Спосіб оцінки протизапальної активності фармакологічних речовин за величиною об’єму дрібних суглобів задніх кінцівок у щурів на моделі ревматоїдного артриту

Реферат: Спосіб оцінки протизапальної активності фармакологічних речовин за величиною об'єму дрібних суглобів задніх кінцівок у щурів на моделі ревматоїдного артриту. За допомогою конусно-променевої комп'ютерної томографії визначають лінійні розміри дрібних суглобів задніх кінцівок та розраховують їх об'єм за формулою V    R 2  h . UA 117538 U (12) UA 117538 U UA 117538 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, зокрема фармакології, ревматології, променевої діагностики, та може бути використана для доклінічної оцінки протизапальної активності фармакологічних речовин, які пропонуються як нестероїдні протизапальні засоби. На сьогоднішній день з метою оцінки протизапальної активності фармакологічних речовин в експериментальній медицині набуло широкого застосування визначення об'єму враженої флогогенним агентом (ад'ювант Фрейнда, карагенін, зимозан, колаген, гістамін, серотонін та ін.) кінцівки у лабораторних щурів. Для цього застосовують цифрові плетизмометри, онкометри (механічний онкометр за О.С. Захаревським), електронні штангенциркулі та ін. [Захаревский А.С. Влияние некоторых производных индола на нервную систему: дис. канд. мед наук: 14.04.03 "Фармакология»/ Захаревский Александр Степанович. - Минск, 1962. - С. 78-80; Доклінічні дослідження лікарських засобів: метод. рекоменд.; за ред. член-кор. АМН України О.В. Стефанова. - К.: ВД "Авіцена", 2001. - 527 с.]. Проте оцінка об'єму кінцівки дозволяє лише опосередковано охарактеризувати зміни з боку кістково-суглобової системи, адже набряк навколосуглобових м'яких тканин не завжди співставляється зі структурним змінами в суглобах. Зважаючи, що ревматоїдному артриту притаманна специфічна тропність саме до суглобів, загальна оцінка об'єму кінцівки не дає вичерпної характеристики протизапальної активності досліджуваних фармакологічних речовин [Мазуров В.И. Клиническая ревматология. Руководство для врачей / под. ред. В.И. Мазурова. - СПб.: издат. "Фолиант", 2005. - 496 с.; Насонов Е.Л. Ревматология. Национальное руководство/ под. ред. Е.Л. Насонова, В.А. Насоновой. - М.: "ГЭОТАР-Медиа", 2008. - 737 с.]. Задачею корисної моделі є оцінка протизапальної активності фармакологічних речовин за значенням об'єму дрібних суглобів задніх кінцівок у щурів на моделі ревматоїдного артриту. Поставлена задача була вирішена введенням інтегральної характеристики лінійних розмірів суглобів задніх кінцівок щурів шляхом розрахунку об'єму досліджуваних суглобів. Умовно було вибрано циліндр, як найближчу фігуру, яка відповідає просторовій організації дрібних суглобів (креслення). Креслення. Оцінка об'єму дрібних суглобів за допомогою геометричного моделювання на прикладі II плесно-фалангового та проксимального міжфалангового суглобів другого пальця задньої правої кінцівки щура. 3 Об'єм розраховували за формулою V    R 2  h , де V - об'єм суглобу (мм ),  математична константа, яка відображає співвідношення довжини кола до його діаметра та 1 становить 3,14; R - радіус кола в основи циліндра ( /2 ширини суглобу, мм), h - висота циліндра (висота суглобу у сагітальній площині, мм). Корисна модель ілюструється наступним прикладом. Приклад. Дослідження проведено на 28 статевозрілих нелінійних щурах-самцях з масою тіла 180-220 г, які утримувались у віварії Вінницького національного медичного університету імені М.І. Пирогова в умовах природної зміни дня і ночі, на стандартному водно-харчовому раціоні (їжа та вода ad libitum). Тварини отримували стандартне харчування у вигляді збалансованого гранульованого корму за встановленими нормами [Науково-методичні рекомендації з утримання лабораторних тварин та роботи з ними/ Ю.М. Кожемякін, О.С. Хромов, Μ.А. Філоненко та ін. - К.: Авіцена, 2002. - 156 с.]. Всі експериментальні дослідження над лабораторними тваринами проводили в атестованій Головною організацією метрологічної служби Міністерства охорони здоров'я України лабораторії кафедри фармакології ВНМУ ім. М.І. Пирогова (свідоцтво про атестацію № 023/13 від 05.03.2013 р.) з урахуванням вимог належної лабораторної практики "GLP" (Good Laboratory Practice), відображених в настанові "Лікарські засоби. Належна лабораторна практика", затвердженої Законом України наказом МОЗ України № 95 від 16 лютого 2009 р. і з дотриманням основних положень Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовуються в експериментах та в інших наукових цілях від 18 березня 1986 p., Директиви Європейського парламенту та Ради ЄС 2010/63/ЄС від 22 вересня 2010 р. про захист тварин, які використовуються для наукових цілей, наказу МОЗ України від 14 грудня 2009 p. № 944 "Про затвердження Порядку проведення доклінічного вивчення лікарських засобів та експертизи матеріалів доклінічного вивчення лікарських засобів", Закону України від 21 лютого 2006 p. № 3447-IV "Про захист тварин від жорстокого поводження". Піддослідні тварини були розділені на 4 групи: І - інтактні щури (n=7), II - щури зі змодельованим АА (n=7) без лікування (контроль), III - щури з АА (n=7), ліковані ібупрофеном (218 мг/кг, внутрішньошлунково (в/ш)), IV - щури з АА (n=7) ліковані ібупрофеном в/ш (218 мг/кг) в комбінації з вінбороном (11 мг/кг, в/ш). 1 UA 117538 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 АА моделювали шляхом субплантарного введенням повного ад'юванту Фрейнда (complete Freund's adjuvant CFA (Thermo scientific, США), 100 мкл/щура), який містить полісахариди вбитої нагріванням полички Коха (Mycobacterium tuberculosis-Mtb, 5 мг/мл) та складні жирні кислоти (деривати ланоліну) з емульгатором (вазелінова олія) у співвідношенні 1:2 в праву задню кінцівку щурів [Freund J. Some aspects of active immunization/ J. Freund // Annual Review of Microbiology. - 1947. - Vol. 1.- P. 291-308.]. День введення ад'юванту вважали як "0" день експерименту. Максимальний прояв місцевої запальної реакції, яка супроводжувалась значним збільшенням об'єму кінцівки, визначався на 12-14 добу [Павлюк-Гаврилова Г.П. Особливості фармакодинаміки диклофенаку та німесуліду за умов комбінованого застосування з амлодипіном на моделі ревматоїдного артриту: дис. на здобуття наук. ступ. к. мед. н. за спец. "Фармакологія" / Ганна Василівна Павлюк-Гаврилова; ДУ "Інститут фармакології та токсикології НАМН України". - К., 2016. - 151 с.], далі активність запального процесу поступово зменшувалась. Лікування АА проводилось з 14 по 28 день, шляхом внутрішньошлункового введення досліджуваних препаратів. Початок введення лікарських засобів відповідав максимальній запальній реакції [Доклінічні дослідження лікарських засобів: метод, рекоменд.; за ред. член-кор. АМН України О.В. Стефанова. - К.: ВД "Авіцена", 2001. - 527 с.]. Ібупрофен (ЗАТ "Фармацевтична фірма "Дарниця", Україна), вводили внутрішньошлунково у вигляді суспензії на основі емульгатора поліоксіетилен (20) сорбітан моноолеату (інші назви: Твін-80 (Tween 80), Полісорбат-80 (Polysorbat-80), E433) та води pro injectionibus (ПАТ "Галичфарм", Україна). Вінборон (ПАТ НВЦ "Борщагівський ХФЗ", Україна), розчинений у воді pro injectionibus (ПАТ "Галичфарм", Україна), вводився за 60 хв. до введення ібупрофену, двічі на добу. Для екстраполяції середньотерапевичних доз для людини на ізоефективні дози для щурів нами здійснено перерахунок за методом Риболовлєва Ю.Р. та співав. (1979 p.). Доза ібупрофену (ЗАΤ "Фармацевтична фірма "Дарниця", Україна) для людини 2400 мг (0,8 г по 3 р/д), яка має достатню протизапальну активність і рекомендована для лікування РА [Применение нестероидных противовоспалительных препаратов. Клинические рекомендации/ А.Е. Каратеев, Н.Н. Яхно, Л.Б. Лазебник, М.Л. Кукушкин, В.Н. Дроздов, В.А. Исаков, Е.Л. Насонов. - М.: ИМА-ПРЕСС, 2009. - 168 с.], при перерахунку відповідає ізоефективній дозі для щурів 218 мг/кг. Доза вінборону (ПАТНВЦ "Борщагівський ХФЗ", Україна) для людини 120 мг (0,04 г по 3 р/д), яка рекомендована до застосування в лікуванні хворих на виразкову хворобу шлунка та дванадцятипалої кишки [Степанюк Η.Γ. Ефективність вінборону при еразивновиразкових ушкодженнях гастродуоденальної зони: дис. на здобуття наук. ступ. к. мед. н. за спец. "Клінічна фармакологія»/ Наталія Георгіївна Степанюк; ВДМУ ім. М.І. Пирогова. - К., 2002. - 184 с.] відповідає дозі для щурів 11 мг/кг. Евтаназію тварин проводили на 28 добу експерименту шляхом цервікальної дислокації під інгаляційним трихлорметановим (СНСІ3) наркозом, після чого виконували ампутацію задніх кінцівок на рівні кульшових суглобів (art. coxae) з подальшою фіксацією матеріалу у 10 % водному розчині нейтрального формаліну. За даними Aurell Y. та співав. (2014 р.) [16. Aurell Y. Work in progress: cone beam computed tomography (CBCT or extremity CT) a new tool for evaluation of erosions in patients with rheumatoid arthritis/ Y. Aurell, M. Malac, K. Forslind// European Society of Musculoskeletal Radiology. 2014. http://dx.doi.org/10.1594/essr2014/P-0028. - DOI: 10.1594/essr2014/P-0028] в діагностиці PA найінформативнішим методом інструментальної діагностики є комп'ютерна томографія. Зважаючи на малі розміри досліджуваного матеріалу нами було виконано КПКТ. Дослідження проведено на базі Центру медичної 3D діагностики (м. Львів, Україна) за допомогою цифрового панорамного конусно-променевого томографу Point 3D Combi 500 (PointNix, Південна Корея), використовуючи площинний сенсор з ділянкою сканування 9×12 см і променевим навантаженням 30-100 мкЗв [Al-Ekrish A. A. A comparative study of the a acuracy and reliability of multidetector computed tomography and cone beam computed tomography in the assessment of dental implant site dimension/ A. A. Al-Ekrish, M. Ekram // Dentomaxillofacial Radiollogy. - 2011. - № 40. - P. 67-75.]. Сканування проводили з напругою 52,0 kV та силою тока 6,0 mA, які були визначені нами емпірично, як оптимальні для дослідження задніх кінцівок щурів. Мультиплантарну реконструкцію (Multi-Planar Reconstruction MPR) кісткових структур високої роздільної здатності здійснювали за допомогою програмного забезпечення "RealScan-CD Viewer". За допомогою програмного забезпечення "RealScan CD Viewer" (PointNix, Південна Корея) проводили вимірювання ширини та висоти суглобу. Вимірювання досліджуваних показників проведено за уніфікованим алгоритмом: ширину суглобу визначали у фронтальній площині, з попереднім налаштуванням векторних ліній паралельно поздовжнім осям кісткових структур ділянки дослідження та збільшенням товщини відображення зрізу до 2 мм. Вимірювання висоти 2 UA 117538 U 5 10 15 20 25 30 35 суглобу було проведено по його середній частині в сагітальній площині з попереднім налаштуванням сагітального вектору паралельно поздовжній осі проксимальної трубчастої кістки, з додатковим збільшенням товщини відображення зрізу до 2 мм. Запропонований алгоритм дозволяв мінімізувати явища просторового накладення анатомічних структур. Оцінку ефективності протизапальної терапії проводили шляхом порівняння розрахованих за отриманими лінійними розмірами об'ємів дванадцяти суглобів (І та V заплесно-плеснових суглобів, І - V плесно-фалангових суглобів та проксимальних міжфалангових суглобів І - V пальців стопи суглобів), ширини та висоти кісткових рядів заплесни і плесни. Статистичну обробку одержаних результатів проведено з використанням прикладної програми для роботи з електронними таблицями "Microsoft Office Excel 2003; 2007" (Microsoft Corporation, США) за допомогою розширення "Real Statistics" у середовищі Widows XP Professional (Microsoft Corporation, США). Оцінку характеру розподілу величин в кожній групі проводили з використанням критерію Шапіро-Вілка (Shapiro-Wilk). Однорідність дисперсій визначали за критерієм Левена (Levene's test). Для оцінки значущості виявлених відмінностей досліджуваних показників за різних умов експерименту проводили статистичний аналіз з використанням параметричних або непараметричних критеріїв [Zar J. Η. Biostatistical analysis (5 ed.). - Prentice-Hall, Englewood. Cliffs N.J. - 2014. - 751 p.] При нормальному розподілі незалежних величин відмінності між групами визначали попарно за t-критерієм Ст'юдента, який порівнювали з критичними значеннями при рівні вірогідності вище 95,0 % (р0,05), вище 99,0 % (р0,01), вище 99,5 % (р0,005) та вище 99,9 % (р0,001). При ненормальному розподілі незалежних величин відмінності між групами визначали попарно за критерієм Манна-Уїтні (Mann-Whitney). Цифрові данні у разі нормального розподілу величин наведені у вигляді "М±m" (М±SE), де Μ - середнє арифметичне значення, m (SE) - стандартна похибка середнього арифметичного. При ненормальному розподілі отриманих величин дані представлено у вигляді Me [LQ; UQ], де Me медіана, [LQ; LJQ] - верхня межа нижнього (першого) квартиля (lower quartile-LQ) та нижня межа верхнього (третього) квартиля (upper quartile UQ) [Подання результатів математичної та статистичної обробки даних медичних і біологічних досліджень у дисертаційних роботах/ А.М. Сердюк, М.Ю. Антомонов, В.Г.Бардов, В.М. Лехан, О.С Прилуцький // Бюлетень Вищої Атестаційної Комісії України. - К., 2010. - Вип. 6. - С. 31-33.]. За даними КПКТ субплантарна інокуляція CFA призвела до збільшення об'єму всіх суглобів задніх кінцівок майже вдвічі (+ 90,1 %) відносно показників інтактних щурів. Найбільший приріст об'єму відмічався в І та V заплесно-плеснових суглобах відповідно на 142,6 % (р0,05) показників І плесно-фалангового суглобу) найвиразніше зменшення об'єму суглобів було відмічено в суглобах, які характеризувались найсильнішою запальною реакцією у тварин контрольної групи. Так об'єм V плесно-фалангового суглобу статистично вірогідно (р