Штам бактерій васіllus аlvеі-413-продуцент антигена герпесвіруса-1 великої рогатої худоби

UA („> УКРАЇНА 14759 ,,„ A (5і)бС 12 N 1/20; A 61 К 39/12 ДЕРЖАВНЕ ПАТЕНТНЕ ВІДОМСТВО ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД без проведення експертизи по суті на підставі Постанови ВерховноТ Ради України 1* 3769X11 від 23.ХІІ. 1993 р. (54) ШТАМ БАКТЕРІЙ BACILLUS ALVEI-413 - ПРОДУЦЕНТ АНТИГЕНА ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ Публікується в редакції заявника ГЕРПЕСВІРУСА-І 1 (21)93007515 (22)02.11.93 (24)18.02.97 (46) 30.06.97. Бюл. Ьк З (47) 18.02.97 (72) Фукс Поліна Павлівна, Голуб Юрій Степанович, Гончарова Лариса Васильовна, Волосянко Олена Вікторівна (73) Інститут експериментальноТ І клінічної ветеринарної медицини (UA) (57) Штамм бактерий Bacillus alvel - продуцент антигена герпесвируса-1 крупного рогатого скота ИЭКВМ УААН N? 413. . Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии и может быть использовано в биотехнологии, в практике работы ветбаклабораторий и научно-исследовательских институтов. Известен штамм Bacillus alvel (Смирнов A.M. Диагностика бактериальных болезней расплода. - Журнал., "Пчеловодство", М., "Колос", 1984, № 2, с. 20) - грубая, спорообразующая палочка, длиной 3,0 - 4,5, шириной 0 , 7 - 1 , 0 мкм, по Граму красится положительно, подвижная, перетрих. Споры располагаются центрально, крупные - 2,54,0 мкм в длину и 0.8-1,5 мкм в ширину, иногда образует ряды в виде частокола. Факультативный аэроб, растет при 37°С на МП А и МПБ, кровяном агаре Цейслера, через сутки образуя на агаре крупные колонии неправильной формы в виде "оленьих рогов", грязно-желтого цвета, на агаре Цейслера образует гемолиз типа /?, иногда а, бульон мутит равномерно. На 3-5 день на поверхности бульона образуется бесцветная или сероватая, гладкая, нежная, нестабильная пленка со слабым пристеночным кольцом, при встряхивании опадающая на дно пробирки. Желатину медленно разжижает, молоко свертывает и пептонизирует, индола не образует, обнаруживаются следы аммиака и сероводорода, крахмал не гидролизует нитраты не восстанавливает. Расщепляет глюкозу, мальтозу, глицерин, лактозу, сахаро°зу с образованием кислоты, но без газа. Биохимические свойства непостоянны, старые культуры имеют неприятный запах, особенно сильный при культивировании микроба на кровяном агаре. Известен также штамм бактерий Bacillus alvel - продуцент рестриктазы BAVI (авт.св. СССР № 1678833, кл. С 12 N 9/14 от 12.07.90), который характеризуется следующими свойствами: Морфологические и культурально-биохимические свойства. Палочки размером 0,5-0,8 х 2-3 мкм расположены поодиночке и парами, споры. Грам-положительны (признак непостоянный, варьирует). Клетки подвижны (признак варьирует). Культура хорошо растет на твердых и жидких 1 С 1 СЛ 7 14759 питательных с.ррдах мчсо-пептонном агаре. Ггульомр Хоттингерл. среде LB. На скошеимом агаре дает слабый нежный налет, на МПЛ растет в Риде мелких, блестящих, выпуклых колоний с ровными краями. На мясо- 5 пептонном бульоне и бульоне Хоттингера равномерное помутнение, сероватая нежная пленка. Отношение к кислороду - аэроб. Утилизация углеводов - на глюкозе, лактозе, сахарозе образует кислоту. Лакмусовое мо- 10 локо свертывает, пептонизируег. Индол не образует. Желатину разжижает. Штамм выращивают на питательной среде, содержащей бульон Хоттингера в условиях аэрации и из полученной биомассы выделяют извест- 15 ными способами рестриктазу. Известен также штамм Bacillus alvel ВГНКИ № 94/84, используемый для изготовления биопрепаратов против европейского гнильца пчел (авт.св. СССР № 1338388, кл. 20 С 12 N 1/20, А 61 К 39/00 от 27.03.85), который характеризуется следующими культурально-морфологическими и биохимическими свойствами; грамположительные палочки, расположенные одиночно или короткими це- 25 почками. Образуют овальные споры, расположенные на конце клетки. Факультативный аэроб, растет при 37°С, способен культивироваться в температурных интервалах 15~47°С, устойчив при воздействии темпе- 30 ратуры 80°С в течение 2 ч. В МПБ культура вызывает слабое помутнение среды, на поверхности иногда образует пленку, на дне пробирки - осадок, при встряхивании поднимающийся в виде косы. Культура растет в 35 среде с 6,5% хлористого натрия, 10 и 40% бычьей желчи. свойству - продуцирования антигена вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (Герпесвируса-1). Задача изобретения - изыскание продуцента антигена вируса инфекционного ринотрахеита к р у п н о г о рогатого скота, позволяющего нарабатывать антиген, используя доступные дешевые питательные среды. Поставленная задача решается использованием штамма Bacillus alvel - продуцента антигена герпесвируса - 1 (вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота) ИЭКВМ УААН I f 413. Ve Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый штамм отличается от известного новым свойством - продуцированием антигена герпесвируса-1 крупного рогатого скота, что соответствует критерию "новизна". Это же свойство не обнаружено при анализе других известных штаммов Bacillus alvel, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого изобретения критерию "изобретательский уровень". Штамм Bacillus alvel-413 выделен из подмора пчел пасеки неблагополучной по инфекционным заболеваниям пчел, типирован бактериофагом Витебского ветеринарного института, депонирован в коллекции микроорганизмов Института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины под номером 413. Штамм Bacillus alvei-413 характеризуется следующими морфологическими, культуральными и биохимическими признаками. Морфологические признаки. Крупные На мясо-пептонном, рыбном и кровяном грамположительные палочки, длиной 2-5 агарах образует плоские или слегка выпукмкм и шириной 0,5-0,8 мкм, эллиптической лые колонии с неровными краями, сливаю- 40 формы. Образуют овальные споры с остаткащиеся в сплошной рост. Колонии ми палочек на обеих концах, они шире палосеро-белого цвета, имеют радиальную исчек и часто расположены рядами. черченность. Ферментативные свойства. Отмечается раздутость спорангия, споры Сбраживает глюкозу, мальтозу, лактозу, располагаются центрально и субтерминальманнит, сорбит с образованием кислоты. 45 но. Размер спор 2,5-4,0 мкм в длину и 0,9Арабинозу, ксилозу, сахарозу, рамнозу, 13,0 мкм в ширину. Строение и форма спор дульцит, инозит, рафинозу, галактозу не характерны. При электронной микроскопии ферментирует. Желатину разжижает, молоклеточная стенка палочки трехслойная, доо ко свертывает, индол не образует. Антигенные свойства. Имеет обособленный 50 стигает толщины 170 А . Цитоплазма имеет гранулярное строение. Споры пятиугольной вегетативный и споровый антигены. Штамм формы с плотной гомогенной оболочкой обладает стабильными свойствами и исо пользуется для получения биологических (270 А) и неравномерными выступами. Зона препаратов для профилактики и терапии ево ропеского гнильца пчел. 55 кортекса (330 А) состоит из 7 слоев. В центре Известные штаммы Bacillus alvei, обласпоры размещена спороплазма. дая сходными морфологическими, культуКультуральные и биохимические свойстральными, биохимическими свойствами, по ва. Факультативный аэроб, хорошо растет антигенной структуре не идентичны заявляна обычных питательных средах (МПА емому штамму и не обладают присущим ему 5 МПБ), рН 7,2 7,4 при 35 37°С Максимальная температура роста 40 45°С, минималі ная 15-20°С. При росте на жидких питательных средах подвижность является непостоянным признаком (реакция варьи- 5 рует) Разлагает глюкозу с образованием кислоты и ацетона без образования газа При росте на средах с арабинозой, ксилозой и маннитом кислоту не образует Растет на средах с 0,001% лизоцима и 5% хлористым 10 натрием, расщепляет казеин и тирозин (непостоянно), проходит кокковидную стадию при культивировании в течение нескольких недель на среде содержащей сахар, желатину разжижает, свертывает и пептонизирует 15 молоко, индола не образует, расщепляет глицерин, лактозу, сахарозу, мальтозу. Нитраты не восстанавливает, каталазоположителен, вызывает /?-гемолиз. Через 24 ч роста на МПБ вызывает по- 20 мутнение среды с образованием слизистого осадка, сероватой нестабильной пленки, при встряхивании опадающей на дно. На МПА образует крупные разветвляющиеся колонии неправильной формы в виде 25 "оленьих рогов" с блестящей поверхностью, иногда грязно-желтого цвета. Способность Bacillus alvel-413 продуцировать антиген, родственный антигену герпесвируса-1 крупного рогатого скота, 30 подтверждают опытом по истощению антител сывороток крови 15 телят, которые до и после истощения титруют антигенами: вирусной диареи крупного рогатого скота, инфекционного ринотрахеита крупного 35 рогатого скота, микоплазм с помощью реакции непрямой агглютинации (РНА); парагриппа-3, рота- и коронавируса с помощью реакции задержки гемагглютимлции (РЗГА) по общепринятой МРгодике Штамм Bacillus alvel 413 выращивают на МПА в течение 24 ч, суточную культуру смывают физраствором рН 7,0 7,2. однократно отмывают физрагтрором и ресусп*»ндируют в нем до концентрации 20 млд м т /мл. Полученную суспензию культуры смешивают с титрованнмми сыворотками в соотношении 1 9 и помещают в термостат на 2 часа при 37°С и на 12 часов при 4°С, после чего пробирки центрифугируют Исходные сыворотки и пробы надосадочной жидкости титруют антигенами вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД), инфекционного ринотрахеита (ИРТ), микоплазм в РНА, парагриппа-З(ПГ-З), ротаи коронавируса в РЗГА. Результаты опыта представлены в табл 1. Параллельно ставят опыт по истощению антител сывороток (с теми же сыворотками по описанной выше методике) с тремя штаммами Bacillus alvel, Bacillus subtilis, Bacillus mesenterlcum, Staphylococcus albus. Результаты опыта представлены в табл 2 Таким образом, использование штамма бактерий Bacillus alvel-413 в качестве продуцента антигена герпесвируса-1 крупного рогатого скота позволяет значительно упростить способ производства и снизить себестоимость целевого продукта за счет использования доступных питательных сред по с р а в н е н и ю с использованием в качестве продуцента герпесвируса-1, требующего для культивирования культивируемых соматических клеток животных. Таблица Результаты опыта по истощению антител сывороток крови телят Bacillus alvel-413 N? живот ного вд ИРТ Титры антител до истощения РотавиМикоПГ-3 Корона плазм 1 16 рус 1 40 вирус 1 160 вд 1 32 Титры антител поспе истощения ИРТ Мико Ротави ПГ 3 0 180 плазм 1 80 Корона рус 140 вирус 1 160 1 160 1 32 1 32 1 80 2 1 64 1 64 1 160 1 64 1 40 1 160 1 64 1 4 180 1 64 140 3 1 64 1 64 180 1256 140 180 1 16 12 180 1 12Я 1 40 180 1512 180 180 1 32 12 1320 1 512 1 НО 1 80 1 4 1 32 1 128 1 320 5 1 128 1 16 1320 164 } 160 1 40 1 128 0 1 160 1 64 1 160 1 40 в 1 16 132 1 80 132 180 1 160 1 16 0 1 80 132 180 1 160 7 164 1-64 1 640 1 32 1 160 180 164 12 1640 1 32 1 160 1 80 8 132 1 64 1640 1 16 1320 1 160 1 32 12 1640 1 16 1320 1 160 9 1 64 1256 1 80 1 64 1320 1 160 1 64 18 180 1 64 1320 1 160 10 1 16 1 64 1 320 1 256 180 140 1 16 1 4 1 160 1 256 180 1 40 180 120 164 0 1320 f 128 180 120 1320 У 20 164 14 180 1 128 ї 320 1 20 11 12 1 128 132 13С0 ! 128 164 1 128 1 80 1 128 П 164 1 64 1 160 164 140 180 1 64 12 1 160 1 64 1 40 1 80 »4 1 128 1 128 1 160 1 16 140 140 1 128 12 1 160 1 16 1 40 1 40 15 1 42 1 124 1 120 1 32 1320 1 80 132 1 4 1 160 132 1 320 1 80 f 8 14759 Таблица 2 Опыт по истощению антител сывороток крови телят Bacillus alvel-413, Bacillus subtllls, Bacillus mesenterlcum, Staphylocoecus albus, Bacillus alvei-57 и ВГНКИ Nf 94/84 Название культуры Титры антител до истощения ИРГ B.J Титры антител после истощения пг-з Мико ИРТ вд ПГ-З плазм. Микоплазм. 1:256 1-32 1:310 1:32 1:4 1:32 1:320 1:32 1.64 Bacillus alvel-413 1:32 1:640 1:64 0 1:32 1:640 1:64 1:256 1:32 1:128 1:320 1:256 0 1:128 1:320 1:128 1:32 1:80 1:64 1:4 1 32 1:80 1:64 1:64 1:64 1:160 1:256 0 1:64 1:160 1:256 1:256 1:32 1:320 1:32 1:256 1:32 1:320 1:32 1:64 Bacillus subtllls 1:32 1:640 1:64 1:64 1:32 1:640 1:64 1:32 1:320 1:256 1:32 1:128 1:320 1:256 1:32 1:80 1:64 1:128 1:32 1:80 1:64 1:64 1:64 1:160 1:256 1:64 1:64 1:160 1:256 1:256 1.32 1:320 1:32 1:256 1:32 1.320 1:32 1:64 Bacillus mesentericum 1:128 1:128 1:32 1:640 1:64 1:64 1:32 1:640 1:64 1:256 1:32 1:256 1:32 1:128 1:320 1:80 1:64 1:128 1:32 1:80 1:64 1:64 1:160 1:64 1:64 1:32 1:320 1:256 1:32 1:160 1:320 1:256 1:256 1:256 1:32 1:64 1:32 1:640 1:64 1:64 1:32 1:640 1:64 1:32 1:128 1:320 1:256 1:32 1:128 1:320 1:256 1:128 1:32 1:80 1:64 1:128 1:32 1:80 1:64 1:64 Bacillus alvei-57 1:320 1:32 1:64 Staphylocoecus albus 1:128 1:128 1:64 * 1:160 1:256 1:64 1:64 1:160 1:256 1:32 1:320 1:32 1:256 1:32 1:320 1:32 1:32 1:640 1:64 1:256 1:256 1:320 1:64 1:32 1:640 1:64 1:64 1:32 1:128 1:320 1:256 1:32 1:128 1:320 1:128 1:32 1:80 1:64 1:128 1:32 1:80 1:64 1:64 1:64 1:160 1:256 1:64 1:64 1:160 1:256 Bacillus alvel 1:256 1:32 1:320 1:32 1:256 1:32 1:320 1:32 ВГНКИ Г* 94/84 1:64 1:32 1:640 1:64 1:64 1:32 1:640 1:64 1:32 1:128 1:320 1:256 1:32 1:128 1.320 1:256 1:128 1:32 1:80 1:64 1:128 1:32 1:80 1:64 1:64 1:64 1:160 1:256 1:64 1:64 1:160 1:256 і Упорядник Замовлення 4149 Техред М.Моргентал Коректор О. Кравцова Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, КиТв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.Гагаріна. 101