Спосіб переробки плаценти

УКРАЇНА (19) UA (11)15241 (із, С 2 (51) 6А61К35/50 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) СПОСІБ ПЕРЕРОБКИ ПЛАЦЕНТИ (21)94030838 (22)02 07 1993 * (24) 15 09 2000 (46) 15 09 2000. Бюл № 4, 2000 р (72) Морозова Розалія Петрівна, Єрмолова Любовь Степановна, RU, Ніколенко Інна Андріївна, Мєльніков Владімір Ільїч, RU (73) Морозова Розалія Петрівна, Єрмолова Любовь Степановна, RU (56) Патент США №4507229, А 61 К 35/50, 1985 (57) Способ переработки плаценты, включающий измельчение, экстракцию с помощью орга нических реагентов и разделение экстракта на фракции с применением раствора хлорида натрия, отличающийся тем что экстракцию проводят 10-18-кратным объемом смеси хлороформа и этанола в соотношении 2 1, а разделение экстракта на фракции осуществляют путем введения 0,1-0,2-кратного объема 0 , 1 0,15% раствора хлорида натрия, после чего из хлороформной фракции упариванием получают липидный комплекс, а из водно-этанольной фракции после упаривания и сушки получают концентрат аминокислот и пептидов Изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно к производству биологически активных ввществ (БАВ) из сырья животного происхождения Прототипом изобретения является способ получения мембраносвязанного белка РРд, который выделяют из измельченной плаценты путем экстракции сначала 1-5-кратным объемом 0,9%ного раствора хлорида натрия, а затем в присутствии неионных петергентов - полиэтиленгликоля или тритона - Х-100 в концентрации не более 0,5% в соотношении 1 10 (1) Недостатком прототипа является сложное трудоемкое выделение из сырья, богатого биологически активными веществами только одного белкового препарата В основу изобретения поставлена задача создать способ переработки плаценты, позволяющий путем упрощения технологии, подбора условий экстракции и фракционирования обеспечить получение двух комплексов, обладающих различными биологическими свойствами, и их разделение Поставленная задача решается в способе переработки плаценты, включающем измельчение, экстракцию с помощью органических реагентов и разделение экстракта на фракции с применением раствора хлорида натрия, в котором, согласно изобретению экстракцию проводят 10-18кратным объемом смеси хлороформа и этанола в соотношении 2 1, а разделение экстракта на фракции осуществляют путем введения 0 1-0,2-кратного объема 0,1-0,15%-ного раствора хлорида натрия, после чего из хлороформной фракции упари ванием получают липидный комплекс, а из водноспиртовой фракции после упаривания и сушки получают концентрат аминокислот и пептидов Увеличение количества получаемых биологически активных веществ и повышение их выхода достигается проведением экстракции смесью растворителей хлороформа и этанола в указанных количествах и соотношении Применение раствора хлорида натрия в указанных концентрациях дает возможность очень быстро разделить экстракт на два слоя хлороформный и водно-этанольный, обеспечивает полноту разделения, исключает возможность загрязнения одной фракции другой фракцией В результате разделения двух слоев жидкости упрощается метод получения комплексов Получаемые БАВ обладают широким диапазоном действия Например липидный комплекс (таблица 1), в состав которого входят эфиры холестерина, этерифицированные и неэтерифицированные (свободные) жирные кислоты, Сг7 (холестерин и др ), Сзо (ланостерин и др ) - стерины, фосфолипиды с преимущественным содержанием фосфатидилхолина (лецитина) Последние обладают регенерирующими и эмульгирующими свойствами, улучшают транспорт жиров в организме и могут найти широкое применение в косметической и фармакологической промышленности Получаемый концентрат (таблица 2), содержащий 80% аминокислот и 50% пептидов является уникальным, т к в известной информации не обнаружено комплексов в которых аминокислоты и пептиды находились бы в соотношении 1 1 СМ О чаем ю О» 15241 Кроме того, этот концентрат содержит в свободном виде глютаминовую кислоту, тогда как в состав пептидов входят цистеин и метионин Такой состав белкового концентрата обеспечивает регулирование азотистого обмена и окислительновосстановительных реакций Пример осуществления способа 1 кг плаценты сельскохозяйственного животного измельчают на мясорубке до получения частиц размером не более 1 мм и экстрагируют хлороформно-этанольной смесью (2 1) при соотношении объемов сырья и смеси растворителей 1 18, при комнатной температуре и перемешивании в течение 1,5 часа Затем массу фильтруют через бязевый мешок на нутч-фильтре и промывают небольшими порциями той же смеси растворителей 3 раза по 0,2 от первоначального объема смеси растворителей К фильтрату прибавляют 0,2-кратный объем 0,12%-ного раствора хлорида натрия, перемешивают и отстаивают до полного просветления двух слоев жидкости Нижний хлороформенный слой сливают в выпарной аппарат через бязевый мешок, содержащий безводный N32SO4 (1 часть на 10 частей хлороформа), и хлороформ удаляют в вакууме полностью Полученный продукт коричневого цвета представляет собой комплекс липидов, легкоплавкий (t плавления 50°С) Выход - 12% от сухого веса сырья Водно-спиртовый слой помещают в выпарной аппарат и удаляют основную часть спирта в вакууме Полученный раствор сушат, остаток белковый комплекс, порошок кремового цвета, представляет собой концентрат аминокислот и пептидов Кроме того, этот продукт содержит небольшое количество углеводов, фосфолипидов Выход - 10% от сухого веса сырья Этот и другие примеры осуществления способа приведены в таблице 3 Другие примеры осуществлялись согласно приведенной в таблице 1 смехе, только изменялось соотношение смеси растворителей и сырья, а также объем и концентрация раствора хлорида натрия Из таблицы 3 видно, что способ дает хорошие результаты при соотношении сырье смесь растворителей в пределах 1 1 18, концентрация раствора NaCI 0,10—0,15% и 0.1-0,2-кратном объема раствора NaCI Оптимальным является соотношение 1 18, концентрация р pa NaCI 0 12% и объем его 0,2-кратный Изменение соотношения сырья и растворителей, объема и концентрации раствора NaCI в сторону уменьшения или увеличения указанных в формуле изобретения пределов не приводит к увеличению выхода конечных продуктов и, следовательно, нецелесообразно Биологическую активность получаемых препаратов изучали при исследовании обмена жиров на крысах весом 100 г, у которых вызывали ожирение печени ("жировую печень") кормлением их пищей, богатой жирами и бедной белками Препараты вводили орально в соотношении 1 1 в количестве 0,1% к основному рациону Установлено, что введение в организм животных получаемых препаратов как совместно, так и раздельно предохраняет их от накопления жира в печени Таким образом, можно сделать вывод о липотропном действии этих препаратов Сопоставление нового способа и аналогов, а также исследование биологической активности конечных продуктов доказывает преимущества нового решения, которые заключаются в получении по предложенной несложной схеме биологически активных препаратов липидной и белковой природы широкого спектра действия с высоким выходом в отличие от аналогичных способов, где выделяют монопродукт в небольших количествах при осуществлении ряда трудоемких операций узконаправленной специфичности (иммуносорбции) Таблица 1 Липидный комплекс Наименование липидов Содержание, % от общих липидов Эфиры холестерина 29,0 Этирифицированные жирные кислоты 14,0 Неэтирифицированные жирные кислоты (свободные) 7,0 Сг7-стерины (холестерин и другие стерины) 28,0 Сзо-стерины (ланостерин и другие стерины) 9,0 Фосфолипиды 4.0 Неидентифицированные липиды 8,0 Нелипидные вещества 1.0 15241 Таблица 2 Комплекс аминокислот и пептидов Аминокислоты Свободные, мг % В составе пептидов, мг % Лизин 4,36 6,48 Гистидин 0,83 1,80 Аргинин 4 28 3,69 Аспарагиновая кислота 9,03 10,94 Треонин 3,92 4 96 Серии 3,34 4 68 Глютаминовая кислота 41,95 28.92 Пролин 3,05 3,33 Глицин 7,63 8.07 Алании 7,79 6,48 Цистеин 0,17 0.90 Валин 3,67 3.73 Метиоиин 0.33 0,99 Иэолейцин 1.54 2,11 Лейцин 3,78 6,44 Тирозин Фенилаланин 2,15 2,15 2,53 3 88 Таблица 3 Примеры осуществления способа № Экстракция Промывка примера Липидов Аминокислот и пептидов 0,2 .«. 0.2 0,1 10,0 9.0 0.1 0,15 11,3 9.5 __ • __ • 0.2 0,12 120 10,0 __ • .-. 0.08 0,08 90 8.0 0,25 0,2 9,0 7.5 Соотнош объемов сырья и смеси растворителей Время экстракции, час. Кол-во промыв 21 1 10 3 1 14 1,5 _«_ 3 м 1 18 .«. 4 .". 18 .«. 5 и 1 20 2 _ . Выход, % от сухого веса сырья Объм Объем Концентр смеси NaCI, no NaCI, % раствори- отношетелей, ПО нию к отноше- первонач нию к его объему первона- р-рителей чальному Соотнош объемов растворителей 1 Обработка NaCI Тираж 50 екз Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 101 (03122)3-72-89 (03122)2-57-03 УКРАЇНА (19) U А (11> 15241 (13) (5і)б А 61 К 37/00 ОПИС ДО ПАТЕНТУ ДЕРЖАВНЕ ПАТЕНТНЕ ВІДОМСТВО НА ВИНАХІД без проведення експертизи по суті на підставі Постанови Верховної Ради України ЬЬ 3769-ХИ від 23.XU. 1993 р. Публікується в редакції заявника (54) СПОСІБ ПЕРЕРОБКИ ПЛАЦЕНТИ 1 (21)94030838 (22) 02.07.93 (24) 30.06.97 (46) 30.06.97. Бюл. № З (56) Патент США № 4507229, кл. А 01 К 35/50. (72) Морозова Розалія Петрівна, Єрмолова Любов Степанівна, Ніколенко Інна Андріївна, Мельников Володимир Ілліч (73) Морозова Розалія Петрівна, Єрмолова Любов Степанівна (UA) (57) Способ переработки плаценты, включающий измельчение, экстракцию с помощью органических реагентов и разделение экстракта на фракции с применением раствора хлорида натрия, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что экстракцию проводят 10-18-кратным объемом смеси хлороформа и этанола в соотношении 2:1, а разделение экстракта на фракции осуществляют путем введения 0,10,2-кратного объема 0,1-0,15%-ного раствора хлорида натрия, после чего из хлороформной фракции упариванием получают липидный комплекс, а из водно-этанольной фракции после упаривания и сушки получают концентрат аминокислот и пептидов. С > СП Изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно к производству биологически активных веществ (БАВ) из сырья животного происхождения. Прототипом изобретения является способ получения мембраносвязанного белка РР4. который выделяют из измельченной плаценты путем экстракции сначала 1-5кратным объемом 0,9%-ного раствора хлорида натрия, а затем в присутствии неионных детергентов - полиэтиленгликоля или тритона -Х-100 в концентрации не более 0,5% в соотношении 1:10 [1]. Недостатком прототипа является сложное трудоемкое выделение из сырья, богатого биологически активными веществами, только одного белкового препарата. В основу изобретения поставлена задача создать способ переработки плаценты, позволяющий путем упрощения технологии, подбора условий экстракции и фракционирования обеспечить получение двух комплексов, обладающих различными биологическими свойствами, и их разделение. Поставленная задача решается в способе переработки плаценты, включающем измельчение, экстракцию с помощью органических реагентов и разделение экстракта на фракции с применением раствора хлорида натрия, в котором, согласно изобретению, экстракцию проводят 10-18-кратным объемом смеси хлороформа и этанола в соотношении 2:1, а разделение экстракта на фракции осуществляют путем введения 0,1 -0,2-кратного объема 0,1-0,15% -ного рас ю 15241 твора хлорида натрия, после чего из хлороформной фракции упариванием получают липидный комплекс, а из водно-спиртовой фракции после упаривания и сушки получа5 ют концентрат аминокислот и пептидов. Увеличение количества получаемых биологически активных веществ и повышение их выхода достигается проведением экстракции смесью растворителей: хлороформа и этанола в указанных количествах и соотно- 10 шении. Применение раствора хлорида натрия в указанных концентрациях дает возможность очень быстро разделить экстракт на два слоя: хлороформный и водноэтанольный, обеспечивает полноту 15 разделения, исключает возможность загрязнения одной фракции другой фракцией. В результате разделения двух слоев жидкости упрощается метод получения комплек20 сов. Получаемые БАВ обладают широким диапазоном действия. Например: липидный комплекс (табл. 1), в состав которого входят эфиры холестерина, этерифицированные и неэтерифицированные (свободные) жирные 25 кислоты, С27 (холестерин и др.), Сзо(ланостерин и др.) - стерины, фосфолипиды с преимущественным содержанием фосфатидилхолина (лецитина). Последние обладают регенерирующими и эмульгирующими свойст- 30 вами, улучшают транспорт жиров в организме и могут найти широкое применение в косметической и фармакологической промышленности. Получаемый концентрат (табл. 2), содер- 35 жащий 80% аминокислот и 50% пептидов, является уникальным, т. к. в известной информации не обнаружено комплексов, в которых аминокислоты и пептиды находились бы в соотношении 1:1. 40 Кроме того, этот концентрат содержит в свободном виде глютаминовую кислоту, тогда как в состав пептидов входят цистеин и метионин. Такой состав белкового концентрата обеспечивает регулирование азотисто- 45 го обмена и окислительновосстановительных реакций. Пример осуществления способа. 1 кг плаценты сельскохозяйственного животного измельчают на мясорубке до пол- 50 учения частиц размером не более 1 мм и экстрагируют хлороформно-этанольной смесью (2:1) при соотношении объемов сырья и смеси растворителей 1:18, при комнатной температуре и перемешивании в те- 55 чение 1,5 часа. Затем массу фильтруют через бязевый мешок на нутч-фильтре и промывают небольшими порциями той же смеси растворителей 3 раза по 0,2 от первоначального объема смеси растворите лей. К фильтрату прибавляют 0,2-кратный объем 0,12%-ного раствора хлорида натрия, перемешивают и составляют до полного просветления двух слоев жидкости. Нижний хлор хлороформенный слой сливают в выпарной аппарат через бязевыймешок, содержащий безводный Na2SO/}(1 часть на 10 частей хлороформа), и хлороформ удаляют в вакууме полностью. Полученный продукт коричневого цвета представляет собой комплекс липидов, легкоплавкий (t плавления 50°С). Выход - 12% от сухого веса сырья. Водно-спиртовый слой помещают в выпарной аппарат и удаляют основную часть спирта в вакууме. Полученный раствор сушат, остаток - белковый комплекс, порошок кремового цвета, представляет собой концентрат аминокислот и пептидов. Кроме того, этот продукт содержит небольшое количество углеводов, фосфолипидов. Выход - 10% от сухого веса сырья. Этот и другие примеры осуществления способа приведены в таблице 3. Другие примеры осуществлялись согласно приведенной в таблице 1 схеме, только изменялось соотношение смеси растворителей и сырья, а также объем и концентрация раствора хлорида натрия Из таблицы 3 видно, что способ дает хорошие результаты при соотношении сырья; смесь растворителей в пределах 1:118, концентрация раствора NaCI 0,10-0,15% и 0,1-0,2-кратном объеме раствора NaCI. Onтимальным является соотношение 1:18, концентрация р-ра NaCI 0,12% и объем его 0,2-кратный. Изменение соотношения сырья и растворителей, объема и концентрации раствора НаС\ в сторону уменьшения или увеличения указанных в формуле изобретения пределов не приводит к увеличению выхода конечных продуктов и, следовательно, нецелесообразно. Биологическую активность получаемых препаратов излучали при исследовании обмена жиров на крысах весом 100 г, у которых вызывали ожирение печение ("жировую печень") кормлением их пищей, богатой жирами и бедной белками. Препараты вводили орально в соотношении 1:1 в количестве 0,1% к основному рациону. Установлено, что введение в организм животных получаемых препаратов как совместно, так и раздельно предохраняет их от накопления жира в печени. Таким образом, можно сделать вывод о липотропном действии этих препаратов. Сопоставление нового способа и аналогов, а также исследование биологической 15241 активности конечных продуктов доказывает преимущества нового решения, которые заключаются в получении по предложенной несложной схеме биологически активных препаратов липидной и белковой природы широкого спектра действия с высоким выхо 6 дом в отличие от аналогичных способов, где выделяют монопродукт в небольших количествах при осуществлении ряда трудоемких операций узконаправленной 5 специфичности (иммуносорбции). Таблица 1 Липидный комплекс Наименование липидов Содержание, % от общих липидов Эфиры холестерина 29,0 • Этерифицированные жирные кислоты 14,0 Неэтерифицированные жирные кислоты (свободные) 7.0 Сг7-стерины (холестерин и другие стерины) 28.0 Сзо-стерины (ланостерин и другие стерины) 9,0 Фосфолипиды 4.0 Неидентифицированные липиды 8,0 Нелипидные вещества 1,0 Таблица 2 Аминокислоты Свободные, мг% В составе пептидов, мг% Лизин 4.36 6,48 Гистидин 0,83 1.80 Аргинин 4,28 3,69 Аспарагиновая кислота 9,03 10.94 Треонин 3.92 4,96 Серии 3.34 4.68 Глютаминовая кислота 41,95 28,92 Пролин 3.05 3.33 Глицин 7.63 8,07 Аланин 7,79 6,48 Цистеин 0,17 0,90 Валин 3,67 3,73 Метионин 0,33 0,99 Изолейцин 1,54 2,11 Лейцин 3,78 6,44 Тирозин 2,15 2,53 Фенилаланин 2.15 3,88 15241 Таблица 3 Примеры осуществления способа Экстракция Промывка Обработка NaCI Выход, % от сухо примера го веса сырья Соот Соот Время нош. нош. экстра- промыв. объе объе кции, мов рас мов час Объем Кол-во Объем Кон Липи Амино смеси NaCI, центр. ДОВ кислот раство- по отно- NaCI, % рите и пепти шению дов * лей, по к перво твори сырья и телей смеси отноше нач. раство нию к объему рителей его пер- р-ритевона лей чальному объему 2:1 2 _ н _ 3 — * — 4 и 5 • — w —. Упорядник Замовлення 4174 1:10 1.5 3 1:14 __ и _ _ я _^ 1:18 _ и _ и 1:8 1 _ и __ _ и 1:20 _ " _ _ и _ Техред М.Моргентал 0,1 10,0 9.0 0.1 0.15 11.3 9,5 0,12 12,0 10,0 0,08 0.08 9,0 8,0 0,25 - • — ~ * . 0,2 0,2 _ 0,2 _ * _ * 0,2 9.0 7,5 Коректор А. Обручар Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, КиТв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.Гагаріна, 101