Спосіб детекції збудника сибірки

Реферат: Спосіб детекції збудника сибірки В. anthracis за допомогою стандартної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), а також ПЛР у реальному часі включає створення наборів праймерів та проб, які складаються з визначених послідовностей. UA 70049 U (12) UA 70049 U UA 70049 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до молекулярної медицини та молекулярної біології, а саме до створення наборів праймерів та проб для видоспецифічної детекції збудника сибірки В. anthracis за допомогою стандартної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), а також за допомогою ПЛР у реальному часі (ПЛР-РЧ). Вона може бути використана як підтверджуючий тест при бактеріологічних дослідженнях, для вирішення задач епідеміології та епізоотології сибірки та може бути запропонована для подальших лабораторних випробувань, що стане наступним кроком на шляху підвищення рівня біобезпеки населення та території України від можливих терористичних викликів. У 1972 році було підписано конвенцію про припинення розповсюдження та виробництва, а також знищення бактеріологічної і токсикологічної зброї. Але навіть після цього деякі країни демонструють готовність продовжувати розвивати наступальні проекти та підтримують програми з розвитку біологічної зброї масового ураження. У зв'язку з цим у провідних країнах центри з контролю за розвитком та розповсюдженням захворювань зосередили свої зусилля (особливо після відомих подій 11 вересня 2001 р. у США) на інфекційних агентах з найбільшим потенційним впливом на здоров'я та безпеку. Особливо тих, які є високоінфекційними або можуть бути модифікованими для широкого розповсюдження за допомогою аерозолів. До таких інфекційних агентів належать віруси, бактеріальні токсини, а також бактерії: Bacillus anthracis (збудник сибірки), Variola major (збудник віспи), Yersinia pestis (збудник чуми), Clostridium botulinum (збудник ботулізму), Francisella tularensis (збудник туляремії), філовіруси (вірус Ебола та вірус геморагічної гарячки Марбурга), аренавіруси (вірус Ласса, вірус аргентинської геморагічної гарячки - вірус Джуніна). В. anthracis - велика паличкоподібна грампозитивна аеробна бактерія, що утворює спори, - є етіологічним агентом виразки, небезпечного, а часом і фатального, захворювання людини і тварин. В. anthracis є членом групи В. cereus sensu lato, яка включає також В. thuringiensis, В. cereus та непатогенні В. mycoides, В. pseudomycoides та В. weihenstephanensis. Ці близькоспоріднені бактерії є патогенами тварин (В. anthracis та В. cereus) та комах (В. thuringiensis). Група В. cereus sensu lato є однією з найбільш таксономічно сумнівних груп бацил. Раніше вважали, що одночасна наявність двох великих плазмід рХО1 та рХО2, які визначають токсичні властивості В. anthracis, є маркером вірулентності бацили. А протягом останніх шести років від людиноподібних мавп отримано ізоляти В. cereus, що містять обидві плазміди рХО1 та рХО2. Таким чином, через наявність обох плазмід рХО1 та рХО2 наразі неможливо принципово відокремити штами В. anthracis від інших близькоспоріднених видів. Основою для успішної детекції штамів В. anthracis та унікальності їхнього окремого кластера може стати виявлення специфічних для В. anthracis хромосомних точкових мутацій. Тому точна ідентифікація Bacillus anthracis залишається складною задачею для диференціації бацил В. anthracis від близькоспоріднених видів В. cereus та В. thuringiensis через існування високого ступеня гомології нуклеотидних послідовностей з представниками групи Bacillus cereus sensu lato. Для детекції та диференціації збудника сибірки від близькоспоріднених представників групи В. cereus sensu lato використовують молекулярно-біологічні та молекулярно-генетичні методи. До числа сучасних технологій ПЛР-детекції та типування патогенів можна віднести ПЛР з використанням проб у різних форматах - лінійних TaqMan, шпилькових молекулярних маяків, скорпіонових праймерів-проб, LNA-модифікованих праймерів. Існує спосіб детекції збудника сибірки та його диференціації від інших представників групи В. cereus sensu lato (Bell, C.A. Detection B. anthracis DNA by LightCycler PCR [Text] / C.A. Bell [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40, N 8. - P. 2897-2902), який базується на ідентифікації фрагментів генів pagA, що кодує захисний антиген, та сарВ, що кодує інкапсулярний протеїн В, шляхом ПЛР у реальному часі з використанням FRET-проб (fluorescent resonance energy transfer). Даний спосіб дозволяє детектувати як вірулентні, так і авірулентні штами В. anthracis протягом 1 години, має високу аналітичну чутливість (одна копія гена на 1 мкл зразка, що досліджують), але істотним недоліком цього способу є насамперед використання плазмідних маркерів (зокрема, внаслідок можливої втрати плазмід), а також його придатність для ідентифікації тільки культуральних штамів та, отже, неможливість застосування для аналізу клінічних зразків. Існує спосіб детекції B. anthracis (Tong, Y. Development of isothermal TaqMan assay for detection of biothreat organisms [Text] / Y. Tong [et al.] // BioTechniques. - 2008. - Vol. 45, N 5. - P. 543-557), оснований на комбінації технології ізотермальної ампліфікації, а саме хеліказозалежної ампліфікації, та ПЛР-РЧ з використанням проб у форматі TaqMan. Як цільові мішені для праймерів були вибрані гени pagA та сарВ, локалізовані на плазмідах рХО1 та рХО2 збудника сибірки відповідно. Ефективність розробленого способу було продемонстровано з 1 UA 70049 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використанням геномної ДНК В. anthracis штаму Ames, який характеризується наявністю близько 65 копій плазміди рХО1 та 2 копій плазміди рХО2 на клітину. Запропонований спосіб, завдяки застосуванню ферменту хелікази, дія якого замінює стандартний етап денатурації при проведенні ПЛР, дозволяє здійснювати роз'єднання ланцюгів ДНК, відпал праймерів, синтез амплікона, гібридизацію проби та наступний її гідроліз за однієї температури, що забезпечує привабливі швидкість та вартість аналізу. Істотним недоліком даного способу є розробка технологічної платформи на основі плазмідних генів В. anthracis, оскільки плазміди можуть бути втраченими або перенесеними до близькоспоріднених представників групи Bacillus cereus sensu lato. Існує спосіб детекції B. anthracis (Satterfield, B.C. Tentacle Probes™: differentiation of difficult single-nucleotide polymorphisms and deletions by presence or absence of a signal in real-time PCR [Text] / B.C. Satterfield [et al.] // Clin. Chem. - 2007. - Vol. 53, N 12. - P. 2042-2050) за допомогою ПЛР-РЧ з використанням Tentacle-зондів, основу якого становить визначення однонуклеотидного поліморфізму у послідовності хромосомного гена gyrA В. anthracis. Результати досліджень, виконаних на 29 зразках навколишнього середовища, продемонстрували можливість застосування вказаного способу для ідентифікації В. anthracis та Bacillus cereus. Але даний спосіб не дозволяє диференціювати В. anthracis від інших представників групи Bacillus cereus sensu lato внаслідок конструювання праймерів та проби на основі знання послідовностей гена gyrA тільки для одного ізоляту В. anthracis та одного ізоляту Bacillus cereus. Найбільш близьким є спосіб визначення вірулентних штамів збудника сибірки та їхньої диференціації від представників групи Bacillus cereus sensu lato за допомогою ПЛР-РЧ з використанням проб у форматі молекулярних маяків (Hadjinicolaou, A.V. Use of molecular beacons and multi-allelic real-time PCR for detection of and discrimination between virulent Bacillus anthracis and other Bacillus isolates [Text] / A.V. Hadjinicolaou [et al.] // J. Microbiol. Methods. - 2009. - Vol. 78, N 1. - P. 45-53). В основі цього способу лежить визначення фрагментів генів сарА, сарВ та сарС, що кодують білки капсули В. anthracis та локалізованих на плазміді рХО2; генів lef та pag, що кодують компоненти токсину В. anthracis та локалізованих на плазміді рХО2; хромосомного гена 16S rRNA, характерного для всіх бактерій. Специфічність розроблених праймерів та проб було перевірено з застосуванням широкого спектра зразків бактеріальної ДНК, екстрагованої із 17 штамів В. anthracis з різним плазмідним профілем, 24 штамів Bacillus spp., 28 штамів низки інших видів бактерій, а також 10 зразків ДНК, екстрагованої із мононуклеарних клітин периферійної крові людини. Праймери та проби, для яких цільовими мішенями були плазмідні гени, дозволяли надійно ідентифікувати вірулентні штами В. anthracis, але за результатами аналізу на основі гена 16S rRNA не завжди було можливим диференціювати Bacillus spp. від інших видів бактерій (наприклад, від S. aureus або L. innocua). Крім того, до істотних недоліків запропонованого способу слід віднести його високу собівартість та трудомісткість, які обумовлені необхідністю використовувати систему шести наборів праймерів та проб внаслідок використання плазмідних маркерів. У зв'язку з вищевикладеним в основу корисної моделі поставлена задача підвищення надійності та точності детекції збудника сибірки та диференціації бацил В. anthracis від близькоспоріднених представників групи В. cereus sensu lato. Задача, яку поставлено в основу корисної моделі, вирішується тим, що у відомому способі детекції збудника сибірки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та за допомогою полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі шляхом створення наборів праймерів та проб, цільовою мішенню для яких визначено фрагмент гена ssp, що характеризується гексануклеотидною інсерцією тільки для ізолятів В. anthracis, згідно з корисною моделлю, використовують праймери та проби, що складаються з таких послідовностей: Banssp7A 5'-gga ggt gag aaa gat gag taa aaa аса ас-3'; Banssp8 5'-aac tag cat ttg tgc ttt gaa tgc ta-3'; Banssp9 5'-gcgactgaaacaaatgtacaagcagt-3'; Banssp10 5'-cgtctgtttcagttgcaaattctgtacc-3'; лінійна проба у форматі TaqMan: 5'-FAM-cgcaagcttctggtgctagcattcaaagc-3'-RTQ1; шпилькова проба у форматі молекулярного маяка: 5'-FAM-cggcgcgcaagcttctggtgctagcattcaaagccgccg-3'-RTQ1, де FAM - флуорофор, a RTQ1 - відповідний йому гасник флуоресценції. При розробці набору праймерів та проб було проаналізовано нуклеотидні послідовності генів rpoВ (кодує β-субодиницю РНК-полімерази), gyr (кодує β-субодиницю гірази), ssp (кодує низькомолекулярний кислоторозчинний протеїн), транскрипційного регулятора plcR бактерій В. anthracis, В. cereus та B. thuringiensis, фрагменти яких можуть бути цільовими мішенями для 2 UA 70049 U 5 10 15 20 25 30 35 детекції та диференціації В. anthracis. При визначенні молекулярно-генетичних маркерів на першому етапі проаналізовано фрагменти геномної ДНК понад 300 ізолятів В. anthracis, В. cereus та В. thuringiensis з бази даних GenBank. Множинне вирівнювання послідовностей гена ssp для ізолятів групи В. cereus sensu lato дозволило виявити наявність недосконалого прямого повтору довжиною 65 п. н. Всередині другого повтору гексануклеотидна інсерція 5'-tagcat-3' є характерною тільки для В. anthracis та делетованою для В. cereus та В. thuringiensis. Беручи до уваги знайдений факт, цю різницю використовують як хромосомний маркер для розробки системи видоспецифічних праймерів для детекції В. anthracis, a частиною мішені для зворотного праймера Banssp8 на 3'-кінці є зазначений гексануклеотид. Після проведення стандартної ПЛР з набором праймерів Banssp7A - Banssp8, один з яких містить характерну тільки для ізолятів В. anthracis 3'-кінцеву гексануклеотидну інсерцію, два амплікони очікуваного розміру (83 п. н. та 200 п. н.) були детектовані тільки для ізолятів В. anthracis, в той час як для ізолятів близькоспоріднених видів В. cereus та В. thuringiensis був детектований тільки один амплікон (83 п. н.). Досягається цей результат тим, що стандартну ПЛР проводять з набором праймерів Banssp7A - Banssp8 за наступних температурних та часових параметрів: початкова інкубація - 95 °C, 3 хв.; денатурація - 95 °C, 1 хв.; відпал - 60 °C, 1 хв.; синтез - 74 °C, 1,3 хв.; кількість циклів - 45. Продукти ампліфікації візуалізують шляхом проведення електрофорезу в 1,5 %-ому агарозному гелі. Використання проб у форматах TaqMan та молекулярного маяка дозволило за допомогою ПЛР-РЧ надійно диференціювати бактерії В. anthracis від близькоспоріднених видів В. cereus та В. thuringiensis. Сигнал флуоресценції для шпилькових проб з форматом молекулярного маяка був позитивним тільки для штамів В. anthracis, а для близькоспоріднених видів В. cereus та В. thuringiensis був негативним. При використанні лінійних проб TaqMan реєстрували високоінтенсивний сигнал флуоресценції для всіх ізолятів В. anthracis та сигнал значно нижчої інтенсивності для В. cereus та В. thuringiensis. Досягається цей результат тим, що ПЛР у реальному часі проводять з набором праймерів Banssp9 - Banssp10 та лінійної або шпилькової проби за наступних температурних та часових параметрів: ПЛР у реальному часі проводили за наступних температурних та часових параметрів: початкова інкубація - 95 °C, 4 хв.; денатурація - 95 °C, 15 сек.; відпал - 60 °C, 60 сек.; синтез - 72 °C, 20 сек.; кількість циклів - 40. Таким чином, у даній корисній моделі представлено набір праймерів для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для детекції В. anthracis, який дозволяє за допомогою стандартної ПЛР з електрофоретичною детекцією диференціювати збудник сибірки від близькоспоріднених видів В. cereus та В. thuringiensis, а також набір праймерів та двох проб для ПЛР з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією для детекції В. anthracis, який дозволяє за допомогою ПЛР у реальному часі диференціювати збудник сибірки від інших представників групи Bacillus cereus sensu lato. Корисну модель, що пропонується, ілюстровано конкретними прикладами. 40 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 Спосіб детекції збудника сибірки В. anthracis за допомогою стандартної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), а також ПЛР у реальному часі шляхом створення наборів праймерів та проб, який відрізняється тим, що використовують праймери та проби, що складаються з таких послідовностей: Banssp7A 5'-gga ggt gag aaa gat gag taa aaa аса ac-3'; Banssp8 5'-aac tag cat ttg tgc ttt gaa tgc ta-3'; Banssp9 5'-gcgactgaaacaaatgtacaagcagt-3'; Banssp10 5'-cgtctgtttcagttgcaaattctgtacc-3'; лінійна проба у форматі TaqMan: 5'-FAM-cgcaagcttctggtgctagcattcaaagc-3'- RTQ1; шпилькова проба у форматі молекулярного маяка: 5'-FAM-cggcgcgcaagcttctggtgctagcattcaaagccgccg-3'- RTQ1, де FAM - флуорофор, a RTQ1 - відповідний йому гасник флуоресценції. 3 UA 70049 U Множинне вирівнювання фрагмента гена ssp для ізолятів Bacillus anthracis, В. cereus та В. thuringiensis. Виділено унікальну для В. anthracis вставку довжиною 6 н., яка є делетованою для ізолятів В. cereus та В. thuringiensis. Підкреслено комплементарну праймеру Banssp8 послідовність "+" - нитки ДНК. Нуклеотиди, які не збігаються з нуклеотидами консенсусної послідовності ізоляту В. anthracis DQ146892, показано маленькими буквами. Наведено номери, що відповідають номерам ізолятів у базі даних GenBank. 4 UA 70049 U Детекція продуктів ампліфікації геномної ДНК представників групи В. cereus sensu lato за допомогою електрофорезу у 1,5 %-ому агарозному гелі після проведення стандартної полімеразної ланцюгової реакції з набором праймерів Banssp7A - Banssp8. M - маркер молекулярної маси, 100 п. н.; 1-3 - ДНК з ізолятів В. cereus; 4-7 - ДНК з ізолятів В. thuringiensis; 8-12 - ДНК з ізолятів В. anthracis; H - негативний контроль ампліфікації. Всі штами групи В. cereus sensu lato мають ПЛР-продукт довжиною 83 п. н., а штами В. anthracis характеризуються наявністю додаткового амплікона довжиною 200 п. н. 5 UA 70049 U Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6