Спосіб одержання біологічно активних речовин з біомаси дощових черв’яків

Способ получения биологически активных веществ из биомассы дождевых червей, включающий очистку и измельчение биомассы, коагуляцию протеинового комплекса в процессе экстракции, разделение комплекса и экстракта, о т л и ч а ю щ и й с я тем. что экстракцию проводят (20-28)-кратным объемом смеси хлороформа и этанола в соотношении 2:1 до получения протеинового комплекса в виде осадка и экстракта, в который вводят при перемешивании (0.2-0,3)кратный объем 0,1-0,5% раствора хлорида натрия и разделяют на хлороформный слой, из которого после концентрирования получают липидный комплекс, и водно-спиртовой слой, из которого после сушки получают концентрат аминокислот и пептидов. Изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно, к производству биологически активных веществ (БАВ) из сырья животного происхождения. Получаемые вещества могут использоваться в качестве биологически активной основы при производстве медицинских, косметических, пищевых и кормовых средств. Прототипом изобретения является способ получения кормового препарата из дождевых червей. Способ включает очистку и измельчение биомассы дождевых червей, коагуляцию протеинового комплекса в процессе экстракции растительным или животным маслом, разделение комплекса и экстракта и дополнительную очистку комплекса от масла органическими растворителями. По способу-прототипу можно получить только один конечный продукт - кормовой препарат, представляющий собой протеи новый комплекс. Другие биологически активные вещества, экстрагируемые маслом, не используются. Кроме того, для получения кормового препарата используют пищевые продукты - растительное и животное масло, что технологически нецелесообразно и экономически неоправдано. В основу изобретения поставлена задача создать способ получения биологически активных веществ из биомассы дождевых червей, позволяющий путем подбора условий экстракции и фракционирования обеспечить получение биологически активных веществ, обладающих различными биологическими свойствами, и разделение их на отдельные комплексы: протеины, липиды, аминокислоты и пептиды. Поставленная задача решается в способе получения биологически активных веществ из биомассы дождевых червеи, включающем очистку и измельчение био (21)93090867 (22) 11.02.93 (24) 19.07.99 (46) 19.07.99. Бюл. № 4 (56) Заявка Японии N? 2-15186, кл. А 23 К 1/10. (72) Морозова Розалія Петрівна. Холодова Юліана Данилівна, Ніколенко інна Андріївна, Малахова Олена Арнольдівна, Повхан Мирон Федорович (73) Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна Національної академії наук України С о с» о з 10814 нового комплекса в процессе экстракции, разделение комплекса и экстракта, в котором согласно изобретению экстракцию проводят (20-28)-кратным объемом смеси хлороформа и этанола в соотношении 2:1 до 5 получения протеинового комплекса в виде осадка и экстракта, в который вводят при перемешивании (0,2-О.З^кратный объем 0,1-0,5% раствора хлорида натрия и разделяют на хлороформный слой, из которого 10 после концентрирования получают липидный комплекс, и водно-спиртовой слой, из которого после сушки получают концентрат аминокислот и пептидов. Экстракция биомассы смесью раство- 15 рителей хлороформ-этанол обеспечивает одновременное получение трех биологически активных препаратов, обладающих различной физиологической функцией: фракций протеинов, лигшдов, аминокислот 20 и пептидов. Подбор объема и соотношения растворителей обеспечивает оптимальный выход конечных продуктов. Получаемый протеиновый комплекс представляет собой белковый препарат в виде набора амино- 25 кислот (табл.1), необходимых в кормовом рационе сельскохозяйственных животных, птиц, рыб, для увеличения их прироста путем повышения усвояемости и биологической ценности кормов. Получаемый 30 липидный комплекс представляет собой кониентрат лнпидов (табл.2), который используют в качестве активного ингредиента пріл производстве лекарственных и косметических средств. По/, ученный концентрат 35 аминокислот и пептидос ,,обл.З) используют как лекарственное средство (1-3%-ный раствор в дистиллированной воде) для лечения гпазных болезней. П р и м е р. В стеклянный стакан емко- 40 стью 5 л помещают 1 кг гумуса, содержащего 100 г червей. Добавляют воду водопроводную в соотношении вода-гумус 3:1, перемешивают в течение 5 мин, отстаивают в течение 15 мин и декантируют верх- 45 ний слой гумуса. Промывку повторяют еще 2 раза. К червям, находящимся на дне стакана, снова приливают воду и отстаивают в течение 1 ч. Затем содержимое стакана выгружают на сито с размером пор 0,2 мм и 50 встряхивают в течение 10 мин. Червей измельчают на мясорубке до величины частиц размером не более 1 мм. В экстрактор, снабженный якорной мешалкой и спускным краном, загружают 100 55 г измельченных червей и смесь хлороформ : :этанол - 2:1 в соотношении сырье : растворитель 1:20 соответственно, всего 2 л. Включают мешалку со скоростью вращения 50 об/мин и проводят экстракцию в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Затем мешалку отключают и всю массу переносят на нутч-фильтр, с помощью вакуума отсасывают растворитель. Массу на нутч-фильтре промываю 2 раза по 0,4 л той же смесью растворителей и полностью отсасывают оакуум-насосом. С нутч-фильтра массу выгружают на эмалированный лоток, который помещают в вакуум-сушильный шкаф. Сушат при 50°С до полного удаления запаха растворителя и остаточной влажности более 5%. Получают протеиновый комплекс (табл.1). Фильтрат из емкости нутч-фильтра переносят в сборник, снабженный якорной мешалкой, смотровым стеклом и спускным краном, прибавляют 0,1% р-р хлористого натрия в количестве 0,2 объема по отношению к общему объему фильтрата, включают мешалку и перемешивают в течение 3 мин. Затем от стаивают до полного расслоения двух слоев и просветления нижнего хлороформного слоя в течение 2 ч. Хлороформный слой сливают через нижний спуск на нутч-фильтр, бязевый мешок которого содержит безводный натрия сульфат, и весь растворитель отсасывают вакуум-насосом. Хлороформный экстракт перекачивают в выпарной аппарат и растворитель упаривают при 50°С в вакууме до объема 0,2 л. Полученный концентрат фасуют в бюксы емкостью 0,05 л по 0,025 л, помещают их в вакуум-сушильный шкаф и высушивают при 50°С до полного удаления запаха растворителя. Хлороформ поступает на регенерацию. Получают липидный комплекс (табл.2). Водно-спиртовой р-р, оставшийся в сборнике, перекачивают в выпарной аппарат и удаляют основную массу спирта, высушивают до получения порошковой массы и стерилизуют в упаковочной таре (типа пенициллиновой). Получают концентрат аминокислот и пептидов (табл.3). Выход конечных продуктов на сухой вес сырья составляет: протеиновый комплекс 56,0%, липидный комплекс - 10%, концентрат аминокислот и пептидов - 10%, другие вещества (нуклеотиды, полисахариды, феромоны, минеральные вещества) - 24%. Протеиновый комплекс представляет собой порошок розовато-серого цвета, массовая доля белка составляет 55-56% на сухой вес. Исследования протеинового комплекса в качестве кормовой добавки проводили на цыплятах однодневного возраста (2,5% к основному рациону и крысах-отьемышах (1% к основному рациону) в лабораторных уело 10814 виях. Среднесуточный привес для цыплят составляет 14,0%, для крыс - 15,0%. Гидролизат протеинового комплекса испытан на крысах-отьемышах в лабораторных условиях при скармливании препарата 5 перорально ( 1 % к основному рациону). Среднесуточный привес составляет 20,0%. Липидный комплекс - это легкоплавное масло с приятным запахом, хорошо растворяется в органических растворителях и не 10 растворяется в воде. Препарат хранят при 0°С в темной стеклянной таре. Исследования фармакологических свойств липидного комплекса проводили согласно инструкции по экспериментально- г5 клинической апробации косметических средсто (Москва, 1986). Во всех случаях опыта продолжительность эксперимента составляла не менее 3 недель. Исследуемый препарат наносили на заранее депилиро- 20 ванную кожу площадью 3 х 3 см ' один раз в сутки тонким слоем. Эксперименты проводили на белых крысах массой 150-180 г. Липидный комплекс применяли в виде 0,1 и 0,5% р-ра в хлопковом масле. При изучении 25 фармакологических свойств препарата исследовались углеводный, липидный, электролитный обмен кожи и ее гидрантное состояние. Исследования показали, что липидный 30 комплекс является нетоксичным препаратом и оказывает позитивное влияние на уг 6 леводный и липидный метаболизм кожи. Этот препарат увеличивает содержание гликогена, снижает уровень молочной к-ты, способствует увеличению окислительновосстановительного потенциала кожи на 1,5-5,5 мВ, приводит к отрицательным величинам избыточного лактата, снижает содержание холестерина в коже на 24-28%, триглицеридов - на 21-23/о, увеличивает уровень фосфолипидов на 16 20%, способствует улучшению зластичногти кожи. По выявленным фармакологическим свойствам установлено, что липидный комплекс оказывает благоприятное воздействие на обменные процессы кожи, оказывает гидратирующее действие на нее, не яьляется токсичным препаратом и может оыть использован как биологически активная добавка в косметические препараты и в продукцию бытовой химии. Концентрат свободных аминокислот и пептидов хорошо растворяется в воде и служит основой для получения раствора, средства для лечения глазных болезней. Концентрат аминокислот и пептидов испытывали в эксперименте на модели поражений роговицы глаза кролика. Отмечено заживление язв роговицы в течение 8 дней, что подтверждает ускорение эпителизации ткани и устранение воспалительного процесса. Таблица 1 Протеиновый комплекс Состав Аминокислоты: Лизин Гистидин Аргинин Аспарагиновая кислота Треонин Серии Глутаминовая кислота Пролин Глицин Алании Цистеин Валин Метионин Изолейцин Лейцин Тирозин • Фенилаланин Другие аминокислоты Общий азот Аминный азот % 8,3-8,7 2,3-2,4 7,6-8,0 9.9-10,0 5,2-5.4 5.5-5,6 15,8-16,9 3,8-4,2 5,5-5.6 6.3-6,5 0,7-0,8 4,0-2,8 2,2-1,2 3,8-4,0 8,0-8,9 3.7-3.9 4,4-4.6 2,2-1,5 0,7-0,9 60-70 10814 Таблица 2 Липидный комплекс Состав Лилиды, в том числе: Фосфолипиды Жирные кислоты С27 - СТериНЫ Триглицериды Эфиры стеринов Другие липиды Нелипидные вещества % 95,0-96,0 25,0-25.5 20,0 4.0-4,5 9,0 17,0 20,0 4,0-5,0 Таблица 3 Концентрат аминокислот и пептидов Состав Лизин Гистидин Аргинин Аспарагиновая кислота Треонин Серии Глутаминовая кислота Пролий Глицин Аланин Цистеин Валин Метионин Изолейцин Лейцин Тирозин Фенил аланин Пептиды Упорядник Замовлення 4687 Техред М.Келемеш % 1,03-1.66 1,37-1,00 1,25-2,59 0,16-1,54 3,75-4,51 2,09-2,92 0,51-3,54 2,28-4,51 2,39-6,64 10,6-12,16 1,58-1,85 9,96-11,24 5,89-7,47 9,02-10,56 23,06-15,00 3.73-4,46 11,07-8,34 4,32-0 Коректор М.Самборська Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655. ГСП, КиТв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.ГагарІна, 101