+ штам к 2 i к 2 гриба blakeslea trispora -продуцент бета-каротину.
Номер патенту: 2220
Опубліковано: 26.12.1994
Автори: Горна Маргарита Степанівна, Стенько Алла Степанівна, Кунщикова Інна Сергіївна, Бондар Ірина Володимирівна, Мацелюх Богдан Павлович, Кунщикова Євгенія Олександрівна, Безкоровайна Надія Карпівна
Формула / Реферат
Штамм К 2+ и К 2- гриба Blakeslea trispora ИМВ АН Украины № КПМ-35 - продуцент бета-каротина.
Текст
Изобретение относится к области медицины, сельского хозяйства и пищевой промышленности. Бета-каротин играет важную роль в обеспечении многих физиологических функций организма. Он обеспечивает нормальный рост организма и развитие плода, повышает активность половых гормонов, повышает устойчивость к инфекционным заболеваниям, обладает антимутагенной, антиканцерогенной и радиопротекторной активностями. Сопряженными двойными связями С=С молекула бета-каротина поглощает разные свободные радикалы, защищая таким образом, клетку от мутагенного и канцерогенного действия ионизирующей радиации и химических мутагенов, кроме того, он широко применяется в лечебнопрофилактических препаратах, в пищевой промышленности. в масложировой, кондитерской, мясомолочной, пищеконсервной и других отраслях. Известно использование в промышленном производстве бета-каротина штамм 64+ и 490- гриба Blakeslea trispora. По паспортным данным в лаборатории на колбах активность указанного штамма составляла 70000100000 ед./100 мл культуральной жидкости (КЖ). При этом характер роста в условиях ферментации (закатывание в крупные шарики) ухудшает массообмен и при этом снижается продуктивность мицелия в единицу времени (мкг каротина в 1 г сухой биомассы). Позже был получен штамм 8А+ и 8А-, обладающий более высокой активностью образования бета-каротина (на 28% выше прототипа), однако не был оптимальным по продуктивности. Позже нами селекционирован штамм К 1+ и К 1- [1] наиболее близко к предлагаемому изобретению, был получен методом последовательного мутагенеза на реплицирующейся ДНК гриба с использованием нитрозогуанидина в концентрации 200-500 мгк/мл при выживаемости 0,02-0,1% для К 1+ и комбинированного действия УФ-облучения (выживаемость 5-7-10%) с нитрозогуанидином в указанной концентрации. Полученный штамм в условиях лаборатории на качалках обладал активностью 155520 ед/100 мо КЖ до 223790 ед/100 мл КЖ. В ферментерах цеха активность составляла от 156860 до 191210 ед/100 мл КЖ, что в среднем составляло 177000 ед/100 мл КЖ. Полученный штамм имел сокращенный цикл ферментации, однако уровень активности еще не удовлетворял требованиям производства и потребности в бета-каротине в частности. Задачей изобретения была селекция высокоактивного штамма - продуцента бета-каротина, который бы более полно отвечал потребностям производства. На следующем этапе селекции были использованы как методы классических генетических подходов 3 мутагенез, так и методы клеточной инженерии - получение и регенерация протопластов. Для достижения поставленной цели разработана методика, состоящая в следующем: молодая физиологически активная форма гриба в 18-20 час возрасте обе (+) и (-) половые формы обрабатывались пищеварительным соком виноградной улитки в разных концентрациях и в комплексе с другими ферментами в средах с осмотическими стабилизаторами лучшими среди которых оказались 0,2-0,8 Μ мальтоза и сукцинат натрия. Титр протопластов составлял от 5,7 до 1,5.106, что позволяло проводить экспериментальные исследования. В результате тотального отбора и проведенных многократных проверок получен штамм К 2+ и К 2, который на качалках имел активность от 195520 ед/100 мл КЖ до 243790 ед/100 мл КЖ. В условиях промышленного производства активность указанного штамма составляла от 280000 ед/100 мл КЖ до 390000 ед/100 мл КЖ. Характеристика штамма К 2+ и К 2-. Гриб Blakeslea trispora относится к мукоровым грибам класс Mucoracae (ранее вид Choanephora реидентифицирован в виде Blakeslea trispora на основе современных исследований Kirk, 1984 и описан в определителе A monograph of the Choanephoraceae (Mycologycal paper, Kew, England, 1984, N 152, p. 1-61). Морфологические свойства. Гифы нитевидные, мощные, часто с перетяжками, образуя клубки. К 2+ имеет хорошо развитый воздушный мицелий от серовато-желтого до желтого цвета. Субстратный мицелий от серовато-оранжевого до желтооранжевого с оранжевым окрасом субстрата. Отмечается интенсивное спорообразование. Бесполое спорообразование только спорангиальное, представлено стилоспораниями и спорангиями. Стилоспорангии 50100 мкм в диаметре. Спорангии -эллиптически-шаровидные 12х16 - 10х14 мкм, трехспоровые, многочисленные; спорангиоспоры также эллиптические 14х8 мкм светло-табачного цвета имеют продольную исчерченность. К 2- воздушный мицелий развит хорошо оранжево-желтого цвета или ярко-оранжевого цвета, субстратный мицелий ярко-оранжево-красный и диффундирует цвет в среду. Культуральные свойства. Оптимальной средой роста гриба служит сусло-агар; гриб хорошо растет на мукоровом агаре, хуже - на ΜΠΑ, на среде Чапека. Наиболее характерным является рост на сусло-агаре, где (+) вариант имеет субстратный мицелий светло-оранжевого или желтого цвета, а (-) форма - субстратный мицелий ярко-оранжевого до красного цвета. На месте стыка совместного роста обеих половых форм образуется зона ярко-оранжевого или яркооранжево-красного цвета шириной 15-25 мм. Этот признак является маркером заявляемого штамма и отличает его от исходного штамма и штамма 8 A+ и 8 А-. По указанному признаку штамм можно легко выделить среди большого набора штаммов. Культивирование штамма К 2+ и К 2-. Для глубинного культивирования на колбах использовались посевные и ферментационные среды: состав посевной среды (в %): мука соевая 2,3 мука кукурузная 4,7 КН2РО4 0,05 тиамин 0,0002 вода водопроводная или дистиллированная сколько надо рН=6,1-6,4 Среда разливается по 100 мл и 150 мл в колбы объемом 750 мл, стерилизуется в режиме 0,3 атм 90 мин. Засев (+) и (-) формами производится отдельно спорово-мицелиальной суспензией и выращивается 48 час на качалках при 220-240 об./мин (при 28°С). После переносится в ферментационную среду. Состав ферментационной среды: (г/л) зеленая патока 38 кукурузный экстракт 21,5 КР2РО4 0,05 тиамин -0,0002 (можно без внесения витамина В1, так как кукурузный экстракт в своем составе содержит комплекс витаминов группы В). рН = 6,1-6,4. Условия стерилизации те же. Среда разливается в колбы по 60 мл и добавляется масло растительное (4,7%). Засев производится в соотношении 1: 10 (+) и (-) форм соответственно. Способ поясняется примерами (получение бета-каротина). Пример: после выращивания (+) и (-) форм на посевной среде в течение 48 час при одинаковом накоплении биомассы К 2+ и К 2- в соотношении 1:10 (в пересчете на биомассу - сухую) дается 1 МЛ К 2+ и 9 мл К 2-. Общее количество посевного материала составляет 20% к объему среды для ферментации. Выращивается на качалках при 220-240 об/мин при 28°С, через 36 час вводится 0,1% бета-ионона - стимулятора каротино-генеза и 0,01% антиоксиданта; процесс ферментации на качалках длится 96 час. После ферментации культуральную жидкость нагревали до 65°С в течение 2 ч 15 мин (для инактивации ферментов), фильтровали и в биомассе определяли активность бета-каротина в мкг/100 мл культуральной жидкости по Викуловой с соавторами. Результаты опытов, полученных на качалках в лабораторных условиях Штамм К 2+ и К 2Активность бета-каротина мкг/100 мл КЖ 1 опыт 195520 2" 196420 3" 201420 4" 211244 5" 198640 6" 199834 7" 243790 Прототип К 14 и К 1" (он же исходный) штамм 1 опыт 155595 2" 179343 3" 150120 4" 142893 5" 140920 6" 164140 7" 172400 Таким образом, полученные результаты на колбах при культивировании в лабораторных условиях свидетельствуют, что активность штамма К 2+ и К 2- на 40% выше ранее полученного штамма К 1+ и К 1-. В цехе в условиях промышленного культивирования активность составляла от 280000 ед/100 мл культуральной жидкости до 390000 ед/100 мл культуральной жидкости, тогда К 1 + и К 1- составлял 180000-220000 ед/100 мл культуральной жидкости.
ДивитисяДодаткова інформація
Автори англійськоюSten`ko Alla Stepanivna, Matseliukh Bohdan Pavlovych, Kunschykova Inna Serhiivna, Horna Marharyta Stepanivna, Bezkorovaina Nadiia Karpivna, Bondar Iryna Volodymyrivna, Kunschykova Yevheniia Oleksandrivna
Автори російськоюСтенько Алла Степановна, Мацелюх Богдан Павлович, Кунщикова Инна Сергеевна, Горна Маргарита Степановна, Безкоровайна Надежда Карповна, Бондар Ирина Владимировна, Кунщикова Евгения Александровна
МПК / Мітки
МПК: C12R 1/645, C12P 23/00, C12N 1/14
Мітки: бета-каротину, trispora, продуцент, штам, гриба, blakeslea
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/2-2220-shtam-k-2-i-k-2-griba-blakeslea-trispora-producent-beta-karotinu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">+ штам к 2 i к 2 гриба blakeslea trispora -продуцент бета-каротину.</a>
Попередній патент: Високовольтний транзистор
Наступний патент: Еректор
Випадковий патент: Спосіб прогнозування дефектів виливків "витік"