Спосіб активізації тканевого активатора плазміногена /його варіанти/

СОЮЗ СОВЕТСНИХ СОЦИАЛИСТЖЄСНИХ РЕСПУБЛИН (191* (51)5 51Jim 16 и 7(И 1 с " . V - --.г. • " A3 і 12 N 15/1 2, С 12 Р 21 /00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ ПРИ ГННТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ г /(21) . ... " ' " 4202987/30-13. X ' • ~ (86) РСТ/ЕР 86/Ш610 (23.10,86) (22) 22 в 06 в 87 • • * -; . (31) Р 3537708о9 ' : и ь • • (32) 2 3 . 1 0 . 8 5 • •?, • • : " (33) DE v " • (46) 15. П.90. Бюл. № 42 (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DE) ' (72) Райнер Рудольф, Штефан Фишер : и Ральф Маттес (DE) (53) 575О22Д.2(088.8) (56) ЕР № бІІА506 ( ісл. С 12 N 15/00, 1984. (54) СПОСОБ АКТИВАЦИИ ТКАНЕВОГО. АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА '(ЕГО ВАРИАНТЫ) (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения активного плазминогена. Целью изобретения я в л я е т с я улучшение к а ч е с т в а конечного продукта з а с ч е т более полного восстановления е г о н а тивных с в о й с т в . Способ активации т к а невого активатора плазминогена - tPA, полученного в результате экспрессии гена tPA в клетках Escherichia c o l i и Pseudomonas p u t i d a , предусматривает проведение реакции реактивации при рН 9-11» концентрации gSSg 0,053 ммоль/л и концентрации gSH 0 , 1 20 ммоль/л0 Б качестве слабого денатурирующего раствора используют раствор L-аргинина в концентрации 0,051 моль/л или мочевины в концентрации 1-4 моль/л, или метилмочевины в концентрации 0,5-3 моль/л, или диметилмочевины в концентрации 0,5J моль/л, или этнлмочевины в концентрации 0,25-0,75 моль/л, или формамида в концентрации 0,5-5 моль/л, или этилформамида в концентрации 0,55 моль/л, или ацетамида в концентрации 0,5-4 моль/л или бутирамида в концентрации 0,5-1 моль/л. 2 с.и 5 з . п . ф-лы, 3 0 табл., а (Л С Э за 30 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения активного плазминогена. Целью изобретения я в л я е т с я улучшение к а ч е с т в а конечного продукта за счет более полного восстановления его нативных свойств» П р и м е р 1о -..,-., а) Приготовление " r e f r a c t i l e bodies". 100 г влажной клеточной массы Е. c o l i в 1,5 л 0,1 моль/л трис/НСІ і и 20 ммоль/л Е Т гомогенизируют ДА (Ultra-Turrax 10 с) и добавляют" 0,25 мг/мл лиозима. После 30 мин инкубации при комнатной температуре вновь гомогенизируют и охлаждают до 3°С„ Разложение клеток осуществляют путем дисперсии при высоком давлении (550 кг/см ) . Затем проводят промывку 300 мг/л 0,1 моль/л трис/ /НС1 (рН 6,5) и 20 ммоль/л ЕДТА, После центрифугирования (2 ч для 27000 g, 4 С) гранулы вводят в 607689" і,3 л 0,1 моль/л трис/HCl (рН 6,6), 20 ммоль/л ЕДТА и 2,5%.тритон-Х-100 и гомогенизируют. После повторного центрифугирования (30 мин для 27000 g» 4°Cj гранулы вводят в 1,3 л 0,1 моль/л 'т.рис НС1 (рН 6,5) , 20 ммоль/л ЕДТА и 0,5% тритон-Х-100 и гомогенизируют» Чередование центрифугирования (30 мин для 2700Og, 10 4 °С) и гомогенизации гранул в 1 л 0,1 моль/л трис/HCl (рН 6,5) и 20 ммоль/л ЕДТА проводят еще трижды» Содержание tPA " r e t r a c t i l e bodies" определяют по SDS-PAGE, идентификацию 1 5 tPA-полос по Westirn-blotting" денситометрическим анализом "Refractile bodies" no SDS-PAGE HUWestirnblotting". Анализ показывает плотную tPA20 полосу с мол0 весом около 60 кДто Доля tPA в общем содержании протеина " r e f r a c t i l e bodies" составляет около 21%, б) Растворение/восстановление "refractile bodies".. Белок инкубируют при концентра- * ции" 1-5 мг/мл в 0,1 моль/л трис/НСІ (рН 8,6), 6 моль/л гуанидингидрохлорида 0,15-0,4 моль/л ДТЕ и 1 ммоль/л ЕДТА в течение 2-3 ч при комнатной температуре,, Затем нерастворенный материал (фрагменты стенок клеток и т.п.) отделяют центрифугированием (30 мин для 35000-50000 g., 40°С). Величину рН надосадочной жидкости устанавливают концентрированной соляной кислотой до рН З е Денатурирующее средство и восстановитель отделяют { диализом против 0,01 моль/л НС1 при 4°СО в) Повторное окисление/активация. Повторное окисление/активацию проводят 1:50 - 1 :2004 разбавлением буфером 0,1 моль/л трис/НСІ (рН10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл BSA, 0,5 моль/л L-аргинина, 2 ммоль/л GSH, 0,2 ммоль/л GSSG. После 17-24 ч активации при 20 С ' определяют активность в сравнении с активностью естественного гликилизированного tPA из эвкарионтов. . Выход готового продукта в пересчете на общее содержание протеина 2,5£О,5%, стимулируемость ± 5. . Выход готового продукта в пересче* те на количество tPA примерно 12%. 25 30 35 л г) Повторное окисление/активация без отделения денатурирующее средство/восстановитель 0 Белок инкубируют при концентрации 1,25 мг/мл в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 8,6), 6 ммоль/л гуанидингидрохлорида, 0,2 моль/л ДТЕ и 1 моль/л ЕДТА в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем сразу же проводят повторное окисление 1:100 разбавлением в 0,1 моль/л трис/HCl (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, I мг/мл BSA, 0,3 моль/л L-аргинина и в указанных в табл. 1 ^ количествах GSSG, Дополнительно в активирующей добавке находится остаточная концентрация 0,06 моль/л гуанидингидрохлорида и 2 ммоль/л ДТЕ', Зависимость выхода активаций от GSSG-концентрации при активации без отделения денатурирующее средство/ восстановитель показана в табл 0 1. Пример 2. Около 5 мг белка инкубируют в 1 мл 0,1 моль/л трис/НСІ (рН 8,6), 6 моль/л гуанидингидрохлорида и 0,15-0,2 моль/л ДТЕ в течение 2-3 ч при комнатной температуре, Нерастворенный материал (фрагменты стенок клеток и т о д.) отделяют центрифугированием (20 мин при 17000 g ) . • Денатурирующее средство и восстановитель удаляют гелевой фильтрацией через Sepliadex G, 25 в 0,01 моль/л НС10 При этом проба разбавляется на коэффициент 5—100 Восстановленный материал растворяют в 0,01 моль/л НС1 при -20" С Т а б л и ц а 40 GSSG, ммоль/л 1 Выход*, % Стимулируемое ть (коэффициент) 45 50 0,2 1 5 6 7 9 10 15 0 0,13 1,49 1,28 1.04 0,98 1,77 0 4.0 • 7,4 5,4 5,8 . 6,2 10,0 — 55 *Выход активного tPA в пересчете на общее содержание-протеина "refractile bodies". 1607689 5 П р и м е р 3, В табл, 2-15 пока' Зависимость активации от добавки зано влияние различных параметров мочевины следующая: на активацию и стимулируемость tPA. Активность, Мочевина Для эксперимента повторного окислемоль/л % ния восстановленный протеин, раство59 I ренный по примеру 2, больше не очи126 1,5 щают. 2 162 Восстановленный протеин (в 141 2.5 0,01 моль/л НС1) активируют раство10 72 3 рением 1:10 - 1:500 в буфере повтор12 4 ного окисления. Активацию определяЗависимость активации от добавют после 22-48 ч инкубации при комки метилмочевины: натной температуре,, Активация окисМетилмочевина Активность, ленного повторно протеина по отноше15 моль/л . % нию к стандартному повторному окислению (=100%) в 0,1 моль/л трис/НС1 22 0,5 (рН 10,5) + 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5моль/л 174 1 L-аргинина, 1 мг/мл BSA, 0,5 моль/л 313 1,5 GSH (восстановленный глютатион), 20 375 2 0,5 ммоль/л GSSG (дисульфид глютати332 2,5 она). 215 3 1. Зависимость выхода активации от Зависимость активации от д о добавки L-аргинина или гуанидингидбавки этилмочевины: рохлорида. 25 Этилмочевина Активность, % Повторное окисление в 0,1 моль/л л моль/л трис/НСІ (рН 1 0 , 5 ) , Ї ммоль/л ЕДТА, 46 0,5 1 мг/мл L-аргинина, 0,5 ммоль/л BSA, 212 J 0,5 ммоль/л GSSG, 323 1.5 Зависимость выхода активации от 30 концентрации L-аргинина представле300 2 на в табл д 2. 2.5 107 Т а б л и ц а 2 Зависимость активации от добавки диметилмочевины представлена в 35 табл. 3« L-аргинин, Активность СтимулируеТ а б л и ц а 3 моль/л мость (коэффициент) СтимулируеДиметилмомость (коэфчевина, 40 фициент) 98 7,5 0,25 мопь/л 0,5 100 21,9 0,75 16,3 27 0,5 8,8 167 1,0 3,5 23 256 8.9 1 9.4 283 1,5 45 Зависимость выхода активации от 7,7 177 2 концентрации гуанидинхлорида следую78 8,9 2,5 щая: 9,9 23 3 Гуанидинхлорид, Актив нос т ь , 8,6 4 4 моль/л (%) 22 0,25 53 0,5 58 0,75 2. Зависимость активации от добавки мочевины и производных мочевины. Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НСІ (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл BSA, 5 ммоль/л GSH, 0,2 ммоль/л GSSG. 50 З о Зависимость активности от добавки амидов жирных кислот. Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НСІ (рН 10,5) 1 ммоль/л ЕДТА, 55 1 мг/мл BSA, 5 ммоль/л GSH, 0,2 ммоль/л GSSG. Зависимость активации от добавок формамида: 1607689 Форм а м и д , моль/л L-аргинина, І мгТмл В А, 0,5 ммоль/л GSH, 0,5 ммоль/л GSSG. Зависимость активности от величины рН представлена в табл.4, Активность, % 0,5 59 175 1,5 245 2 325 2,5 423 3 444 416 4 5 341 Зависимость активации от добавок метилформамида: Метилформамид, Ак тив нос ть, моль/л % . 1 0,5 100 1 135 1,5 304 2 389 2,5 466 452 3 425 4 121 5 Зависимость активации от добавок ацетамида: Ацетамид, Актив нос ть, моль/л % 0,5 1 1,5 2 2,5 3 72 134 207 261 204 237 198 141 Зависимость активации от добавок пропионамида: Пропионамид, Ак тив ность, моль/л % 0,5 95 1 99 1,5 197 150 2 10! 2,5 39 3 2 •4 Зависимость активации от добавок бутирамида: Бутирамнд, Активность, моль/л Х4 5 0,5 55 1 52 4. Зависимость выхода активности от величины рН.• Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НС1# 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5моль/л 8 Т а б л и ц а рН 10 15 Стимулируемоеть (коэффициент) Активность, % 9 10 11 4 105 89 13,6 20,3 95 21,3 5. Зависимость выхода активности "от GSH/GSSG концентрациио Повторное окисление в 0,1 ммоль/л 20 трис/HCl (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 ммоль/л L-аргинина, 1 мг/мл BSA0 а) 1 ммоль/л GSH, Зависимость активности от концент25 рации GSH представлена в табл„ 5. Т а б л и ц а GSH, Активность, 30 ммоль/л г 0,1 0,2 0,5 35 1 5 10 20 239 273 193 198 17 0 0 40 5 Стимулируемость (коэффициент) 14,9 15,3 13,3 12,5 б) 0,2 ммоль/л GSSG, зависимость активности от концентрации GSSG представлена в* табл 0 6„ Т а б л и ц а 45 5С . 2,1 — GSSG, ммоль/л 0,05 0,1 0,2 0,5 1 55 5 10 20 6 Активность, Стимулируе% мое ть (коэффициент) _ 2,2 3,8 55 - . 7,9 15 40 112 142 273 260 143 • 6,8 7,4 6,8 • 6,3 5,1 1607689П р и м е р *„ Активация tPA смешанными дисульфидами tPA и глютатиона. Использование " r e f r a c t i l e b o d i e s " , полученных по одному из предыдущих ' примеров. Восстановление " r e f r a c t i l e b o d i e s " проведено за 2 ч инкубации • при комнатной температуре в 0,1 моль/л , трис/ЧС1 (рН 8 , 6 ) , 1 ммопь/л ЕДТА, 10 6 моль/л Gdn HC1, 0,2 моль/л ДТЕ при концентрации протеина около 1 мг/мл„ Диализированный 0,01 мл/л НС1, восстановленный протеин разбавляют в соотношении 1:1 0,1 моль/л трис/ИС1, 15 рН 9,3, 9 моль/л мочевины и 0, 2 моль/л GSSG и инкубируют 5 ч при комнатной температуре. После подкисления концентрированной соляной кислотой до рН 3 проводят диализ 0,01 моль/л НС1 при 4 р С е После диализа общая концентрация протеина составляет 0,35 мг/мл о Таким образом получают tPASSG. а) рН - оптимум активации tPASSG, 25 Здесь, как и в последующих экспериментах по оптимизации условной реактивации, не применяют GSSG и а к тивацию проводят через 17 ч путем разбавления в 0,1 моль/л трис, 30 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л L-аргинина, 1 мг/мл BSA и I ммоль/л GSH при изменении величины рН (табл, 7 ) , Т а б л и ц а Выход, 1,35 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 5,66 7,32 8,65 8,59 8,32, 6,15 3,07 7 Стимулируемость 31,4 і 7,1 8,2 7,0 8,7 ' 11,7 12,5 11,2 Выход готового продукта определен по проценту активности tPA в пересчете на введенное количество протеина„ б) Воспроизводимость результатов активации tPASSG. Все данные активации суммируют после 1:100 или 1:200 разбавления в 0,1 моль/л трис/НСІ (рН 8 , 5 ) , 10 I ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л L-аргинина, 1 мг/мл BSA и 2 ммоль/л GSH (табл. 17). Воспроизводимость результатов активации tPA SSG представлена в табл. 8. Т а б л и ц а Выход, % Опыт 1 9 » 3 4 5 6 7 8 9 Средняя величина 8,65 4,47 4,49 8,50 -.45 4,32 3,29 3,54 5,07 5,111,9 8 Стимулируе-.мость 7,0 9,3 9,7 6,5 17,2 8,3 14,0 13,4 16,4 11,3+3,8 в) Стабильность активированного протеина 0 Активацию проводят в 1:200 разбавлении в 0,1 моль/л трис/НСІ, 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л L-аргинина, 1 мг/мл BSA и 2 ммоль/л GSH, Данные о стабильности активированного протеина приведены в 35 табл„ 9„ Т а б л и ц а 9 Время 40 1 6 23 47 45 71 215 239 I Выход, % і Стимулируемоеть 0 0,89 2,43 2,83 2,62 2,21 2,28 15,5 23,1 23,6 21,5 22,6 14,3 П р и м е р 5о Активация полученного генной технологией интерферона-/?. Восстановление/растворение проводят следующим образом: осадок инкубируют 3 ч при 25 С в 10 мл 9,1 моль/л 55 трис/НСІ (рН 8 , 6 ) , 6 моль/л Gdn HC1, I ммоль/л ЕДТА и 0,2 моль/л ДТЕ и после 30 мин центрифугирования при 4°С и 48000 g величину рН надосадоч50 11 1607689 12 ) ной жидкости устанавливают концентри" Элюат разбавляют 1:50 буфером рованной НС1 около 3. Затем проводят 0,1 моль/л 'трис/HCl (рН 8,5), гелевую фильтрацию через Sephadex 1 ммоль/л ЕДТА и 0,25 моль/л L-арG25 в 0,01 моль/л НС1. гинина и пробу исследуют после 17 ч активации при 0°С, Элюат исследуют-на.проводимость, концентрацию протеина и реактивируеЗависимость активации от добавки мое ть. GSH/GSSG представлена в табл. 10. Активацию повторно окисленного Т а б л и ц а 10 протеина определяют по стандартной to активации (= 100%) в 0,1 моль/л трис/HCl (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДГА, GSH/GSSG, Зависимость Активность, 5 ммоль/л GSH, 0,5 ммоль/л GSSG и ммоль/л активации, % 0,25 моль/л L-аргинина, ммоль/л а) Зависимость выхода активации 15 - . от добавки L-аргинина, Элюат разбавлен 0,1 моль/л трис/ 6 0,5 1 НС1 (рН 8,5), 1 ммоль/л ЕДТА, ЇЗ • 5 .0*5 5 ммоль/л GSSG и активирован 20 ч 10 0,5 25 при 0 С, 20 0,5 25 20 Зависимость"активации от L-арги13 5 0.І нина следующая: 0,5 13 5 L-аргинин, Активность, 1,0 13 5 моль/л % 5 5 6 0,25 8 0,5 • 15 0,75 15 б) Зависимость выхода активации от добавки мочевины. Раствор активации соответствовал раствору ло пункту а ) , однако активацию проводят 17 ч при 0°С. Зависимость активации от добавки мочевины: Мочевина, моль/л Активность, % 13 100 200 100 О 0.5 1 1,5 в) Зависимость выхода активации от добавки формамида. Активация как в пункте а ) ; пробы исследуют после 17 ч активации при 0°(\ Зависимость выхода активации от добавки формамида: Формамид,, Активность, моль/л %-0 \Ъ 4 2 3 4 25 д ) З а в и с и м о с т ь выхода а к т и в а ц и и от д о б а в к и BSA, Элюат р а з б а в л я ю т 1:50 буфером 0,1 м о л ь / л трис/HCl (рН 8 , 5 ) , 30 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л GSH, 0 , 5 ммоль/л GSSG и 0 , 2 5 м о л ь / л L - а р гинина и исследуют ч е р е з 17 ч а к т и в а ц и и при 0 ° С . З а в и с и м о с т ь а к т и в а ц и и от д о б а в к и 35 BSA: BSA, мг/мл Активность, 0 1 2 5 40 45 50 13 13 25 13 е ) З а в и с и м о с т ь выхода а к т и в а ц и и от рН. Элюат равняют 1:50 буфером 0,1 м о л ь / л трис/НС1„ 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л L - а р г и н и н а и исследуют ч е р е з 17 ч а к т и в а ц и и при 0 С. Зависимость активации от величины рН: рН Активность, И • 13 0 " 0 г) Зависимость выхода активации от окислительно-восстановительного буфера. 55 6,5 7,5 8.5 9.5 0 6 13 50 10,5 . 100 1607689 14 13 Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я 3. Способ п о п , ! или п. 2 , о т л и ч а ю щ и й с я тем, что перед реак' I . Способ активации тканевого а к тивацией проводят дополнительную с т а тиват'ора плаэминогена, включающий ДНЮ ОЧИСТКИ. экспрессию гена tPA в клетках Esche4, Способ по п. 1 или п. 2, о т л и r i c h i a c o l i или Pseudoraonas p u t i d a , ч а ю щ и й с я тем ? что реактивключающий суспендирование и разрушевацию проводят в присутствии денатуние бактериальных клеток в буферном рирующего средства и восстановитерастворе, отделение нерастворимых 10 л я , при этом реакционную смесь поссоставных частей, салюбилизацию в ле процедуры денатурации - в о с с т а растворе, содержащем 6 моль/л гуаниновителя разбавляют буфером реактидинхлорида в присутствии 0 , 1 5 вации т а к , чтобы при последующей 0,2 моль/л DTE, очистку с отделением реактивации концентрация gSSg преденатурирующего средства и восстано- 15 восходила остаточную концентрацию вителя, реактивацию в слабом денатуДТЕ. рирующем растворе путем обработки 5о Способ активации тканевого акокисленной - gSSg и восстановимой тиватора плазминогена, включающий gSH, о т л и ч а ю щ и й с я тем, экспрессию гена tPA в клетках Escheчто стадию реактивации осуществляют 20 r i c h i a c o l i или Pseudomonas p u t i d a , при рН 9-11, при концентрации gSSg включающий суспендирование и разру0,05-3 ммоль/л и концентрации gSH шение бактериальных клеток в буфер0,1-20,0 ммоль/л, а в качестве сланом растворе, содержащем 6 моль/л бого денатурирующего раствора испольгуанидинхлорида в присутствии 0 , 5 зуют раствор L-аргинина в концентра- 2 5 0 , 2 моль/л ДТЕ, очистку с отделением ции 0,05-1,0 моль/л, или мочевины денатурирующего средства и восстанов концентрации 1-4 моль/л, или метилвителя с последующей реактивацией, мочевины в концентрации 0,5-3,0 моль/л,' о т л и ч а ю щ и й с я тем, что или диметилмочевины в концентрации после отделения гуанидинхлорида белок 0,5-1,0 моль/л, или этилмочевины в переносят на смешанный дисульфид инконцентрации 0.25-0,75 моль/л, или кубацией с gSSg при концентрации формамида в 'концентрации 0 , 5 0,1 моль/л в присутствии 4,5 моль/л 5,0 моль/л, или этилформамида в конмочевины, а реактивацию проводят центрации 0,5-5,0 моль/л, иди ацетпри рН 7-10,5 путем обработки gSH амида в концентрации 0,5-4,0 моль/л, 35 в концентрации 1-3 ммоль/л в присутили бутирамида в концентрации 0 , 5 ствии 0,5 моль/л L-аргинина, 1,0 моль/л, 6 о Способ по п . *), о т л и ч а ю щ и й с я тем, что стадию реак2 0 Способ п о п , ^ о т л и ч а тивации проводят в сывороточном а л ь ю щ и й с я тем, что стадия реакти- 40 бумине BSA. вации концентрации - gSH составляет 7. Способ по п . 1 или п. 6, 0,2-10,0 ммоль/л и/или концентрация о т л и ч а ю щ и й с я тем, что суспендирование и разрушение бактеgSSHg 0,05-1,0 моль/л, риальных клеток проводят в С,1 М де трис-буферном растворе с рН 6 , 5 . Редактор Мо Циткина Составитель Т. Забонкина Техред Л.Сердюкова Корректор М.Шароши Заказ 3556 Тираж 493 Подписное В И П Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР НИИ ПЗО35, Иосква, Ж-35, Раушская н а б . , д . 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул.'Гагарина,101