Амперометричний ензимосенсор для визначення концентрації холіну в водних розчинах

Реферат: Амперометричний ензимосенсор для визначення концентрації холіну у водних розчинах за низького потенціалу (0,4 В) складається із портативної системи на основі триелектродного перетворювача, виготовленого методом трафаретного друку, вуглецевий робочий електрод якого від початку вкритий шаром кобальтфталоціаніну, послідовно модифікований додатковою композитною плівкою нафіону з детонаційними наноалмазами і ферментною мембраною на основі холін оксидази. Даний перетворювач внесений до вимірювальної комірки, виходи датчиків призначені для підключення до відповідних входів потенціостату, що призначений для підключення до комп'ютера. UA 118287 U (12) UA 118287 U UA 118287 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Пропонована корисна модель належить до галузі охорони здоров'я, тваринництва та харчової промисловості, і може бути застосована для визначення концентрації холіну у водних розчинах, а більш конкретно до амперометричного ензимосенсора, для визначення концентрації холіну у водних розчинах. Також даний ензимосенсор придатний для перевірки продуктів харчування, насамперед дитячих сумішей, на кількісний вміст холіну, який є вагомим для попередження порушень у функціонування нервової системи та системи обміну жирів у немовлят. Холін (гідроокис 2-оксіетилтриметиламонію) - важливий метаболіт, який належить до вітамінів групи В. Він відіграє ключову роль в нормальному функціонуванні нервової системи. Холін бере участь в утворенні захисної мієлінової оболонки нервів. Наявність холіну в організмі запобігає руйнуванню мієлінового шару та пошкодженню нервових клітин. В організмі з холіну синтезується нейромедіатор, що бере участь у передачі нервового імпульсу - ацетилхолін. Таким чином наявність достатньої кількості холіну запобігає розладам нервової системи. Холін входить до складу фосфоліпідів (наприклад лецитину та сфінгомієліну), тому практично є складовою всіх клітин тіла, він впливає на вуглецевий обмін людини та регулює рівень інсуліну в організмі. Холін знижує рівень холестерину і концентрацію жирних кислот у крові, очищає від холестеринових бляшок стінки судин, приймає участь в синтезі метіоніну, завдяки чому видаляються надлишки гомоцистеїну, що знижує ризик серцево-судинних захворювань. В результаті цього, холін зміцнює серцевий м'яз, нормалізує серцевий ритм. Холін відіграє важливу роль у відтворенні людини. Він бере участь у біосинтезі простагландинів в передміхуровій залозі, підвищує рухливість сперматозоїдів, в літньому віці попереджає порушення роботи передміхурової залози. Він є також гепатопротектором та ліпотропним засобом, в комплексі з лецитином сприяє транспорту та обміну жирів в печінці. Відсутність холіну в харчових продуктах призводить до відкладання жиру в печінці, ураженню нирок та кровотечі. Враховуючи, що холін - це найважливіший будівельний матеріал мозку, додаткове вживання його в їжу вагітними (плід не може самостійно його виробляти) і дітьми перших п'яти років життя позитивно позначається на розумових здібностях малюків. Потреба в холіні становить 0,5 г на день [1-6]. З аналітичної точки зору холін не має властивостей для прямого визначення спектрометричними чи електроаналітичними методами. Такі методи для визначення холіну (вільного чи після виділення з фосфатидилхоліну) здебільшого засновані на визначенні його похідних. Частина спектрофотометричних і електроаналітичних методів базуються на основі реакції, каталізованої холін оксидазою (ХОД) [9, 10]. Наприклад, розроблена система аналізу в проточній системі (flow injection analysis, FIA), яка базується на з'єднанні ферментного реактора з електрохемілюмінісцентним детектором. Цю систему успішно застосовують при визначенні холіну в зразках людської сечі [10]. Ферментний реактор готується ковалентною іммобілізацією ХОД на амінопропілові скляні кульки з порами контрольованого розміру, які потім обережно упаковують в мікроколонку. Іммобілізована ХОД каталізує утворення перекису водню (Н2О2), що перебуває в прямій залежності від концентрації холіну. Ензиматично отриманий Н 2О2 визначають за допомогою електрохемілюмінісцентного детектора, розміщеного на нижній течії ензиматичного реактора, на основі люмінол-Н2О2-електрохемілюмінісцентної системи. В межах оптимальних умов FIA/електрохемілюмінісцентна система показує високу чутливість виявлення холіну з лімітом визначення 0,05 мкМ. Однак, даний метод є високовартісним у зв'язку з використанням електрохемілюмінісцентних детекторів. Також, для визначення холіну застосовують метод, заснований на дії на гладеньку мускулатуру утворюваного з холіну ацетилхоліну або оцінці інтенсивності росту певного організму, як наприклад Neurospora crassa. Після опромінення рентгенівськими чи ультрафіолетовими променями клітини даного організму втрачають здатність до синтезу холіну, і тому можуть рости лише на середовищах, збагачених холіном. Інтенсивність росту і розвитку N.crassa в таких випадках пропорційна концентрації холіну у середовищі [11]. Однак, даний метод здатен вказати тільки відносну кількість холіну в середовищі, а також потребує значних затрат часу та наявності культури N.crassa. Високоточним є метод 1Н ядерної магнітно-резонансної спектроскопії (1Н NMR Spectroscopy), який дає можливість визначати холін у клітинах печінки та зразках їжі. Метод високоефективної рідинної хроматографії є одним із найбільш поширених для визначення холіну в їжі. Він дозволяє визначати холін від 0,25 мкМ. Проте, обидва методи потребують дороговартісного обладнання та висококваліфікованого персоналу. З цією ж проблемою стикаються і інші класично лабораторні методи, такі як: протонна магнітно-резонансна спектрографія по 3Т (Proton MR Spectroscopy at 3T), капілярний електрофорез з наступним 1 UA 118287 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 електрохімічним визначенням, ядерна магніторезонансна спектроскопія та рідинна хроматографна масс-спектрометрія [7, 8, 20, 21, 22, 23]. В тваринництві холін визначають методом капілярного електрофорезу, проте, окрім зазначених вище недоліків, межа виявлення холіну (0,025 г/кг) за цим методом на 3 порядки перевищує цей показник для даного портативного нанокомпозитного амперометричного ензимосенсора [12, 22]. Метод оптичного визначення холіну за допомогою Н2О2 чутливих квантових точок дозволяє працювати в умовах низької концентрації холіну (починаючи із 0,1 мкМ холіну у розчині), проте, лімітується високоточним і дороговартісним виготовленням квантових точок, що не можливо без спеціального обладнання [24]. В основу пропонованої корисної моделі поставлено задачу створення такого амперометричного ензимосенсора для визначення концентрації холіну у розчинах, який би дозволив визначати концентрацію холіну в комплексних рідинах з більш високою чутливістю, точністю, у широкому діапазоні концентрацій, був стабільним та більш перспективним та дешевим для подальшого масового виробництва. Поставлену задачу вирішують запропонованим амперометричним ензимосенсором, для визначення концентрації холіну у водних розчинах за низького потенціалу (0,4 В), який складається із портативної системи на основі трьохелектродного перетворювача, виготовленого методом трафаретного друку, вуглецевий робочий електрод якого від початку вкритий шаром кобальтфталоціаніну, послідовно модифікований додатковою композитною плівкою нафіону з детонаційними наноалмазами і ферментною мембраною на основі холін оксидази, даний перетворювач внесений до вимірювальної комірки, виходи датчиків призначені для підключення до відповідних входів потенціостату, що призначений для підключення до комп'ютера. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де: На фіг. 1 схематично представлено пропонований амперометричний ензимосенсор, для визначення концентрації холіну у водних розчинах, виготовлений методом трафаретного друку для визначення концентрації холіну у водних розчинах; на фіг. 2 показана блок-схема портативного приладу для роботи з амперметричними датчиками на основі триелектродного перетворювача С410; на фіг. 3 продемонстровано відгуки амперометричного ензимосенсора, для визначення концентрації холіну у водних розчинах на додавання холіну на реальному прикладі проведення експерименту; на фіг. 4 наведено графік визначення холіну методом стандартних додавань. Пропонований амперометричний ензимосенсор, для визначення концентрації холіну у водних розчинах складається: З керамічного чипу (КЧ) 1 (фіг. 1), розміром 33×10×0,5 мм, та розміщених на ньому карбонового робочого електрода (РЕ) 2 (діаметром 4 мм), від початку вкритого шаром кобальтфталоціаніну (С 410, Drop Sens), з нанесеним шаром нафіону з наноалмазами та покритого робочою мембраною (РМ) 3, яка містить у своєму складі фермент холіноксидазу, селективну до холіну, додаткового електрода (ДЕ) 4, срібного псевдоелектрода порівняння (СПЕ) 5 та срібних електричних контактів (СЕК) 6 для з'єднання сенсора з потенціостатом, виходи якого підключені до відповідних входів комп'ютерам. Амперометричний ензимосенсор для визначення холіну (АЕ) 7 (Фіг. 2) при роботі знаходиться у вимірювальній комірці з аналізованим розчином 8 (ВК) та входить до складу портативної амперометричної біосенсорної системи для визначення концентрації холіну в розчині (Фіг. 2), що складається з потенціостату µ200 "Drop Sens" (ПС) 9, до якого підключені виходи сенсора, а сам потенціостат приєднаний до комп'ютера (ПК) 10. Амперометричний ензимосенсор для визначення концентрації холіну у водних розчинах визначає холін за принципом реєстрації перекису водню, що утворюється, згідно з реакцією: Холіноксидаза Холін + О2 + Н2О → Бетаїн+2Н2О2(1) + Н2О2→2Н + 2е (2) 55 В процесі ферментативної реакції окислення холіну за участю іммобілізованої холіноксидази утворюється перекис водню (1), який в свою чергу розкладається на поверхні електрода з вивільненням електронів (2). Вивільнення електронів призводить до зміни сили струму, яка реєструється при фіксованому оптимальному потенціалі як відгук ензимосенсора і є мірою концентрації холіну. 2 UA 118287 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Оптимальне співвідношення компонентів ферментативної мембрани було отримано авторами експериментально за умов оцінки оптимальних аналітичних характеристик. Пропонований амперометричний ензимосенсор, для визначення концентрації холіну у водних розчинах, готували наступним чином. Суспензію 1 % наноалмазів (середній розмір часток: 4,5 нм, питома площа поверхні: - 220 2 м /г) у 1 % спиртовому розчині нафіону наносили на поверхню робочого електроду крапельним методом та висушували на повітрі протягом 1 години. Після цього на поверхні модифікованого електроду формували ферментну мембрану з мембранної суміші, яка містила 0,5 % ХОД, 8 % БСА, 5 % гліцерину, 0,2 % декстрану, 2 % лактітолу. Іммобілізацію ферменту здійснювали методом ковалентної зшивки в білковий гель у насичених парах глютарового альдегіду протягом 35 хв., після чого на 1 годину залишали при 4 °C для стабілізації структури мембран. Готову мембрану тричі відмивали 25 мМ фосфатним буфером рН 7,9. Вимірювання амперметричного сигналу ензимосенсора здійснювали за допомогою приладів μStat 200 та μStat 400 ("DropSens", Іспанія) із відповідним програмним забезпеченням, що був підключений до комп'ютера згідно інструкцій, наданих фірмою-виробником (деталі на веб-сайті http://www.dropsens.com/en/inicio.html). Пропоновану систему використовували наступним чином. Вимірювання проводили у відкритій комірці об'ємом 2,5 мл у 25 мМ фосфатному буфері, рН 7,9, за кімнатної температури та при інтенсивному перемішуванні. Перед початком експериментів електродну ділянку амперометричного ензимосенсора витримували у робочому буфері протягом 40 хв. Концентрацію субстратів у комірці змінювали додаванням певних аліквот вихідних розчинів. За величину сигналу портативного нанокомпозитного амперометричного ензимосенсора, що відповідає певній концентрації субстрату, враховували середнє арифметичне з трьох паралельних вимірювань. Похибка вимірювань не перевищувала 5-7 %. Для виготовлення амперометричного ензимосенсора для визначення концентрації холіну у водних розчинах застосований електрод трафаретного друку С410 фірми DropSens на основі вуглецю, вкритого шаром кобальтфталоціаніну - одноразовий пристрій, призначений для визначення перекису водню за низького потенціалу 0,4 В з метою уникнення впливу компонентів суміші на сигнал сенсора у мікрооб'ємах зразка. Комерційний датчик є одноразовим, так як прикріплення медіатора на поверхні електрода не є механічно міцним (утворюються великі агрегати Co-фталоціаніну, які легко злущуються). Поверхню робочого електрода модифікували сумішшю нафіону з наноалмазами (НА), що зробило розроблений датчик придатним для багаторазового використання та покращало його аналітичні харктеристики. В роботі було застосовано наноалмази детонаційного синтезу, модифіковані мурашиною кислотою. НА були використані для збільшення площі реакційної поверхні датчика та підвищення чутливості вимірювань. Стабільну роботу ензимосенсора забезпечили також за рахунок оптимізації складу ферментної мембрани та умов іммобілізації холіноксидази на поверхню модифікованого робочого електрода. При внесенні в дослідну комірку розчину холіну отримували відповідну реакцію дослідної кривої (фіг. 3). Для визначення холіну в невідомих зразках застосовували метод стандартних додавань (Фіг. 4). Авторами були виявлені переваги пропонованого амперометричного ензимосенсора, для визначення концентрації холіну у водних розчинах у порівнянні з існуючими (таблиця). А саме, запропонований ензимосенсор має широкий діапазон визначення (0,0022,5 мМ), найнижчою межею визначення (0,2 мкМ) і високою стабільністю протягом найдовшого проміжку часу (74 % протягом 35 днів), що в сумі дає можливість стверджувати про те, що даний амперометричний ензимосенсор для визначення концентрації холіну у водних розчинах є найкращим з існуючих. 50 3 UA 118287 U Таблиця Електроді Pt Pt Вуг. паст. Pt СВЕ Склад ДіамінобензенБерлінська блакить Полівінілферо-цен хлорат Берлінська блакить АuНЧ-ПВАГлутардегід ПДМДА-FеРО4Берлінська блакить Межа Робочий визнаСтапотенціал, Посилання чення, більність мВ мкМ 85 % / 2 50 0 [13] міс. Час, с Лінійний діапазон, мМ 30 0,052 70 0,0041,2 4 750 [14] 30 0,022 20 50 [15] 20 0,020,4 10 400 2 0,0023,2 0,4 0 1 міс. 80 %/14 дн. 95 % /14 дн. 75 % / 1 міс. [16] [17] Pt SiO2-BHT 15 0,0050,1 0,1 160 Pt-BHT ПДМДАполіаліламінполівініл сульфат 8 0,0050,1 0,2 600 90 % / 1 міс. 400 Запропоно74 %/ 35 ваний дн. ензимосенсор С-Софталціаннафіон-НА 5 10 15 20 25 30 35 БСА-ХОД-Д-Л 20 0,0022,5 0,2 [18] [19] Джерела інформації: 1. Zeisel S.H., da Costa К.A. Choline: an essential nutrient for public health // Nutr. Rev. - 2009.Vol. 67. - P. 615-23. 2. Zeisel S.H. Choline: an essential nutrient for humans // Nutrition. - 2000. - Vol. 6. - P. 669-71. 3. Blusztajn J.K. Choline, a vital amine // Science. - 1998. - Vol. 281. - P. 794-5. 4. Cohen E.L., Wurtman R.J. Brain acetylcholine: control by dietary choline // Science. - 1976. Vol. 191.- P. 561-62. 5. Wilcock G.K., Esiri M.M., Bowen D.M. Alzheimer's disease: Correlation of cortical choline acetyltransferase activity with the severity of dementia and histological abnormalities // Journal of the Neurological Sciences. - 1982. - Vol. 57. Is. 2-3. - P. 407-417. 6. Canty D.J, Zeisel S.H. Lecithin and choline in human health and disease // Nutr. Rev. - 1994.Vol. 52.-P. 327-39. 7. Fayad L.M., Salibi N., Wang X. Quantification of muscle choline concentrations by proton MR spectroscopy at 3T: technical feasibility // AJR Am. J. Roentgenol. - 2010. - Vol. 194(1).-P. 73-79. 8. Mazzetti S., Bracco C, Regge D. Choline-containing compounds quantification by 1H NMR spectroscopy using external reference and noise measurements // Physica Medica. - 2013. - Vol. 29.P. 677-683. 9. A.L. Buchman, M. Sohel, A. Moukarzel, D. Bryant, R. Achanler, M. Awal, P. Burns, K. Dorman, M. Belfort, D. Jenden, D. Killip, M. Roch. // Plasma choline in normal newborns, infants, toddlers, and in very-low-birth-weight neonates requiring total parenteral nutrition. // Nutrition-2001. - Vol. 17. - P. 18-21. 10. Jiye Jin, Masahiro Muroga, Fumiki Takahashi, Toshio Nakamura. // Enzymatic flow injection method for rapid determination of choline in urine with electrochemiluminescence detection. // Bioelectrochemistry. - 2009. 11. Адріанов М. В. // Біологічно активні речовини. - 1999. - Журнал МБФ РГМУ. - Vol. 12. - Р. 27-33. 12. http://www.lumex.ru/complete solutions/13AR03 14_04_1.php. 13. Zhao W., Qiu Q.-Q., Chen H.-Y. Nanocrystallyne diamond modified gold electrode for glucose biosensing // Biosensors and Bioelectronics // 2006. - Vol. 22. - P. 649-655. 14. Coulet P.R. What is a biosensor // Biosensor principles and application / Eds. L.J. Blum, P.R. Coulet.- New York: Marcel Dekker.-1991. - P. 1-6. 15. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. // Москва: Мир, 1982 - Т. 1. - С. 370-376. 4 UA 118287 U 5 10 15 20 25 30 16. El-Sherbeny, Shindla A.A., and Sheriff Y.M. Optimazation of various factors affecting Glucose Oxidase Activity Produced by Aspergillus niger II International Journal of Agriculture@Biology. - 2005. - Vol. 7. - P. 953-958. 17. Rusin M. Karin, Fare L. Т., Stample J.Z. Immobilization of flavoproteins on silicon: Effect of cross-linker chain length on enzyme activity // Biosensensors.& Bioelectronics. - 1992. -Vol. 7.-P. 367373. 18. Gadda G., Fan F., Hoang J.V. On the contribution of the positively charged headgroup of choline to substrate binding and catalysis in the reaction catalysed by choline oxidase// Arch. Bioch. Biophys. - 2006. - 451. - P. 182-187. 19. Gadda G. Kinetic mechanism of choline oxidase from Arthrobacter globiformis/Biochimica et Biophysica Acta. - 2003. - 1646. - P. 112-118. 20. Bruno J.P. Sarter M., Gash C., Parikh V. Choline-and acetylcholine-sensitive microelectrodes // Eur. J. Neurosci. - 2004. - P. 1545. 21. Hefni M., McEntyre C., Lever M., Slow S. A Simple HPLC Method with Fluorescence Detection for Choline Quantification in Foods // Food analytical methods. - 2015. - P. 2401-8. 22. Barkhimer TV, Kirchhoff JR, Hudson RA, Messer Jr WS, Tillekeratne LV. Electrochemical detection of acetylcholine and choline: application to the quantitative nonradiochemical evaluation of choline transport // Analytical and bioanalytical chemistry. - 2008. - P.651. 23. Lenky C.C., McEntyre C.J., Lever M. Measurement of marine osmolytes in mammalian serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Analytical biochemistry. - 2012. - P. 7-12. 24. Chen Z., Ren X., Meng X., Chen D., Yan C., Ren J., Yuan Y., Tang F. Optical detection of choline and acetylcholine based on H2O2-sensitive quantum dots // Biosensors and Bioelectronics.2011. - P. 50-5. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Амперометричний ензимосенсор для визначення концентрації холіну у водних розчинах за низького потенціалу (0,4 В), який складається із портативної системи на основі триелектродного перетворювача, виготовленого методом трафаретного друку, вуглецевий робочий електрод якого від початку вкритий шаром кобальтфталоціаніну, послідовно модифікований додатковою композитною плівкою нафіону з детонаційними наноалмазами і ферментною мембраною на основі холін оксидази, даний перетворювач внесений до вимірювальної комірки, виходи датчиків призначені для підключення до відповідних входів потенціостату, що призначений для підключення до комп'ютера. 5 UA 118287 U Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6