Противірусний засіб

Применение 6-азацитидина в качестве противовирусного средства. Синтетический нуклеозид 6-азацитидин является структурный аналогом пиримидиновых нуклеозидов (цитидина), синтезированный как потенциальный противоопухолевый агент. В основу изобретения положена задача расширения функциональных возможностей 6-азацитидина, изыскание новых противовирусных средств с улучшенными свойствами. Технический результат - выявление механизмов антиаденовирусного действия препарата: его воздействие на синтез аденовирусных макромолекул (ДНК, полипептидов) и специфического антигена. Сущность способа состоит в том, что в качестве противовирусного средства применяют 6-азацитидин. Существует тесная причинно-следственная связь между техническим результатом и с о в о к у п н о с т ь ю существенных признаков. Выявлено объективное влияние препарата на синтез инфекционного вируса, ДНК, вирусных полипептидов и вирусного антигена. С > ел о 21596 Способ осуществляется следующим образом. Использовали эталонные штаммы аденовирусов 1 и 2-го типов, культивированных в культурах клеток HeLa (карцинома шейки 5 матки) или Hep-2 (карцинома гортани человека). Ростовая среда составлялась из равных частей среды 199 и Игла с добавкой 10% инактивированной прогреванием сыворотки крупного рогатого скота. Монослойную 10 культуру клеток, выращенную в 1,5 л флаконах в течение 1-2 суток, инфицировали аденовирусом при множественности инфицирования 1-20 ВОЕ (включение образующих единиц) на клетку. Перед заражени- 15 ем клетки отмывали раствором Хенкса, адсорбцию вируса проводили 60 минут при комнатной температуре. В качестве поддерживающей среды использовали среду 199 или Игла без сыворотки. После развития ци- 20 топатогенного эффекта (через 3-4 суток) инфицированные клетки, которые отделились от стенок флаконов и находились в культуральной среде, подвергали термолизису путем 3-х кратного замораживания в жидком 25 азоте и оттаивании при 37°С. Детрит клеток осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. В полученном вирус-содержащем материале определяли инфекционный титр аденовируса при титро- 30 вании его цитоморфологическим методом и сохраняли при -20°С до использования. Антиаденовирусную активность вещества определяли разработанным нами цитоморфологическим методом, основанным на подсчете количества инфицированных клеток, содержащих вирусные внутриядерные включения (подсчет их в 500 клеток монослоя на каждом из 3 стекол). Об ингибирующем влиянии препарата на репродукцию аденовируса судили по уменьшению количества инфицированных клеток по сравнению с контролем. Данные выражали в процентах. За минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) принимали ту, которая вызывала уменьшение количества клеток с включениями на 50%. Химиотерапевтический индекс препарата (ХТИ) определяли по отношению МИК к МПК (максимальная переносимая концентрация). Общепринятыми методами определяли влияние вещества на ростовую способность клеток, синтез инфекционного вируса, суммарных ДНК и РНК в неинфицированных и инфицированных клетках, вирусных макромолекул (ДНК и структурных полипептидов) и вирусного антигена (антигена (гёксона). В табл. 1 приведены данные влияния 6-азацитидина на репродукцию аденовиру 35 40 45 5Q 55 са типа 1, в табл. 2 - то же. иа репродукцию аденовируса типа 2. На фиг. 1 приведены данные влияния 6азацитидина на ростовую способность клеток; на фиг. 2 - то же. на синтез РНК и ДНК в неинфицированных и инфицированных клетках; на фиг. 3 - то же, синтез аденовирусной ДНК и на фиг. 4 - то же, иа синтез структурных вирусных полипептидов. В широком диапазоне нетоксичных для клеток концентраций 6-азацитидин оказывал ингибирующее влияние на репродукцию аденовируса человека типа 1, что выражалось в снижении числа инфицированных клеток, выявляемых по наличию в ядрах вирусных включений и вирусного антигена (табл. 1). В^ концентрации 125-62 мкг/мл 6аэацитидин почти полностью предотвращал образование в ядрах характерных вирусспецифических включений, снижая их число с 77% в инфицированной контрольной культуре, необработанной препаратом, до 6% (р