Спосіб подолання антибіотикорезистентності мікроорганізмів-збудників інфекційно-запальних процесів щелепно-лицевої ділянки

Реферат: Спосіб подолання антибіотикорезистентності мікроорганізмів-збудників інфекційно-запальних процесів щелепно-лицевої ділянки людини, який включає виявлення у мікроорганізмів плазмідної ДНК та елімінацію R-плазмід. Визначають антибіотикорезистентні плазмідовмісні штами клінічних ізолятів бактерій-збудників, проводять елімінацію R-плазмід з відібраних штамів обробкою клітин бактерій у інкубаційному середовищі сферичними наночастинками золота або срібла розміром 30 нм протягом 20-24 годин. UA 118412 U (12) UA 118412 U UA 118412 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до наномедицини, а конкретно, до способів подолання антибіотикорезистентності мікроорганізмів. На сьогоднішній день антибіотики широко використовують в медицині та ветеринарії. Як показала практика, таке застосування антибіотиків є прямим шляхом до виникнення і розповсюдження антибіотикорезистентних бактерій. Резистентність патогенних штамів бактерій є серйозною терапевтичною та епідеміологічною проблемою. Відомо, що в бактеріальних популяціях розповсюджені екстрахромосомні фактори спадковості - плазміди [Пехов А.П. Основы плазмидологии. Издательство Российского Университета Дружбы Народов, 1996 г.]. За розміром вони менше хромосомної ДНК, не пов'язані з нею і зазвичай відтворюються окремо від неї. Гени, які переносяться плазмідами, найчастіше не є життєво необхідними для виживання бактерій в звичайних умовах, але можуть надавати клітинам-носіям переваги в боротьбі за існування в деяких особливих обставинах. Надзвичайно розповсюдженими в бактеріальних популяціях є плазміди антибіотикорезистентності (R-плазміди), які несуть гени, що кодують синтез речовин - деструкторів антибіотиків (бета-лактамази, тощо). Протягом короткого проміжку часу сформувався пул полірезистентних патогенних мікроорганізмів. Так, плазмідоасоційовані бета-лактамази, що продукуються грамнегативними бактеріями, в першу чергу ешерихіями та синегнійною паличкою, визначають переважне число внутрішньогоспітальних штамів, резистентних до сучасних антибіотиків. Найчастіше такий тип резистентності виникає в популяціях патогенних стафілококів, ешерихій, сальмонел, синегнійної палички. З епізотичної точки зору надзвичайно небезпечною є пов'язана з плазмідами передача детермінант стійкості до антибіотиків від одного виду патогенних мікроорганізмів до іншого. Відомими шляхами вирішення проблеми резистентності є такі: захист відомих антибіотиків від руйнування ферментами бактерій або видалення їх з бактеріальної клітини за допомогою мембранних насосів; застосування інших антибіотиків обраної групи; застосування комбінації антибіотиків; проведення цільової і вузьконаправленої антибактеріальної терапії; синтез нових сполук, що відносяться до відомих класів антибіотиків; пошук принципово нових класів антибактеріальних препаратів. Перспективним підходом вирішення задачі подолання стійкості бактерій до антибіотиків є використання таких хімічних речовин, які забезпечують ефективну елімінацію R-плазмід з бактеріальних клітин. Наприклад для R-плазмідовмісних сальмонел, шигел і ешерихій такою ДНК-тропною речовиною є акридиновий жовтогарячий. Однак ця речовина є відомим мутагеном, тому її застосування в якості лікарського засобу є неможливим. Елімінації плазмід досягали за допомогою інших хімічних речовин. Так, відомо, що бромистий етидій призводить до втрати плазмідоасоційованого гену резистентності до тетрацикліну з бактерій Staphylococcus aureus 1030 [Ana Lucia Costa Darini A genetic study of a Staphylococus aureus plasmid involving cure and transference //San Paulo Medical Journal. 1996-V. 114., N 1. - P. 1516-3180]. Однак, бромистий етидій є інтеркалюючим агентом, а отже володіє мутагенними властивостями, тому використання такої речовини з метою елімінації R-плазмід є небезпечним. Плазміди антибіотикорезистентності елімінуються з бактерій Escherichia coli під впливом налідиксової кислоти та новобіцину з різним рівнем частоти. [Jochen Weisser, Bernd Wiedemann Elimination of plasmids by new 4-quinolones //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1985. - V. 28. - P. 700702]. Відома висока ефективність (84,17 %) використання налідиксової кислоти і для елімінації плазмід антибіотикорезистентності з бактерій нозокоміального штаму Acinetobacter calcoaceticus ΧΜ 1570 [Yang Sun, Qi Liu, Shuo Chen, Yang Song, Jun Liu, Xuejun Guo, Lingwei Zhu, Xue Ji, Lizhi Xu, Wei Zhou, Jun Qian, Shuzhang Feng Characterization and plasmid elimination of NDM-1-producing Acinetobacter calcoaceticus from China //PLOS ONE. - 2014. - 2. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.010655]. Показано, що R-плазміди бактерій E.coli, Enterobacter, Proteus, Staphylococcus та Yersinia елімінуються з певною частотою при дії на клітину деяких гетероциклічних речовин, які здатні зв'язуватися з ДНК [G.Spengler, A.Molnar, Z.Schelz, L.Amaral, D.Sharpies, J.Molnar The mechanism of plasmid curing in bacteria // Curr Drug Targets. - 2006. - 7(7). - P.823-841]. Задача елімінації плазмід хімічними засобами вирішується або за допомогою високотоксичних агентів, або лише для окремих видів бактерій, які є музейними штамами, а не клінічними ізолятами, або спостерігається низька частота елімінації плазмід. Таким чином, сьогодні безпечні, високоефективні та широкоспецифічні елемінуючі R-плазміди хімічні засоби не відомі. В останні роки проведені дослідження з вивчення взаємодії наночастинок золота та срібла з плазмідною ДНК бактерій штаму E. coli XL1-Blue [Дибкова С.М., Грузіна Т.Г. та ін., Збірник наукових праць Міжнародної наукової конференції "Фактори експериментальної еволюції організмів", Київ, 2014 р., Т. 15, - С. 48-52; Дибкова С.М., Вісник проблем біології та медицини, 1 UA 118412 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2014 р. В3., Т. 2. (111), - С. 314-318]. Як об'єкти досліджень застосовували рекомбінантні плазміди бактерій E.coli XL1-Blue pUC19 та pBR322, які використовуються для клонування та мають гени антибіотикорезистентності: плазміда pUC19 несе ген стійкості до антибіотика ампіциліну, а плазміда pBR322 несе гени ампіцилінової та тетрациклінової резистентності. Обробка препаратів плазмід наночастинками золота (розмірами 20 та 30 нм) або срібла (розміром 30 нм) в інкубаційному середовищі протягом 30-60 хвилин при 24 °C призводила до структурних змін в обох плазмідах, а експерименти щодо взаємодії плазмідовмісних бактерій штаму E. coli XL1-Blue з вказаними наночастинками металів показали їх здатність викликати високу частоту елімінації досліджуваних плазмід із бактеріальних клітин. Беручи до уваги вищесказане, дуже актуальним є застосування наночастинок благородних металів для розробки способів та засобів подолання антибіотибіотикорезистентності різних інфекційних захворювань. Особливо гострою проблемою медицини сьогодні є стійкість до антибіотиків госпітальних штамів патогенних бактерій. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу подолання антибіотикорезистентності збудників інфекційно-запальних процесів щелепно-лицевої ділянки людини. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб включає виявлення у мікроорганізмів плазмідної ДНК та елімінацію R-плазмід, в якому згідно з корисною моделлю визначають антибіотикорезистентні плазмідовмісні штами клінічних ізолятів бактерій-збудників та проводять елімінацію R-плазмід з відібраних штамів обробкою клітин бактерій в інкубаційному середовищі сферичними наночастинками золота або срібла розміром 30 нм протягом 20-24 годин. Рекомендується використовувати наночастинки золота у вигляді колоїдного розчину, одержаного шляхом відновлення аурату калію за методом Девіса, а наночастинки срібла - у вигляді колоїдного розчину, одержаного конденсаційним методом шляхом відновлення солей срібла. Наночастинки металів вводять в інкубаційне середовище у вигляді стерильних водних розчинів у кількості, яка забезпечує вміст наночастинок золота в середовищі 3,0-10,0 мкг/мл, а срібла - 15,0-45,0 мкг/мл (за металом). Нижче наведені приклади здійснення корисної моделі, що заявляється. Приклад 1 Визначали наявність R-плазмід у бактерій, які є основними збудниками інфекційнозапальних процесів щелепно-лицевої ділянки людини: Staphylococcu aureus № 1, S.aureus № 2, S.aureus № 3, S.aureus № 4, Micrococcus sp., Klebsiella pneumonie, Haemophilus influenzae, Enterococcus faecalis. Для цього використовували клінічні ізоляти вказаних бактерій, виділені від хворих з гнійно-запальними захворюваннями щелепно-лицевої ділянки у відділенні щелепнолицевої хірургії № 2 та травматологічного пункту Київської міської клінічної лікарні № 12. Для скринінгу плазмідної ДНК в бактеріальних клітинах здійснювали процедуру отримання препаратів плазмідної ДНК методом лужного лізису за Бірнбоймом і Долі [Birnboim Н.С., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA //Nucleic Acids Res. 1979. - 7, № 6. - Ρ. 513-1523]. Осаджували 100 мл нічної культури бактерій, клітини ресуспендували в 6 мл буферу, інкубували 10 хвилин при 0 °C та проводили лужний лізис за вказаною методикою. Отриману плазмідну ДНК візуалізували методом електрофорезу [Маниатис Е., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Перевод с англ. под ред. акад. А.А. Баева и д-ра биол.наук С.К. Скрябина. Москва: Мир., 1984. - 479 с.]. Таким чином виявлено R-плазміди у бактерій наступних досліджуваних збудників клінічних ізолятів: S.aureus № 2, № 3, № 4, Klebsiella pneumonie, Haemophilus influenzae, Enterococcus faecalis. Ці штами відбирали для подальших досліджень їх антибіотикорезистентності. Приклад 2 Визначали наявність антибіотикорезистентності бактерій клінічних ізолятів, що містять Rплазміди й відібрані за прикладом 1. Для цього 18-годинні культури, що вирощували на м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ) висівали по 0,1 мл на чашки з м'ясо-пептонним агаром (ΜΠΑ). Одночасно з висівом бактерій на середовище культивування ΜΠΑ на поверхні середовища розміщували диски з антибіотиками: стрептоміцином 30 мкг, еритроміцином 15 мкг, цефтазидимом 30 мкг, лінкоміцином 15 мкг, ампіциліном 10 мкг, гентаміцином 10 мкг, тетрацикліном 30 мкг, та канаміцином 30 мкг. Далі проводили культивування бактерій протягом 24 годин при 37 °C в присутності досліджуваних антибіотиків. Визначення антибіотикорезистентності проводили шляхом візуального спостереження за зонами навколо дисків з антибіотиками. Наявність зони 2 UA 118412 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 просвітління навколо диску свідчила про чутливість бактеріального штаму до відповідного антибіотика, а відсутність такої зони - про його резистентність. Зразки клінічних ізолятів бактерій, у яких була виявлена резистентність по відношенню до певних антибіотиків, відбирали та використовували в наступних експериментах як контрольні зразки. Приклад 3 Проводили обробку антибіотикорезистентних штамів бактерій клінічних ізолятів, визначених за прикладом 2, за допомогою наночастинок золота (AuNP) або cрібла (AgNP) з метою елімінації R-плазмід. Для цього застосовували колоїдний розчин золота зі сферичними наночастинками золота середнього розміру 30 нм, одержаний відновленням аурату калію ацетоном або етанолом з використанням як вихідної речовини золотохлористоводневої кислоти Η[ΑuCl4]·4Η2Ο (метод Девіса). Для приготування препаратів наносрібла використовували колоїдний розчин срібла зі сферичними частинками середнього розміру 30 нм, який одержано конденсаційним методом шляхом відновлення солей срібла. Готували вихідні стерильні водні препарати з вмістом наночастинок золота 38,6 мкг/ мл за металом та з вмістом наночастинок срібла 80 мкг/мл за металом. 18-годинні культури бактерій антибіотикорезистентних зразків відібрані за прикладом 2, розводили МПБ у співвідношенні 1:50 та підрощували на качалці 2 години до титру клітин 19 45 2×10 . Далі 1×10 1×10 клітин вносили в пробірки з 2 мл МПБ, куди попередньо додавали вихідний препарат наночастинок золота або срібла у кількості, що забезпечувала вміст золота 3,2 або 9,65 мкг/мл за металом, а срібла - 20 або 40 мкг/мл за металом. Вирощували культури на качалці у темряві при 37 °C. Таку обробку виконували протягом 20-24 годин. Оброблені наночастинками бактеріальні культури висівали по 0,1 мл на чашки з ΜΠΑ та визначали чутливість до антибіотиків так, як описано в прикладі 2. Крім того, оброблені наночастинками металів клітини всіх досліджуваних клінічних ізолятів перевіряли на наявність плазмідної ДНК шляхом виділення плазмід методом Бірнбойма і Долі з послідуючим електрофорезом в агарозному (1 %) гелі та візуалізацією в УФ-світлі як описано в прикладі 1. В результаті такого скринінгу плазмідної ДНК в жодному зі зразків антибіотикорезистентних клінічних ізолятів, відібраних за прикладом 2 та оброблених наночастинками золота або срібла як описано вище, не було знайдено R-плазмід. Висновки щодо подолання антибіотикорезистентності у досліджуваних клінічних ізолятів збудників інфекційно-запальних процесів отримували шляхом порівняння даних щодо резистентності зразків, оброблених наночастинками, з даними, отриманими для контрольних зразків за прикладом 2. Результати взаємодії відібраних за прикладом 2 антибіотикорезистентних штамів досліджуваних збудників S.aureus № 2, № 3, № 4, Klebsiella pneumonie, Haemophilus influenzae, Enterococcus faecalis у вигляді клінічних ізолятів бактерій з наночастинками золота або срібла наведені у таблицях 1-6. Таблиці містять дані щодо чутливості до антибіотиків зразків бактеріальних штамів, оброблених наночастинками золота або срібла і для порівняння - відповідних не оброблених бактерій (контрольних зразків). У таблицях наявність резистентності до антибіотику позначено як "r", а наявність чутливості до антибіотику як "s". Встановлено, що обробка бактеріальних культур клінічних ізолятів S.aureus № 2, № 3, № 4, К. pneumonie, H. influenzae, та Е. faecalis наночастинками золота розміром 30 нм в концентраціях 9,6 та 3,8 мкг/мл за металом та наночастинками срібла розміром 30 нм в концентраціях 40 і 20 мкг/мл за металом призводить до суттєвих змін у антибіотикограмах даних збудників. Як видно з табл. 1-3, резистентність у трьох ізолятів S. aureus до ампіциліну, гентаміцину та тетрацикліну втрачалася шляхом обробки бактеріальних клітин як наночастинками золота так й наночастинки срібла. Ефективнішими щодо втрати ознак резистентності до вищезгаданих антибіотиків у золотистого стафілокока виявилися наночастинки срібла. Обробка клінічних ізолятів S. aureus наночастинками золота в концентрації 3,2 мкг/мл не завжди призводила до втрати чутливості до ампіциліну, гентаміцину та тетрацикліну. Дані табл. 2 і 3 свідчать про ефективну дію наночастинок срібла щодо втрати резистентності до стрептоміцину та еритроміцину у бактерій золотистого стафілокока. При обробці клітин S. aureus № 2 та № 3 наночастинками золота чи наночастинками срібла у більшості випадків спостерігали втрату стійкості до канаміцину. Однак, при концентрації наночастинок срібла 20 3 UA 118412 U 5 10 15 20 25 30 мкг/мл у бактерій штаму S. aureus № 2 спостерігалася відсутність втрати резистентності по відношенню до цього антибіотика. У випадку обробки наночастинками золота чи срібла клінічного ізоляту Klebsiella pneumonie (див. табл. 4) спостерігали стійку втрату резистентності до антибіотиків цефтазидиму та тетрацикліну під впливом наночастинок срібла в обох концентраціях та наночастинок золота в концентрації 3,2 мкг/мл за металом. Набуття антибіотикочутливості до ампіциліну у даного штаму спостерігали лише за дії наночастинок золота в концентрації 3,2 мкг/мл. Як показано в табл. 5, у бактерій клінічного ізоляту Haemophilus influensae відбувалася ефективна втрата антибіотикорезистентності до антибіотику тетрацикліну під впливом обох типів наночастинок металів. Антибіотикочутливість таких бактерій проявлялася щодо канаміцину при обробці наночастинками золота в концентрації 3,2 мкг/мл за металом та срібла в концентрації 20 мкг/мл. Щодо втрати стійкості до ампіциліну у бактерій клінічного ізоляту Haemophilus influensae ефективними були лише наночастинки срібла в концентрації 40 мкг/мл. При обробці бактерій даного ізоляту спостерігали втрату стійкості до цефтазидиму під впливом наночастинок золота в концентрації 3,2 мкг/ мл та срібла в концентрації як 40 мкг/мл, так і 20 мкг/мл. Наведені в табл. 6 дані свідчать про те, що бактерії клінічного ізоляту Enterococcus faecalis також втрачали антибіотикорезистентність під впливом наночастинок золота та срібла. Значної уваги заслуговує повна втрата стійкості до ампіциліну як у випадку використання в ролі елімінуючого агенту наночастинок золота так і наночастинок срібла. Також зафіксовано успішну втрату чутливості до стрептоміцину та еритроміцину наночастинками золота в обох концентраціях. Антибіотикорезистентність втрачалася до антибіотиків тетрацикліну та канаміцину при обробці бактерій Enterococcus faecalis наночастинками срібла в концентраціях 40 та 20 мкг/мл. Таким чином, наведені експериментальні дослідження доводять ефективність застосованих препаратів наночастинок срібла та золота як засобів подолання антибіотикорезистентності мікроорганізмів інфекційно-запальних процесів щелепно-лицевої ділянки людини. При цьому елімінацію R-плазмід спостерігали щодо усіх досліджуваних антибіотикорезистентних штамів. Випадки збереження стійкості до деяких антибіотиків у деяких зразках оброблених наночастинками бактерій можна пояснити наявністю у цих штамів інших факторів антибіотикорезистентності крім R-плазмідної. Таблиця 1 Штам бактерій S.aureus №2 Зразок препарату та концентрація наночастинок, мкг/мл контроль AuNP 9.65 AuNP 3.2 AgNP40 AgNP20 Антибіотик Ампіцилін, 10 мкг Гентаміцин, 10 мкг Тетрациклін, 30 мкг r s s s s r s s s s r s s s s Таблиця 2 Зразок Антибіотик препарату та Штам концентрація Стрептоміц Еритроміци Ампіцилін, Рентаміцин Тетрациклі Канаміцин, бактерій наночастинок, ин, 30 мкг н, 15 мкг 10 мкг , 10 мкг н, 30 мкг 30 мкг мкг/мл контроль r r r r r r AuNP 9.65 s s s s s s S.aureus AuNP 3.2 s s r r s s №3 AgNP 40 s s s s s s AgNP20 s s s s s r 4 UA 118412 U Таблиця 3 Зразок Антибіотик препарату та Штам концентрація Стрептоміц Еритроміци Ампіцилін, Гентаміцин, Тетрациклі Канаміцин, бактерій наночастинок, ин, 30 мкг н, 15 мкг 10 мкг 10 мкг н, 30 мкг 30 мкг мкг/мл контроль r r r r r r AuNP 9.65 r r s s s s S.aureus AuNP3.2 r r s r s s №3 AgNP40 s s s г s s AgNP20 s s s г s s Таблиця 4 Штам бактерій Klebsiella pneumonie Зразок препарату та концентрація наночастинок, мкг/мл контроль AuNP 9.65 AuNP 3.2 AgNP 40 AgNP20 Антибіотик Цефтазидим, Ампіцилін, Тетрациклін, 30 мкг 10 мкг 30 мкг r r r r r r s r s s r s s s s Таблиця 5 Зразок препарату та концентрація наночастинок, мкг/мл контроль AuNP 9.65 Haemo philus AuNP3.2 influenzae AgNP40 AgNP20 Штам бактерій Антибіотик Цефтазидим, Ампіцилін, Тетрациклін, Канаміцин, 30 мкг 10 мкг 30 мкг 30 мкг r r r r r r s r s г s s s s s r s r s s Таблиця 6 Зразок Антибіотик препарату та Штам Стрептомі Тетpaц концентрація Еритроміц Ампіцилі Гентаміци Канаміци лінкоміцин бактерій цин, 30 иклін, наночастинок ин, 15 мкг н, 10 мкг н, 10 мкг н, 30 мкг ,15 мкг мкг 30 мкг , мкг/мл контроль r r r r r r r AuNP 9.65 s s s s r r s Enterocoecu AuNP 3.2 s s s s r r s s faecalis AgNP 40 s r s s s s s AgNP20 r s s r s s r 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 1. Спосіб подолання антибіотикорезистентності мікроорганізмів-збудників інфекційно-запальних процесів щелепно-лицевої ділянки людини, який включає виявлення у мікроорганізмів плазмідної ДНК та елімінацію R-плазмід, який відрізняється тим, що визначають антибіотикорезистентні плазмідовмісні штами клінічних ізолятів бактерій-збудників, проводять елімінацію R-плазмід з відібраних штамів обробкою клітин бактерій у інкубаційному середовищі сферичними наночастинками золота або срібла розміром 30 нм протягом 20-24 годин. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що використовують наночастинки золота у вигляді колоїдного розчину, одержаного шляхом відновлення аурату калію за методом Девіса. 5 UA 118412 U 5 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що використовують наночастинки срібла у вигляді колоїдного розчину, одержаного конденсаційним методом шляхом відновлення солей срібла. 4. Спосіб за пп. 1, 2, який відрізняється тим, що наночастинки золота вводять до інкубаційного середовища у кількості 3,0-10,0 мкг/мл за металом. 5. Спосіб за пп. 1, 3, який відрізняється тим, що наночастинки срібла вводять до інкубаційного середовища у кількості 15,0-45,0 мкг/мл за металом. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6