Спосіб одержання серинової протеази, штам лужнофільних bacillus sp.- продуцент серинової протеази

Область настоящего изобретения относится к получению сериновой протеазы Bacillus с применением технологии рекомбинантных ДНК. Бактериальные сериновые протеазы могут быть получены из многих прокариотических организмов, включая грам-отрицательные организмы, такие как виды Serratia или Pseudomonas и грам-положительные бактерии, такие как виды Micrococcus и Bacillus. В группу промышленно важных сериновых протеаз, представляющих исключительный интерес, входят те протеазы, которые имеют высокую активность в щелочных средах. В то время как промышленные сериновые протеазы вырабатываются различными видами включая B.subtilis, B.licheniformis, B.amyloliquefaciens, B.alcalophilus, и другие виды Bacillus, высокощелочные протеазы в основном вырабатываются штаммами Bacillus, которые способны к росту при щелочном pH. Примером такой бациллы служит Bacillus novo species PB 92. Существует значительный интерес к разработке штаммов бацилл, способных вырабатывать протеолитические ферменты с большим выходом, в частности высокощелочные протеазы. Были успешно клонированы гены, кодирующие сериновую или щелочную протеазу B.subtilis (Wong et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81 (1984) 1184), B.licheniformis (Jacols et al. Nucleic Acids Res 13 (1985) 8913) и B.amyloliquefaciens (Wells et al. Nucleic Acids Res 13 (1985) 8913 и B.amyloliquefaciens (Wells et al. Nucleic Acids Res, 11 (1983) 7911). Производство промышленных сериновых протеаз в различных видах Bacillus описано, например, в патентах США №3,674643; 3,723,250 и 4,480,043. Производство высокощелочного протеолитического фермента в штаммах Bacillus способных к росту при щелочном pH описано, например, в патентах США №3,723,250; Re 30,602 и 4,480,037. В качестве обзорной статьи по использованию бацилл для производства промышленно важных ферментов может служить, например, статья Дебабова: "The industrial Use of Bacilli", in: The Molecular Biology of Bacilli, (Acad Press New York, 1982. Протокол трансформации протопласта В.subtillis был описан в статье Chang and Gohen (Моl. ben Genet, 168 (1979) 111 - 115). Подобные протоколы были описаны для успешной трансформации протопластов В.megaterium (Vorobjeva et al., FRM Microbiol Letters 7 (1980) 261 - 263, протопластов В.amyloliquefaciens (Smith et al., Appl. and Env. Microbiol, 51 (1986) 634), протопластов В.thuringiensis (Fisher et al., Arch Microbiol 139 (1981) 213 - 217, протопластов В.sphaericus (Mc Donald, Y. Gen. Microbiol 130 (1984) 203) и протопластов В.larvae (Bakhiet et al., Appl. and Env Microbiol 49 (1985) 577). Однако, Bakhiet et al. (выше) сообщали о не удачных результата х с В.рорillае. Mann et al., Current Microbiol 13 (1986) 131 - 135 сообщили об успешной трансформации В.polymyxa , В.lichenifornu's , В.macerans и В.laterosporus. Однако, эти способы не были удачными в случае B.coagulans, B.cereus и B.pumilus, хотя и наблюдалось хорошее образование протопластов. Другие способы введения ДНК в протопласты включают слияние с липосомами, содержащими ДНК (Holubova, Folia Microbiol 30 (1985) 97). Выделение и экспрессия генов высокощелочной протеазы раскрываются в приоритетном документе Европейской заявке № EP-A-872000358.1, на котором основа данная заявка, содержание которой включено здесь с помощью ссылок. Удобный вектор для трансформации клетки Bacillus включает структурный ген, кодирующий высокощелочную протеазу, продуцируемую щелочефильной Bacillus, содержащей контролирующие районы, такие как последовательность промотора, последовательность, образующая участок связывания с рибосомами, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции гена щелочной протеазы, причем перечисленные контролирующие участки являются функциональными в хозяйской клетке щелочефильной Bacillus. Кроме того, вектор может содержать маркерный ген, например, для придания устойчивости к антибиотику, к которому хозяйский штамм чувствителен (особый интерес представляет устойчивость к неомицину), и origin репликации, который способен автономно реплицироваться в хозяйской клетке. Origin репликации может и быть таким, который имеет мутацию, делающую его функционирование в хозяйской клетке температурочувствительным, таким образом, обеспечивая селекцию на хромосомальное встраивание, как описано Ehrlich Proc, Natl. Acad. Sci USA 75 (1978) 1433. С целью производства высокощелочной протеазы предпочтительной последовательностью ДНК для использования в трансформации штаммов Bacillus, которые уже продуцируют сериновую протеазу, является последовательность, полученный из Bacillus novo species PB 92. Аминокислотная последовательность сериновой протеазы, кодируемая указанной последовательностью ДНК, следующая: Хотя предпочтительным штаммов для обеспечения гена протеазы является вид Bacillus sp. PB 92, по существу, такая же сериновая протеаза и может быть получена из других щелочефильных бацилл. Гены протеаз, гомологичные, по крайней мере, на 70% и, предпочтительно, свыше 80% гену Bacillus PB 92, входят в объем настоящего изобретения. Желательно, чтобы продукт экспрессии секретировался. Так как щелочная протеаза секретируется, могут быть использованы секреционные лидерные сигналы и сигналы процессинга дикого типа. Кроме того, может быть получен слитый ген путем придания 5' последовательности структурному гену, кодирующему секреторный лидерный сигнал и сигнал процессинга. Характерные гетерологичные секреторные лидерные последовательности включают секреторные лидерные последовательности генов амилазы и протеазы Bacillus. В зависимости от того, желательно ли встраивание структурного гена в хромосому хозяйского штамма, либо поддержание его во внехромосомальном элементе, репликационная система Bacillus может быть включена или нет. С целью встраивания участки гомологии плазмидной конструкции с геномом Bacillus могут быть использованы для увеличения вероятности рекомбинаций. Более того, включение в плазмидную конструкцию температурочувстви тельного origin репликации позволяет проводить селекцию по хромосомальному встраиванию (См., например, Ehrlich, Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978) 1433). Для увеличения экспрессии структурного гена в хозяйскую клетку может быть вставлено более одной копии структурного гена. Стабильная амплификация структурного гена может быть получена встраиванием, по крайней мере, одной добавочной копии структурного гена с геном хозяйской клетки и отбором трансформантов, в которых копии структурного гена разделены эндогенными хромосомальными последовательностями. Конструкции ДНК и способы для прокариотических систем описаны в Европейской заявке №EP-A-87200356 изобретение, которое включено здесь в качестве ссылки. В качестве хозяина для трансформации может быть использован любой штамм Bacillus, однако при выборе подходящего штамма учитываются факторы, которые могут улучшить продукцию высокощелочных протеаз. Продукция может быть улучшена различными путями, включая хозяина, в котором снижена деградация желаемого продукта, узнавание регуляторных сигналов, облегчение секреции и так далее. Таким образом, хотя предпочтительным хозяином Bacillus является продуцент высокощелочной протеазы, в качестве хозяина также может быть использован мутант, который сам по себе не вырабатывает высокощелочную протеазу. Бациллы, продуцирующие высокощелочную протеазу, таксономически недостаточно классифицированы и их обычно относят к щелочефильным штаммам Bacillus. Примеры штаммов Bacillus способных расти при щелочном pH описаны, например, в патентах США №3,723,250; Re.30, 602 и 4,480,037. Примером предпочтительного хозяйского штамма щелочефильного Bacillus является штамм Bacillus novo species PB 92, раскрытый наряду с другими в патенте США №Re.30,602. Промышленные штаммы щелочефильных Bacillus могут также быть использованы в качестве хозяйских клеток. Для промышленных штаммов Bacillus характерна устойчивость к генетическому обмену, такому как фаговая инфекция или трансформация. Эти штаммы стабильны и трансформанты могут быть или не быть способными к образованию спор. Они обычно фототрофы и модифицированы для обеспечения высоких выходов эндогенных белковых продуктов, таких как a-амилаза и различные протеазы. Выход эндогенного белкового продукта, полученный в процессе промышленного производства, может доходить, по крайней æ îáúåì ö ç ÷ мере, до 5г/л 0,5% è âåñ ø . Промышленные штаммы также секретируют ДНК-азы, которые приводят к деградации ДНК в среде, обеспечивая защиту от генетического обмена. Трансформация щелочефильных штаммов Bacillus будет преимущественно включать использование протопластов упомянуты х штаммов. Однако, как описано Cohen et al. (выше) обычный способ трансформации протопласта не работает для щелочефильных штаммов Bacillus. Следовательно должны бы быть разработаны дополнительные способы. Для щелочефильных бацилл образование и регенерация протопластов может происходить при высоком pH, предпочтительно около pH 8. Протопласты могут быть приготовлены ресуспендированием клеток в щелочной буферной среде (AHM - alkaline holding medium), pH 7,8 - 8,5, с последующей инкубацией клеток в течение 30 - 80 минут при 37°С. В качестве примера AHM смотри пример 5. Полученные протопласты затем промываются для удаления лизоцима, затем ресуспендируются в AH M. Затем, в присутствии подходящего реагента для слияния, плазмидная конструкция и протопласт щелочефильного хозяина Bacillus объединяются. Хотя может быть использован любой реагент для слияния, который обеспечивает желаемую эффективность, обнаружено, что полиэтиленгликоль молекул, веса 1000 - 8000 в значительной мере обеспечивает высокую эффективность слияния. Протопласты, приготовленные из акцепторного штамма Bacillus смешиваются с плазмидной конструкцией в течение не более 5 минут, желательно не дольше 2 минут в присутствии полиэтиленгликоля. Смесь реагентов для слияния затем заменяется обычной питательной средой, в которой клетки инкубируются в течение до 5 часов, предпочтительно 2 - 3 часов, перед переносом на регенерирующие чашки. Регенерирующие чашки содержат антибиотик, такой, как неомицин для отбора трансформантов. Клоны с эписомальным поддержанием конструкции ДНК могут быть идентифицированы путем обнаружения экспрессии высокощелочной сериновой протеазы. Для идентификации тех клонов, которые содержат экспрессирующую конструкцию в виде участка, встроенного в их хромосомы, клоны, которые получаются, скринируются путем выделения суммарной клеточной ДНК и отбора тех клонов, в которых может быть обнаружена свободная плазмидная ДНК, но маркерный ген плазмиды экспрессируется. Эти клоны затем можно скринировать подходящими способами, для обнаружения экспрессии высокощелочной сериновой протеазы. Различные методы обнаружения, включая использование специфических антител, ДНК или РНК гибридизацию, образование ферментного продукта или исчезновение ферментного субстрата, могут быть использованы для скринирования клонов с целью обнаружения присутствия экспрессирующей конструкции и экспрессии интересующего стр уктурного гена, а именно производства протеазы. Производимая протеаза может быть охарактеризована биохимически, например определением молекулярного веса протеазы с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, электрофореза в гистидин-MOPS геле и определением кинетических параметров Km и Vmax, определяемых на синтетическом субстрате succinyl-L alanyl-L-alanyl-L-probyl-L-phenylalanyl-f-nitro-analide. Хозяин Bacillus, содержащий экспрессирующую конструкцию, включенную эписомально или хромосомально, затем выращивается на питательной среде в условиях, благоприятствующи х синтезу фермента. Питательная среда обычно будет включать средства для поддержания плазмиды, такие как присутствие антибиотика, к которому чувствителен нетрансформированный хозяин. Ферментация может продолжаться пока не истощится бульон. Там, где продукт секретируется, он может быть выделен из бульона удобным способом, например, экстракцией, хроматографией, электрофорезом или подобным. Там где продукт остается в цитоплазме, клетки могут быть собраны центрифугированием, фильтрацией и так далее, лизированы механическим перетиранием, детергентом, лизоцимом или другими методами и продукт может быть выделен, как описано ранее. Когда нетрансформированная хозяйская клетка является продуцентом высокощелочной протеазы, посредством представленного метода могут быть достигн уты сильно увеличенные выходы высокощелочной сериновой протеазы, обычно по крайней мере 120% по сравнению с выходом в нетрансформированной хозяйской клетке с единственной внехромосомной копией гена. На фиг.1 показано результаты гистидин/MOPS гельэлектрофореза, проведенного с супернатантами культур B.subtilis DB104, содержащими соответственно pub 110 и pM58, в сравнении с некоторыми субтилизинами. 1 дорожка: субтилизин Carlsberg 2 дорожка: протеаза Bacillus PB 92 3 дорожка: субтилизин Bacillus subtilis 4 дорожка: Bacillus subtilis DB 104 (pM 58) 5 дорожка: Bacillus subtilis DB 104 (pMB 110). На фиг.2 показано рестрикционную карту плазмиды pM58. Более того, в верхней части рисунка показана стратегия сиквенирования. Сплошные линии со стрелками представляют фрагменты, клонированные в векторах mp10, mp11 и mp13 фага M13. Нижняя часть рисунка показывает стратегию сиквенирования с использованием 10 олигонуклеотидов, локализованных через равные промежутки на гене протеазы. На фиг.3 показано нуклеотидную последовательность кодирующей цепи, соотнесенную с аминокислотой последовательностью сериновой протеазы Bacillus PB 92. Также показаны промоторы (P1, P2), сайт связывания рибосом (rbs) и районы терминаций (term) последовательности ДНК. Пронумерованные сплошные линии представляют место размещения десяти олигонуклеотидов, использованных для сиквенирования. На фиг.4 А показано конструирование плазмиды pE/194-neo. На фиг.4В показано конструирование плазмиды pMAX-4. Пример 1. Приготовление библиотеки геномной ДНК из щелочефильногоо нового вида Bacillus PB 92 и выделение гена сериновой протеазы. Хромосомальная ДНК, выделенная из Bacillus novo sp. PB 92 (хранится под №OR-60 в лаборатории микробиологии. Технический университет Дель, Нидерланды, смотри патент США №Re 30, 602) по способу, описанному Saito-Minva, Biochim. Biophys. Acta. 72 (1963) 619 - 632, и была частично переварена рестрикционным ферментом San 3A и лигирована в BamHI сайт плазмиды pUB 110 (Grycran ry al.,Y.Bacteriol, 1978, 134, 313 - 329). Плазмида ДНК pUB 110 была приготовлена как описано Birnoboim и Doly (Nucl. Acids Res, 7 (1979) 1513 - 1523). Лигирующую смесь трансформировали в B.subtilis IA40. Генетический центр хранения бацилл по способу Spizizen et al., Y.bacteriol 81 (1961) 741 - 746, используя 0,6 - 1мкг ДНК на мл компетентных клеток. Клетки из трансформационной смеси высеивали на минимальные чашки, содержащей 2,8% К2НРO4; 1,2% КН2РO4; 0,4% (NH4)2SO 4; 0,2% три-Na-цитрат. 2Н2O; 0,04% MgSO4×7H2O; 0,00005% MnSO4×2Н2О; 0,4% Lглутаминовую кислоту; 0,5% глюкозу; 0,02% казаминовых кислот; 50мкг/мл триптофана; 20мкг/мл метионина; 20мкг/мл лизина; 20мкг/мл неомицина; 0,4% казеина и 1,5% агара. После инкубации чашек в течение ночи при 37°С одна из 50000 колоний, устойчивых к неомицину, показала возросшую продукцию протеазы, что определили по увеличению преципитации ореола продуктов расщепления казеина вокруг колоний на пластинке агара. Плазмидная ДНК была выделена из этой колонии по способу, описанному Birnboim и Doly (Nucleie. Acids Res, 7 (1979) 1513 - 1523) и обозначена pM58. Пример 2. Экспрессия гена сериновой протеазы PB 92. Bacillus subtilis IA40, содержащая pM58 была выращена на минимальной среде (Spizizen et al. Proc. Natl. - Acad. Sci USA, 1958, 44, 1072 - 1078), к которой было добавлено 0,02% казаминовых кислот; 50мкг/мл триптофана; 20мкг/мл метионина; 20мкг/мл лизина и 20мкг/мл неомицина. Через 24 часа культур у центрифугировали и супернатант проверяли на протеазную активность используя в качестве субстрата диметилказеин (Lin et al., - J. BIol. Chem., 1969, 244, 789 - 793). Культура B.subtilis IA40, содержащая плазмиду pUB110, использованная в качестве контроля, показала меньше чем 1/60 протеазной активности, показанной культурой, трансформированной PM58. Протеазная активность полностью ингибировалась обработкой 1мМ фенилсульфанилфлуоридом (PMSF), но не 20мМ ЭДТА. Аликвоты супернатантов, описанных выше, анализировались с помощью белкового геля по способу Laemly, Nature 227 (1970) 680. Пробы для анализа на этих гелях были приготовлены обработкой супернатантов 5% трихлоруксусной кислотой (ТХУ). После центрифугирования образца, осадок преципитированного белка промывался дважды ацетоном, затем растворялся в 40мкл буфера для образцов (0,5М трис/НС pH7,5; 10% (объемных) 2-меркаптоэтанола; 50% (объемных) глицерина и 0,05% бромфенолового синего) при кипячении в течение 10 минут. После электрофореза гели окрашивали, используя Кумасси Бриллиантовый Синий. Затем пробы супернатанта культур анализировались электрофорезом. Использовались три разных штамма B.subtilis IA40: штамм, содержащий pUB110; или pM58; или без плазмиды и протеаза Bacillus PB 92 в качестве контроля. После электрофореза гели окрашивали используя Кумасси Бриллиантовый Синий и отмывали. Образец из B.subtilis штамма IA40, содержащего pM58, содержал белок весом 31кДа, готовый мигрирует совместно с протеазой Bacillus PB 92. Этот белок не обнаруживался в контрольной дорожке штамма B.subtilis IA40, содержащего pUB110. Все сериновые протеазы имеют одинаковые молекулярные веса. Поэтому клонированная сериновая протеаза Bacillus PB 92 дифференцировалась от известных сериновых протеаз субтилизина B.subtilis, субтилизина Carlsberg с помощью трансформации pM58 и pUB110 в беспротеазный штамм B.subtilis DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442 - 444) и анализа продуцируемой внеклеточной протеазы. Полученные трансформанты выращивались на минимальной среде (Spizizen et аl., выше), содержащей 0,02% казаминовых кислот, 50мкг/мл гистидина и 20мкг/мл неомицина. Через 24 часа были взяты образцы, центрифугированы и без дополнительной обработки анализированы с помощью гистидин/MOPS гелей, содержащих 75мМ KOH; 40мМ гистидин; 100мМ MOPS (3-(N-морфолино)-пропансульфоновая кислота), pH 7,5 и 5% полиакриламид. Электрофоретический буфер содержал 40мМ гистидина, 100мМ MOPS, pH 6,6. Образцы двигались по направлению к катоду. Полосы протеазы обнаруживались с помощью профессиональных пленок Agfa pan 100 (Zuidweg et al., Biotechnol and Bioengin, 1972, 14, 685 - 714). Эти результаты показаны на фиг.1. Как показано, pM58 несет ген, кодирующий протеазу Bacillus PB 92. Пример 3. Сиквенирование гена сериновой протеазы Bacillus PB 92. Полная последовательность Ball-Hpal фрагмента pM58 была определена способом Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77 (1977) 6463. Рестрикционные фрагменты pM58 (смотри рисунок 2) были клонированы в векторах mp10, mp11 и mp18 фага M13 (Messing et al., Nucleic Acids Res, 1981, 9, 309 - 321). Встраивания фрагментов pM58 скринировали с помощью гибридизации бляшек. После сиквенирования были сделаны десять олигонуклеотидов, локализованных через равные промежутки на гене и было повторено сиквенирование, которое подтвердило последовательность, показанную на рисунке 3. Пример 4. Конструирование плазмиды pMAX-4, содержащей сериновую плазмиду. Для конструирования плазмиды pUCN710 (рисунок 4А) pUB110 была переварена Tagl и Pvull. Фрагмент, содержащий ген, придающийустойчивость к неомицину, был очищен с помощью низкоплавкой агарозы и затуплен полимеразой Кленова и НТФ (Maniatis, Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor 1982). Плазмида pUC7 (Vieira et al., Gene 19 (1982) 259 - 268) была линеаризована Sall и затуплена, как описано выше. Оба фрагмента были лигированы T4 лигазой (Maniatis) и трансформированы в E.Coli JMI03. Отбор вели на 2 ´ TY чашках (1,6% вес/объем Бакто-триптона; 1% вес/объем дрожжевого экстракта; 0,5% NaCI), содержащих 50мкг/мл ампицилина и 10мкг/мл неомицина. Полученная плазмида, названная pUC710, была переварена bamHI. Плазмида pEI94 (Jordanescu, Plasmid 1 (1978) 468 - 479) была переварена ВСII. Фрагменты из обоих расщеплений были лигированы 14 лигазой и трансформированы в B.subtilis IA40. Отбор вели на минимальных чашках, содержащих 20мкг/мл неомицина. Субклонирование гена протеазы в вектор встраивания вели следующим образом: pM58 (смотри пример 1) переваривали Hpal и Ball и Bgell. Плазмиду pE194-neo переваривали Hpal. Эти фрагменты лигировали T4 лигазой и трансформировали в B.subtilis IA40. Трансформанты отбирали на основе устойчивости к неомицину и увеличения продукции протеазы, о чем судили по преципитации продуктов расщепления казеина (образованию ореола, смотри пример 1). Была получена плазмида pMAX-4, стр уктура которой подтверждена анализом рестрикционными фрагментами (смотри рисунок 4В). Пример 5. Трансформация протопласта штамма Bacillus PB 92 pMAX-4. Штамм Bacillus PB 92 растили в течение ночи в 100мл NBSG-X среды (Тhоrne et al., J. Bacteriol, 1966, 91, 1012 - 1020). Культур у центрифугировали в течение 10 минут при 4500об/мин в роторе Sorvall модель GSA. Протопласты были приготовлены инкубированием бацилл в течение одного часа при 37°С в 10мл щелочной среды (AHM), содержащей 0,5М са харозы; 0,02М MgCI2 и 0,02М Трис/малеат, pH 8,0; в стерильной воде, к которой было добавлено 0,4мг/мл лизоцима. Протопласты были осаждены 10 минут при 4500об/мин, ресуспендированы в 5мл буферной смеси AHM+ pH 8,0 (AHM буфер, к которому добавлено 3,5% вес/объем Бакто Penassay бульона и 0,04% вес/объем Merieux альбумина), перемешаны, затем переосаждены, как выше. После ресуспендирования в 5,0мл AHM, 0,5мл этой суспензии протопластов было смешано с 5мкг деминерализованной воды, содержащей 1мкг плазмидной ДНК, и инкубированы в течение 2-х минут в присутствии 30% вес/объем полиэтиленгликоля 8000, pH 8,0. После трехкратного разбавления средой AHM+ pH 8,0 и центрифугирования, осадок ресуспендировали в малом объеме 1мл AHM+ и инкубировали в течение 2 - 3 часов. Аликвоты по 100мкл были высеяны на свежеприготовленные регенерационные чашки, содержащие 0,5М сукцинат Na/HCI pH 8,0; 1,5% вес/объем агар; 0,5% вес/объем казаминовые кислоты; 0,5% вес/объем дрожжевой экстракт; 0,031М фосфатный буфер pH 8,0; 0,5% вес/объем глюкозу; 0,2 М MgCl2 и 0,02% вес/объем Merieux альбумина. Эти чашки также содержали 1000мкг/мл неомицина для селекции. После инкубации при 37°С в течение по крайней мере 72 часов колонии были перенесены на чашки с агаром, содержащим сердечный экстракт и 20мкг/мл неомицина. Пример 6. Встраивание pMAX-4 в хромосому штамма Bacillus PB 92. Колония штамма Bacillus PB 92, содержащего pMAX-4, выращенные на чашке с агаром, содержащим сердечный экстракт и 20мкг/мл неомицина, была внесена в 100мл триптонного соевого бульона содержащего 1мкг/мл неомицина, и инкубирована в течение 24 часов при 37°С. 2мл культуры (приблизительно 109клеток/мл) были разведены в 100мл той же среды, содержащей 1мкг/мл неомицина, и инкубированы в течение 24ч при 50°С. Через 24ч 5мл культуры (приблизительно 10 9клеток/мл) были разведены снова, как описано выше, и инкубированы в течение 24ч при 50°С в присутствии 1мкг/мл неомицина. Последняя процедура была повторена еще раз. Затем клеточная суспензия была разведена в 100 раз и высеяна на чашки с агаром, содержащим сердечный экстракт (HI-агар, Difco), содержащем 1мкг/мл неомицина. Чашки инкубировали в течение 16 часов при 50°C. Колонии, устойчивые к неомицину, были изолированы и культивировали, в 10мл среды TSB, содержащей 1мкг/мл неомицина, в течение 16 часов при 37°С. Из этих к ультур была выделена суммарная ДНК (Holnus et al., - Anal. Biochem. (1981) 114, 193 - 197) и с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле проверена на отсутствие плазмиды. Образцы, в которых не обнаруживались плазмидная ДНК, были перепроверены с помощью трансформации суммарной ДНК в B.Subtilis IA40. Образцы, лишенные способности трансформировать B.Subtilis IA40, считались свободными от плазмиды. Устойчивый к неомицину, свободный от плазмиды, полученный из Bacillus PB 92 штамм был найден и назван PBT109. Этот штамм содержал копию плазмиды pMAX-4, встроенной в его хромосому. Встраивание в штамм PBT109 происходило по так называемому механизму Campbell типа путем гомологичной рекомбинации, приводящей к двум тандемно расположенным генам протеазы на хромосоме, разделенным плазмидными последовательностями. Эта генетическая организация штамма PBT109 была подверждена, как показано в совместном EPA-0 000 000, зарегистрированном одновременно с настоящим, открытие которого включено здесь в качестве ссылки. Пример 7. Протеазная продукция трансформированных штаммов. Протеазная продукция трансформированных штаммов была тестирована добавлением 0,2мл культуры TSB, содержащей приблизительно 109клеток/мл, в 500мл качалочные колбы, содержащие 100мл продукционной среды, описанной в патенте США №Re.30, 602. Однако при тестировании штаммов B.Subtilis pH был доведен до pH 7,0. Неомицин добавляли в концентрации 20мкг/мл для штаммов DB104 (pUB110), DB104 (pMAX-4), PB92 pMAX-4 и в концентрации 1мкг/мл для PBT109. Относительная продукция протеазы для этих клеточных линий показана в таблице. При ферментации в большем масштабе 10 литрах Bacillus PB 92 pMAX-4 обнаруживал нестабильность и уменьшение продукции по сравнению по сравнению с PBT109, если к ферментационной среде не добавляли неомицин. Из упомянутых вы ше результатов следует, что предложен простой и эффективный способ продукции сериновой протеазы путем стабильного введения гомологичного или гетерологичного гена, кодирующего сериновую протеазу, в хромосому промышленных штаммов Bacillus. Также предлагается увеличенная продукция сериновой протеазы в хозяине Bacillus, который уже производит сериновую протеазу. Встраивание плазмидных конструкций в хромосому хозяйской клетки приводит к более стабильной ситуации в производственных ферментациях и значительно усиленной продукции протеазы, чем в присутствии конструкций с внехромосомальными плазмидами. Различные методики работы с генами хорошо известны. Клоны, содержащие встроенный фрагмент ДНК, кодирующий щелочную фосфатаз у, могут быть обнаружены с помощью устойчивого маркера или путем использования способа прямой или положительной селекции, как разработанные для B.Sublitis (Gryczan и Dubnow. - Gene, (1982) 20, 459 - 469). Кроме того, клоны, экспрессирующие высокощелочную протеазу могут быть идентифицированы с помощью антител против продукта экспрессии или обнаружением потери субстрата или образования продукта протеолитического фермента. Например, колонии, экспрессирующие маркерный ген, такой как ген устойчивости к антибиотику, могут быть проанализированы на производство протеазы, определяемое по увеличенной преципитации ореола казеина вокруг колоний на чашках с агаром, содержащим казеин.