Спосіб стереоселективного відновлення за участю мікроорганізмів та штам мікробактерій

Способ получения соединения формулы (III) (В) отличающийся тем, что осуществляют реакцию соединений формулы (IV) (Ю с Microbactenum MB 5614, депонированным как АТСС 55557, или с его мутантом, Лейкотриены составляют группу локально действующих гормонов, продуцируемых в живых где А представляет собой -CH=CH-S- или СН=СН-СН=СН-, 1 2 R и R , независимо, представляют собой водород или галоген, 3 6 6 7 R представляет собой CO2R , COR или C(R )2-OR8, R6 представляет собой водород или низший алкил, R7 представляет собой низший алкил, и R8 представляет собой водород или группу, защищающую гидроксильную группу 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что А представляет собой -СН=СН-СН=СН-, один из R1 и R представляет собой водород, а другой представляет собой галоген, и R3 представляет собой CO2R6 3 Способ по п 1, отличающийся тем, что А представляет собой -СН=СН-СН=СН-, один из R1 и R представляет собой водород, а другой представляет собой хлор, и R3 представляет собой СО2СНз 4 Способ по п 1, отличающийся тем, что упомянутый Microbactenum культивируют в водной питательной среде, содержащей способные к ассимиляции источники углерода и азота 5 Способ по п 1, отличающийся тем, что упомянутый Microbactenum находится в состоянии покоя 6 Способ по п 4, отличающийся тем, что упомянутая питательная среда дополнительно содержит FeCb 7 Способ по п 4, отличающийся тем, что упомянутая питательная среда дополнительно содержит мононатрийглутамат 8 Способ по п 4, отличающийся тем, что упомянутая питательная среда дополнительно содержит FeCb и мононатрийглутамат 9 Штамм Microbactenum MB 5614, депонированный как АТСС 55557, или его мутанты системах из арахидоновой кислоты Основными лейкотриенами являются лейкотриен В4 (сокра О 47410 киолкетана до соответствующего (S)щенно LTB4), LTC4, LTD4 и LTE4 Биосинтез этих гидроксипроизводного, который включает контаклейкотриенов начинается с воздействия ферментирование упомянутого фенилалкилкетона с та 5-липоксегиназы на арахидоновую кислоту с Microbactenum MB5614, депонированного как продуцированием эпоксида, известного как лейАТСС 55557 или с его мутантом или его варианкотриен А4 (LTA4), который последующими фертом Настоящее изобретение также относится к ментативными стадиями превращается в другие биологически чистой культуре Microbactenum MB лейкотриены Детали биосинтеза, так же, как и 5614 (АТСС 55557), или его мутанта или его вариметаболизм лейкотриенов, излагаются в книге анта Leukotnenes and Lipoxygenases, ed J Rokach, Elsevier, Amsterdam (1989) Действие лейкотриеС одной стороны, настоящее изобретение отнов в живых системах и их участие в различных носится к стереоселективному способу восстановболезненных состояниях также обсуждаются в ления фенилалкилкетона до соответствующего книге под ред J Rokach (5)-гидроксипроизводного, который включает приведение в контакт упомянутого фенилалкилкетона В патенте США 5270324 сообщается о классе с Microbactenum MB 5614, депонированного как антагонистов лейкотриенов хинолинового типа, АТСС 55557, или с его мутантом или его варианподгруппой являются соединения, имеющие обтом щую формулу (I) Конкретнее, настоящее изобретение относится к способу R1 R3 в которой R , R , в частности, представляют собой водород или галоген, и Rc может представлять собой CO2Rd, CORd или C(Re)2-OH Rd может представлять собой водород или низший алкил, и Re может представлять собой низший алкил, и ALK представляет собой, например, циклопропил-1,1-(бис)-метилен, изопропил и т п В опубликованной заявке на европейский патент 604114 также описываются антагонисты лейкотриенов, к которым относятся соединения, имеющие общую формулу (II) со,н в которой R , R , R и ALK имеют вышеупомянутые значения, (З)-Гидроксисоединения формулы (III) (см ниже) являются промежуточными соединениями при синтезе соединений формулы (I) и формулы (II) Соединения формулы (III) могут быть получены из соответствующих кетонов формулы (IV) (см, ниже) при использовании хирального восстановителя, такого как диизопинокамфенилхлорборан Химическое хиральное восстановление, как правило, требует применения дорогостоящих хиральных восстановителей, следовательно, существует необходимость в альтернативном способе получения хиральных соединений формулы (III), который может быть более экономичным и/или более удобным, чем химический способ Настоящее изобретение относится к стереоселективному способу восстановления - фенилал который включает реакцию соединения формулы (IV) R3 с Microbactenum MB 5614, имеющего определяющие признаки АТСС 55557, или с его мутантом или его вариантом, где А представляет собой -CH=CH-S- или СН=СН-СН=СН, R1 и R2, независимо, представляют собой водород или галоген, R представляет собой CO2R6, COR6 или 7 C(R)2-O-R8, R6 представляет собой водород или низший алкил R представляет собой низший алкил, и R8 представляет собой водород или группу, защищающую гидроксильную группу В предпочтительном варианте осуществления изобретения А представляет собой -СН=СНСН=СН-, один из R1 и R2 представляет собой водород, а другой представляет собой галоген, и R3 представляет собой CO2R6 В более предпочтительном варианте осуществления изобретения А представляет собой СН=СН-СН=СН-, один из R1 и R2 представляет собой СО2ОН3 С другой стороны, настоящее изобретение относится к биологический чистой культуре микроорганизма Microbactenum MB 5614, имеющего определяющие признаки АТСС 55557, или его мутанта или его варианта Аббревиатуры и определения В настоящей заявке если нет иных указаний, 47410 Санта-Роза, пров Гуанакасте, Коста-Рика Поле подвергалось огневой очистке за 48 часов до отбора образцов Образец культуры депонирован, по Будапештскому соглашению, в Американской коллекции типовых культур, Роквилл, Мэриленд, как АТСС 55557, и в коллекции культур ресурсов микроорганизмов Мерк (Merk Microbiai Resources Culture Collection), Rahway, Нью-Джерси, как MB 5614 В следующем далее описании наблюдения за ростом и основными признаками культур осуществлялись так, как описано в Сиге и Keddie, 1969, Methods For Morphological Examination of Aerobic Coryneform Bacteria, в Board and Lovelock (editors), Samplmd-Microbiological Monitoring of Environments, Academic Press, London, pp 123-135 Утилизацию источников углерода проводят в соответствии с описанием Kamagata и Suzuki, 1986, в Sneath, Р Н , М S Mam, М Е Sharpe, and J G Holt (editors), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, V II, pp 1314 Другие физиологические испытания проводят так, как описано в Jones, 1375, A Numerical Taxonomic Study of Coryneform and Related Bacteria, J Gen Microbiol 87 52 - 96 Анализ клеточных стенок осуществляют, используя методы Lechevaher и Lechevaher, 1980, The Chemotaxonomy of Actmomicetes, в Dietz, A , and D W Thayer (editors), Actmomyces Taxonomy, Society for Inductnal Microbiology, Arlington, VA pp 225 - 291, и Uchida и Aida, 1984, An Improved Method For The Glycolate Test For Simple Identification of Acyl Type of Bacterial Cell Walls, J Gen, Appl Microbiol 30 131 - 134 Анализ менахинонов проводят по методу Hiraishi et al, 1992, Rapid Profiling of Bacterial Qumones By TwoDimtnsional Thin-Layer Chromatography, Letter in Appl Microbiol 14 1 7 0 - 1 7 3 Анализ жирных кислот осуществляют по методу Miller и Berger, Полезность 1985, Hewlett-Packard Application Note, pp 228 Соединения формулы (III) являются промежу241, Hewlett-Packard Co , Palo Alto, CA точными соединениями при получении антагонистов лейкотриенов формул (I) и (II), получение Морфология клетки Неподвижная, грамполотаких антагонистов лейкотриенов с использованижительная, плеоморфная "палочка" (1,14 х ем таких промежуточных соединений описывается 0,38мкм) с булавовидной морфологией Первичв патенте США 5270324 и в опубликованной заявное ветвление происходит во время цикла роста, ке на европейский патент 604114, а также в нахоно без продуцирования мицелиев Не происходит дящейся в процессе одновременного рассмотречеткого цикла развития палочка-кокк Эндоспоры ния заявке в США с регистрационным номером не продуцируются 08/17493L Соединения формул (I) и (II) пригодны в Культуральные и физиологические признаки качестве противоастматических, противоаллергиМезофильный, причем рост происходит при 28°С ческих, противовоспалительных и защитных для и 37°С Термоустойчивый, выживающий после клеток лечебных средств нагревания в течение 30 минут при 60°С Строгий аэроб, каталазоположительный, оксидазоотрицаПолучение субстрата тельный Метаболизм, главным образом, газовый, В способе настоящего изобретения для микхотя он может быть также ферментативным Киробного хирального восстановления кетонов субслота продуцируется на целлобиозы, фруктозы, страты для Microbacterium - соединения формулы галактозы, D-глюкозы, глицерина, маннозы, маль(IV) - могут быть получены в соответствии со спотозы, D-рибозы, сахарозы, трегалозы и D-ксилозы, собами, известными в технике Так, получение но не из D-арабинозы, инозита, лактозы, мелибиосоединений формулы (IV), в которых А представзы, D-рафинозы, рамнозы, растворимого крахмаляет собой -СН=СН-СН=СН- описывается в пала, D-сорбита, L-сорбозы или L-ксилозы Желатин тенте США 5270324, а получение соединений гидролизуется в малой степени, но хитин, крахформулы (IV), в которых А представляет собой -Sмал, казеин, мочевина или целлюлоза не гидролиСН=СН-, описывается в опубликованной заявке на зуются Питание комплексное, причем рост происевропейский патент 604114 ходит на средах на основе пептона На средах на Описание микроорганизма основе пептона колонии составляют 1 - Змм в Microbacterium MB 5614 выделяли из образцов диаметре, желтые по цвету, прозрачные, растут и почвы, собранных на поле в мемориальном парке употребляются аббревиатуры и определения, перечисленные ниже FAB-MS - масс-спеісгрометрия при бомбардировке быстрыми атомами, ВЭЖХ (HPLC) - высокоэффективная (высокого давления) жидкостная хроматография, MES - N-морфолиноэтансульфоновая кислота, MSG - мононатрийглутамат, ЯМР - ядерный магнитный резонанс, ТХС - тонкослойная хроматография, УФ - ультрафиолет "Алкил" обозначает линейные, разветвленные и циклические структуры и их сочетания "Низший алкил" означает алкильные группы, содержащие 1-7 атомов углерода Примерами низших алкильных групп являются метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор- и трет-бутил, пентил, гексил, гептил, циклопропил, циклобутил, циклопентилметил, циклогексил и подобные группы "Галоген" включает фтор, хлор, бром и иод "Группа, защищающая гидроксильную группу" может представлять собой, например, простую эфирную группу, такую как метоксиметил, тетрагидропиранил, этоксиэтил, трихлорэтил, третбутил, аллил, бензил, триметилсилилэтил, дифенилметил и трифенилметил, простую силильную эфирную группу, такую как триметилсилил, диметилизопропилсилил, трет-бутилдиметилсилил и трет-бутилдифенилсилил, сложную эфирную группу, такую как формил, трихлорацетил, бензоил и трифторацетил, карбонатную группу, такую как трихлорэтил, бензил и аллил Другие группы, подходящие для защиты гидроксильной группы, можно найти в известной литературе, например, в Protective Groups in Organic Synthesis, Green and Wuts, Eds , 1991, John Wiley & Sons, Inc, NY, имеют неповрежденный край Поверхность блестит, а текстура мукоидная Пигменты, способные диффундировать, не продуцируются Химия клеточных стенок Диаминокислотой в клеточной стенке является лизин Также присутствуют глицин, аланин и глутаминовая кислота Тип клеточных стенок более всего подобен В1а Основным сахаром клеточных стенок является рамноза, наряду с маннозой, рибозой и не идентифицированным сахаром (Галактоза = 0,75), которые все присутствуют в более низких концентрациях 47410 8 Основными менахинонами являются МК10 и МК11 Основными жирными кислотами являются 15 Оантеизо, 17 Оантеизо и 16 Оизо, Хемотаксономические исследования показывают, что MB 5614 принадлежит к роду Microbacterium, однако, сравнение признаков роста и типов углеводного брожения не дает совпадения с шестью признанными на сегодняшний день видами этого рода (табл 1) На основании этого предполагается этот штамм расположить как новый вид Microbacterium campoguemadoensis Таблица 1 Признаки Цвет Продуцирование кислоты из целлобиозы D-арабинозы D-рафинозы D-рибозы D-сорбита D-ксилозы фруктозы галактозы глюкозы глицерина инозита L-сорбозы L-ксилозы лактозы мальтозы маннозы мелибиозы рамнозы раств крахмала сахарозы тре гал оз ы Гидролиз казеина целлюлозы хитина желатина крахмала мочевины Рост при 37°С MB 5614 желтый М lacticumi желто-белый М laevamformans желтый М impenalsi красно-оранжевый + + + + + + + + + + + + не опр не опр + + + не опр не опр + + + не опр не опр + + + + + + + + + + + + + не опр не опр + + + + не опр не опр + + + не опр не опр + + + + не опр не опр изм + не опр + + не опр + не опр не опр изм изм не опр + 47410 10 Таблица 1 (продолжение) Признаки Цвет Продуцирование кислоты из целлобиозы D-арабинозы D-рафинозы D-рибозы D-сорбита D-ксилозы фруктозы галактозы глюкозы глицерина инозита L-сорбозы L-ксилозы лактозы мальтозы маннозы мелибиозы рамнозы раств, крахмала сахарозы тре гал оз ы Гидролиз казеина целлюлозы хитина желатина крахмала мочевины Рост при 37°С М dextranolyticum2 желтый М arborescens2 оранжевый М aurum2 желтый + + не опр + + + + не опр + + + + + + не опр + не опр не опр + не опр не опр не опр не опр не опр не опр не опр не опр не опр не опр не опр не опр не опр + ± + не опр + + + не опр не опр + + + + + + не опр не опр не опр не опр не опр не опр + не опр не опр не опр не опр + + + 1 Данные взяты из Yokota et al 1993, Proposal of two new species of the genus Microbactenum Microbactenum dextranolyticum sp nov and Microbactenum aurum sp nov Int J Syst Bactenol 43(3) 549 - 554, и из Collins and Keddie 1986, в Sheath, P H , N S Hair, M E Sharpe and J G Holt (editors), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, V II, pp 1320 -1322 2 Данные взяты из Yokota et al 3 Положительные данные у Collins and Keddie He опр - не определялось Изм - изменчивые результаты Описание способа Штамм Microbactenum может быть выращен в обычной среде, содержащей известные источники питания для роста бактерий, т е , усвояемые источники углерода и азота, с добавлением необязательных неорганических солей и других известных факторов роста Культуру выращивают, предпочтительно, в аэробных условиях при погружении, однако, для культивирования в небольших масштабах можно также использовать поверхностные культуры и микробиологические матрасы Обычные процедуры, применяемые для выращивания других бактерий, применимы в настоящем изобретении Питательная среда, используемая для куль тивирования Microbactenum, должна содержать соответствующий усвояемый источник углерода, такой как глюкоза, фруктоза, сахароза и целлюлоза В качестве источника азота могут использоваться хлорид аммония, сульфат аммония, мочевина, нитрат аммония, нитрат натрия, глутамат натрия и т п , либо по отдельности, либо в сочетании с органическими источниками азота, такими как пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, соевая мука, хлопковое масло и т п При необходимости также могут добавляться питательные неорганические соли, чтобы обеспечить источники натрия, калия, кальция, аммония, фосфата, сульфата, хлорида, бромида, карбоната, цинка, магния, марганца, кобальта, железа и подобных составляющих Microbactenum можно выращивать при любой температуре, подходящей для удовлетворительного роста, например, при 25 - 40°С, и наиболее удобно осуществлять процесс при температуре 27 - 32°С Если ферментация должна осуществляться в бродильных чанах, желательно использовать растительный инокулят в питательном бульоне из культуры на косячке агара или лиофилизованной культуры После получения активного инокулята таким способом, его стерильно переносят в сбраживаемую среду в бродильный чан Возбуждение 12 11 47410 в бродильном чане обеспечивается перемешиваего вариантов и мутантов, которые сохраняют нием, а аэрация может быть осуществлена путем способность восстанавливать кетоны Такие вариподачи воздуха или кислорода в перемешиваемую анты и мутанты могут быть продуцированы из росмесь дительского штамма с помощью различных В одном из вариантов осуществления насредств, таких как рентгеновское излучение, УФстоящего способа кетонный субстрат (IV) привооблучение, и химические мутанты, такие как Nдят в контакт с Microbactenum выращиваемым в метил-г\Г-нитро-г\І-нитрозогуанидин водной питательной среде Кетон может быть доПриведенные ниже примеры даются, для бобавлен к культуре Microbactenum в любое время, лее полной иллюстрации настоящего изобретено, предпочтительно, субстрат добавляют, когда ния, и не должны рассматриваться как ограничиобразуется достаточная биомасса микроорганизвающие каким-либо образом обьем настоящего ма Концентрацию биомассы можно легко контроизобретения лировать, например, путем измерения поглощеПример 1 ния света образцом культуры, при 660нм с Посевная культура Microbactenum MB 5614 использованием спектрофотометра Как правило, Дают возможность 1,5-мл ампуле с заморомаксимум биомассы достигается через 3 5 суток женным Microbactenum MB 5614 в среде SG (сопосле инокуляции Процесс биоконверсии можно став приводится ниже в примере 4) оттаивать при проконтролировать обычными способами, такими комнатной температуре, и затем переносят в колкак ВЭЖХ, с последующим контролем спектров бу Эрленмейера емкостью 250мл, содержащую50 Уровень стереоселективного восстановления промл среды КЕ, содержащей (на литр среды) дукта достигает максимального значения через 3 Юг декстрина, 4 суток после добавления субстрата Биоконвер5г ардамина рН, сия кетонного субстрата до соответствующего (S)5г амина NZTHna E, гидроксисоединения может быть осуществлена Зг дрожжевого экстракта, непрерывно, например, в течение периода до 500 1г декстрозы, часов, при периодическом добавлении кетона 0,37г К2НРО4, Полученное таким образом нужное (S)0,05г MgSO4, 7H2O, гидроксисоединение может быть извлечено из деионизованную воду, q v , до 1л, ферментативного бульона любым способом, подNaOH до рН 7,1, ходящим для такого извлечения и отделения, 0,5г СаСОз, примерами такого способа являются экстракция, Колбу инкубируют при 28°С в течение 24 час преципитания, хроматография и другие известные на круговой качалке при 220об/мин Аликвоту в технике традиционные методы культуры из колбы в 1,0мл затем используют для инокулирования 2-л колбы Эрленмейера, содерВ другом варианте осуществления настоящего жащей 500мл среды КЕ Колбу емкостью 2л инкуспособа кетонный субстрат приводят в контакт с бируют в течение 24 час при 28°С на круговой каMicrobactenum на стадии покоя Стадия покоя чалке при 220об/мин здесь означает, что микроорганизм не растет активно, но способен к нужному функционированию Пример 2 в буферном растворе в отсутствии факторов, подБиоконверсия метил-2-(3-(3-(2-(7-хлор-2держивающих рост Покоящиеся клетки хинолинил)этенил)фенил)-3-оксопропил)бензоата Microbactenum получают, собирая растущие клет(далее называемого кетоэфиром) до метил-2-(3ки Microbactenum, например, путем центрифуги(3-(2-(7-хлор-2-хинолинил)этенил)фенил)-3(3)рования, собранные клетки также могут быть гидроксипропил)бензоата (далее называемого лиофилизованы и затем сохранены при -80°С для гидроксиэфиром) (способ А) будущего применения Покоящиеся клетки исАликвоту в 2мл посевной культуры примера 1 пользуют в виде клеточной суспензии в соответпереносят в колбу с перегородками емкостью ствующем буферном растворе, таком как фос250мл, содержащую 50мл биоконверсионной срефатный буферный раствор или трис-буфер (рН 6 ды, в состав которой входят (на литр среды) 8) Кетон добавляют к клеточной суспензии, и 20г глюкозы, смесь инкубируют при температуре от 20° до 5г соевой муки, 40°С, чтобы осуществить восстановление К кле5г дрожжевого экстракта, точной суспензии, необязательно, можно добав5г NaCI, лять глюкозу, чтобы улучшить эффективность 9,8г N-морфолиноэтансульфоновой кислоты биоконверсии Клетки, иммобилизованные на (MES), подложке физической адсорбцией или захватом, деионизованная вода, q v , до 1л, также могут использоваться для способа хиральрН доводят до 7,0 ного восстановления Иммобилизации клеток Добавляют к среде раствор кетоэфира (5мг) в можно достичь, используя обычные способы, наацетоне (0,5мл), и колбу инкубируют при 27°С на пример, способ, описанный в Karsten, G , and качалке при 220об/мин, в темноте Биоконверсию Simon, H , Appl Microb Biotechnol , 1993, 38 441 контролируют следующим образом Отбирают из 446, и способы, описанные в цитированных здесь колбы в различное время образцы по 1мл и смессылках шивают с 1мл изопропанола Получающуюся в результате смесь после интенсивного перемешиСледует иметь в виду, что для осуществления вания центрифугируют, и аликвоту супернатанта биотрансформации настоящее изобретение не проверяют ВЭЖХ (аналитическая колонка ODS-3, ограничивается конкретным микроорганизмом, Whatman Partisil 10 элюент - линейный градиент упомянутым выше, но включает использование 14 13 47410 ацетонитрила в воде (55% - 95% за 30 минут), ры примера 1 для инокуляции колбы Эрленмейескорость потока 1 мл/мин, температура колонки ра емкостью 2,0л, содержащей 500мл производст45°С), венной питательной среды (среда SG), в состав которой входят (на литр среды) Пример 3 Выделение и исследование гидроксиэфира 0,5rFeCI3, 6H2O, После инкубации в течение 48 часов соедиЗОг декстрозы, няют бульон от биотрансформации из 4 колб (все20г мононатрий глутамата (MSG), го 200мл), и доводят рН до 6,0 Бульон центрифу9,8rMES, гируют (20мин при 3700об/мин), и извлекают 5г дрожжевого экстракта, супернатант Осадок затем суспендируют в 150мл 5г NaCI, метанола, и перемешивают в течение 30 мин в деионизованная вода, q v, до 1л (рН 7,0, темноте Полученную таким образом суспензию NaOH) центрифугируют, как упоминалось выше, и снова Колбу инкубируют при 28°С на круговой каизвлекают супернатант Осадок экстрагируют еще чалке при 200об/мин раз, и супернатант присоединяют к супернатанПосле инкубации производственной культуры там, извлеченным ранее в течение 5 суток добавляют кетоэфир (250г, в виде раствора 25мг/мл в диметилсульфоксиде) Объединенный экстракт смешивают с равным На 8 и 9 сутки после инокуляции добавляют дообъемом метиленхлорида, и, после энергичного полнительные порции кетоэфира (каждая по встряхивания, извлекают метиленхлоридную фазу 250мг) Биоконверсия до гидроксиэфира контрои сушат при пониженном давлении Высушенный лируют, проверяя концентрации кетоэфира и гидостаток наносят на полупрепаративную силикагероксиэфира в культуре Коротко, аликвоту культулевую пластину, и пластину проявляют в системе рального бульона экстрагируют двумя объемами растворителя - метиленхлориде Проявленную этилацетата Затем экстракт сушат в атмосфере ТХС-пластину проверяют под УФ-светом, и сосреазота и ресуспендируют в ацетонитриле, и расдотачиваются на основной полосе УФ-поглощения твора хроматографируют на ВЭЖХ-колонке с величиной Rf ниже, чем у субстрата Соскребают Zorbax RX-C8 (подвижная фаза - ацетонитрил в силикагель с этой площади, и тщательно экстраводе 10 - 90%, обе подкислены 0,12 Н3РО4, скогируют метиленхлоридом Экстракт концентрирурость потока 1,5мл/мин) Время удержания (кетоют при пониженном давлении и фильтруют эфир) = 5мин, время удержания (гидроксиэфир) = Фильтрованный экстракт затем очищают не12мин Биоконверсия при этих условиях продуцисколькими впрыскиваниями в полупрепаративную рует приблизительно 500мг/л гидроксиэфира на колонку ODS-3 (9,4мм х 25см), Whatman Partisil 10 10 сутки после инокуляции, при скорости во время Эту колонку проявляют, используя обычные услореакции приблизительно 100мг/(1 сутки) вия для аналитической колонки, за исключением того, что скорость потока составляет Змл/мин (см пример 2), Объединяют очищенные ВЭЖХ фракции, и тщательно экстрагируют их метиленхлоридом Метиленхлорид ный экстракт сушат над Na2SO4 и концентрируют досуха в атмосфере азота, получают 3,5мг сухого конечного продукта (прямое количественное определение ВЭЖХ субстрата и продукта показывает конверсию в 30-40% по отношению ко времени сбора культуры) ЯМР и спектральный анализ FAB-MS показывают, что продукт представляет собой метил-2-(3(5)-(2-(7хлор-2-хинолинил)этенил)фенил)-3гидрокси)пропил)-бензоат, и хиральная хроматография фракции, очищенной ВЭЖХ, на колонке Chiralcel OD (элюент 90% гексана/изопропанол, скорость потока 2мл/мин, время удержания 17,9мин для (З)-гидроксиэфира, 19,8мин для Rгидроксиэфира) показывает избыток энантиомера в 95% Пример 4 Биоконверсия кетоэфира в гидроксиэфир (способ Б) Используют 10-мл аликвоту посевной культу Пример 5 Биоконверсия кетоэфира до гидроксиэфира с помощью покоящихся клеток Microbactenum MB 5614 Культуру Microbactenum MB 5614 выращивают по методике, описанной в примерах 1 и 2 Культуру в среде для биоконверсии инкубируют в течение 44 час при 28°С на круговой качалке при 220об/мин, клетки собирают центрифугированием при 15000об/мин в течение 120мин Получающийся в результате осадок промывают три раза 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,2, лиофилизуют и хранят при -80°С Клетки оттаивают, суспендируют в буфере, 4 5, г/объем, и к клеточной суспензии добавляют кетоэфир (5мг/0,5мл ДМСО) Смесь инкубируют при 11 °С Биоконверсию проверяют так, как описано выше После инкубации в течение 40 часов наблюдают конверсию более 50% (при определении ВЭЖХ) Добавление глюкозы (0,1 М) к клеточной суспензии дает в результате конверсию приблизительно 60% после 40-часовой инкубации 15 47410 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 16