфическим. Отсутствие биологической активности фрагмента F/ab'/ антитела, который способен связываться (как 17Е6/ab'/ : (рис.10) является классическим показателем того, что димеризация необходима для осуществления функций за счет антитела. Для подтверждения того, что перекрестная сшивка действительно необходима для 17Е6 действия на aVb3, 17Е6 F/ab'/ подвергают перекрестной сшивке во время анализа клеточного присоединения за счет добавления поликлонального анти-F/ab'/ антитела. Наблюдается классический прозоноподобный эффект, где при критических концентрациях как первичных, так и вторичных антител, и только тогда, наблюдается сильное ингибирование присоединения клеток. Высокие количества одного только антитела вторичного слоя или одного F/ab'/ не влияют на клеточную адгезию. Более того, этот эффект не является неспецифическим результатом перекрестного связывания aVb3 интегринов: перекрестное связывание aVb3 связывающим, но не ингибирующим антителом АР3 не оказывает влияния на присоединение клеток (рис.12). Концентрации F/ab'/ активны после добавления вторичного антитела в экспериментах по перекрестному связыванию и находятся в соответствии с IC50 интактных 17Е6 при осуществляемых за счет aVb3 присоединениях (см. рис. 11). Взятые вместе эти данные показывают, что перекрестное связывание aVb3 интегрина необходимо для предотвращения присоединения М164 и М21 к родственным лигандам, тогда как aVb5 и aVb1 не требуют перекрестного связывания для их инактивации. 17Е6 является слабым блокатором рецепторных функций в анализе изолированных рецепторов. 16 40621 Необычный характер функций 17Е6 на aVb3 был подробно исследован в анализах на выделенных рецепторах. Контраст между классическими ингибиторами активных сайтов и 17Е6 хорошо заметен. Связывание витронектина с aVb3 насыщается при ~ 5 мкг/мл/~10 нМ; в предположении, что средний размер витронектинового мультимера составляет 10 мономеров) (рис. 13), и это связывание специфически конкурирует как с классическими линейными пептидами, имитирующими лиганды (GRGDS PK: IC50 ~ 2 мкМ), так и циклическими пептидами (сRGDfV: IC50 ~ 5 нМ). Используя меченый биотином вариант сRGDfV, cRGDfKбиотин, можно продемонстрировать непосредственно, что не только ингибиторы конкурируют за связывание с витронектином, но и витронектин конкурирует за связывание с ингибитором (рис.13), т.е. система симметрична. Действительно, витронектин, GRGDS PK и cRGDfV каждый конкурирует друг с другом и делает это как "рационально", так и "симметрично" в том смысле, что IC50 для конкуренции отражает IC50 для ингибирования связывания витронектина с aVb3 комплексом (рис. 13). 17Е6 связывание насыщает aVb3 при 0.01– 0,1 мкг/мл/700–70 рМ) (см. рис. 10). Однако, антитело является лишь слабым ингибитором лигандного связывания. Даже при концентрации антител 70 нМ они дают менее чем 30 (+10%) ингибирования связывания витронектина. Поведение L М609 аналогично, тогда как aVb3-связывающие неингибирующие антитела (14D9, F8, 20A9 и WAM2-4) оказываются неэффективными. Имитирующий лиганд циклический пептид сRGDfV, эффективно ингибирует взаимодействие рецептор-лиганд (IC50 ~ 10 нМ) (рис. 14), но не влияет на 17Е6 связывание. При этом не ингибируется ни интактное ни одновалентное 17Е6 (данные не представлены). 17Е6 связывает aVb3 в присутствии насыщающих количеств конкурирующих лигандов. Слабая конкуренция 17Е6 за лиганд в анализе с выделенными рецепторами и доступность таких сильно конкурирующих ингибиторов, как сRGDfV, выдвигает вопрос о том, каким образом 17Е6 влияет на aV-функцию. Ингибирующая активность 17Е6 и его фрагментов в анализах клеточного присоединения для aVb3 интегрина требует перекрестного связывания, поведение, которое не полностью совместимо с ингибированием за счет конкуренции. Далее было исследовано, мешают ли лиганды aVb3 непосредственно связыванию 17Е6. Лиганды были предварительно связаны с рецептором и были добавлены низкие концентрации непосредственно меченых 17Е6 (рис. 15). На связывание 17Е6 не влияют (менее 10% ингибирования) высокие концентрации витронектина, фибронектина, или фибриногена (все природные лиганды aVb3) Cheresh and Spiro, 1987) в 100-кратном избытке по сравнению с концентрациями, необходимыми для насыщения специфических связывающих сайтов на aVb3. Напротив, предварительно связанные 17Е6 сильно конкурируют за связывание с добавляемыми затем мечеными 17Е6 (рис. 15, 16), и нативные лиганды aVb3 также существенно конкурируют друг с другом (дан ные не представлены). Это фальсифицирует наше предположение, что 17Е6 конкурирует с витронектином за aVb3 активные сайты. Более того, сильные конкуренты активных сайтов, подобно циклическими пептидам сRGDfV при 200 мкМ также не оказывают действия на 17Е6 связывание, хотя и ингибируют связывание витронектина с aVb3 при IC50 равной 2 нМ (рис.13). Данные ELISA (рис. 10) показывают, что 17Е6-aVb3 взаимодействия являются одновалентными, что снижает возможность того, что наблюдается конкурирующий артефакт за счет очень высокого сродства антитела наряду с низким сродством лиганда. Однако, были помечены и использованы другие aV- и b3-специфические антитела для стимуляции предварительно связанного лиганда (рис. 15), включая сами антитела (рис. 16). Антитела успешно конкурируют друг с другом и отчетливо попадают в группы перекрестной конкуренции (рис. 16). b3-специфическое антитело АР3 конкурирует с его собственным связыванием, но не влияет на связывание и на него не влияют антитела, специфичные либо к aVb3 комплексу (L М609), либо одной только aV-цепи (17Е6, 14D9, F8); L M609, 17Е6 и 14D9, F8 все сильно перекрестно конкурируют. Напротив, предварительно связанные лиганды не влияют на 17Е6 связывание с aVb3. Можно сделать вывод 17Е6 не функционирует за счет непосредственной конкуренции за сайт связывания лиганда. Клонирование и секвенирование 17Е6 вариабельных участков. Библиотека праймеров, сконструированная для PCR амплификации вариабельных участков иммуноглобулина была использована для клонирования иммуноглобулин-обогащенных кДНК библиотек для участков тяжелых и легких цепей гибридомы 17Е6. Праймеры избыточных вариабельных участков терминировали на страте лидера. Обратные праймеры константных участков заканчиваются на 30 bp в константном участке. Праймеры сконструированы с концевыми SAll или Xmall рестрикционными сайтами для клонирования. Продукты PCR ожидаемых размеров (420–450 вр) (Jones and Bonding, 1991) были получены, клонированы и секвенированы (рис. 17). Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина 17Е6, VL 17Е6, имеет длину 381 bp. Вариабельный участок тяжелой цепи, VH17E6, имеет длину 411 bp. Вариабельные последовательности тяжелой цепи являются характеристиками иммуноглобулинов Kabat группы 11b, а последовательности легкой цепи характеристиками Kabat группы V(Kabat et. al., 1987). Стратегия клонирования представлена схематически на рис. 18. Развитие опухоли и метастазы является классическим заболеванием, в котором клетки прекращают нормальный рост и контроль адгезии, и вторгаются, мигрируют, присоединяются и растут в несоответствующем месте. Теперь известно, что интегрины контролируют многие акты клеточной адгезии, в свою очередь, могут механически регулировать механически вплетающиеся акты, включая рост, дифференциацию, клеточные перемещения и активность сети протеаз, акты развития, которые повторяются в метаста 17 40621 ляемые через его посредство. Различия в активности 17Е6 по отношению к присоединенным и присоединяющимся М21 клеткам могут состоять в различных функциях и локализации aVb3 и aVb5 в каждой ситуации. В случае присоединяющихся клеток оба диффузно распределены, тогда как в случае присоединенных клеток, aVb3 находится в фокальных контактах, а aVb5 диффузно распределены (Wayner et al., 1991, Zambruno et al., 1993). Далее исследовали селективно ли 17Е6 нарушает один из этих контактов. Рост опухолей М21 у голых мышей сильно зависит от V-интегринов (Felding-Habermann et al., 1992, Sanders et al., 1992). Так как 17Е6 может регулировать стабильные взаимодействия aV-лиганд и оказывать длительное воздействие, было исследовано его влияние на развитие опухоли. Было обнаружено, что 17Е6 ингибирует развитие подкожных М21 опухолей у голых мышей, тем самым существенно подтверждая исследования Felding-Habermann et al. Кроме того, можно показать, что aV промотирует, а 17Е6 ингибирует развитие М21 в экспериментально вызванных метастазах в легких. Таким образом, настоящее изобретение независимо подтвердило важные предшествующие исследования и продолжило их, используя сингеничную, осуществляемую с участием антител "терапию" за счет 17Е6. Эти результаты подчеркивают важность aV-интегринов в развитии М21 опухоли, и включают возможность отнесения полученных ранее результатов к селекционным артефактам клонирования. Ин витро 17Е6 действие продолжается более 24 часов после смыва. При введении мыши объема 20 мл, начальная концентрация антитела ин виво составляет примерно 10 нМ, порядок величины, превышающий IC50 для изменения в культуре взаимодействий клетка-лиганд. 17Е6 сингенично для обработанных животных, BALB/c nu/nu, а срок полураспада IgG1 мыши составляет 20,,200 часов (Tao and Morrison 1989, Haba et al, 1985). Так, IC50 для прекращения взаимодействия М21лиганд может продолжаться в течение, по крайней мере, 100 часов в этой модели (5 сроков полураспада). Интересно сравнить 17Е6 с RGDS-пептидами. В модели с В16F10-C57b1к6 мелономы мыши совместно инъецированные пептиды ингибируют развитие В16-F10 легочных опухолей (Humphries et al., 1986, Hardan et al., 1993). С теми же предположениями, что и для 17Е6, примерно 100 мкг RGDS-пептида присутствует (Hardan et al., 1993), что примерно на два порядка величины больше дозы, необходимой для блокирования присоединения клеток к витронектину. Однако, RGDS имеет срок полураспада сыворотки 8 минут (Humphries et al., 1988). Как общее терапевтическое правило, может быть предпочтительным создавать ингибиторы для подавления развития опухолей с более длительным сроком жизни. Как может 17Е6 влиять на развитие опухоли? Так как оно не реагирует с мышиными клетками, оно действует на опухолевые клетки и, очевидно, действие антитела на антиогенез опухоли можно исключить (Brocks et al., 1994). Единственное действие 17Е6, которое можно идентифицировать, состоит в: а/ его связываниb с внеклеточными доменами aV-интегринов, b/ в его способности тическом каскаде (Liotta et al., 1991, Stotler Stevensom et al., 1993, Pidler 1988). В этом исследовании описываются антитела, против интегринов человека aV-серий, одно из которых, 17Е6, нарушает исходное клеточное присоединение, разрушает стабильное aV-лиганд взаимодействие и мешает развитию меланомы человека в ин виво модели на животных (Figler, 1986). В биохимических анализах антитела альфа-V-группы демонстрируют характер реакций близко сходный с L М142 – хорошо известным антителом к aV-человека, но сильно отличается от характера реакций 3-специфических (L M609), aVb5-специфических (Р5Н9) и от других определенных анти-интегриновых антител. Так, антитела альфа V-группы, по-видимому, распознают V интегриновые цепи человека. кДНК клонирование транскриптов иммуноглобулина 17Е6 выявило уникальные однозначные последовательности. Вариабельные последовательности тяжелых цепей являются характеристиками иммуноглобулинов Kabat группы 11b, а последовательности легких цепей – характеристиками Kabat группы V(Kabat et al., 1987). Таким образом, это антитело определено однозначно. 17Е6 существенно нарушает клеточное взаимодействие, осуществляемое за счет aV. Антитела, которые нарушают функцию, были жизненно необходимы для пониманий функций интегрина, но aV-область не содержит класc-специфически блокирующих антител. 17Е6 ингибирует осуществляемое за счет V клеточное присоединение при IC50 примерно 0,3–1 нМ (МВ антител 150000); для сравнения, пептидный ингибитор, GRGDS PK имеет IC50 примерно 5 мкМ. Клеточные линии, экспрессирующие, главным образом, aVb3 (L М793) или aVb5 (UCL AP3) ингибируются 17Е6, так же как и клетки, экспрессирующие, главным образом, aVb1. Таким образом, 17Е6 является общим ингибитором для aV-интегринов. 17Е6 не только предотвращает начальное взаимодействие aV-интегринов с их лигандами, но также прекращает уже установившиеся взаимодействия, вызывая быстрое отторжение клеток, присоединенных к витронектину. Взаимодействия aVb3 с витронектином были ранее охарактеризованы как "недиссоциируемые", происходящие на двух стадиях, когда после начального ингибируемого взаимодействия быстро следует реакция стабилизации (Orlando and Cheresh, 1991). Напротив, 17Е6 быстро вызывает оттягивание и частичное отделение М21 и многих других клеток (неопубликованные наблюдения) от витронектиновых субстратов. Округление прекращается в тех случаях, когда удаляется антитело. Исходное присоединение М21 на витронектин полностью ингибируется (примерно 90%) 17Е6, но его округление эффективно влияет практически на все присоединенные клетки. Можно подтвердить все предыдущие исследования, в которых начальное присоединение М21 к витронектину было полностью блокировано смесями анти-aVb3 и анти-aVb5 антителами, и RGDS-пептидами, подтверждая тот факт, что вовлечены как aVb3, так и aVb5 (Wayner et al., 1991). Как было показано в этом исследовании, 17Е6 блокирует некоторые aV-рецепторы и может нарушать стабильные взаимодействия, осуществ 18 40621 aVb3 не показывает этого перехода, и поэтому указывает, что одновалентное взаимодействие как с одновалентными, так и с двухвалентными элементами 17Е6 протекает в этой конфигурации. В лигандо-связующем рецепторном анализе, в котором используют ту же ELISA конфигурацию, 17Е6 оказывается удивительно слабым ингибирующим реагентом по сравнению с имитаторами пептидных лигандов, подобных EMD66203: cRGDfV. В этом контексте: тогда как cRGDfV увеличивает на два-три порядка активность (IC50 от ~ 1 мкМ до ~ 1нМ) при переходе от клеточного анализа к анализу на выделенных рецепторах, 17Е6 теряет, по крайней мере, 3 порядка величины кажущейся активности (IC50 от ~ 10 нМ. мл до более 100 мкг/мл), и становится практически неактивным. Такая аномалия и соответствующие данные по перекрестному взаимодействию клеточных антител была разрешена в экспериментах по конкуренции. Они указывают, что 17Е6, в противоположность пептидным блокаторам, не мешают непосредственно сайтам связывания лиганда. В отсутствии прямого доказательства, обычно предпогают, что блокирующий реагент функционирует за счет стерической изоляции сайта взаимодействия лиганд-рецептор, точка зрения, подкрепленная в области интегринов такими имитаторами активных сайтов лигандов, как RGD-содержащие пептиды (Hynes, 1992) и инактивацией лигандов, вызываемой мутагенезом этого сайта в витронектине (Cherney et al., 1993). Наши данные достаточно достоверно указывают, что для блокирующего антитела 17Е6 это не так. И в заключение: у aVb3 интегрина а) пептиды, имитирующие лиганд, конкурируют друг с другом и самими лигандами, b) лиганды конкурируют за пептид, с) ни пептиды, ни лиганды не конкурируют за 17Е6 связывание, d) 17Е6 не конкурирует за связывание с лигандом, ни связывание с имитатором лиганда, е) 17Е6 полностью конкурентоспособны сами по себе и с другими aV-связывающими антителами. 17Е6 является крайне слабым конкурентом за лигандное связывание с aVb3, хотя витронектин и зонды активных сайтов на основе RGD сильно конкурируют друг с другом у рецептора. И другие антитела сильно конкурируют за 17Е6. Так, 17Е6 действует как аллостерический ингибитор. Эксперимент по перекрестному связыванию выявил, что aVb3 но не aVb1 или aVb5 должны димеризоваться, прежде чем 17Е6 может осуществить блокировку. Это открытие показывает, что 17Е6 функционирует по новому механизму, который включает регулирование характера вызываемой интегрином трансдукции сигнала, а не просто противодействует взаимодействиям интегрин-лиганд. Так как aVb3 лиганды являются гомополимерами в их активной форме и неактивны как мономеры (Preissner, КТ, 1991, Stockman A., et al, 1993), мультимеризация интегринов за счет субстрата может быть существенна для их функций и, действительно, димеризация киназ рецепторного тирозина семейства рецепторов фактора роста лигандами является ключевым событием в трансдукции сигнала инициирования (Dougall, WC, et al., 1994). Интуитивно кажется очевидным, что стереохимия полимера субстрата становится главной в ориентации интегринов в мембране и распоря нарушать клеточные взаимодействия, осуществляемые за счет aV. Можно предположить, что большинство источников уничтожения клеток за счет антител, возможных для голых мышей, были исключены. 17Е6 хронически или в острой форме не влияют на рост клеток М21 и их жизнеспособность, не осуществляют фиксацию комплемента, не влияют на синтез ДНК и не обладают цитотоксичностью, осуществляемой за счет макрофагов. Клетки М21 чувствительны к АДСС, так как они эффективно умерщвляются микроглиальными клетками в присутствии Mab 14.18 G2a. IgG1 Mab (подобно 17Е6) эффективно взаимодействуют с мышиным макрофагом АДСС (Herlyn et al. 1985). Количество aVb3 сайтов экспрессируемых одной клеткой может быть ниже критического порога для АДСС. Предварительные исследования показали, что эффективность АДСС коррелирует с мишеневой антигенной плотностью (Rodeck et al., 1985). Макрофаги, в отличие от остальных миелоидных или лимфоцитных эффекторных клеток, экспрессируют все три класса Fcg рецепторов. Эти данные противоречат АДСС как механизму, объясняющему ингибирование роста опухоли, наблюдаемого ин виво с 17Е6. Антитело не содержит эндотоксин. Можно исключить возможность того, что умерщвление за счет NK-клеток активируется 17Е6, но если и так, оно гораздо более слабо активируется сингенными, меченными изотипами контрольными антителами, которые были при этом использованы. Таким образом, вероятно 17Е6 действует за счет ослабления функции aV-интегринов. Функции, которые, по-видимому, могут ингибировать 17Е6, и в которых aV могут принимать участие, включают клеточную адгезию, взаимодействие с растворимыми компонентами матрикса (Seftor et. al., 1992; de Boer et al., 1993; Preissner, 1991), стимуляцию клеточного движения (Saftor et al., 1992; Gehlsen et al., 1992); или влияние на рецепторную интернализацию (Wickhan et al., 1993; Panotti and McKeown Longo, 1993a; Panetti and McKeown Longo, 1993b), но какая именно из них вовлечена в этот процесс остается вопросом для дальнейшего исследования. Ингибирующее действие 17Е6 на aVb3 но не на aVb1 и aVb5 требует димеризации мишени. Хотя одновалентные и двухвалентные 17Е6 антитела фрагменты одинаково активны в связывании интегрина в ELISA, и в блокировании клеточной адгезии за счет aVb1 и aVb5 одновалентные фрагменты особенно неактивны против aVb3. Более того, если перекрестно-связывающие антитела добавляют к одновалентным фрагментам, они возобновляют способность блокировать адгезию за счет aVb3 и демонстрируют классический прозоновый эффект, осуществляя это. Простого перекрестного связывания недостаточно для ингибирования активности, однако, так как перекрестно-связывающий АР3 не оказывает действия на адгезию за счет aVb3: АР3 связывает b3 цепь (см. рис. 2В:e). Переход от одновалентного к двухвалентному взаимодействию вызывает резкое повышение сродства антитела к его мишени (Lane and Harlow, 1988). ELISA титрование 17Е6 на выделенных 19 40621 ресно проверить, могут ли они также нарушать осуществляемые за счет aV взаимодействия и препятствовать развитию меланомы. Терапевтическое и диагностическое применение. Антитела настоящего изобретения можно вводить пациентам с терапевтической целью. Поэтому целью настоящего изобретения было создание фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента, по крайней мере, одно антитело или фрагмент антитела, как определено ранее и в формуле изобретения, в связи с одним или более из фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов или разбавителей. Обычно антитело настоящего изобретения вводят с помощью внутривенных инъекций или парентерально. Обычно дозовый интервал для введения антитела (или его фрагмента) достаточно широк для достижения желаемого подавления опухоли и эффекта лизиса опухоли. Величина дозы зависит от возраста, состояния, пола и серьезности заболевания пациента и может меняться от 0,1 мг/кг до 200 мг/кг, предпочтительно, от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг/дозу в виде одной или нескольких доз, вводимых в течение дня, в течение одного или нескольких дней. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примеры неводных растворителей включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, такие растворимые масла, как оливковое масло, и такие органические сложные эфиры для инъекций, как этилолеат, и другие растворители, известные специалистам и которые пригодны для этих целей. Антитела настоящего изобретения можно использовать в композициях, содержащих физиологически приемлемые носители. Примером таких подходящих носителей является физиологический раствор, PBS. Раствор Рингера или раствор Рингера с молочной кислотой. В фармацевтических композициях могут также присутствовать консерванты, и такие другие добавки, как антибиотики, антиоксиданты и хелатирующие агенты. Антитело (или его фрагмент) может также конъюгировано в соответствии с известными способами с такими цитокинами, как IL-2 для подкрепления их цитотоксичности. Фармацевтические композиции настоящего изобретения пригодны для лечения всех типов опухолей, включая меланомы, глиомы и карциномы, а также опухоли системы циркуляции и твердые опухоли. Для диагностических целей антитело может быть конъюгировано, например, с непроницаемым для ионизирующего излучения красителем или в него может быть введен радиоизотоп. Предпочтительным способом введения метки является способ Iodogen. Предпочтительно вводить антитело целиком или в виде SCFV фрагментов для диагностических целей. Это обеспечивает более качественные результаты, так как не приходится вычитать фон. жается образованием сигнального комплекса. Действительно, биологическая "логика" мультимерного витронектина для клеточной адгезии может определяться этими затруднениями. Мультимеры витронектина состоят из 3–16 единиц по размеру (Stockmann, A. et al., 1993), и можно предсказать, что образуют упорядоченные стрелы интегринов на поверхности клеток и обязательно повышают сродство за счет мультимерных взаимодействий. Индивидуальное время жизни взаимодействия мономерный витронектин – aVb3 мало, и сродство низко, при этом несвязанный интегрин в плоскости мембраны быстро вращается, а сродство антитела и скорость велики. Так, можно предсказать, что двухвалентные антитела, связанные с одним интегрином на клеточной поверхности, могут захватывать диссоциированные интегрины во время вращения, и заключать их в конформацию, которая не может связывать лиганд. Это вызывает прогрессирующее ослабление молекулярных стрел aVb3 и витронектиновых связей и дестабилизирует взаимодействие клетка-витронектин. Это может объяснить недостаточную функцию 17Е6 в рецепторном анализе, где рецептор не может вращаться в необходимой ориентации для обеспечения двухвалентного связывания (доказано по данным ELISA), и его эффективность в клеточном анализе объясняет наблюдаемый недостаток необходимости конкурирования за активные сайты в клеточном анализе и объясняет неэффективность F/ab'/ фрагмента при блокировании aVb3-опосредствованной клеточной адгезии. Также совершенно очевидно, что так как aVb5 и aVb1(и aVb6, aVb8 и aVb1) разделяют спектр перекрывающихся лигандов с aVb3 можно также предположить, что они перекрестно регулируют функции друг друга, способом, совершенно аналогичным перекрестной регулировке за счет гетеродимеризации рецепторов в семействе рецепторов фактора роста RTK (Dougall, WC et al., 1994). Так, например, aVb5, обладая более высоким сродством к витронектину, нежели aVb3, может конкурировать за aVb3 сайты связывания на отдельных мультимерах этого субстрата – закрывая гомодимеры aVb3, необходимые для создания сигнала или сохранения клеточной адгезии, заменяя их гетеродимерами aVb3-aVb3. Остальные aV-интегрины могут функционировать аналогичным перекрестно-регулирующим образом, но твердых результатов, подтверждающих эти гипотезы, нет. В заключение можно сказать, что создан набор моноклональных антител против цепи aV-интегринов человека. Один из них, 17Е6, одновременно блокирует и нарушает процессы ин виво, происходящие за счет aV. Интересно, что оно также блокирует aV-зависимое развитие меланомы у голых мышей. Это дает возможность предположить, что aV-интегрины могут быть эффективными кандидатами в терапии опухолей. Пока подготавливалась эта рукопись, Lеhmann et al. (Lehmann et al., 1994) описал aVспецифические антитела, и некоторые свойства которых родственны свойствам 17Е6. Будет инте 20 40621 Таблица 1 Характер реакций Mab в ELISA и CELISA Антитело Иммуноген 17Е6 20A9 23G5 14D9.F8 10G2 14E2 21H6 LM609 LM142 P5H9 CP8 P4C10 AP3 avb3 M21 M21 M21 M21 M21 M21 Изотип aVb3 a11вb3 М21 M21-L M21-L-11в UCLA-P3 SPECIFIC ITY IgG1/k IgG1/k IgG1/k IgG1/k IgG1/k IgG1/k IgG1/k IgG1/k IgG1/k IgG1/k IgG1/k IgG1/k IgG1/k + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + aV aV aV aV aV 200 KDa 200 KDa aV3 aV av5 a11вb3 b1 b3 Таблица 2 Реакционная способность моноклональных антител по данным цитометрии в потоке Антитело Специфичность M21 M21-L avb3 (b3) @ M21-L(р) (b3) M21-L-IIb M-21L4 a11вb3 avb3 @ avb5 M21-L12 (b3) @ UCLA-P3 WM793 avb5 avb3 avb5 avb5 17E6 20A9 23G5 14D9.F8 14E2 av av av av 200 KDa ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ LM609 LM142 P5H9 P4C10 AP3 CP8 avb3 av avb5 b1 b3 a11вb3 ++ +++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ + ++ ++ ++ + ++ +++ ++ ++ +++ + ++ Таблица 3 Антигибирование развития очагов опухоли М21 за счет 17Е6 Maо в анализе "экспериментальных метастазов" в легких мышей ВА В/с Клетки и обработ- Образов. опухока лей М21 (Control) M21–17E6 M21-L 99 8 6 Число опухолевых очагов Контроль среднее Median интервал % 87 ± 110 8 ± 7,7 19 ± 22 30 5 8,5 (3-378) (0–21) (0–60) 100 9 22* Примеры. Пример 1: Материалы Животные: мыши для получения антител (самки BAL B/c: в возрасте 8 недель) и для моделей опухолей ("голые мыши": самки гомозиготные атимичные BAL B/c nu/nu: в возрасте 4–5 недель) были получены от Сriffa (Barcelona, Spain). Голых мышей выдерживают в стерильной комнате в микроизоляторных клетках и кормят стерилизованной пищей и водой по мере необходимости. Все манипуляции осуществляют в стерильном окружении. Протеины: фибронектин (Ruoslahti et al., 1982), витронектин (Yatohgo et al., 1988) выделяют из свежезамороженной плазмы человека, а фибриноген (Kazal et al. , 1963) из целой крови. Ламинин выделяют из Engеlbrеth-Holm-Swarm мышиных опухолей (Paulsson et al., 1987). Если нет других указаний, все манипуляции осуществляют при 20оС, а все промывки осуществляют PBS без кальция-магния ("PBS": 137 мМ NaCl, 2,8 KCl, 8,1 мМ Na2HPO4, 1,5 мМ КН2РО4, рН 7,4). PBS++ представляет собой PBS с добавлением 1 мМ MgCl2 и 1 мМ CaCl2, Если нет специальных указаний, все химикалии (Merck KGaA, Darnstadt) были наивысшей из доступных степени чистоты. Циклические пептиды, подобные cRGDfV 21 40621 и cRGDfK были синтезированы в соответствии с известными стандартными методиками (например, FEBS Let., 291, pp. 50–54, 1991). Линейный пептид GRGDSPK, который используют в качестве сравнительного соединения, коммерчески доступен (например, от Bachem, Switzerland). Опухолевые клеточные линии и культуры: Американская коллекция типовых культур (АТТС) поставила SW1116, НТ29 карциномы человека и А375 меланомы человека, а следующие клеточные линии были великодушным подарком коллег: М21 меланомa, ее варианты М21-L и М21-L 4 (Cheres h and Spiro, 1987), М21-L-11b (получено по способу Kieffer et al., 1991) и UCL AP3 аденокарцинома легких человека (Cheresh et al., 1989) (Dr. D.A. Cheresh, Scripps), WM793 и WM164 меланома (Dr. M. Herlyn, Wistar) (Herlyn et al. 1990), NP18, карцинома поджелудочной железы (Dr. GCapella; Hospital Sant Pau, Barcel.). B16F10 мышиная меланома, полученная от Dr. I. Fidler (Poste et al., 1980) (Dr. S. Alinio, University of Valencia). ЕММ31 было установлено нашей группой из образца опухоли, определенной в соответствии со стандартными гистологическими критериями, как первичная меланома (Jaggle et al., неопубликованные наблюдения). Все клетки культивировали при 37оС в 7,5% СО2, 92,5% воздуха при 90% РРМ1 1640, 10% сыворотки плода теленка (FCS) плюс 2 мМ L-глутамина, и по данным соответствующего теста (Mycotect Kit; Gibco) они практически не содержали микоплазмы. Антитела – слияние моноклональных антител (Mab), скринирование ELISA, субклонирование и поддержание культуры осуществляют, используя стандартные методики (Harlow and Lane, 1988), если нет других указаний. Пример 2. Иммунизация. Mab против avb3 получают за счет внутрибрюшинной инъекции (вб) очищенного aVb3 плаценты, иммобилизованного на Сефарозе (80 мкг avb3 на 80 мкг Сефарозы в 200 мкл PBS) или из живых клеток М21 (1 х 106 клеток в 0,5 мл РВS) каждые две недели в течение более чем 12 недель. Через 4 для после последней инъекции осуществляют PEG-индуцируемое слияние, используя в качестве партнера Friondly миелому/ Ventrex/. Антитела к 300 кДа связанному с меланомой поверхностному протеину получают за счет иммунизации интактных М21 клеток (1 х 106 клеток в 0,5 мл PBS). Скринирование: используют ELISA на рецепторах и на фиксированных М21 клетках. Для ELISA на рецепторах 96 ячеечные пластины (Dynatech) покрывают очищенным aVb3 (1 мкг/мл в PBS, 16 часов, 4оС), блокируют (1,5% снятого молока в PBS, 1 час, 4оС) и инкубируют с гибридомной надосадочной жидкостью. Связанные иммуноглобулины определяют с помощью щелочного фосфотазного конъюгат антимышечного Ig (Дако), используя в качестве субстрата пара-нитрофенилфосфат. Для клеточного ELISA фиксируют М21, М21-L, М21-L-11b или UCLAP3 клетки на 96 ячеечных тканевых культуральных пластинах (4% формальдегида в PBS, 15 минут, 20оC) и блокируют (3% BSA, PBS), 1 час, 4оС) перед тем, как инкубируют с гибридомной надосадочной жидкостью и определяют, как в рецепторном ELISA. Позитив ные гибриды субклонируют трижды, ограничивая разбавление, и адаптируют к РРМ1 среде. Изотоп иммуноглобулина определяют, используя подкласс-специфичные антитела тяжелых цепей (Zynod) или антитела легких цепей (Promega). Другие мышиные Mab, использованные в этих исследованиях, были подарком наших коллег L M609 к aVb3 и L М142 к aV (Cheresh and Spiro, 1987) (Dr. D.A. Cheresh, Scripps), P4C10 к avb1 интегрину (Саrter et al.1990) (Telios) и Р5Н9 к avb5 интегриновому комплексу (Wayner et al., 1991) (Dr. E. Wayner, University of Minnesota), СРВ к комплексу (Dr. Ruggieri, Scripps), АР3 к a11вvb3 цепи (Furihata et al., 1987), (АТСС), 9.2.27 против протеогликана поверхностных клеток меланомы (Harel et al., 1990) (Dr. R. Reisfeld Scripps) и 14, 18 G2a против GD2 ганглиозидов (Mujoo et al., 1989). Пример 3. Очистка антитела и увеличение производства Для очистки в крупных масштабах надосадочные жидкости антител собирают с культур в экспоненциальной фазе, выращиваемых во вращающихся склянках. Эти антитела очищают на протеин-А-Сефароза СL-4В (Pharmacia) и диализуют против PBS перед стерильной фильтрацией (0,45 мкм) и хранят при -7оС (Harlow and Lane, 1988). Очищенные антитела освобождают от эндотоксинов, пропуская через колонки Kurimover-11 (Kurita–Vater, Tokyo). Это позволяет снизить уровень эндотоксина с более чем 250 IU эндотоксина на мг антител до менее чем 0,2 IU эндотоксина на мг в Limulus анализе (Melvaer and Fystro, 1982). F/ab'/2 и F/ab'/ фрагменты 17Е6 (мышиный IgG1) получают стандартными способами расщепления пепсином и выделения на протеин-А колонках (Pharmacia) с последующим расщеплением папаином и выделением за счет гельфильтрации (Harlow and Lane, 1988). Очистка avb3 и a11вb3 интегринов avb3 выделяют из плаценты человека (Smith and Cheresh, 1988). Кусочки плаценты измельчают и промывают примерно в 2 объемах охлажденного льдом раствора А (0,05 % вес/объем дигитонина, 2 мМ CaCl2, 2 мМ PMSF, рН 7,4), затем фильтруют. Оставшийся материал экстрагируют примерно в 4 объемах охлажденного льдом буфера В (100 М октил-b-D-глюкопиразид (OG), 1 мМ CaCl2, 2 мМ PMSF, в PBS) и центрифугируют (12000 g макс. 45 минут, 4оС). Надосадочная жидкость рециркулирована в колонку L М609 антител (16 часов, 4оС). После промывки буфером С (0,1% NP40 в PBS, примерно 10 сv) и буфером В (0,1% NP40, 2 мМ CaCl2, 10 мМ Na-ацетата, рН 4,5: примерно 10 сv), связанный материал элюируют буфером Е (буфер Д с рН 3.1). Элюат нейтрализуют 3М Tris (рН 8,8), диализуют против буфера С и концентрируют примерно в 10 раз, используя Aquacido11 (Calbiochem). Очищенный рецептор хранят при -70оС. a11вb3 получают из тромбоцитов человека (Pitela et al., 1986). Устаревшие концентраты тромбоцитов смешивают с одним объемом буфера Tyrodes, осаждают (1200 g макс.) и осадок экстрагируют (1 час, 20оС) лизисным буфером (50 мМ OG, 1 мМ MgCl2, 1мМ CaCl2, 1 мкМ MnCl2, 2 мМ PMS F, 150 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl; рН 7,4). Пос 22 40621 ле центрифугирования (32000 gмакс, 30 минут, 4оС) надосадочная жидкость рециркулирует (16 часов, 4оС) в GRGDS PK-конъюгированной CL-4B Сефарозой колонке. Колонку промывают лизисным буфером (примерно 10 сv) и элюируют GRGDS PK (3 мг/мл в 90% лизисного буфера, 10% ДМСО). Пик концентрируют примерно в 5 раз, диализуют против модифицированного лизисного буфера (0,1% NP-40 заменяют на OG) и хранят при -70оС. Препараты интегрина были примерно 95% степени чистоты по данным антиинтегрин ELISA, с использованием моноклональных антител специфичных к a- и b-цепям и за счет SDS-PAGE. Пример 4. Внесение поверхностных меток и иммунохарактеризации. Биотинилирование клеточной поверхности и экстрагирование – Клетки в стадии экспоненциального роста собирают за счет EDTA, промывают и 5 х 106 клеток в PBS (1 мл) поверхностно метят биотин-N-гидроксисукцинимидо-сложным эфиром (10 мк г/мл; Sigma) на end-over-end ротаторе (2 часа, 20оС), промывают и 5 х 106 клеток на миллилитр подвергают лизису в течение 1 часа при 20оС в экстракционном буфере (100 мМ OG 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2 и 1 мМ PMSF в PBS). После центрифугирования (12000 g, 20 мин.) надосадочную жидкость используют для иммуноосаждения. Иммуноосаждение: биотинилированные клеточные экстракты Alfigol иммуноосаждают очищенными анти-интегрин Mab соединенными с 10 шариками (Biorad) или связывают с протеин-G-Сефарозой (Pharmacia). 10 мг соединенных Mab инкубируют с 5Е6 клеточными эквивалентами биотинилированного клеточного экстракта в течение ночи при 4оС. Промытые шарики кипятят в невосстанавливающем SDS-буфере, центрифугируют и разделяют на 7,5% SDS-PAGE. После электрофоретического переноса на нитроцеллюлозу (Towbin et al., 1979), полосы визуализируют козьим антибиотин конъюгатом со щелочной фосфатазой (Дако), используя NBT-BCIP (Biorad) в качестве субстрата. Цитометрия в потоке: клетки собирают с помощью ЕДТА, промывают и 106 клеток в PBS – 1 % BSA инкубируют с Mab (10 мкг/мл), 20 минут, 4оС). После промывания и введения метки (20 минут, 4оС, козьего антимышиного Ig-FITC (Becton Dickinson//, клетки инкубируют с пропидиумиодидом перед цитометрическим анализом в потоке (EPICS Profilo II, Coulter). Живые клетки отбирают с помощью соответствующих окон на рассеивателе (sido and forward scatter). Флуоресценцию возбуждают на 488 нм аргоновым ионным лазером и испускаемое излучение (525 нм) регистрируют. В некоторых экспериментах клетки М21-L окрашивают с последующей кратковременной фиксацией и стадией предварительного придания им проницаемости (70% этанол, 5 минут, 20оС). Цитотоксичность, зависимая от комплемента (CDC): клетки М21 помещают на пластину с 96 ячейками с 50 мкм полной среды и 20 мкл антител. Кроличью сыворотку (50 мкл, 1:5, Behring) добавляют в качестве источника комплемента, и пластину инкубируют (37оС, 60 мин.). Лизис коли чественно определяют с помощью МТТ (3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолилбромид) Mosmann, 1983). Процент лизиса рассчитывают, используя ячейки с 1% Твин-20 в качестве 100% контрольных значений и без антител – в качестве 0% контрольных значений. Пример 5. Рост клеток, их жизнеспособность и активация Пролиферационный анализ: для определения хронического действия антител 106 клеток инкубируют в присутствии Mab (70 мкг/мл) PBS, 1 час, 20оС) на непрерывном (end-over-end) ротаторе, промывают, затем снова суспендируют и продолжают культивировать в RPMI-среде. Рост и жизнеспособность оценивают по исключению красителя Trypan blue. Активацию определяют в анализе с МТТ, как описано ранее, и количество клеток подсчитывают ежедневно, используя счетчик клеток (Coulter electronics). Прилипшие клетки меланомы определяют (0,05% Трипсин, 0,02% ЕДТА). Промытые клетки засевают в плоскодонные микротитровальные пластины с 96 ячейками (1 х 104 клеток на ячейку) и культивируют без (контроль) или в присутствии сериально разбавленных антител в RPMI среде с 10% FCS. Через 48 часов клетки пульсационно метят в течение 18 часов (18,5 кBeq [3H]-тимидина на ячейку) и собирают. Включенную радиоактивность определяют и выражают, как число импульсов в минуту. Пример 6. Анализ направляемой антителами клеточной цитотоксичности (ADCC). Подготовку (BALB) с микроглиальных клеток и условия для АDCC и цитостаза за счет эффекторных клеток (AECM) осуществляют, как указано у Sutter et al., 1991. Клетки М21 импульсно метят в течение 18 часов [3H]-тимидином (18 кВq на 4 х 103 клеток на ячейку) и инкубируют на пластинах с 96 ячейками BAL B/c микроглиями (5 х 104 клеток на ячейку) в 200 мкл DMEM/FCS (10%) в присутствии антител. Через 48 часов [3Н] определяют метки, сохранившиеся в ядрах меченых клеток. Мао-зависимую цитотоксичность определяют, используя формулу: [(экспериментальное количество импульсов – количество спонтанных импульсов)] / (максимальное количество импульсов – количество спонтанных импульсов)] x 100. Пример 7. Цитостаз, зависимый от антител и эффекторных клеток (АЕСМ): как и для ADCC, но используют вместо импульсно меченых клеток свежеприготовленные немеченые М21 клетки. В течение 24 часов эффектор-мишеневые клетки совместно культивируют и затем импульсно метят [3H]-тимидином (18 кВq на ячейку) в течение дополнительно 24 часов и определяют включенные ядерные [3Н] метки. Анализ клеточного присоединения осуществляют в соответствии с приведенным ранее описанием (Goodman et al., 1991), используя активность гексозаминидазы (Landegren, 1984) для определения присоединившихся клеток. Разбавления и клеточные суспензии проводят в буфере для присоединения (RPMI, 1% BSA, 25 мМ HEPES, рН 7,4). Матричные протеины наносят на 23 40621 пластины с 96 или 48 ячейками, ячейки блокируют BSA и добавляют сериально разбавленные Mab в ячейки, а затем клетки (2,5 х 104 – 5 х 104). Спустя 1 час при 37оС клетки, которые не прилипли, смывают, а присоединившиеся клетки подсчитывают параллельно со стандартной кривой. Ингибирование присоединения рассчитывают, используя ячейки, в которых не было Mao, в качестве сравнения. Обычно в течение 1 часа к витронектину присоединяются более 70% добавляемых клеток. Присоединение клеток к ячейкам, покрытым только BSA, обычно менее 5% от специфически-присоединившихся клеток. Анализ поверхностных сшивок. Как и в анализе на присоединение клеток клеткам дают возможность присоединиться к покрытым матрицей пластинам в присутствии сериально разбавленных 17Е6 или их F/ab'/2 или F/ab'/ фрагментов, и возрастающих количеств козьих анти-мышиных F/ab'/ в качестве сшивающего агента. Промывку и определение присоединившихся клеток проводят, как и в анализе присоединения нормальных клеток. Анализ нарушения присоединения: клетки наносят в буфере присоединения на ячейки с нанесенным покрытием и блокированные как для анализа присоединения клеток, и инкубируют при 37оС. После распространения (60–75 минут) добавляют сериально разбавленные Mab, и клетки возвращают в инкубатор. В другом варианте клеткам дают возможность присоединяться в течение 24 часов перед добавлением антител. После 2–3 часов в присутствии антитела надосадочную жидкость осторожно удаляют и 5 раз заменяют на свежий предварительно подогретый буфер присоединения – что приводит к окончательному фактору нарушения присоединения более 1 х 105. Развитие опухоли ин виво: опухолевые клетки в стадии экспоненциального роста собирают с помощью ЕДТА, промывают и исследуют их жизнеспособность с помощью исключения красителя Trypan Blue. Жизнеспособность составляет 96– 99%. Для роста первичной опухоли вводят подкожно клетки (0,5 х 106 клеток в 0,2 мл PBS++) в бок голой мыши. За ростом опухоли следят, измеряя диаметры опухоли кронциркулем, а объем опухоли рассчитывают, используя приблизительную формулу для растянутого эллипсоида: объем = [(a × b2)/2], где а представляет большую ось опухоли, а b – наименьшую. В каждой группе находится не менее 8 животных. Для экспериментальных метастазов в легких клетки собирают (0,05% Trypsin (0,02% ЕДТА) и вводят в хвостовую вену голой мыши (0,5 х 106 клеток в 0,2 мл PBS++). Через 7 недель животных умерщвляют, извлекают легкие и фиксируют в растворе Bouin's и подсчитывают опухолевые очаги на поверхности легких. Для обработки антителами собранные и промытые клетки инкубируют с очищенными не содержащими эндотоксина Mab (70 мкг/106 клеток, 0,5 мл PBS++/ в течение 30 минут при 20оС в end-over-end ротаторе перед тем, как разбавляют до 0,5 х 106 клеток в 0,2 мл PBS и инъектируют. Жизнеспособность клеток оценивают по исключению красителя Trypan blue до и после завершения схемы инъекций, причем не было обнаружено заметной разницы (жизнеспособность до инъекций = жизнеспособности после инъекций ± 5%). Данные относительно ингибирования опухоли оценивают, используя двойной Ттест Стьюдента. Пример 8 Методики молекулярной биологии Если нет других указаний, все методики молекулярной биологии соответствовали описанным подробно в книге Sambroock et al., 1989. Препараты РНК и ДНК: полную РНК выделяют из 17Е6 клеток за счет экстракции гуанидинийтиоцианатом, а РНК выделяют за счет ультрацентрифугирования с градиентом плотности хлорида цезия (Chirgwin et al., 1979). Однонитевую кДНК синтезируют, используя коммерческий набор (Pharmacia). Синтез осуществляют в объеме 15 мклс 5 мкл РНК в течение 1 часа при 37оС. Первую нить кДНК используют непосредственно для PCR амплификации. PCR амплификация: вариабельные участки мышиных легкой и тяжелой цепей амплифицируют, используя избыточный и полудегенеративный наборы PCR праймеров, сконструированные для гибридизации с мышиной Ig лидерной последовательностями (Jones and Bonding, 1991). Смесь 61 олигонуклеотида служит в качестве 5' праймеров вариабельного домена тяжелой цепи, а смесь 405 олигонуклеотидов служит в качестве 5' праймеров для вариабельного участка каппа цепи. 3' праймеры конструируют для отжига в постоянном участке: при этом используют специфические IgG1 и каппа мышиные праймеры. Для амплификации с термостабильной ДНК полимеразой 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл кДНК-РНК гибрида, 250 нМ подходящей 5' и 3' смеси праймеров, 200 мкМ каждого OWTP, 1 мМ MgCl2 (для легкой цепи), 2 мМ MgCl2 (для тяжелой цепи) и 1 ед. Taq полимеразы (Cetus) покрывают минеральным маслом и нагревают для начала при 60оС до 55оС температуры отжига. Через 30 циклов (1' x 55оС 1,5' x 72оС, 45 сек х 92оС) одну десятую PCR реакции ведут на 1% агарозном ТАЕ гельэлектрофорезе и окрашивают этидиумбромидом для визуализации и получения PCR продуктов. Молекулярное клонирование и секвенирование: по 1 мкл каждого PCR-продукта лигируют в ТА вектор (Invitrogen, San Diego). Две реакции ДНК лигирования для вариабельных участков легкой и тяжелой цепей треоформируют термошоком в компетентные клетки Е.coli штамма TG1 для создания двух ДНК библиотек, одна для легкого вариабельного участка 17Е6 Mab, а другая для тяжелого вариабельного участка 17Е6 Mab. Колонки селектируют на LB пластинах с помощью 100 мкг/мл карбенициллина и отбирают для дальнейшего анализа. Позитивные колонки отбирают за счет PCR скринирования или используя плазмидное переваривание (Gussow and Clackson, 1989). Двунитевую плазмидную ДНК получают (Wisard preps., Promoga Corp.) для секвенирования из трансформантов. Секвенирование в термоциклах с использованием терминации дидезоксинуклеотидной цепи (Sanger et al. 1977) осуществляют, используя Tag полимеразу. Используют праймеры секвенирования для ТА векторов. Связывание интегринового лиганда и конкурентный анализ: 24 40621 ние 3 часа, 30оС с последующей промывкой и определением связанного биотина, как это было указано для прямого конкурентного анализа. Описание последовательностей (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) NAME: Merck Patent GmbH (B) STREET: Farnkfurter Str. 250 (C) CITY: Darmstadt (E) COUNTRY: Germany (F) POSTAL CODE (ZIP): 64271 (G) TELEPHONE: 49–6151–727022 (H) TELEFAX: 49–6151–72791 (ii) TITLE OF INVENTION: Анти-альфа-V моноклональное антитело (iii) число последовательностей 17 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1,0, Version #1.30 (EPO) (2) информация для послед. 1Д № 1 (i) характеристики последовательности (А) длина: 381 пара оснований (В) тип: нуклеиновая кислота (С) тип нитей: однонитевая (D) топология: линейная (ii) тип молекулы кДНК (iii) типотетическая? нет (iv) антисмысловая? нет (v) тип фрагмента: N-конец (vi) источник: (А) (А) организм; мышь (В) (В) штамм: BAIB/c (vii) непосредственный источник (В) (В) клон: 72–17Е6 (ix) характеристика (А) название/ключ CDS (B) положение: 1...129 (D) другая информация: функция = лидер и FR-1 последовательность (лидер: 1–60, FR-1: 61–129) (ix) характеристика (А) название/ключ: CDS (B) положение: 130–162 (D) другая информация: функция: " CDR-1 последовательность" (ix) характеристика (А) название/ключ CDS (B) положение 163...207 (D) другая информация: функция: "FR-2 последовательность" (ix) характеристика (А) название/ключ CDS (B) положение 208...228 (D) другая информация: функция = "CDR-2 последовательность" (ix) характеристика (А) название/ключ (B) положение 229...324 (D) другая информация: функция = "FR-3 последовательность" (ix) характеристика (А) название/ключ CDS (B) положение 325...351 (D) другая информация: функция= "CDR-3 последовательность" Биотинилирование лигандов. Лиганды в PBS разбавляют пятикратно концентрированным буфером лигирования (конечная концентрация 1 мг/мл протеина, 100 мМ NaCl, 100 мМ NaHCO3, рН 8,2) в конечном объеме 1 мл. Свежеприготовленный Nгидроксисукцинимидобиотиновый раствор (100 мкл, 1 мг/мл в ДМСО) добавляют при перемешивании, и реакцию ведут в течение 2 часов при 20оС в непрерывном ротаторе. После исчерпывающего диализа при 4оС: PBS, 0,05% NaN3 концентрацию протеина оценивают, и биотинилированный лиганд хранят при 4оС и используют в течение 21 дня. Синтез биотинилированного пептида cRGDfK (циклический – Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys = N-биотин-аминогексановая кислота) был описан ранее или его можно провести в соответствии со стандартными методиками. Прямой конкурирующий анализ был основан на более ранних методиках Smith et al, 1990), aVb3 разбавляют до 1 мкг/мл в буфере А/150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ СaCl2, 10 мкм MnCl2, 20 мМ Tris-HCl,рН 7,4) и 100 мл вводят в течение ночи при 4оС на микротитровальные пластины с 96 ячейками. Пластины промывают один раз буфером В (3% BSA/вес/объем), 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 10 мкМ MnCl2, 50 мМ Tris-HCl, рН 7,4) и инкубируют в течение 2 часов при 20оС в том же самом буфере. После промывания буфером С с BSA в концентрации 0,1%/вес/объем добавляют буфер В, содержащий биотинилированный лиганд (1 мкг/мл конечная концентрация) и сериальными разбавлениями тестируют пептиды или протеины. После инкубирования (3 часа, 30оС) несвязанные лиганды смывают с пластины, трижды промывая буфером С и инкубирование продолжают в течение 1 часа с анти-биотин-щелочная фосфатаза конъюгированным антителом (1:10000 в буфере С) (Sigma) с последующей промывкой PBS и определением связанного антитела NBT-BCIP в качестве субстрата. ЕСМ молекулы и антитела биотинилируют обычным способом и используют, как они есть, в конфигурационном анализе. Анализы обычно осуществляют на трех или четырех пластинах и повторяют, по крайней мере, трижды для определения IС50 из невзвешенной сигмоидной кривой. Результаты нормализуют относительно внешних контрольных пептидов для обеспечения сравнения внутри анализа. В качестве внешних стандартов обычно используют линейный RGD пептид GRGDSPK и циклический пептид cRGDfV при титровании, так же, как и контрольные ячейки, и определяют связывание биотинилированного лиганда с блокированными, но не содержащими интегрина ячейками, и связывание антибиотинового антитела с не содержащим лиганда интегрином; сигнал от контрольных ячеек составляет менее 7,5% специфического лигандного связывания. Пластины для конкурентного анализа с предварительным блокированием, покрытые рецепторами и блокированные, как для прямого конкурентного анализа, предварительно инкубируют с удвоенной концентрацией антител, молекулами матриц или конкурирующими пептидами (50 мкл в буфере С: 1 час, 30оС) перед добавлением биотинилированного зондирующего лиганда или антитела (50 мкл в буфере С) и продолжают инкубирова 25 40621 (ix) характеристика (А) название/ключ (B) положение 352...381 (D) другая информация: функция: "FR-4 последовательность" (xi) Описание последовательности 1Д №1 (2) Информация для послед. 1Д № 2 (i) характеристики последовательности (А) длина: 43 аминокислоты (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 2 Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Val Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Ile Ile Ser Cys 35 40 (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 3 (2) информация для послед. 1Д № 3 (i): характеристики последовательности (А) длина: 11 аминокислот (В) тип: аминокислота Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 (2) информация для последовательности 1Д № 4 (i) характеристики последовательности (А) длина: 15 аминокислот (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 4 26 40621 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Phe 1 5 10 15 (2) информация для последовательности 1Д № 5 (i) характеристики последовательности (А) длина: 7 аминокислот (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 5 Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser 1 5 (2) информация для послед. 1Д № 6 (i) характеристики последовательности (А) длина: 32 аминокислоты (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 6 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Asn Leu Asp Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys 20 25 30 (2) информация для послед. 1Д № 7 (i) характеристики последовательности (А) длина: 9 аминокислот (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 7 Gln Gln Gly Asn Thr Phe Pro Tyr Thr 1 5 (2) информация для послед. 1Д № 8 (i) характеристики последовательности (А) длина: 10 аминокислот (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 8 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Arg 1 5 10 (B) положение: 148...162 (D) другая информация:148 /функция = "CDR-1 последовательность"/ (ix) характеристика (А) название/ключ: CDS (B) положение: 163...204 (D) другая информация: /функция = "FR-2 последовательность"/ (ix) характеристика (А) название/ключ: CDS (B) положение: 205...255 (D) другая информация: /функция = "СDR-2 последовательность"/ (ix) характеристика (А) название/ключ: CDS (B) положение: 256...351 (D) другая информация: /функция = "FR-3 последовательность"/ (ix) характеристика (А) название/ключ: CDS (B) положение: 352...378 (D) другая информация: /функция = "СDR-3 последовательность"/ (ix) характеристика (А) название/ключ: CDS (B) положение: 379...411 (2) информация для послед. 1Д № 9 (i)характеристики последовательности (А) длина: 411 пар оснований (В) тип: нуклеиновая кислота (С) тип нитей: однонитевая (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: кДНК (iii) гипотетическая? нет (iv) антисмысловая? нет (v) тип фрагмента: N-конец (vi) источник (А) организм: мышь (В) штамм: BA B/c (vii) непосредственный источник (В) (В) клон: 272–17Е6 (ix) характеристика (А) название/ключ: CDS (B) положение 1...57 (D) другая информация: / функция = лидерная последовательность"/ (ix) характеристика (А) название/ключ: CDS (B) положение: 58...147 (D) другая информация: /функция = "FR-1 последовательность"/ (ix) характеристика (А) название/ключ: CDS 27 40621 (D) другая информация: /функция = "FR-4 последовательность"/ (xi) описание последовательности 1Д № 9 CAA GCA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 411 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 5 10 (2) информация для последовательности 1Д № 10 (i) характеристики последовательности (А) длина; 19 аминокислот (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 10: Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Ile Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser (2) информация для последовательности 1Д № 11 (i) характеристики последовательности (А) длина; 30 аминокислот (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 11 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 (2) информация для последовательности 1Д № 12 (i) характеристики последовательности (А) длина: 5 аминокислот (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 12 28 40621 Ser Phe Trp Met His 1 5 (2) информация для последовательности 1Д № 13 (i) характеристики последовательности (А) длина: 14 аминокислот (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 13 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 (2) информация для последовательности 1Д № 14 (i) характеристики последовательности (А) длина: 17 аминокислот (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 14 Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Glu Cys Asn Glu Ile Phe Arg Asp 1 5 10 15 (2) информация для последовательности 1Д № 15 (i) характеристики последовательности (А) длина; 32 аминокислоты (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 15 Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln 1 5 10 15 Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Aka Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 20 25 30 (2) информация для последовательности 1Д № 16 (i) характеристики последовательности (А) длина: 9 аминокислот (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 16 Phe Leu Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 (2) информация для последовательности 1Д № 17 (i) характеристики последовательности (А) длина; 11 аминокислот (В) тип: аминокислота (D) топология: линейная (ii) тип молекулы: протеин (xi) описание последовательности 1Д № 17 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 29 40621 Фиг. 1 Фиг. 2 А Фиг. 2В Фиг. 2C Фиг. 2D 30