Спосіб одержання очищеного димеру рибонуклеази

1 Способ получения очищенного димера рибонуклеазы, предусматривающий приготовление раствора рибонуклеазы добавлением мономера рибонуклеазы к буферному раствору, димеризацию мономера рибонуклеазы посредством добавления к раствору суберимидатного сшивающего реагента, причем рН раствора поддерживают на требуемом уровне, а затем остановку реакции димеризации в данный момент посредством снижения рН, очистку полученного раствора димеризованной рибонуклеазы посредством жидкостной хроматографии, элюирование и сбор фракций, содержащих целевой продукт, отличающийся тем, что значение рН указанного буферного раствора рибонуклеазы во время реакции димеризации поддерживают на уровне по меньшей мере 9, реакцию димеризации останавливают в заданный момент снижением рН до примерно 7, а очистку проводят по меньшей мере в две стадии жидкостной хроматографии полученного раствора димерсодержащих фракций, которые предпочтительно включают пропускание раствора через колонку, заполненную поперечно сшитой декстрановой смолой. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в растворе мономерной рибонуклеазы устанавливают значение рН примерно 10. 3. Способ по п 2, отличающийся тем, что в растворе мономерной рибонуклеазы значение рН устанавливают добавлением NaOH 4. Способ по п 1, отличающийся тем, чтот применяемый в растворе мономерной рибонуклеазы буфер представляет собой раствор дигидрата динатрийгидрофосфата 5. Способ по п 1, отличающийся тем, что осаждающий реагент добавляют к раствору мономерной рибонуклеазы при поддержании в растворе значения рН, равным примерно 10. 6 Способ по п. 1, отличающийся тем, что соединяющее средство представлено диметилсуберимидатом. 7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадии димеризации проводят при комнатной температуре. 8. Способ по п 1, отличающийся тем, что стадии димеризации проводят при непрерывном перемешивании раствора 9 Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию прекращают добавлением раствора HCI. 10 Способ по п. 1, отличающийся тем, что раствора димеризованной рибонуклеазы перед очисткой концентрируют с помощью системы с тангенциальным потоком. 11. Способ по п 1, отличающийся тем, что раствор мономера рибонуклеазы содержит 40-60 г мономера рибонуклеазы и 4-6 л буфера, а соединяющий реагент добавляют в количестве 4-6 г. 12. Способ по п 1, отличающийся тем, что фракции, отобранные после первого этапа элюирования, анализируют методом гель-электрофореза. 13 Способ1 по п. 1, отличающийся тем, что фракции, отобранные после первого этапа элюирования, лиофилизируют. 14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фракции, отобранные после первого этапа элюирования и содержащие в основном мономерную рибонуклеазу, рециркулируют на димеризацию. 15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что второй этап элюирования проводят при рН около 5. 16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что рН на втором этапе элюирования устанавливают с использованием натрийацетатного буфера. 17. Способ по п 1, отличающийся тем, что фракции, отобранные на втором этапе элюирования, анализируют методом гель-электрофореза. 18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после второго этапа элюирования проводят стадию обессоливания. 19 Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадию обессоливания проводят с применением колонки с сшитым декстраном G 25. 20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию удаления эндотоксинов из полученного в качестве продукта очищенного димера рибонуклеазы. 21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что эндотоксины удаляют на колонке с детоксигелем. О 00 со CM 27438 Изобретение относится к способам получения и очистки димера рибонуклеазы, которые могут использоваться для лечения вирусных и бактериальных инфекций Все возрастающее количество бактериальных и вирусных болезнетворных штаммов с устойчивостью к известным антибиотикам вызвало необходимость во введении для лечения человека и животных лекарств нового типа Среди применяемых в настоящее время многих новых методов лечения и лекарств для лечения больных, пораженных различными заболеваниями, получило признание введение таким больным мономерных форм ферментов В некоторых случаях это необходимо потому, что при некоторых симптомах заболевания наблюдается снижение активности ферментов Ферменты относятся к каталитически активным белкам, при участии которых протекают все жизненно важные процессы в организме В силу этого многие ферменты, как в индивидуальном состоянии, так и в определенных сочетаниях выделены из-за их физико-химического, физиологического или биологического действия К числу различных ферментов, для которых известно лечебное действие или которые снижают свою активность при определенных симптомах заболевания, относятся и рибонуклеззы Рибонуклеазы образуют группу нуклеиновых ферментов, обычно обнаруживаемых во многих животных и растительных организмах Изучение свойств рибонуклеазы и методов выделения этого фермента начали в середине 50-х годов Schmidt и McDonald Среди многих открытий, связанных с этим ферментом, было и то, что раковая ткань характеризуется крайне сниженной активностью своих рибонуклеаз В одном случае было обнаружено, что мышь с лейкозом обладает значительно пониженной активностью кислотной рибонуклеазы, наблюдаемой, в частности, в митохондриевых и микросомных фракциях, полученных из тканей селезенки животного Исследования, подобные этим, указывают на то, что введение рибонуклеазы, возможно, удастся использовать для профилактики или для борьбы с симптомами, связанными с вирусной лейкемией К сожалению потенциальные возможности, которые могли бы быть использованы применением рибонуклеазы, не были реализованы, в первую очередь, вследствие сильного цитотоксического действия мономерной формы этого фермента Например, в опытах с культивируемыми фибробластами цитотоксическое действие от введения мономерной формы рибонуклеазы наблюдалось даже при чрезвычайно низких ее дозировках Очевидно, что необходимо создать способы максимального использования потенциальных возможностей рибонуклеазы при одновременном сведении к минимуму потенциально вредного цитотоксического действия мономерной формы этого фермента Недавно обнаружено, что из рибонуклеазы может быть приготовлена противовирусная или антибактериальная композиция, не обладающая цитотоксическим действием, если такую композицию готовят на димерной форме фермента При менение композиций димера рибонуклеазы, как найдено, эффективно при лечении ряда инфекционных заболеваний, и в то же время не оказывает сильного цитотоксического действия, обычно связанного с мономером рибонуклеазы Применение димеров рибонуклеазы в различных курсах лечения раскрыто в находящейся на одновременном рассмотрении заявке РСТ № 88/01785 Хотя некоторые способы получения димерной формы рибонуклеазы из ее мономерной формы известны, важное значение имеет возможность получения больших количеств димерной формы недорогим и эффективным путем Таким образом, крайне желательно создание системы получения и анализа больших количеств очищенного димера рибонуклеазы, содержащего минимальные количества таких примесей, как мономеры, мультимеры или другие загрязняющие вещества Согласно изобретению предлагаемый способ получения в качестве конечного продукта димера рибонуклеазы предусматривает стадии a) приготовление раствора рибонуклеазы добавлением мономерной рибонуклеазы к буферному раствору с установлением рН, по меньшей мере равным 9, b) добавления суберимидатного (содержащего имидат пробковой кислоты) связующего средства, такого как диметилсуберимидат с целью димеризации мономеров рибонуклеазы в растворе рибонуклеазы с поддерживанием в растворе рН 9 или выше, c) понижения рН примерно до 7 с целью прекращения реакции димеризации на данном уровне, d) очистки раствора димеризованной рибонуклеазы проведением первого этапа фильтрования, на котором раствор пропускают через ионообменную смолу и отбирают фракции, содержащие существенные количества димерной формы рибонуклеазы, e) проведения второго этапа фильтрования, на котором фракции, отобранные на первом этапе фильтрования, пропускают через ионообменную смолу, f) сбора в качестве конечного продукта второго этапа фильтрования димерной рибонуклеазы высокой степени чистоты Применением вышеприведенного способа можно приготовить в качестве конечного продукта большие количества димера рибонуклеазы, который будет чрезвычайно полезен для лечения различных вирусных и бактериальных заболеваний Фиг 1 и 2 графически иллюстрируют характер элюирования при ионообменной хроматографии, проводимой в соответствии с предлагаемым изобретением При получении в соответствии с предлагаемым изобретением димерной формы рибонуклеазы в качестве исходных продуктов могут быть использованы любые доступные в настоящее время мономеры рибонуклеазы Применяемые в предлагаемом изобретении мономеры рибонуклеазы получены от фирмы Серва Файн Биокемика, ГмбХ, Гейдельберг и имеют каталожный № 27438 28260. Применяемые мономеры могут быть представлены рибонуклеазой А или любой другой из доступных рибонуклеаз. Мономеры рибонуклеазы готовят к реакции соединения их растворением при комнатной температуре в фосфатном буфере с получением раствора мономера рибонуклеазы. В качестве применяемого буфера рекомендуется 0,1 М буферный раствор дигидрата динатрийгидрофосфата, в котором растворяют мономер непрерывным перемешиванием раствора по меньшей мере 2 ч. Приемлемый буферный раствор получен растворением примерно 70 г дигидрата динатрийгидрофосфата примерно в 1000 мл НгО. Хотя точные количества реагентов и растворов, применяемых в способе предлагаемого изобретения, могут меняться, тем не менее реакцию димеризации предлагаемого изобретения осуществляют применением 40-60 г мономера рибонуклеазы, растворенных в 5 л раствора дигидрата динатрийгидрофосфата в качестве буфера. Кроме того, рекомендуется установить в растворе мономера значение рН по меньшей мере 9, наиболее предпочтительно около 10. Установление рН может быть проведено добавлением 0,1 н. NaOH. Реакцию димеризации инициируют добавлением в качестве сшивающего средства суберимидата в определенном отношении к раствору мономера рибонуклеазы с установлением значения рН, равного по меньшей мере 9 или выше, предпочтительно 10 (±0,2). В качестве соединяющего средства в предлагаемом изобретении рекомендуется применение диметилсуберимидата, но могут быть также использованы и другие суберимидатные соединяющие реагенты. К раствору мономера, приготовленного вышеописанным способом, рекомендуют добавлять 4-6 г диметилсуберимидата, который растворяется в пределах 1 мин. При непрерывном перемешивании с помощью магнитной мешалки или иного устройства реакция димеризации при комнатной температуре (25 ± 5°С) протекает в течение 3060 мин. Реакция может быть прекращена понижением рН до 7 (±0,2), что может быть осуществлено добавлением 1 М раствора HCI. В этот момент рекомендуется концентрировать полученную смесь с помощью тангенциальной проточной системы, более подробно описанной ниже. 3 различные моменты времени после начала реакции соединения рекомендуется отбирать из раствора образцы для анализа и анализировать их электрофорезом на геле. Исследования электрофорезом на геле показали, что, хотя мономерная форма фермента четко видна почти во всех анализируемых фракциях, полоса, соответствующая димерной форме рибонуклеазы, поддается обнаружению спустя примерно 10 мин после начала реакции. Полоса, соответствующая димерной форме фермента, четко видима спустя примерно 15 мин, и эта полоса становится все более значимой по мере протекания реакции. Кроме того, примерно через 30 мин после добавления сшивающего реагента можно наблюдать образование олигомерных форм фермента. Мономерная форма рибонуклеазы обладает относительной мол. м. 1500, а димерная фор