Спосіб моделювання фізичного виснаження, що призводить до раптової серцевої смерті у лабораторних тварин (щурів)

Реферат: Спосіб моделювання фізичного виснаження, що призводить до раптової серцевої смерті у лабораторних тварин (щурів), здійснюють шляхом виснаження відновних систем організму поступовим збільшенням стресорного іммобілізаційного навантаження. На фоні виснаження відновних систем виконують моделювання піку активності симпатичної нервової системи шляхом застосування фізичного навантаження після тривалої іммобілізації в нефізіологічному положенні, та порушення мікроциркуляторного русла шляхом застосування фізичного навантаження після іммобілізації в нефізіологічному положенні та контрольованої гіпотермії. UA 71315 U (54) СПОСІБ МОДЕЛЮВАННЯ ФІЗИЧНОГО ВИСНАЖЕННЯ, ЩО ПРИЗВОДИТЬ ДО РАПТОВОЇ СЕРЦЕВОЇ СМЕРТІ У ЛАБОРАТОРНИХ ТВАРИН (ЩУРІВ) UA 71315 U UA 71315 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, зокрема до кардіології, і може бути використана у науково-дослідних установах, де вивчають особливості розвитку серцевої недостатності, зокрема раптової серцевої смерті, а також у випробуваннях лікарських засобів, що призначені до використання при серцевих захворюваннях та запобігання розвитку серцевої смерті. У світі спостерігається зниження смертності від серцево-судинних захворювань (ССЗ) проте ССЗ, і в першу чергу ішемічна хвороба серця, продовжують залишатися провідною причиною смертності в більшості розвинутих країн у теперішній час. Незважаючи на те, що спостерігається зменшення кількості смертей від ССЗ, раптова серцева смерть (РСС) залишається дуже важливою проблемою охорони здоров'я в усьому світі та складає до 15 % всіх смертей [1]. В 1982 році Голдштейн [2] запропонував ввести поняття РСС, куди відносили всі засвідчені випадки смерті, що наступили в межах 1 години з моменту появи гострих симптомів кардіальної патології. Незважаючи на це, і в теперішній час зберігаються різні підходи при дослідженні РСС, що робить цю проблему "статистичним кошмаром". Основні механізми РСС повністю не розшифровані, хоча деякі етапи досить ясні. Установлено, що домінуючою є фібриляція шлуночків, однак пускові механізми її до кінця не вивчені. При дослідженні механізмів РСС в основу повинна бути поставлена прижиттєва клінікоморфологічна оцінка з урахуванням всіх факторів ризику, ступеня компенсації, макро- і мікроскопічних характеристик. Пошук критеріїв повинен бути спрямований на виявлення ранніх маркерів пошкодження міокарду та розвитку РСС. Виходячи з вищенаведеного, виникає потреба у виявленні маркерів розвитку РСС та можливості його моделювання для проведення досліджень, щодо ефективності прогнозування ризиків виникнення, профілактики та можливості перевірки ефективності заходів, що призначені для запобігання РСС. Прототипом корисної моделі можна вважати використання моделі хронічного, гострого та гострого на фоні хронічного іммобілізаційного стресу за Ф.З. Меєрсоном [3]. Недоліком цієї моделі для визначення патогенезу РСС є, те що зазначена модель призводила до адаптації, а летальних випадків, навіть після довготривалого моделювання, не спостерігалось й смертей внаслідок РСС тим більше. Тому використання моделі за Ф.З. Меєрсоном не дає змоги провести дослідження з виявлення маркерів РСС та можливості його прогнозування та профілактики. Задачею корисної моделі є відпрацювання протоколу моделювання раптової серцевої смерті та виявлення прижиттєвих прогностичних маркерів розвитку РСС. Поставлена задача вирішується за рахунок того, що у відомому способі моделювання фізичного виснаження, що призводить до раптової серцевої смерті у лабораторних тварин (щурів) шляхом виснаження відновних систем організму поступовим збільшенням стресорного іммобілізаційного навантаження, згідно з корисною моделлю, на фоні виснаження відновних систем виконують моделювання піку активності симпатичної нервової системи шляхом застосування фізичного навантаження після тривалої іммобілізації в нефізіологічному положенні, та порушення мікроциркуляторного русла шляхом застосування фізичного навантаження після іммобілізації в нефізіологічному положенні та контрольованої гіпотермії. Розробка моделі та експериментальні дослідження маркерів РСС проводились на базі Центральної науково-дослідної лабораторії НМАПО імені П.Л. Шупика. Приклад: Моделювання проводили на білих безпородних щурах з місцевого віварію. Модель відтворювали на 24 щурах, щури були помічені та в групи набиралися з урахуванням агресивної поведінки, що оцінувалась за реакцією на зовнішній подразник. Початок всіх маніпуляцій відбувався об 11 годині ранку, щодня протягом тижня крім вихідних днів, що мало на меті моделювання робочого тижня. Контрольним матеріалом слугувала кров тих самих щурів до початку експерименту, також відбір матеріалу для досліджень проводився щотижня у той самий день та той самий час шляхом відбору крові з хвостової вени. Після відбору крові проводився комплекс біохімічних та імунологічних досліджень, що мали на меті виявлення маркерів РСС. Так моделювання РСС було поділено на три етапи, що включали у себе різні типи впливу на тварин. Перший етап - це моделювання виснаження організму шляхом поступового збільшення навантаження. Тварин піддавали іммобілізаційному стресу в непрозорих пеналах у притул один до одного, що давало відчуття близькості партнера по групі, але унеможливлювало візуальний та тактильний контакт, проте не даючи змоги адаптуватися, що досягалося збільшенням часу стресування та нефізіологічним знаходження тварин під час стресування на спині. Так протягом першого та другого тижня відбувалось поступове нарощення часу стресування. По досягненні 120 хв. стресування було тимчасово призупинено збільшення часу на тиждень, що мало на меті 1 UA 71315 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відтворити адаптаційний період за рахунок виснаження резервів організму. Потім на останньому, четвертому тижні збільшення термінів стресування відбувалось до досягнення строку у 180 хв. і продовжувалось до кінця тижня. Перший етап моделювання призвів до загибелі 15 % тварин. Другий етап - етап фізичного навантаження на фоні іммобілізаційного стресу. Було застосовано примусове плавання у теплій воді, що мало на меті моделювання стрімкого навантаження на серце тварини. Так, після 180 хв. іммобілізаційного стресування на спині, тварин виймали з пеналів та занурювали у воду температурою 42 °C та примушували плавати, не даючи торкатися країв та дна. Час примусового плавання після іммобілізації поступового рівномірно збільшували протягом 4 тижнів з 45 с до 300 с. Вказаний етап мав на меті змоделювати найбільшу кількість РСС, а саме РСС в ранковий час, піку активності симпатичної нервової системи, тобто стрімке підвищення активності після тривалого спокою, що було підтверджено смертю 15 % експериментальних тварин в результаті інфаркту міокарда, за даними розтину та морфологічних досліджень. Третій етап мав на меті моделювання порушення циркуляції крові на фоні підвищеного навантаження. Було застосовано збільшення іммобілізаційного навантаження. Так іммобілізаційне навантаження відтворювали за наступною схемою, один день тварин піддавали іммобілізації протягом 3 годин, а в інший - протягом 18 годин. Також кожного дня тварин піддавали примусовому плаванню у воді температурою 4-5 °C протягом 30 с у перший день та поступовим збільшенням до 120 с протягом 4 тижнів. Після примусового плавання у холодній воді тварин вміщували у ємність з теплою водою (37 °C) та примушували плавати протягом 240 с в перший день з поступовим збільшенням до 300 с протягом 4 тижнів, під час останніх двох етапів тварини були під пильним наглядом, оскільки в результаті виснаження могли затонути. Зазначене навантаження мало на меті порушення мікроциркуляторного русла в результаті переохолодження та збільшення навантаження на серцево-судинну систему після порушення циркуляції крові. На останньому етапі моделювання кількість порушень роботи серця призвело до 20 % летальних випадків та сягнуло 50 % від початкової кількості експериментальних тварин летальних випадків, що свідчило про ефективність запропонованої корисної моделі. Прижиттєвий відбір крові для лабораторних досліджень виявив, що деякі показники добре корелювали зі смертю тварин в результаті РСС, морфологічно підтвердженої. Дослідження рівня молекул середньої маси (МСМ) дає змогу оцінити розвиток ендотоксикозу, зумовленного стресом, тобто дає змогу оцінити ступінь порушення регуляторних механізмів організму. Для виявлення маркерів РСС також було виконано дослідження рівня апоптозу та індексу індукції апоптозу (ПА) мононуклеарних клітин крові, що дає змогу оцінити функціональний резерв клітин організму. Рівень молекул середньої маси визначали з використанням трихлороцтової кислоти (ТХО). До 0,6 мл сироватки додавали 0,3 мл 10 % ТХО, перемішували, інкубували протягом 5 хв. при 20 °C. Після цього центрифугували протягом 20 хв. при 1700 g. До 0,5 мл супернатанту додавали 4,5 мл дистильованої води. Вимірювання проводили при довжинах хвиль 280 нм та 254 нм. Після цього проводили розрахунок індексу розподілу шляхом ділення результатів оптичної густини отриманих при 280 нм на показник оптичної густини при 254 нм. Дослідження індексу індукції апоптозу. Перед проведенням дослідження всі матеріали стерилізували протягом 30 хв. під ультрафіолетовою лампою. Процедури підготовки проб до інкубації проводилися в стерильному боксі. Стан клітин організму оцінювали за показниками індексу індукції апоптозу (НА) та змін мітохондріального мембранного потенціалу мононуклеарних клітин крові. Для визначення рівня апоптозу за анексиновим методом та вивчення мембранного потенціалу мітохондрій, виділяли мононуклеарні клітини крові (МНК) хворих на градієнті щільності фіколурографін (d=1,077). Для 5 визначення індексу індукції апоптозу відбирали по 10 мононуклеарних клітин. У одну із пробірок додавали індуктор апоптозу та інкубували на поживному середовищі при 37 °C протягом 18 годин. Дослідження рівня індексу індукції апоптозу (ПА) мононуклеарних клітин (МНК) відбувалось в два етапи: перший - це дослідження рівня спонтанного апоптозу, другий - дослідження рівня індукованого апоптозу. Дослідження спонтанного апоптозу дає змогу оцінити вихідний стан організму. Таким чином, це дає змогу виявити внутрішні порушення, котрі не виявляються звичайними методами, а саме визначити ступінь виснаження або функціонального резерву клітин організму [4, 5]. Визначення змін мембранного потенціалу мітохондрій (ММП) проводили за загальноприйнятою методикою [6] з родаміном 123 ("Fluka"). 2 UA 71315 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На першому етапі моделювання було виявлено спочатку збільшення індексу розподілу (IP) МСМ до 0,30 у.о. та настання смерті після 1 тижня іммобілізаційного стресу, а потім поступове зниження до контрольних значень 0,26 у.о. після 3 тижнів маніпуляцій. Найбільше значення рівня ендогенної інтоксикації та накопичення ендотоксинів було отримано після 4 тижнів (0,35 у.о.). Додавання фізичного навантаження після іммобілізації призвело до зниження IP МСМ та смерті від інфаркту міокарду. Подальші маніпуляції не призводили до значних змін IP МСМ до смерті після 12 тижнів маніпуляцій (фіг. 1 - динаміка змін IP МСМ експериментальних тварин під впливом тривалого фізичного навантаження). Дослідження залежностей клітинної загибелі від тривалості та рівня навантаження показали, що рівень спонтанного апоптозу поступово підвищувався до максимального значення після 2 тижнів - 25 %. Після досягнення максимуму спостерігалося зниження рівня спонтанного апоптозу до 20 % після 4 тижнів. Додавання фізичного навантаження після іммобілізаційного стресу призвело до загибелі від ІМ після 5 тижнів і відображалось також підвищенням рівня спонтанного апоптозу в перші 2 тижні маніпуляцій з максимумом 24 % після 6 тижнів та мінімумом 13 % після 8 тижнів. Наступний етап також призводив до підвищення та поступового зниження, проте смерть наступила після того, як рівень апоптозу почав зменшуватися, а рівень некрозу збільшуватися (фіг. 2 - динаміка змін рівня спонтанного апоптозу МПК експериментальних тварин під впливом тривалого фізичного навантаження; фіг. 3 - динаміка змін рівня некрозу МНК експериментальних тварин під впливом тривалого фізичного навантаження). Визначення рівня індукованого апоптозу виявило схожі тенденції проте більш виражені в точках мінімумів максимумів (фіг. 4 - динаміка змін рівня індукованого апоптозу МНК експериментальних тварин під впливом тривалого фізичного навантаження). Результати, отримані після розрахунку ПА, показали, що обрана модель викликає зміни функціонального резерву клітин організму та призводить до виснаження, що, в свою чергу, призводить до смерті після збільшення навантажень та може бути прогнозована (фіг. 5 динаміка змін НА МНК експериментальних тварин під впливом тривалого фізичного навантаження). Доказова база: раптова серцева смерть настає у 50 % тварин; виявлено, що смерть настає в результаті збільшення навантаження на фоні виснаження організму і підтверджується результатами біохімічних та імунологічних досліджень; виявлено, що індекс індукції апоптозу є маркером розвитку РСС оскільки мінімальні значення індексу індукції апоптозу передували смерті тварин. Перевагами запропонованого способу моделювання перед прототипом є те, що він призводить до раптової серцевої смерті, дозволяє вивчати особливості розвитку РСС, дає можливість прогнозувати настання РСС, розробляти та впроваджувати профілактичні заходи. Технічним результатом є розробка алгоритму, що призводить до раптової серцевої смерті. Отримані результати вказують на те, що розроблена модель є ефективною при моделюванні РСС і може бути використана у практиці науково-дослідних та лікувальних установ з подальшим науковим застосуванням, а також може бути використана для проведення досліджень ефективності лікарських засобів та лікувальних маніпуляцій, що мають на меті запобігти РСС. Джерела інформації: 1. Zheng ZJ, Croft JB, Giles WH, Mensah GA. Sudden cardiac death in the United States, 1989 to 1998. Circulation 2001;104(18):2158-2163. 2. Goldstein S., Medendorp Sh.V.,Landis J.R., Wolfe R.A., Leigtton R.,Ritter G., VAsu C.M., Acheson A.: Analysis of cardiac symptoms preceding cardiac arrest. mer.J.Cardiol, 1986, 58, N13, 1195-1198. 3. Меерсон Ф.3. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца / Ф.3. Меерсон - М.: Медицина, 1984. - 272 с. 4. Данченко Е.О. Лабораторные методы оценки апоптоза и некроза // Медицинская панорама (Лабораторная медицина). - 1999. - № 3. - С. 18-19. 5. Ігрунова К.М. Апоптоз мононуклеарних клітин крові у хворих з патологією серцевосудинної систем / Ігрунова К.М., Моторна М.М., Степачова Т.І. // Лабораторна діагностика. 2004. - № 1. – С. 16-18. 6. Darzynkiewicz Z., Juan G., Li X., Gorczyca W., Murakami Т. and Traganos F. (1997). Cytometry, 27, 1. 3 UA 71315 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб моделювання фізичного виснаження, що призводить до раптової серцевої смерті у лабораторних тварин (щурів), що здійснюють шляхом виснаження відновних систем організму поступовим збільшенням стресорного іммобілізаційного навантаження, який відрізняється тим, що на фоні виснаження відновних систем виконують моделювання піку активності симпатичної нервової системи шляхом застосування фізичного навантаження після тривалої іммобілізації в нефізіологічному положенні, та порушення мікроциркуляторного русла шляхом застосування фізичного навантаження після іммобілізації в нефізіологічному положенні та контрольованої гіпотермії. 4 UA 71315 U 5 UA 71315 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6