Дипептиділамінопептидаза, що виділена з dictiostelium discoideum та спосіб ферментативного відщеплення n-кінцевих дипептидів met-tyr, met-arg або met-asp від поліпептидної послідовності

1. Дипептидиламинопептидаза, выделенная из Dictiostelium discoideum ATCC 28368 и обладающая следующими характеристиками: молекулярный вес: около 225000 Д; ферментативная активность: способна отщеплять аминоконцевой дипептид Met-Tyr, Met-Arg или Met-Asp от Met-Tyr человеческого проинсулина, Met-Arg человеческого проинсулина или Met-Asp человеческого проинсулина, соответственно, при рН оптимуме около 3,5. 2. Способ ферментативного отщепления N-KOHцевых дипептидов Met-Tyr, Met-Arg или Met-Asp от полипептидной последовательности, предусматривающий контактирование полипептидной последовательности с дилептидиламинопелтидазой при условиях, достаточных для этой реакции, отличающийся тем, что дипептидиламинопептидаза выделена из Dictiostelium discoideum ATCC 28368, а реакцию проводят при рН от 2,5 до 5,5 и при температуре от 15°С до 45°С в течение от 1 мин до 24 часов. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная полипептидная последовательность является Met-Tyr человеческим проинсулином. 4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная полипептидная последовательность является Met-Arg человеческим проинсулином. 5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная полипептидная последовательность является аналогом Met-Arg человеческого проинсулина. 6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная полипептидная последовательность является Met-Asp человеческим гормоном роста. Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. В частности, настоящее изобретение касается дипептидиламинопептидазы, выделяемой из слизистых грибов Dictyostelium и применяемой для синтеза биологических соединений путем рекомбинации. Dictyostelium discoideum - это примитивный эукариотический микроорганизм, обычно называемый слизистым грибом или, точнее, клеточным слизистым грибом. Название микроорганизма происходит от двух его крайних, с макроскопической точки зрения, состояний. В период активного роста D. discoideum напоминают одноклеточную амебу. В этот период у грибов нет клеточных стенок, и они похожи на тонкую пленку (слизь). Голодая на твердой среде, отдельные клетки собираются в колонию. Колония проявляет свойства многоклеточного организма, мигрирует в форму, называемую шишкой, а затем дифференцируется: самые молодые клетки образуют подошву, самые старые ножку, а средние - плодовое тело. В естественных условиях этот организм встречается на поверхности почвы или навоза. В природе амеба питается исключительно путем поглощения (фагоцитоза) бактерий целиком, поэтому их иногда называют плотоядными. Были получены мутантные аксенические культуры D. discoideum, способные расти без сокультуры пищевых бактерий и поэтому способные расти в растворимых ередах. Настоящее изобретение касается новой дипептидиламинопептидазы, выделяемой из D discoideum. Дипептидиламинопептидазы (ДАП) - это ферменты, гидролизующие предпоследнюю пептидную связь в аминоконцах, отделяя от свободных аминоконцов пептидов и белков дипептиды. В настоящее время известно четыре класса дипептидиламинопептидаз (они обозначаются ДАП-1, Д А П II, ДАП-ІІІ и ДАП-IV), которые различаются своими физическими свойствами и скоростью катализа расщепления аминоконцов, образованных различными последовательностями пептидов. ДАП-1 это относительно неспецифическая Д А П , которая выступает в качестве катализатора при отщепле СМ О 00 Vй |s* fs* СМ —. £_, *~ ^f «^ ~ о> ~ 27718 ний от свободных аминоконцов полипептидов и белков различных дипептидных комбинаций ДАП не проявляет активности или проявляет слабую активность, если последний дипептид - это XПро(лин), Арг(инин)-Х или Лиз(ин)-Х, где Х- любая аминокислота ДАП-1І оказывает предпочтение конечным дипептидам Арг-Х или Лиз-Х и в меньшей степени Х-Про Большинство других дипептидов ДАП-Н отщепляет гораздо медленнее ДАП-ІІІ тяготеет к конечным дипептидам вида Арг-Арг и Лиз-Лиз ДАП-IV проявляет наивысшую активность по отношению к конечным дипептидам вида XПро Выяснилось, что ферменты - ДАП, особенно ДАП-1 и ДАП-IV, полезны в операциях с белками Настоящее изобретение касается новой ДАП, получаемой из Dictyostehum discoideum и применяемой в операциях с рекомбинантными белками, имеющими в удлиняющем сегменте аминоконца четное число аминокислот Настоящее изобретение направлено на получение новой дипептидиламинопептидазы, выделяемой из клеточных слизистых грибов Dictyostehum discoideum Этот новый фермент - ДАП, или dflAn - проявляет активность, сходную по характеру с поведением ДАП-1 и ДАП-ІІІ, но сильно отличается от этих ферментов по физическим и другим ферментативным свойствам Настоящее изобретение касается также способов использования фермента йДАП для отщепления дипептидов от N-концов рекомбинантных белков или полипептидов-предшественников Фермент dflAn, предложенный настоящим изобретением, может быть использован для отщепления одного дипептида от N-конца полипептида, а также для последовательного отщепления нескольких дипептидов от N-конца полипептида-предшественника Кроме того, настоящим изобретением предложены способы выделения фермента dflAn из культур D discoideum и его очистки Следуя целям настоящего изобретения, объявленным выше, определим следующие термины и сокращения dflAn - дипептидиламинопептидаза, выделяемая из Dictyostehum discoideum, имеющая оптимальную активность при рН около 3,5, с ГФпНА в качестве субстрата, нативную молекулярную массу ок 225000 дальтон (по данным аналитического ультрацентрифугирования) и субъединичную молекулярную массу около 60000 дальтон (по данным дифференциального сканирующего элекрофореза в полиакриламидном геле) ГФпНА - Гли(цин)-Фен(илаланил)-п-нитроанилид Полипептид-предшественник - полипептид, полученный путем рекомбинации и образованный четным числом аминокислот, взятых из аминоконца нужного полипептида Обработанный полипептид - полипептид, от Nконца которого отнят дипептид или несколько дипептидов с целью получения нужного полипептида РРБНА-Арг(инин)-Арг(инин)-р-нафтиламид Все сокращения, использованные для обозначения аминокислот, утверждены Патентным Ведомством США (United States Patent and Trademark Office) и приведены в 37 С F R §1, 822 (b) (2) (1990) Настоящее изобретение направлено на получение dflAn, дипептидиламинопептидазы, выделенной из клеточных слизистых грибов Dictyostelium discotdeum Фермент dflAn имеет свойство расщеплять те же последовательности свободных аминоконцов, что и ферменты ДАП-І и ДАП-ІІІ, но он сильно отличается от этих ферментов по физическим и другим ферментным свойствам dflAn имеет рН - оптимум при рН около 3,5, с ГФпНА в качестве субстрата, нативную молекулярную массу около 225000 дальтон и субъединичную молекулярную массу ок 66000 дальтон Лектин-аффинная хроматография показала, что фермент dflAn является, скорее всего, гликопротеидом Фермент dflAn обладает способностью отщеплять дипептиды от синтетических субстратов, Гли-Фен-паранитроанилида (ГФпНА) и АргApr-p-нафтиламида (РРБНА), а также от целого ряда других синтетических и рекомбинантных полипептидов Известные ферменты класса ДАП-І выделяют из различных животных организмов и тканей Новый фермент dflAn выделяют из культурной среды Dictyostehum discoideum Ферментам ДАП-І для проявления активности необходимы галогениды и восстановители Такие реактивы, как йодоацетат, который модифицирует сульфгидрилы цистеина, инактивируют ферменты класса ДАП-І Оптимальные условия для действия ферментов класса ДАП-І создаются при рН между 5 и 6 В отличие от них, для фермента dflAn оптимальным является водородный показатель рН ок 3,5, при этом в качестве субстратов выступают Гли-Фен-пНА или Гли-Арг-пНА При этих условия dflAn проявляет значительную активность по отношению к полипептидам и белкам При рН выше 6 dflAn проявляет лишь незначительную активность К ферменту dflAn не нужно добавлять восстановители, кроме того, он полностью сохраняет активность в присутствии модификаторов цистеина, таких как йодоацетат и тетратионат dflAn подобен коровьим ДАП-І в том, что он не способен расщеплять пептиды с блокированными N-концами, но, в отличие от коровьих ДАП-І, dflAn-li проявляет активность по отношению к субстратам, имеющим в составе N-концов окисленный метионин Кроме того, в отличие от коровьих ДАП-І, dflAn легко расщепляет субстрат состава Арг-Арг-рнафтиламид Эта его способность расщеплять субстрат, имеющий в составе N-конца Арг-Аргдипептидил, делает его похожим на ферменты класса ДАП-ІІІ, выделенные из организмов млекопитающих и культур микроорганизмов, хотя ферменты класса ДАП-ІІІ наилучшим образом действуют в щелочной среде, a dflAn - в кислой Субъединичная молекулярная масса dflAn, по оценке SDS PAGE, составляет около 66000 дальтон, а субъективная молекулярная масса ДАП-І млекопитающих составляет около 22000 дальтон Фермент dflAn, предложенный настоящим изобретением, может быть использован для превращения полипептидов-предшественников в обработанные полипептиды Например, если искомым полипептидом является гормон человеческого роста, следует просто зкспрессировать предшественник гормона человеческого роста (в одном из возможных случаев гормон чел роста 27718 Мет(ионин)-Асп(арагиновая кислота), а затем обработать его ферментом сЩАП, чтобы разъединить дипептид Мет-Асп и искомый обработанный полипептид - гормон человеческого роста Необязательно, чтобы обработанный пептид был натуральным, природным полипептидом, так как часто требуется получить аналог или промежуточный продукт Способ обработки полипептидов-предшественников также является предметом настоящего изобретения К числу предшественников, которые можно подвергать обработке ферментом dflAfl, относятся Мет-Арг-чел гормон роста, МетТир(озин)-проинсулин, Мет-Арг-проинсулин, МетАрг-проинсулина аналог (В28 Лиз(ин), В29 Про(лин)), Мет-Тир-проинсулина аналог (В28 Лиз, В29 Про), Мет-Арг-проинсулина аналог (В10 Асп, des B28-30) и Мет-Тир-проинсулина аналог (В10 Асп, des В28-30) Аналог инсулина (В28 Лиз, В29 Про) описан в европейской патентной заявке с серийным номером 90301224 3, а аналог инсулина (В10 Асп, des B28-30) описан в европейской патентной заявке с серийным номером 92305678 2 Кроме того, dflAn можно использовать для последовательного удаления нескольких дипептидов от N-конца полипептида-предшественника Обработка Мет-Арг-проинсулина и Мет-Арг-проинсулина аналогов описана в патенте США № 5 126 249 Беккером и др (Becker et al), идеи которых использованы в настоящем изобретении Использование фермента йДАП для удаления дипептидов из белков-предшественников удобно тем, что оптимальные условия для действия гіДАП создаются при рН 3,5, что позволяет проводить реакции в кислой среде, в которой растворимо большинство полипептидов-предшественников Более того, операции над многими полипептидами-предшественниками при нейтральном рН и выше приводят к высоким уровням межцепочечной дисульфидной димериэации или полимеризации субстрата с соответственной потерей в выходе продукта Это явление, известное под названием дисульфидного скремблирования, создает особенно серьезные помехи, когда используется коровий ДАП-І, поскольку для проявления действия ДАП-І требуется добавление к реакционной смеси восстановителей, таких как р-меркаптоэтанол или цистеин Кроме того, окисление метиониновых остатков при кислотных значениях рН происходит медленнее Далее, экономически гораздо более целесообразно использовать фермент, выделенный из ферментационной культуры D discoideum, чем полагаться на промышленное производство ферментов из животных источников, поскольку ферментационная технология дает больший выход продукта и большее его единообразие Отказ от животных ферментов объясняется тем, что имеется постоянный источник хорошо очищенного продукта Ферментация D discoideum А х З (АТСС 28368 - номер в амер коллекции типовых культур), после которой осуществляется центрифугирование, хроматография анионного обмена, хроматография гидрофобных взаимодействий и хроматография с сортировкой по размеру, дает высокочистый раствор фермента dflAn, который можно хранить либо использовать незамедлительно для обработки полипептидов-предшественников Выделение dflAn из ферментаци онного бульона и его очистка также является предметом настоящего изобретения Превращение полипептидов-предшественников в обработанные полипептиды может осуществляться при различных температурах, в широком диапазоне значений рН и с различной продолжительностью Обычно реакция проводится в водной среде, в которой создан соответствующий буфер для получения и поддержания рН от ок 2,5 до ок 5,5 Предпочтительное значение рН среды находится в интервале от ок 3,0 до ок 4,5, а наиболее предпочтительное - в промежутке от ок 3,0 до ок 3,5 Оптимальное значение рН может немного измениться в зависимости от субстрата Например, скорость обработки Гли-Фен-пНА и Гли-АргпНА наиболее высока при рН от 3,0 до 3,5 Скорость обработки Арг-Арг-£НА наиболее высока при рН ок 4,5 Специалист согласится, что оптимальное значение рН для каждой реакции определяется такими факторами, как стабильность и растворимость данных полипептида-предшественника и фермента В некоторых случаях используются средства повышения растворимости, такие как мочевина, натрия додецилсульфат, гуанидин и т п Реакция обработки может иметь любую заданную продолжительность от нескольких секунд до нескольких дней В предпочтительном случае реакция имеет продолжительность от 1 минуты до 24 часов, а в наиболее предпочтительном случае от ок 1 часа до ок 8 часов Специалист согласится, что продолжительность реакции можно регулировать в соответствии с требованиями, предъявляемыми природой данного полипептида-предшественника Температуру реакции обработки также можно регулировать в соответствии с составом данного субстрата В предпочтительном случае реакция осуществляется при температуре от ок 15°С до ок 45°С В более предпочтительном случае температура реакции колеблется в интервале от ок 20°С до ок 37°С, а в наиболее предпочтительном - от ок 25°С до ок 37°С И снова специалист будет согласен с тем, что продолжительность, температуру и рН среды реакции можно изменять в зависимости от требований, предъявляемых составом конкретного полипептида-предшественника или обработанного полипептида В качестве буфера можно использовать любое из известных буферных средств, с тем лишь условием, чтобы оно обеспечивало поддержание рН в пределах заданного диапазона Примерами типичных буферных средств могут служить фосфат натрия, ацетат натрия, цитрат натрия, глицин и т п Предпочтительными буферными средствами являются ацетат натрия, фосфат натрия и глицин Полипептиды-предшественники для использования в рамках настоящего изобретения готовились путем рекомбинации ДНК При их изготовлении цепочки нуклеотидов, кодирующие искомые полипептиды-предшественники, обрабатывались с использованием стандартных технологий Обычно эти технологии предусматривают изготовление олигонуклеотидов, кодирующих как участки искомых кодовых последовательностей, так и комплементарные к этим участкам последовательности Олигонуклеотиды составлены так, чтобы один 27718 участок кодовой последовательности перекрывался с двумя участками комплементарной последовательности и наоборот Олигонуклеотиды спаривают и соединяют, в конечном счете получая искомую последовательность генов Эту последовательность вставляют в клонирующий вектор в таком месте, чтобы экспрессия закодированного его продукта оказалась возможной Приемлемый клонирующий вектор содержит хотя бы часть управляющей экспрессионной последовательности Нижеследующие примеры приведены в целях иллюстрации настоящего изобретения Их не следует истолковывать как ограничение настоящему изобретению Пример 1 Ферментация Dictyostelium discoideum Лиофилизированные культуры Dictyostelium discoideum A x 3 были получены из Американской коллекции типовых культур в Роквилле, Мэриленд, под номером АТСС 28368, и рассажены с различными плотностями в чашки с агаром (1,2% Дифко-Бакто-Arap-Difco Bacto Agar), в которых содержалась пептонно-дрожжевая среда с буфером, состоящая из (г/литр) дрожжевого экстракта Difco Yeast Extract (7,15), пептонной среды Difco Bacto Peptone (14,3), Na2HP04 (0,51) и КН2РО4 (0,49), с добавлением глюкозы (10 г/литр, окончат конц), простерилизованной отдельно из соображений асептики и доведенной до окончательного рН 6,5 (+/- 0,1) с помощью NaOH или H2SO4 Та же среда (без агара) была использована для выращивания жидкой культуры в объемах, не превышающих 1 литр Чашки с агаром выдерживали при температуре от 21 °С до 24°С от 3 до 5 дней Затем осторожно, чтобы не захватить "пищевые бактерии", модифицированные с культурой А х 3, собрали мешочки со спорами и посеяли споры в 3 мл пептонно-дрожжевого бульона с буфером Посев выдерживали при 21-24°С и при легком встряхивании Затем клетки D discoideum размножили, пересаживая во все большие объемы пептонно-дрожжевого бульона с буфером Каждая пересадка совершалась при разбавлении в от 10 до 25 раз, когда плотность клеток превышала 2хЮе/мл Бульоны все время выдерживали при 21-24°С при легком встряхивании Ферментацию с перемешиванием обычно осуществляли в подобной же среде с соевым пептоном (например, Phytone Peptone или Marcor Soy Peptone) в концентрации от 2 до 14,3 г/л в исходной пептонно-дрожжевой среде вместо пептона Bacto Peptone "Урожай" собирали из ферментов рабочим объемом от 10 до 5000 литров, оснащенных 1-3 турбинными мешалками марки Rushton, вращающимися со скоростью 40-150 об /мин Температуру поддерживали на уровне 22 +/- Г С , поток воздуха пропускали со скоростью от 0,1 до 0,5 объемов воздуха на объем жидкого бульона, противодавление поддерживали на уровне 3-5 фунтов/кв дюйм В некоторых случаях ферментацию проводили при рН 6,4 в присутствии серной кислоты, а в некоторых случаях - с растворенным кислородом, уровень которого - 40-60% - регулировали путем изменения интенсивности перемешивания и скорости потока воздуха Принимались меры по минимизации срезов во время фермен тации и манипуляций, т е поддержании клеток во время роста в состоянии бесстеночной амебы Как правило, перемешиваемые культуры D discoideum A x 3 росли с продолжительного периода удвоения от 12 до 36 часов Количество растворенного кислорода постепенно уменьшалось (если его не поддерживали на постоянном уровне), а затем начинало расти - после того, как прекращался рост плотности клеток Окончательная плотность клеток колебалась между Зх106/мл и 5хЮ6/мл, а перенос кислорода был ограничивающим фактором в тех случаях, когда максимальная плотность клеток была ниже Образцы для анализа выбирались произвольно Измерялись плотность клеток и ГФпНА-зная активность (см пример 3, ниже) Для оценки плотности клеток, превышающей 5х106/мл, использовали счетную камеру Петрова - Хаузера Как правило, ГФпНА-зная активность возрастала в ходе ферментации Наибольшая активность dflAn наблюдалась через 2-4 дня после того, как плотность клеток достигала максимального значения Цельные бульоны хранили при 4°С или замораживали при -20°С, затем оттаивали и анализировали на активность Урожай от ферментации собирали путем охлаждения до менее 10°С и отделения клеток с помощью центрифуги непрерывного действия Пример 2 Приготовление dflAn А Удаление клеток и концентрация Начальная очистка гіДАП от ферментацтиоиного бульона Dictyostelium discoideum предусматривает шаги удаления клеток и концентрации Удаление клеток осуществлялось с помощью центрифуги непрерывного действия марки Western States Освобожденную от клеток среду концентрировали до ок 20 раз путем проточной фильтрации вдоль потока с мембраной, отбирающей частицы с молекулярной массой 50000 Задержанную массу из ультрафильтра отобрали, а ультрафильтр промыли 50 мМ-ным трис-буфером с рН 7 для получения дополнительной порции dflAn Задержанную массу и смывы соединили и получили окончательный концентрат, который хранили замороженным при -20°С в течение нескольких месяцев, затем продолжили обработку В Осветление Замороженный окончательный концентрат размораживали в течение 12 часов при комнатной температуре Перед первым шагом колонной хроматографии оттаявший концентрат осветлили Осветление осуществили путем центрифугирования с последующей фильтрацией через 5микронную мембрану Осветленный окончательный концентрат довели до рН 7,0 и выдерживали при температуре от 4° до 10°С менее 12 часов, прежде чем подвергнуть ионообменной хроматографии С Ионообменная хроматография Первым шагом процесса очистки d/ДАП была хроматография с анионным обменом, с использованием смолы Pharmacia Q - Sepharose Fast Flow (FFQ) Колонну уравновесили 50 мМ-ным трисбуфером, рН 7 Осветленный, очищенный от клеток концентрат подавали с линейной скоростью 50см/час в соотношении 60 литров неконцентри 27718 рованной ферментационной среды на литр смолы Это давало нагрузку в 60 граммов белка на литр смолы (расчет количества белка проводился на основании опытов Pierce ВСА Protein Assay no отношению к стандартному коровьему сывороточному альбумину) На литр смолы FFQ давали ок 250 единиц активности dflAFl Проводимость очищенного от клеток концентрата составляла ок 5 мСм/см После полного нагружения порции, смолу FFQ промывали буферным раствором, используемым для уравновешивания, в количестве трех объемов колонны Активность dflAn элюировали из смолы с использованием линейного градиента от 0 до 1 М NaCI, 50 мМ трис, рН 7 на 10 объемов колонны, со скоростью потока 50 см/ч Размер фракции был 0,1 объема колонны Затем колонну FFQ элюировали тремя объемами колонны 1,0 Много NaCI в 50 мМ-ном трис, рН 7 Выходной поток проверяли на проводимость и оптическую плотность при 280 нм, а фракции проверяли на активность гіДАП, анализируя их способность расщеплять колориметрический субстрат Гли-Фенпаранитроанилида (ГФпНА) при рН 3,5 Соединив фракции, содержащие более 90% всей элюированной активности гіДАП, получили основной пул Активность 6ЦАГ\ элюировала как единственный пик размером около двух объемов колонны Основной пул окислили до рН 3,5 с помощью 10% (объем к объему) НСІ Основной пул окисленной FFQ хранили при 4°С менее 2 дней D Хроматография гидрофобных взаимодействий Основной окисленный пул FFQ подвергали дальнейшей очистке путем хроматографии гидрофобных взаимодействий со смолой Pharmacia Phenyl Sepharose Fast Flow Объем колонны составлял одну треть объема колонны для анионного обмена На литр смолы давали ок 650 единиц активности, а нагрузка белка была 4 грамма на литр смолы (1 единица оптической плотности при 280 нм приравнивалась к 1мг/мл белка) Основной поток FFQ подготавливали к загрузке в хроматографическую колонну, добавляя к нему 140 г/литр сульфата аммония Поток доводили до рН 3,5, и его окончательная проводимость составляла 90 мСм/см Хроматографическую колонну уравновешивали в 50 мМ-ном цитрате, рН 3,5, содержащем хотя бы 140 г/л сульфата аммония Поток подавали в колонну с линейной скоростью 40 см/ч, а смолу промыли буфером, используемым для уравновешивания, в количестве хотя бы три объема колонны Активность йДАП элюировали из смолы с использованием линейного градиента от 140 г/литр до 0 г/литр сульфата аммония в 50 мМном цитрате, рН 3,5, на 10 объемов колонны при 40 см/ч Затем колонну элюировали хотя бы тремя объемами колонны 50 мМ-ного цитрата, рН 3,5 Размер фракции составлял 0,1 объема колонны Выходной поток проверяли на проводимость и оптическую плотность при 280 нм, а фракции проверяли на активность йЦАП, исследуя их способность расщеплять ГФпНА при рН 3,5 Соединив фракции, содержащие около 90% всей элюированной активности dflAn, получили основной пул Активность йДАП элюировала как единственный пик величиной ок двух объемов колонны Основной пул довели до рН 3,5 с помощью 10% (объем к объему) HCI или 10% (вес к весу) NaOH Основной пул, полученный после гидрофобной хроматографии, выдерживали при 4°С менее суток, затем продолжили процедуры Е Хроматография с сортировкой по размеру Продукт хроматографии гидрофобных взаимодействий подвергли дальнейшей очистке путем хроматографии с сортировкой по размеру, с использованием сефарозы S-200 Sepharose HR Колонна имела объем, равный двум объемам колонны для гидрофобной хроматографии, и высоту придонного слоя 78см Продукт хроматографии гидрофобных взаимодействий подготовляли к хроматографии с сортировкой по размеру путем концентрации в ультрафильтре с мембраной, отбирающей молекулярную массу 10000 дальтон Продукт гидрофобной хроматографии сконцентрировали до 2,5% объема колонны для хроматографии с сортировкой по размеру, а задержанную массу отобрали из ультрафильтра Ультрафильтр промыли 50 мМ-ным буферным цитратом в количестве, равном 2,5% объема колонны для хроматографии с сортировкой по размеру Задержанную массу и смывы соединили и получили окончательный концентрат, который довели до рН 3,5 с помощью 10% (объем к объему) HCI или 10% (вес к объему) NaOH Проводимость окончательного концентрата составляла около 30 мСм/см Хроматографическую колонну уравновесили 50 мМ уксусной кислотой, 20 мМ-ным хлоридом натрия, рНЗ,5 и проводимость около 2 мСм/см Окончательный концентрат подавали в колонну с линейной скоростью 15см/ч, а активность йДАП элюировали буфером, применяемым для уравновешивания, в количестве одного объема колонны Размер фракции составлял 0,02 объема колонны Выходной поток проверяли на проводимость и оптическую плотность при 280 нм, а фракции проверяли на активность dflAn, исследуя их способность расщеплять ГФпНА при рН 3,5 Соединив фракции, содержащие около 90% всей элюированной активности йДАП, получили основной пул Активность йДАП элюировали единственным пиком величиной около 0,08 объема колонны Основной пул можно хранить при 4°С в течение нескольких месяцев Очистка ёЦАП путем последовательного применения способов хроматографии анионного обмена, хроматографии гидрофобных взаимодействий и хроматографии с сортировкой по размеру дала материал, который на SDS-PAGE мигрировал как главная полоса Полоса мигрировала на геле в положение, эквивалентное молекулярной массе стандартного коровьего сывороточного альбумина (66 килодальтон) Белок окрасили красителем ISS Про-синим На характер миграции не повлияло присутствие или отсутствие 0,1 М-ного ДДТ (плюс 100°С на 5 мин ) во время подготовки образца Субъединичная молекулярная масса ДАП-І (коровьей) составляла ок 22000 дальтон по результатам SDS-PAGE Пример 3 Активность d/ЗАП А Реакции превращения 1 Расщепление ГФпНА Активность dflAn обычно прослеживают по расщеплению хромогенного субстрата Гли-Фен 27718 паранитроанилида (ГФпНА) Обычно опыт проводят при 11-кратном разбавлении фермента 1,0 мл 4 мМ-ного ГФпНА, доведенного до рН 3,5 Скорость отщепления дипептида Г-Ф измеряли при 37°С посредством измерения роста оптической плотности при 405 нм Одна единица активности вызывает при этих условиях изменение оптической плотности на 0,90 в минуту Оценку значения в ед /мл можно сделать на основании предполо- жения, что коэффициент затухания для свободного пНА при 405 нм составляет 9,9 м М 1 с м 1 Профиль ингибирования активности сЩАП по отношению к субстрату ГФпНА сравнивали с профилем ингибирования активности коровьих ДАП-І с использованием йодоацетамида и тетратионата калия, модификаторов сульфгидрила, известных как ингибиторы действия ДАП-І Образцы СІДАП или ДАП-І, полученных из коровьей селезенки, выдерживали 15 минут при комнатной температуре в окончательных концентрациях 0, 0,5, 5,0 или 50 мМ каждого ингибитора при рН 7 в 100 мМ трис-буфера После этого растворы разбавляли в 21 раз 4 мМ-ным ГФпНА, рН 3,5 Скорость расщепления измеряли посредством измерения роста оптической плотности при 450 нм и 37°С Скорость расщепления ГФпНА коровьими ДАП-І уменьшилась более чем на 90% в присутствии 5 мМ-ного йодацетамида и на 95 % была блокирована 5мМным тетратионатом калия Значительного же уменьшения активности сЩАП не наблюдалось ни при одном из испытанных уровней йодацетамида и тетратионата калия Оптимальные значения рН для расщепления ГФпНА с помощью сІДАП определялись посредством доводки буфера, состоящего из 0,5 трис, фосфата и цитрата, 10% соляной кислотой или 10% гидроокисью натрия до заданных значений рН в пределах от 3 до 8 Фермент сЩАП разбавляли в 20 раз буфером, состоящим из ЮОмМ-ного