Церебропротекторний і стреспротекторний лікарський засіб “ноотрил” у вигляді розчину для ін’єкцій

Винахід відноситься до медицини, зокрема, до фармакотерапії і може бути використано в розчинах для ін'єкцій з комбінованою активною основою. Відомо лікарський засіб у вигляді 1 і 2,5% розчинів "Тіотриазоліна" для ін'єкцій [Лекарственные препараты Украины. - Харьков. - 1999. - Т.2. -С.577]. Розчини містять активний інгредієнт тіотриазолін, що має антиоксидантну, гепатопротекторну, кардіотонічну, анаболічну, протиішемічну, мембраностабілізуючу, імуномодулюючу і інші дії. Відомо лікарський засіб у вигляді 20% розчину пірацетама [Машковский М.Д. Лекарственные средства. Μ: 2002. -Т.1. -С.111.]. Пірацетам має церебропротекторні і стреспротекторні властивості, але не спричиняє антиоксидантної дії та може викликати загострення коронарної недостатності і виникнення диспептичних явищ. Відомо церебропротекторний і ноотропний лікарський засіб - таблетки "Ноотрил", вкриті оболонкою [Деклараційний патент України, №55983А]. Активними інгредієнтами таблеток "Ноотрил" є суміш тіотриазоліна і пірацетама. Цей лікарський засіб приймаємо за прототип. Фармакологічні переваги цього лікарського засобу обумовлені взаємопотенцюючою дією активних речовин. Так, тіотриазолін проявляє антиоксидантну і протиішемичну дії, а також посилює церебропротекторну дію пірацетама, що поряд з метаболічним механізмом регулювання кровопостачання, сприяє нормалізації нервового механізму його регуляції, підвищує швидкість і силу впливу лікарського засобу на поліпшення кровопостачання головного мозку. Лікарський засіб "Ноотрил" не тільки зберігає, але і розширює спектр фармакологічної дії, властивої тіотриазоліну і запобігає побічній дії, яка можлива при використанні пірацетама, а також підвищує ефективність лікування. До недоліків відомого засобу варто віднести затримку фармакологічної дії таблеток на період їхнього всмоктування, розпаду і не повну біологічну доступність. Останнім часом проблема регуляції когнітивних функцій головного мозку (увага, пам'ять, орієнтовнодослідницька поведінка, здатність до навчання, прийняття рішень), порушених як у екстремальних станах, так і при різних захворюваннях (черепно-мозкові травми, інсульти, хронічна церебро-васкулярная недостатність, постгіпоксичні енцефалопатії, нейроінфекції, затримки розумового розвитку у дітей) має велике соціальне і медичне значення у зв'язку із широким поширенням даних захворювань. Відомо, що стрес є однією з основних причин раптової смерті. В умовах стресу значно підсилюються споживання енергії, катаболічні процеси, активується перекисне окислювання ліпідів, збільшується вміст змінених білків з антигенними властивостями, що призводить до негайної реакції з боку імунної системи. Відповідно, мета винаходу - розробка лікарського засобу, що негайно надходить до кровообігу пацієнта та забезпечує максимальну біологічну доступність його активних інгредієнтів. Рішення поставленої задачі забезпечує церебропротекторний і стресп-ротекторний лікарський засіб "Ноотрил" у розчині для ін'єкцій, що містить активну основу у вигляді суміші тіотриазоліна з пірацетамом: тіотриазоліна 25мг, пірацетама 100мг і води для ін'єкцій до одного літра. Фармакологічні переваги лікарського засобу по винаходу: "Ноотрил" (розчин для ін'єкцій) у дозі 250мг/кг маси тварини має виражену антиамнес-тичну, антистресорну дії, підвищує виживання недоношеного потомства, позитивно впливаючи на їхній психічний і фізичний розвиток, володіє більш вираженим ноотропним ефектом. Застосування ін'єкційного розчину "Ноотрил" у гострому періоді внутрішньомозкового крововиливу, а також у гострому періоді ішемії при реперфузії головного мозку підвищує виживання, зменшує ступінь ішемічного ушкодження нейроцитів за рахунок зниження рівня біоенергетичних процесів та реактивації антиоксидантної системи і активації власних антирадикальних механізмів. Розчин "Ноотрил" для ін'єкцій має виражену церебропротекторну дію, що забезпечує нормалізацію показників вуглеводно-енергетичного обміну й антиоксидантної системи в нейроцитах. Попереднє введення розчинів пірацетама, тіотриазоліна і ноотрила показало, що у "Ноотрила" стреспротективний ефект найбільш виражений. Терапевтичний антистресовий ефект від застосування препаратів після короткочасної іммобілізації, максимально виражений у "Ноотрила", тому що показники клітинного складу периферичної крові, кісткового мозку стабілізуються на 12 годин раніш, ніж після використання пірацетама і на 24 години раніше, ніж при використанні тіотриазоліна. Сутність винаходу пояснюється нижченаведеним описом і прикладами дослідження лікарського засобу по винаходу. Дослідження церебропротекторної дії ін'єкційного розчину "Ноотрил" Ноотропну активність розчину по винаходу ви вчали в дослідах на 114 білих щура х лінії Вістар обох статей, масою 160-180 г, отриманих з розплідника Інституту фармакології і токсикології АМН України. Для оцінки антиамнестичної дії використовували умовну реакцію пасивного уникання (УРПУ). Тварину поміщали у світлий відсік двокамерної установки і реєстрували латентний час заходу в темний відсік камери, де щур одержував одноразовий удар струмом через електродну підлогу (навчання). Безпосередньо після навчання застосовували електрошок (110В, 50Гц, 500мс). Відтворення рефлексу здійснювали через 24 години після навчання. В іншій серії експерименту амнезію УРПУ викликали внутрішньоочеревинним введенням скополаміна в дозі 2,5мг/кг. Вивчення впливу розчину по винаходу на діяльність вищої нервової системи (ВНД) проводили також на моделі одноразового навчання УРПУ без застосування амнезуючого фактора. Здатність тварини до запам'ятовування нанесеного електробольового роздратування розраховували по різниці латентного часу до і після навчання через 24 години. По закінченню експерименту в тканині мозку визначали основні показники вуглеводно-енергетичного обміну - вміст АТФ, глікогену, малата і лактата. Розчин по винаходу й аналоги вводили внутрішньоочеревинно: "Ноотрил" - 250мг/кг, іпрацетам 10% 200мг/кг, тіотриазолін 2,5% - 50мг/кг у перерахуванні на суху речовину активних інгредієнтів. Також вивчення ноотропної активності досліджували при моделюванні екстремальних станів. Навчання проводили використовуючи методику УРПУ описану вище, але при заході в темний відсік щур відразу одержував удар стр умом, минаючи одноразовий удар через електродну підлогу, і вибігав у світлий відсік. Відтворення УРПУ перевіряли через 24 години. Про збереження навички судили по зміні латентного часу заходу в темний відсік. Препарати вводили в дозах: "Ноотрил", як і в першому досліді - 250мг/кг, пірацетам 10% - 400мг/кг, феназепам - 1,0мг/кг. У першій серії дослідів екстремальні умови створювалися по методу Жуве, обмеженням рухової активності і сну. Для цього щурів розміщували на площадці діаметром 6,0см (1 щур на площадці) у плексигласовому басейні, заповненому водою (t»5°С). Площадка піднімалася над басейном на 1,5-2см. У басейні було 5 площадок. У даному випадку відбувалася виборча депривація парадоксальної фази сну (ПФС), тому що під час ПФС м'язи тварин розслаблювалися і вони падали у воду. Депривацію ПФС проводили безпосередньо після навчання. Препарати вводили за ЗО хвилин до навчання. В другій серії дослідів екстремальну ситуацію створювали в умовах зіткнення питного й оборонного рефлексів за загальноприйнятою методикою "Конфліктної ситуації". Експеримент починали з тренування щурів з метою вироблення в них навички взяття води з поїлки. Для підвищення питної мотивації і почуття спраги, протягом 2 діб, тварин тримали на сухому раціоні. Потім, в один і той же час, протягом 3-х діб тварин поміщали на 10 хвилин у клітку для одержання води, на 4-й день тренування, щуру через 5 секунд після початку пиття, завдавали удару стр умом через електрод, що знаходиться біля носика поїлки. Таким чином, зіткнення двох рефлексів (питного й оборонного) приводило до створення екстремальної ситуації, при якій страх отримання больового роздратування утримував тварину від угамування спраги. Надалі (через 30 хвилин) протягом 20 хвилин, реєстрували кількість взяття води, число підходів до поїлки і величину загальної рухової активності по числу пересічених квадратів. Препарати вводили протягом усього періоду тренування один раз на добу. Вплив розчину "Ноотрил" по винаходу на недоношених щурів вивчали за допомогою визначення в динаміці основних показників їхнього функціонального розвитку і росту: покриття шерстю, прорізання зубів, відкриття очей, кількості горизонтальних переміщень, вставань на задні лапи, заглядання в отвори підлоги, виживання потомства. Для роботи були відібрані щури самки і самці, яких поміщали в клітки в співвідношенні 1 самець на 5 самок. Усього було змодельовано 5 сімей, яких утримували на стандартному раціоні віварію. По перших ознаках вагітності велася реєстрація термінів. На 19-20 день вагітності у самок викликали дострокові пологи. У контрольних щурів пологи проходили в термін. Породілей з потомством відсаджували в окремі клітки і проводили спостереження. Розчин "Ноотрил" і препарати порівняння вводили новонародженим з першого дня життя в дозах: ноотрил - 62,5мг/кг, пірацетам - 50,0мг/кг, тіотриазолін - 12,5мг/кг, у розрахунку на суху речовину. У кожній групі знаходилося під спостереженням 12 новонароджених щурів. Дослідження церебропротекторної активності розчину по винаходу виконано на 245 білих щура х лінії Вістар, масою 180-200г в умовах моделювання гострого порушення мозкового кровообігу і крововиливу у внутрішню капсулу головного мозку. Порушення мозкового кровообігу моделювали оперативним шляхом: 1) білатеральна перев'язка внутрішніх сонних артерій під небуталовим наркозом; 2) введення аутокрові до області внутрішньої капсули головного мозку, за допомогою свердління отвору в черепі щура, через який в область внутрішньої капсули вводили 0,2мл крові, отриманої з вени хвоста тварини. Препарати вводили щодня внутрішньоочеревинно протягом 4-х днів після моделювання, в дозах: тіотриазолін 2,5% - 50мг/кг, пірацетам 10% -200мг/кг, розчин "Ноотрил" 12,5% - 250мг/кг. Забій тварин робили шляхом декапітації під нембуталовым наркозом (40мг/кг) на 4-у добу спостереження. Кров і півкулі головного мозку, після гомогенізації, досліджували біохімічно, за загальноприйнятими методиками. Гостру ішемію і реперфузію головного мозку моделювали тимчасовим вимиканням кровотока по сонних артеріях. Операції проводили під нембуталовМм наркозом. Робили поздовжній розріз в області шиї, виділяли сонну артерію, на яку накладали лігатур у на 30 хвилин. Потім лігатур у знімали й ушивали шкіру. Після ви ходу з наркозу щурів поміщали в клітки по 6 тварин. На 3-ю добу після операції тварин декапітуровали під нембуталовым наркозом і проводили забір ішемизованих півкуль. У тварин проводили забір крові із сонної артерії по 0,2-0,3мл під час операції, через 30 хвилин після накладання лігатури і через 30 хвилин після зняття лігатури. Крім того, проводився забір крові з черевної артерії на 3-ю добу після операції під час забою. Кров і півкулі головного мозку, після гомогенізації, досліджували біохімічно, за загальноприйнятими методиками. Препарати уводили внутрішньвенно двічі, за 30 хвилин до накладення лігатури і перед реперфузією: тіотриазолін 2,5% - 50мг/кг, пірацетам 10% - 200мг/кг, ноотрил - 250мг/кг. Для оцінки церебропротекторної дії препаратів визначався стан біоенергетики по вмісту: аденилових нуклеотидів, активності гліколізу (рівень лактату, пірувата), окислюванні в циклі Кребса (вміст малата), а також інтенсивність вільно-радикального окислювання (СРО) по вмісту малонового діальдегіда (МДА), дієнових коньюгат (ДК) і трієнкетонів (ТК) і стану антиоксидантної системи по активності супероксиддісмутази (СОД), каталази, глутатіонпероксидази (ГГТР) і вмісту α-токоферолу. Про ішемічне ушкодження головного мозку судили за показниками гіперферментемії (активність мозкової ізоформи креатинфосфокинази - КФК). Дослідження противосудомної активності проводили на білих щура х -самцях лінії Вістар, вагою 180-220г. Модель ГАМК-дефіцитних судом відтворювали шляхом введення тваринам тіосемикарбазида підшкірно в дозі 30мг/кг. Розчин "Ноотрила" по винаходу вводили внутрішньоочеревинно в дозі 250мг/кг за 30 хвилин до введення тіосемикарбазида. Препарати порівняння - пірацетам 200мг/кг і фенобарбатил 20мг/кг внутрішньоочеревино і мидикалм 25мг/кг підшкірно, уводили як і "Ноотрил" за 30 хвилин до введення тіосемикарбазида. Картину судом оцінювали за часом появи і тривалості окремих компонентів судомного припадку - клінічної і тонічної фаз. На піку судомного припадку тварин виводили з експерименту. їм видаляли кору головного мозку і поміщали її в рідкий азот. Кору головного мозку гомогенізували в рідкому азоті й обробляли за загальноприйнятими біохімічними методиками. Про інтенсивність процесів СРО в корі головного мозку щурів, на піці судомного припадку, судили по накопиченню продуктів цього процесу - ДК, ТК, МДА, про інтенсивність утворення оксиду азоту - (NO) у тканині кори головного мозку щурів - по виявленню стабільного його метаболіту нитратіона – NO3. Результати наведених прикладів досліджень розчину ноотрил по винаходу і препаратів порівняння відображені в таблицях. Вивчення ноотропних властивостей препарату "Ноотрил" Вивчення антиамнестичних властивостей препарату "Ноотрил" проводили на моделі електрошокової і атропіновій амнезії. Досліджували вплив ін'єкційних розчинів тіотриазоліна, пірацетама і "Ноотрила" на усунення амнезії УРПУ, викликаної атропіном і електрошоком. Дослідження показали, що проведення електрошока відразу після навчання УРПУ, також як і введення атропіну, викликає забування навички в контрольних тварин при відтворенні через 24 години після навчання (таблиці 1; 2). Уведення тіотриазоліна, пірацетама і ноотрила експериментальним тваринам до навчання і при наступному проведенні електрошока (чи введенні атропіну) викликало значне збільшення латентного часу рефлексу в порівнянні з контрольними тваринами (таблиці 1; 2). При цьому, найбільш ефективним було введення препарату "Ноотрил", як при нанесенні електрошока, так і при введенні атропіну. Таблиця 1 Вплив досліджуваних препаратів на амнезію УРПУ, викликану атропіном Препарат Контроль без амнезії (n=6) Контроль з амнезією (n=6) Пірацетам (n=6) Тіотриазолін (n=6) Ноотрил (n=6) Латентний час Доза, рефлексу при мг/кг відтворенні УРПУ, сек 136,5±21,6 22,5±2,4 200,0 37,0+6,2* 50,0 57,8±7,6* 250,0 74,8±6,2* Примітка: * - р