Спосіб одержання дифтерійного анатоксину

Способ получения дифтерийного анатоксина, включающий культивирование коринебактерий дифтерии, центрифугирование культуральной массы, стерилизующую фильтрацию, частичное обезвреживание и осаждение дифтерийного токсина, центрифугирование и очистку осадка, стерилизующую фильтрацию и полное обезвреживание токсина, отличающийся тем, что перед осаждением частично обезвреженный токсин подвергают ультрафильтрации и концентрированию при температуре 4 -8°С до 1/6 - 1/10 от исходного объема токсина. CS Изобретение относится к фармации, а именно к способу получения дифтерийного анатоксина, который может быть использован в качестве препарата для иммунизации. Известен способ получения дифтерийного анатоксина путем выращивания коринебактерий дифтерии, получения токсина, обезвреживания токсина, осаждения трихлоруксусной кислотой, очистки активированным углем, растворения в буфере и обезвреживания формалином / Ильницкая Е.А., Лобанова А.Н. Дифтерийный анатоксин. Г В кн.: Руководство по вакцинному и сывороточному делу. М.: - Медицина, 1978, - С.133-153 /. К недостаткам способа относятся получение целевого продукта с низкой степенью очистки и использование больших объемов полуфабриката при осажде-" нии токсина. Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения дифтерийного анатоксина путем культивирования коринебактерий дифтерии, центрифугирования культуральной массы, стерилизующей фильтрации, частичного обезвреживания формалином, осаждения трихлоруксусной кислотой, центрифугирования и очистки осадка активированным углем, каолином и гидроокисью алюминия, стерилизующей фильтрации и полным обезвреживанием токсина / Регламент производства очищенного адсорбированного дифтерийного анатоксина № 130-69 Предприятия по производству бактерийных препаратов МосНИИВС им. И. И. Мечникова. М., 1965 /. Данный способ имеет следующие недостатки: использование больших объемов полуфабриката при осаждении, что приводит к увеличению длительности контакта продукта с трихлоруксусной кислотой, и низкая степень очистки, так как использование каолина приводит к потере целевого продукта, что в свою очередь снижает нагрузку препарата (отношение активного вещества - единиц флокуляции ( ЛФ ) к 1 мг белкового азота) - основного показателя качества дифтерийного анатоксина. В основу изобретения поставлена задача создать способ получения дифтерийного анатоксина, в котором технологические стадии и параметры процесса позволили бы получить препарат с высокой степенью очистки и снизить объемы полуфабриката при осаждении токсина. Поставленная задача решается тем, что в способе получения дифтерийного анатоксина, включающем культивирование коринебактерий дифтерии центрифугирование культуральной массы, стерилизующую фильтрацию, частичное обезвреживание и осаждение дифтерийного токсина, центрифугирование и очистку осадка, стерилизующую фильтрацию и полное обезвреживание токсина, согласно изобретению перед осаждением частично обезвреженный токсин подвергают ультрафильтрации и концентрированию при температуре 4-8° С до 1/6 - 1/10 от исходного объема токсина. В табл.1-2 приведены данные, обосновывающие достаточность выбранных соотношений для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата. О t CD О) 17641 Таблица 1 Зависимость степени очистки препарата от температуры при ультрафильтрации Температура, ° С 2 I 4 8 10 6 Нагрузка преп- 1580 1735 1800 1750 1610 арата ЛФ/1 мг белкового азота Показатели Как видно из данных, приведенных в табл.1, оптимальной является температура проведения ультрафильтрации 4-8°С. Использование температуры ниже указанной величины приводит к меньшему отделению балластных компонентов, а повышение температуры приводит к уменьшению содержания специфического белка токсина, что в свою очередь в обоих случаях снижает нагрузку препарата. Таблица 2 Зависимость степени очистки препарата от концентрации токсина Концентрация токсина от исходного объема 1/8 1/4 1/6 1/10 1/12 Нагрузка преп- 1600 1670 1700 1650 1480 арата ЛФ/1 мг белкового азота Показатели Как видно из табл.2, оптимальной является концентрация токсина 1/6-1/10 от исходного объема. Использование концентраций меньше указанных значений приводит к потере специфического белка токсина за счет сорбции белка на волокнах аппарата для ультрафильтрации, а увеличение конечного объема токсина не позволяет полностью удалить балластные примеси. В обоих случаях снижается нагрузка препарата. Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом приведены в табл.3. Таблица 3 Характеристика препарата в зависимости от способа получения Показатели Нагрузка препарата ЛФЛмг белкового азота Объем анатоксина, используемый для осаждения, л Способ Предлагаемый 1650-1800 Прототип 1400-1530 3-5 30-35 Продолжение таблицы 3 Показатели Объем анатоксина, используемый для осаждения, л Способ Предлагаемый 1 Прототип 3 Возможность осуществления изобретения иллюстрируется следующими примерами: Пример 1 В реактор загружают 35 л жидкой среды Лингуда, а затем вносят культуру коринебактерий дифтерии. Культивирование проводят в течение 48ч при температуре 37-38° С. Затем культуральную массу отделяют центрифугированием. Прозрачный раствор токсина подвергают стерилизующей фильтрации. К полученному раствору добавляют формалин и проводят частичное обезвреживание токсина при температуре 40° С в течение 5 суток. Затем частично обезвреженный токсин подвергают ультрафильтрации через колонки ВПУ-15 с величиной пор, отсекающих вещества с молекулярной массой 15 кД, при температуре 4° С. Концентрированние проводят до 1/6 от первоначального объема токсина. Полученный раствор осаждают трихлоруксусной кислотой до рН 3,8 - 4,2. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в борно-боратном буфере с рН 7,9 - 8,0 и обрабатывают активированным углем и гидроокисью алюминия. Затем проводят стерилизующую фильтрацию, добавляют формалин и помещают токсин в термостат при температуре 40° С на 15-20 суток до полного обезвреживания. Степень очистки-нагрузка препарата ЛФЛмг белкового азота составляет 1650. Пример 2 В реактор загружают 35 л жидкой среды Лингуда, а затем вносят культуру коринебактерий дифтерии. Культивирование проводят в течение 48ч при температуре 37-38° С. Затем культуральную массу отделяют центрифугированием. Прозрачный раствор токсина подвергают стерилизующей фильтрации. К полученному раствору добавляют формалин и проводят частичное обезвреживание токсина при температуре 40° С в течение 5 суток. Затем частично обезвреженный токсин подвергает ультрафильтрации через колонки ВПУ-15 с величиной пор, отсекающих вещества с молекулярной массой 15 кД, при температуре 6° С. Концентрирование проводят до 1/8 от первоначального объема токсина. Полученный раствор осаждают трихлоруксусной кислотой до рН 3,8 - 4,2. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в борно-боратном буфере с рН 7,9 - 8,0 и обрабатывают активированным углем и гидроокисью алюминия. Затем проводят стерилизующую фильтрацию, добавляют формалин и помещают токсин в термостат при температуре 40° С на 15-20 суток до полного обезвреживания. Степень очистки нагрузка препарата ЛФ/1мг белкового азота составляет 1800. 17641 Пример 3 В реактор загружают 35 л жидкой среды Лингуда, а затем вносят культуру коринебактерий дифтерии. Культивирование проводят в течение 48ч при температуре 37-38° С. Затем культуральную массу отделяют центрифугированием. Прозрачный раствор токсина подвергает стерилизующей фильтрации. К полученному раствору добавляют формалин и проводят частичное обезвреживание токсина при температуре 40° С в течение 5 суток. Затем частично обезвреженный токсин подвергают ультрафильтрации через колонки ВПУ-15 с величиной пор, отсекающих вещества с молекуля рной массой 15 кД, при температуре 8° С. Концентрирование проводят до 1/10 от первоначального объема токсина. Полученный раствор осаждают трихлоруксусной кислотой до рН 3,8 - 4,2. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в борно-боратном буфере с рН 7,9 - 8,0 и обрабатывают активированным углем и гидроокисью алюминия. Затем проводят стерилизующую фильтрацию, добавляют формалин и помещают токсин в термостат при температуре 40° С на 15-20 суток до полного обезвреживания. Степень очисткинагрузка препарата ЛФ/1 мг белкового азота составляет 1700. ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Бульв. Лесі Українки, 26, Київ, 01133, Україна (044) 254-42-30, 295-61-97 Підписано до друку />S • ОЗ. 2001 p. Формат 60x84 1/8. Обсяг $.3£ обл.-вид.арк. Тираж 50 прим. Зам. S~ УкрІНТЕІ Вул. Горького, 180, Київ, 03680 МСП, Україна (044) 268-25-22