Спосіб діагностики радіаційно-індукованих когнітивних розладів після опромінення в малих дозах

Реферат: Спосіб діагностики радіаційно-індукованих когнітивних розладів після дії опромінення в малих дозах включає діагностику за допомогою Короткої шкали оцінки психічного статусу (Mini Mental State Examination - MMSE), генетичний аналіз лімфоцитів периферичної крові людини із застосуванням полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі. UA 74123 U (12) UA 74123 U UA 74123 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб належить до медико-біологічного напрямку, а саме до радіаційної медицини, радіаційної психоневрології та молекулярної біології, і може бути використаний для діагностики когнітивних розладів у людини після дії малих доз іонізуючої радіації у віддаленому періоді після опромінення. Відомий спосіб діагностики пострадіаційних когнітивних порушень у віддалений період [1], що включає нейропсихологічні дослідження і картування біоелектричної активності головного мозку, який відрізняється тим, що у пацієнта одночасно оцінюють відносний вербальний коефіцієнт інтелектуальності, когнітивність, пам'ять та увагу, проактивну інтерференцію вербальної інформації, короткочасну вербальну пам'ять, ретроактивну інтерференцію вербальної інформації, відносну потужність (%) тета-діапазону електричної активності головного мозку у лівій лобній ділянці, відношення сумарної відносної (%) потужності тета- до альфа-діапазону, після цього визначають вірогідність радіаційного ґенезу змін кожного показника та його питому вагу у діагностиці пострадіаційних когнітивних порушень. Даний спосіб використовується для оцінки вірогідності радіаційного генезу когнітивних порушень у віддалені терміни після загального опромінення людини у дозах до 5 Гр при радіаційних аваріях. Недоліком даного методу є надмірна повнота різноманітних тестів, що проводяться безпосередньо з пацієнтом протягом тривалого часу і можливого спотворення результатів тестів за рахунок не врахованих змін внаслідок астенізації під час виконання завдань. Цей чинник є особливо важливим для осіб з когнітивними порушеннями, оскільки в переважній більшості випадків у них спостерігається психоорганічний синдром з церебрастенічним компонентом різного ступеня вираженості. Окрім того, основний ухил робиться в нейропсихометричному напрямку, що зумовлює певну суб'єктивізацію оцінки стану пацієнтів і широке коливання отриманих результатів в залежності від впливу різноманітних зовнішніх чинників. В даному методі повністю відсутня молекулярно-генетична складова, яка б дозволила максимально об'єктивізувати когнітивні порушення пацієнта за рахунок використання чітких діагностичних маркерів, виключивши ефект впливу зовнішніх факторів на момент обстеження. Також вищезгаданий спосіб використовується для діагностики пострадіаційних когнітивних порушень в широкому діапазоні доз, в той час як запропонований авторами спосіб стосується радіаційно-індукованих когнітивних порушень після опромінення в малих дозах. Відомий спосіб діагностики деменції та інших неврологічних захворювань, який направлений на визначення стану здоров'я або відхилень у стані здоров'я пацієнтів із хворобою Альцгеймера, а також ризиків виникнення хвороби Альцгеймера, когнітивних розладів та деменції. Спосіб включає аналіз зразків крові пацієнтів за допомогою мас-спектрометрії з високим ступенем роздільної здатності. Спосіб дозволяє визначати зміни масових показників крові хворих пацієнтів порівняно із референтними зразками. Підвищення або зниження амплітуди сигналів молекул крові пацієнтів дозволяє встановити діагноз - хвороба Альцгеймера, охарактеризувати клінічний стан пацієнтів із хворобою Альцгеймера, із деменцією, когнітивними розладами, а також встановити ризики виникнення когнітивних розладів [2]. До недоліків способу відносяться відсутність даних щодо застосування методу у хворих, які зазнали дії опромінення, а також зниження точності методу навіть після дії опромінення за рахунок зміщуючого впливу іонізуючої радіації на показники мас-спектрометрії навіть у інтервалі малих доз. Відомий спосіб диференційної діагностики цереброваскулярних захворювань, який включає визначення клінічного неврологічного стану, показників реоенцефалографії (РЕГ) і ультразвукової доплерографії (УЗДГ). При цьому аналізують діагностичні критерії: розлад когнітивних функцій, вегетативний симптомокомплекс, вираженість неврологічних осередкових симптомів, вираженість артеріальної гіпертензії, гіперліпопротеїнемії, наявність регіональних морфологічних дисплазій та тип РЕГ порушень, асиметрію кровотоку за даними РЕГ, тип УЗДГ порушень, асиметрію кровотоку судин головного мозку за даними УЗДГ, зміну судин очного дна за даними офтальмоскопії. Спосіб дозволяє визначити ступінь вираженості неврологічних розладів за 4-бальною шкалою: 0 балів - норма, 1 бал – легкий ступінь, 2 бали - середній ступінь, 3 бали - важкий ступінь вираженості. За діаграмою, векторами якої є вираженість діагностичних критеріїв, діагностують стадії ураження [3]. За способом можлива діагностика тільки первинних хронічних цереброваскулярних захворювань. Недоліком є праце- та часоємність. Відомий спосіб диференційної діагностики деменції Альцгеймера у пацієнтів з експонованими помірними когнітивними порушеннями. Метод призначений для визначення тих пацієнтів, які страждають помірними когнітивними порушеннями, у яких є ймовірність захворіти хворобою Альцгеймера. Спосіб включає визначення біохімічного маркера - специфічної глютамін-синтетази людини у біологічній рідині, переважно у крові. Метод базується па 1 UA 74123 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проведенні імуноферментного аналізу включення антитіл, специфічних до глютамін-синтетази людини. Даний спосіб дає змогу діагностувати деменцію при хворобі Альцгеймера [4], є простим та повторюваним. До недоліків способу відноситься неможливість впровадження для діагностики при деменціях іншого походження. Відомий спосіб визначення захворювань, пов'язаних із старінням, який базується на дослідженні функціонального стану клітин в умовах штучного підвищення їх проліферативної активності шляхом внесення до реакційного середовища біологічно активних субстанцій, які модулюють активність myc-подібного протеїну, з наступним визначенням активності ферменту теломерази, що приймає участь у регуляції довжини теломерів. як індуктори використовують L2-myc, N-myc, L-myc білки. За способом можливо також тестувати фармацевтичні препарати, які містять L2-myc протеїн [5]. Недоліком цього способу є можливість визначення тільки тих захворювань, у розвитку яких бере участь с-myc протеїн, що робить обмеженим його застосування для визначення ефектів іонізуючого опромінення. Відомий також метод визначення біомаркерів генного профілю та терапевтичних мішеней старіння мозку та когнітивних розладів пов'язаних із віком [6]. В основі методу лежить ідентифікація білків і генів, які їх кодують, та можливість їх використання як нових біомаркерів старіння мозку і як мішеней для розробки методів лікування когнітивних розладів, пов'язаних із віком, хвороби Альцгеймера та хвороби Паркінсона. Недоліком цього методу є те, що застосування запропонованих біомаркерів генного профілю обмежується особами похилого віку. Найбільш близьким до заявленого способу є спосіб визначення класів легких когнітивних порушень з використанням даних генної експресії. Система і метод базуються на отриманні даних генної експресії у пацієнтів з легкими когнітивними порушеннями та ідентифікацію передбачуваного підтипу легких когнітивних відхилень на підставі "генного підпису". Спосіб дозволяє визначити клас легких когнітивних розладів з використанням алгоритму розгалуження [7|. Даний спосіб, прийнятий за найближчий аналог, є аналогічним заявленому тим, що базується на визначенні відносних показників генної експресії як діагностичних маркерів когнітивних розладів, однак забезпечує діагностику лише легких неврологічних порушень та не спрямований на радіаційно-індуковані патології. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалення діагностики радіаційноіндукованих психоневрологічних розладів, а саме у віддаленому періоді після дії іонізуючого опромінення у малих дозах. Поставлена задача запропонованого способу вирішується тим, що за допомогою дослідження когнітивних порушень за допомогою Короткої шкали оцінки психічного статусу (Mini Mental State Examination - MMSЕ) та експресії генів у клітинах периферичної крові за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у реальному часі, які дозволяють визначити зв'язок когнітивних розладів з дією іонізуючого опромінення. Дослідження когнітивних розладів проводили, використовуючи Коротку шкалу оцінки психічного статусу (Mini Mental State Examination - MMSE). Вона є досить надійним валідизованим інструментом і найбільш часто використовується у всьому світі для первинного скринінгу когнітивних порушень, у тому числі деменцій. За допомогою шкали оцінюються орієнтація в часі і місці, сприйняття, концентрація уваги, пам'ять, мова, виконання 3-етапних команд, читання і змальовування. Результат тесту отримують шляхом сумації балів по кожному з пунктів. Максимальний показник в цьому тесті - 30 балів, що відповідає найвищим когнітивним здібностям. Чим менше результат тесту, тим більше виражений когнітивний дефіцит. Кількість балів менше 27 свідчить про наявність когнітивного дефіциту. Дослідження генної експресії проводили за допомогою ПЛР із зворотною транскрипцією у реальному часі. Суть методу полягає в тому, що одноланцюгову молекулу РНК перетворюють за допомогою реакції зворотної транскрипції в комплементарну ДНК (кДНК) і потім ампліфікують одноланцюгову молекулу ДНК з використанням ПЛР. Був використаний ПЛР у реальному часі, в основі якого лежать загальні принципи ПЛР, однак відрізняється тим, що вимірюється кількість ампліфікованої ДНК у реальному часі, після кожного циклу ампліфікації. Виділення РНК проводили за допомогою автоматичної станції QIAcube (QІAGENE, Germany) для виділення нуклеїнових кислот та спін-колонкового набору для виділення РНК - NucleoSpin RNAII (Macherey-Nagel, Germany). Процес запуску системи складається з трьох кроків: завантаження зразків, завантаження буферів, завантаження роторів. Виділення тотальної РНК проводили із мононуклеарів периферичної кроні шляхом стабілізації, лізису та гомогенізації клітин, додавання етанолу та зв'язування тотальної РНК, відмивки та DNase обробки та елюції тотальної РНК. Синтез кДНК із зразків виділеної РНК проводився за допогою High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA), 2 UA 74123 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 що є першим з двох років проведення RT-PCR (ПЛР із зворотною транскрипцією) експерименту. Набір містить реагенти, які при змішуванні формують 2х Reverse Transcription Master Mix (RTMM). Рівні об’єми зразка PНK (10l) та RT-MM (10l) змішували та проводили реакцію зворотної транскрипції за допомогою термошейкера (Biosan, ТS 100). Робочі позиції термошейкера змінювались як продемонстровано у табл. 1. Ампліфікація кДНК є другим кроком у проведенні RT-PCR експерименту, який можна представити за схемою, яка наведена на рис. 1. Проведене нами дослідження ґрунтувалося на визначенні відносних показників експресії генів індукованих із апоптозом (ТР53, ТР53І3, FASLG, MADD, ВАХ, BIRC5) теломеротеломеразним комплексом (TERT, TRF1, TRF2) та клітинним циклом (CCND1, CDKN1A, CDKN1B, МАРK14, MKNK2) у лімфоцитах периферичної крові осіб із різним ступенем когнітивних розладів у віддаленому періоді після опромінення. Загальна кількість обстежених пацієнтів склала 50 осіб. Групи обстеження: 1 - контрольна група, 2 - опромінені особи із когнітивними розладами різного ступеня важкості (УЛНА на ЧАЕС 1986-87 рр). 3 - неопромінені особи із когнітивними розладами різного ступеня важкості. Характеристика груп обстеження наведена у табл. 2. Всі пацієнти проходили обстеження у відділі радіаційної психоневрології ІКР ДУ "НЦРМ НАМН України", за інформованою згодою. Наводимо конкретні приклади виконання способу. Приклад 1. Пацієнт В., 78 років, реєстраційний номер № 10/165232, УЛНА на ЧАЕС 1986 р. Доза опромінення 0,0132 Зв. Діагноз - легкий когнітивний дефіцит. Кількість балів за шкалою MMSE - 26. За даними ПЦР аналізу у реальному часі встановлена гіперекспресія ВАХ (рис. 2), BIRC5, DDB2, MKNK2, VEGFA генів, а також зниження відносного рівня RQ (середнє значення відносного рівня експресії (умовні одиниці) генів CCND1, CDKN1A, CDKN1b, МАРK14, NFKB 1, TGFBR1. Приклад 2. Пацієнт Ш., 54 роки, реєстраційний номер № 10/165233, УЛНА на ЧАЕС 1986 р. Доза опромінення 0,046 Зв. Діагноз - легкий когнітивний дефіцит. Кількість балів за шкалою MMSE - 25. За даними ПЦР аналізу у реальному часі встановлена гіперекспресія ВАХ, BIRC5 (рис. 3), DDB2, MKNK2, VEGFA генів, а також зниження відносного рівня RQ генів CCND1, CDKN1A, CDKN1b, МАРK14, NFKB 1,TGFBR1. Приклад 3. Пацієнт Ш., 54 роки, реєстраційний номер № 10/165233, УЛНА на ЧАЕС 1986 р. Доза опромінення 0,046 Зв. Діагноз - деменція. Кількість балів за шкалою MMSE - 18. За даними ПЦР аналізу у реальному часі встановлена гіперекспресія ВАХ, BIRC5, DDB2, MKNK2, VEGFA генів, а також зниження відносного рівня RQ генів CCND1 (рис. 4), CDKN1A, CDKN1b, МАРК14, NFKB 1, TGFBR1. Спосіб може бути використаний у лікувально-профілактичних закладах системи охорони здоров'я, які надають допомогу постраждалим внаслідок Чорнобильської катастрофи, медичносанітарних частинах підприємств, де використовуються джерела іонізуючих випромінювань (АЕС, радіохімічні підприємства та ін.), науково-дослідницьких інститутах та закладах, аерокосмічній та воєнній медицині. Перелік фігур креслення: Таблиця 1 - Робочі позиції термошейкера при проведенні зворотної транскрипції Таблиця 2 - Характеристика груп обстеження Фіг. 1 - Схема проведення RT-PCR експерименту Фіг. 2 - Гіперекспресія гена ВАХ. 1, 4 - контрольна група; 5-8 - УЛНА на ЧАЕС з когнітивними розладами Фіг. 3 - Гіперекспресія гена BIRC5. 1, 4 - контрольна група; 5-8 - УЛНА на ЧАЕС з когнітивними розладами Фіг. 4 - Зниження експресії гена цикліну D1 CCND1. 1, 4 - контрольна група; 5-8 - УЛНА на ЧАЕС з когнітивними розладами Використані джерела інформації: 1. Спосіб діагностики пострадіаційних когнітивних порушень / Логановський К.М., Антипчук К.Ю., Крейніс Г.Ю., Чумак С.А., Колосинська О.О., Логановська Т.К., Бомко М.О. // Патент на корисну модель № 46847. Індекси МПК: А61K 51/00, опубліковано 11.01.2010, бюл. № 1. 2. Methods for the diagnosis of dementia and othe neurological disorders / Cook Lisa, Goodenowe Dayan // Патент на винахід № EП 2322531 А2, Індекси МПК: C07F 9/09, G01N 33/483, G01N 33/68, G01N 27/00, G01N 37/00, опубліковано 18.05.2011, esp@cenet. 3. Способ дифференциальной диагностики начальных хронических цереброваскулярных заболеваний / Чурсин В.В., Боев И.В., Чигрина Н.В. // Патент па винахід № RU 2314030 С1, 3 UA 74123 U 5 10 15 Індекси МПК: А61В 5/6, А61В 5/021, А61В 5/0295, А61В 8/06, А61В 3/2, опубліковано 10.01.2008 Бюл. № 1. 4. Process for differential diagnosis of Alzheimer's dementia in patients exhibiting mild cognitive impairment / Tacahashi Mioyoko, Jackowski George // Патент на винахід № CA000002498881 A1, Індекси МПК: G01N 33/573, G01N 33/68, опубліковано 01.04.2004, http://www.depatisnet.de. 5. Method of treating aging-related disorders / Andrews William H. // Патент на винахід № US2003077757 (A1), Індекс МПК: С07K 16/00, С12Р 21/08, С07K 16/00, С12Р 21/08, опубліковано 24.04.2003, esp@cenet. 6. Gene expression profile biomarkers and therapeutic targets for brain aging age-related cognitive impairment / Philip W Landfield, Eric M Blalock, Kuay-Chu Chan, Thomas Fossex // Патент на винахід № US 2005/0071088 A1, Індекси МПК: G06F 1900, опубліковано 31.03.2005, http://www.depatisnet.de. 7. System and method for mild cognitive impairment class discovery using gene expression data /Amit Chakraborty, Dorin Comaniciu, Lu-yong Wang // Патент на винахід № US 2006/0094044 A1, Індекси МПК: C12Q 1/68, G06F 19/00, опубліковано 04.05.2006, http://www.depatisnet.de. Таблиця 1 Температура Час Крок 1 25 °С 10 хв. Крок 2 37 °C 120 хв. Крок 3 85 °С 5 хв. Крок 4 4 °C необмежений час Таблиця 2 Характеристика груп обстеження Групи обстеження 1 - контрольна група 2 - опромінені особи із когнітивними розладами 3 - неопромінені особи із когнітивними розладами кількість (осіб) n 13 вік (роки) М±m 50±5,53 29 56±7,99 8 52±6,17 доза (мЗв) діапазон від 13,2 до 2800 мЗв 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб діагностики радіаційно-індукованих когнітивних розладів після дії опромінення в малих дозах, який включає діагностику за допомогою Короткої шкали оцінки психічного статусу (Mini Mental State Examination - MMSE) і генетичний аналіз лімфоцитів периферичної крові людини із застосуванням полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі, який відрізняється тим, що при значеннях Короткої шкали оцінки психічного статусу менше 27 балів, підвищенні експресії генів BIRC5, ВАХ та зниженні експресії генів CCND1, ТР53, ТР53І3, TERF1 та TERF2 діагностують радіаційно-індуковані когнітивні розлади. 4 UA 74123 U 5 UA 74123 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6