Спосіб детекції borrelia burgdorferi sensu lato у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб детекції Borrelia burgdorferi sensu lato, у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає проведення полімеразної ланцюгової реакції, підготовку буфера, ампліфікацію, детекцію ампліфікаційної ДНК, який відрізняється тим, що використовують плазмідний ген OSP і хромосомальний ген S16, що складаються з таких послідовностей пар праймерів: Корисна модель належить до медицини та ветеринарної мікробіології, імунології та біотехнології, а саме до способу детекції ДНК бактерій роду Borrelia burgdorferi. Існують способи для діагностики наявності збудника Borrelia burgdorferi бактеріологічні та серологічні, а також темнопільна мікроскопія. [Guiqing Wang, Alje P. van Dam, Ira Schwartz, and Jacob Dankert Molecular Typing of Borrelia burgdorferi Sensu Lato: Taxonomic, Epidemiological, and Clinical Implications. Clinical Microbiology Reviews, October 1999, p. 633-653, Vol. 12, No. 4]. Бактеріологічний спосіб застосовують для діагностики початкової стадії інфекції при використанні біопсійних зразків з області мігруючої еритеми. Недоліком є те, що при хронічному перебігу захворювання діагностична цінність бактеріального способу невелика. Серологічні реакції та темнопільна мікроскопія використовуються теж для встановлення зараженості кліща Borrelia burgdorferi, але чутливість цих способів також незначна. Найбільш близьким способом визначення В. burgdorferi за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), є спосіб запропонований [Susanne Priem, Gerd R Burmester, Thomas Kamradt, Karsten Wolbart, Michael G Rittig, Andreas Krause. Detection of Borrelia burgdorferi by polymerase chain reaction in synovial membrane, but not in synovial fluid from patients with persisting Lyme arthritis after antibiotic therapy. Ann Rheum Dis 1998; 57:118-121]. Використають два гени-мішені - плазмідний ген OSP і хромосомальний ген Р66. Це рішення може бути прототипом. Недоліком даного способу є специфічність праймерів тільки для Borrelia burgdorferi sensu stricto, поширеність якого в Європі невелика, а в основному на цій території поширені Borrelia burgdorferi sensu lato, а саме: Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii та Borrelia afzelii. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб детекції Borrelia burgdorferi sensu lato у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає проведення ПЛР, підготовку буфера, ампліфікацію, детекцію ампліфікаційної ДНК шляхом використання плазмідного гену OSP і хромосомального гену S16, що складаються з таких послідовностей пар праймерів: (19) UA (11) 12659 (13) U для виявлення ДНК Borrelia burgdorferi sensu lato (Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii та Borrelia afzelii.) для виявлення ДНК Borrelia burgdorferi sensu lato (Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii та Borrelia afzelii), 3 12659 щоб забезпечити спосіб детекції Borrelia burgdorferi. Спосіб виконується таким чином. Приклад 1. Проведення ПЛР 1. ДНК праймери до генів-мішеней S16 РНК та OSP, були підібрані з використанням програми GeneRunner v.3.0 і синтезовані фірмою "Літех" (Росія). Послідовності пар праймерів для гена S16 РНК: Розміри продуктів ПЛР 445 та 234 нуклеотидів відповідно. Послідовності пар праймерів для гена OSP: Розміри продуктів ПЛР 632 та 328 нуклеотидів відповідно. 2. Виділення ДНК із зразків здійснювали за допомогою набору для виділення ДНК фірми "Мініпреп" [Сілекс М., Росія]. 3. Буфер для ампліфікації містив 10мм Трис НСl (р 8,3), 50мм КСl, 0,01% альбуміну і по 200мкМ дезоксинуклеозид трифосфатів (dATP, dTTP, dCTP, dGTP). На 50мкл реакційної суміші додавали 50пмоль кожного праймера і 1 од. Tag-полімерази. Для проведення ПЛР із різними праймерами були необхідні наступні додаткові умови: для пар праймерів OSP-out1/2 й OSP-in-3/4 концентрація MgCl2 у реакційній суміші склала 1,75мМ, а для пар 16S-out-1/2 й 16S-in-3/4 2,5мМ. Виділену із проб ДНК додавали в кількості 5мкл. Для запобігання випару реакційної суміші зверху нашаровували 50мкл мінеральної олії. 4. Ампліфікацію проводили з використанням наступних програм: Для пар праймерів OSP-out-1/2 й OSP-in-3/4 4 94°С - 3хв (1 цикл) 94°С - 10сек 58°С - 10сек 72°С - 10сек (10 циклів для зовнішньої пари праймерів і 30 для внутрішньої пари); Для пар праймерів 16S-out-l/2 та 16S-in-3/4 94°С - 3хв (1 цикл) 94°С - 10 сек 47°С - 10сек 72°С - 10сек (10 циклів для зовнішньої пари праймерів і 30 для внутрішньої пари). 5. Детекцію ампліфіційної ДНК здійснювали з використанням електрофорезу в 1,5% агарозному гелі в ТБЕ-буфері. Для цього 10мкл ампліфіційного зразка наносили в лунку агарозного гелю, і витримували при 20мвт/см протягом 15хв. Забарвлення гелю здійснювали 0,1% розчином етидія броміду протягом 5хв. Приклад 2. Порівняльна оцінка чутливості розробленого способу для виявлення ДНК Borrelia burgdorferi sensu lato (див. таблицю). Аналіз чутливості розробленого способу, при дослідженні ДНК виділеної із кліщів Ixodes ricinus, проводили в порівнянні з комерційною ПЛР-діагностичною системою "АмпліСенс Borrelia burgdorferi sensu lato" [ЦНДІ епідеміології МЗ РФ] шляхом паралельного тестування 219 зразків. Збіг результатів тестування за допомогою комерційної тест-системи і розробленого нами способу було відзначено в 215 (99,1%) з 217 випадків. При використанні комерційного способу в якості референтного - діагностична чутливість склала 97,8%. Детекція специфічної ДНК В. burgdorferi способом ПЛР, яка спрямована на пряме виявлення збудника в біологічних зразках, є простим високочутливим і високоспецифічним способом для діагностики хвороби Лайма на різних стадіях захворювання. Використання в нашій тест-системі варіанта з використанням двох пар праймерів до гена-мішені (Nested-ПЛР), дозволяє підвищити чутливість виявлення ДНК В. Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii та Borrelia afzelii. Таблиця "АмпліСенс Borrelia burgdorferi sensu lato" "+" n=46 "-" n=173 Представлений способ «+» «-» 38 7 1 167 "+" - позитивні, "-" - негативні зразки Комп’ютерна верстка А. Крулевський Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601