Спосіб отримання рослин-регенерантів із сегментів вузлової зони пагона методом agrobacterium-опосередкованої трансформації кукурудзи

Реферат: Спосіб отримання трансгенних рослин-регенерантів кукурудзи методом Agrobacteriumопосередкованої трансформації, який полягає у інокуляції поперечно розрізаних сегментів вузлової зони пагонів 7-8-денних проростків господарсько-цінних інбредних ліній суспензією клітин обеззброєного штаму A. tumefаciens, регенерації пагонів, їх укорінення та селекції рослин-регенерантів з цільовим трансгеном, крім того регенерацію пагонів і їх укорінення здійснювали на модифікованому середовищі В5 Гамборга одного складу без сахарози з додаванням нового компоненту - сорбітолу, а інокуляцію проводили з додаванням до модифікованого регенераційного середовища тіосульфату натрію без ацетосирінгону, що створило можливість суттєво прискорити процедуру отримання трансгенних рослинрегенерантів шляхом прямого органогенезу ряду елітних інбредних ліній вітчизняної селекції. UA 77323 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ РОСЛИН-РЕГЕНЕРАНТІВ ІЗ СЕГМЕНТІВ ВУЗЛОВОЇ ЗОНИ ПАГОНА МЕТОДОМ AGROBACTERIUM-ОПОСЕРЕДКОВАНОЇ ТРАНСФОРМАЦІЇ КУКУРУДЗИ UA 77323 U UA 77323 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель стосується генетичної інженерії та біотехнології. Може бути використана для отримання трансгенних рослин-регенерантів за Agrobacterium - опосередкованої трансформації in vitro з метою подальшого створення біотехнологічних рослин кукурудзи (Zea mays L.). В основу корисної моделі поставлено вирішення задачі удосконалення способу генетичної трансформації господарсько-цінних інбредних ліній кукурудзи з використанням обеззброєних штамів Agrobacterium tumefaciens. Регенерація трансформованих клітин ключовий етап системи методів генетичної трансформації рослин, в тому числі кукурудзи (Zea mays L.). Це має безпосереднє відношення, з одного боку, до вибору типу експланта (ізольовані сегменти органів й тканин), оптимізації живильних середовищ і умов культивування, а з іншого - до методу та умов доставки рекомбінантних молекул ДНК. Перші трансгенні рослини кукурудзи були отримані із застосуванням клітин ембріогенного калюсу, отриманого з незрілих зародків, але здатність до індукції пагоноутворення - ознака, яка на даний час визначена у обмеженої кількості господарсько-цінних інбредних ліній кукурудзи [1-6]. Тому очевидна потреба у модифікації способів генетичної трансформації кукурудзи, спрямованих на подолання генотипової залежності та на прискорене економічно вигідне отримання рослин-регенерантів з генами інтересу. Таким підходом можна вважати Agrobacterium - опосередковану трансформацію in vitro з використанням як первинний експлант сегментів пагонів, які включають апікальну меристему, з клітин якої здатні формуватися генеративні структури, що формують гамети. Спосіб полягає у інокуляції суспензією клітин Agrobacterium tumefaciens певним чином підготовлених експлантів, кокультивування, елімінації клітин агробактерій бактерицидними агентами, індукції пагоноутворення і їх укорінення, відборі стійких до селективних чинників регенерантів та їх молекулярно-генетичний аналіз. Перевагою методу Agrohacterіum - опосередкованої трансформації рослин є можливість інтеграції поодиноких копій Т-ДНК у транскрипційно активні області ядерного геному, що забезпечує стабільну експресію трансгенів та низьку собівартість робіт [7|. Модифікації (удосконалення) методу Agrobacterium-опосредкованої трансформації in vitro здійснюються з метою інтродукції рекомбінантних молекул ДНК (цільових трансгенів) у тотипотентні клітини рослин кукурудзи та їх інтеграції у ядерний геном. Вже визначаються експланти кукурудзи, які містять апікальну меристему, з компетентних до Agrobacteriumопосередкованої трансформації клітин якої за певних умов культивування in vitro може реалізувалися морфогенетичний потенціал шляхом прямого і непрямого органогенезу. Зокрема, апекси пагонів розміром 1,0×0,3 мм [8], апікальна меристема розміром 3-4 мм [9], ембріогенний калюс отриманий з сегментів подовж розщепленої вузлової зони пагонів 7-10-денних пагонів [10]. Тобто з'являються передумови стандартизації методу. Це здійснюється за допомогою варіювання складу живильних середовищ, компонентів середовищ інокуляції, умов пророщування зернівок та селекції трансформованих пагонів. Задачею корисної моделі є удосконалення системи методів генетичної трансформації in vitro, спрямованої на прискорене економічно вигідне отримання трансгенних рослинрегенерантів господарсько-цінних інбредних ліній кукурудзи вітчизняної селекції. Суть корисної моделі полягає у застосуванні живильного середовища, в якому за короткий термін шляхом прямого органогенезу здійснюється регенерація рослин з клітин поперечно розрізаних сегментів (1-2 мм) вузлової області пагонів 7-8-денних проростків кукурудзи, інокульованих Agrobacterium tumefaciens. Приклад реалізації корисної моделі: При удосконаленні способу Agrobacterium-опосередкованої трансформації кукурудзи in vitro використовували інбредні лінії кукурудзи: 250, 390, 1544, Л1552, 1563, 1652 (селекції Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ). Процедуру трансформації проводили штамом LBA4404, який містив плазміду рВі2Е з дволанцюговим РHК-супресором гена проліндегідрогенази 1 Arabidopsis thaliana (pro I) та селективним геном nptІІ, отриманий від к.б.н. Кочетова А.В. (Інститут цитології і генетики Сибірського відділення РАН. м. Новосибірськ). Після поверхневої стерилізації зернівки пророщували протягом 7-8 діб на середовищі Мурасіге-Скуга [11] при 27 °C з 16-годинним фотоперіодом та освітленням 3-4 клк. Для підвищення доступності Agrobacterium tumefaciens до тотипотентних клітин апекса, компетентних до агробактеріальної інфекції, частину пагона вузлову зону і тканини, розташовані нижче і вище неї на – 0,5 см, розділяли поперечно на сегменти розміром 1-2 мм. Вони були первинними експлантати для генетичної трансформації. 1 UA 77323 U R 5 10 15 20 25 Суспензію клітин агробактерії нарощували у живильному бульйоні НІMEDIA REF М002, потім розводили у 5 разів модифікованим середовищем Гамбурга В5 [12], яке містило 2 мМ Na2S2O3 (оптична щільність при 600 нм = 0,5 оптичних одиниць) та інокулювали експланти 1 год. Кокультивання проводили протягом 2 діб в темряві при 27 °C на аналогічному агаризованому безвуглеводному середовищі. Індукцію пагоноутворення і ризогенез також здійснювали на модифікованому живильному середовищі В5 Гамборга, яке містило сорбітол без додавання сахарози та 8,0 мг/л кінетину, 0,4 мг/л нафтилоцтової кислоти (В5п). Для елімінації агробактерій додавали антибіотик цефотаксим в кінцевій концентрації 500 мг/л. Для молекулярно-генетичного аналізу брали рослинирегенеранти, які витримували селективну концентрацію канаміцин сульфату. Селекцію проводили після індукції ризогенезу протягом 2-3-х пасажів (по 12-14 діб). Наявність цільових на селективних генів визначали ПЛР-методом, використовуючи наступні праймери: 1 - до фрагменту першого екзону гена pro I 5'-AACAA-ACTGG-ATCCG-GCGAT-CTTAC-3' (F) і 5'-GAGAT-GTTGG-TCTAG-ATTTG-GCAGC-3' (R), розмір амплікону - 545 п.о.; 2 - до фрагменту, що включає перший екзон і інтрон гена prol, -5'-AACAA-ACTGG-ATCCGGCGAT-CTTAC-3' (F) і 5'-ATTAA-GCTTT-CGAAC-CAAAC-AAGT-3' (R), розмір амплікону - 700 п.о.; 3 - до фрагменту гена nptII-5'-CCTGA-ATGAA-CTCCA-GGACG-AGGCA-3' (F) и 5'-GCTCTAGATC-CAGAG-TCCCG-CTCAG-AAG-3' (R), розмір амплікону - 649 п.о.; 4 - до фрагменту гена virC Ті-плазміди штаму LBA4404 5'-АТС ATT TGT AGC GAC Т-3' (F) і 5'-AGCTC-A AACC-TGCTT-C-3' (R), розмір амплікону - 730 п.о. Праймери були підібрані згідно з рекомендаціями Кочетова А.В. [13]. Sawada H. та ін. [14] ДНК із листків канаміцин-стійких та контрольних рослин виділяли з використанням "ДНКсорб-С" ("Amplisens", Россия). Молекулярно-генетичний аналіз проводили на ампліфікаторі R Mastercycler personal 5332 (Eppendorf). Загальна схема умов ПЛР: преденатурація – 4 хв, 94 °C, ампліфікація 35 циклів (денатурація, гібридизація, синтез), кінцева елонгація - 10 хв. 72 °C. Умови ампліфікації: Ген virC nptll екзон pro l інтрон pro I Денатурація, гібридизація, синтез 94 °C-30 с. 57 °C-1 хв., 72 °C-15 с. 94 °C-30 с, 53 °C-30 с., 72 °C – 30 с. 94 °C – 30 с. 53 °C – 30 с, 72 °C-35 c. 94 °C-30 с. 55 °C – 30 с, 72 °C45 с. 30 35 40 45 50 Електрофорез ДНК проводили в 1,2 %- або 0,8 %-ному агарозному гелі при напруженості 5 В/см у 0,5×ТБЕ буфері з додаванням етидію броміду кінцевої концентрації 0,5 мкг/мл [15]. Як маркер застосовувались Lambda DNA/Hindlll або DNA LadderMix (Fermentas). При культивуванні на середовищі В5п регенерація здійснювалася шляхом прямого органогенезу (рис. 1). Індукція перших регенерантів відбувалася на 10-14 добу, в окремих випадках спостерігали 2-3 пагона на експлант, які могли показувати різну стійкість до селективної концентрації канаміцин сульфату. Середня частота регенерації канаміцин-стійких рослин варіювала від 15 % до 17 % та достовірно не відрізнялася для усіх проаналізованих генотипів. Ризогенез здійснювався на цьому ж середовищі через короткий період часу після індукції пагоноутворення. Це знижує рівень самоклональної мінливості трансформованих рослин-регенерантів, тривалість культивування in vitro та собівартість робіт. Для підвищення частоти регенерації селекцію на стійкість до летальних концентрацій антибіотику доцільно проводити після індукції пагоноутворення. На рис. 2 представлені результати відбору рослин кукурудзи, стійких до канаміцин сульфату. ПЛР-аналіз ДНК канаміцин-стійких рослин-регенерантів з використанням праймерів до першого екзону і інтрону дволанцюгового РНК-супресора гена проліндегідрогенази 1 арабідопсиса та селективного гена, показав наявність цільового гена у тотальній ДНК листків R0-рослин кукурудзи (рис. 3). Відсутність агробактеріальних домішок підтверджена результатами ПЛР-аналізу (рис. 4). 2 UA 77323 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Інтродукцію Т-ДНК та її інтеграцію в геном здійснювали у відсутності активатора VirA-VirG двокомпонентної регуляторної системи - ацетосирінгону з використанням лише високої концентрації тіосульфату натрію - одного з полових компонентів, який як встановлено Olhoft і співав. [16] здатен підвищувати частоту генетичної трансформації. Крім того, цей фактор згідно з нашими даними [17] може стимулювати індукцію пагоноутворення. Джерела інформації: 1. Sticklen М.В., Oraby H.F. Shoot apical meristem: a sustainable explant for genetic transformation of cereal crops // In Vitro Cell Dev. Biol. - Plant.-2005. - V. 41, N 3-P. 187-200. 2. Frame В., Main M, Schick R., Wang K. Genetic transformation using maize immature zygotic embryos / Thorpe T.A., Yeung E.C. (eds) Plant Embryo Culture. Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. (Springer Science-Business Media 2011) - V. 710. - P. 327-341. 3. Zhong H., San В., Warkentin D. et al. The competence of maize shoot meristems for integrative transformation and inherited expression of transgenes // Plant Physiol.-1996. -V. 110. - P. 1097-1107. 4. Frame B.R., Shou H., Chikwamba R. K. et al. Agrobacterium-tumerfaciens-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system // Plant Physiol.-2002-V. 129. - P. 13-22. 5. Ishida Y. Hiei Y., Komari T. Protocol. Agrobacterium-mediated transformation of maize // Nature protocols.-2007. - V. 2. N 7. - P. 1614-1621. 6. Данилова С.А., Долгих Ю.И. Условия, необходимые для эффективной агробактериальной трансформации Agrobacterium tumefaciens эмбриогенного каллуса кукурузы // Физиология растений.-2005. - Т. 25, № 4. - С. 600-608. 7. Shou Н., Frame В.R., Whitham S.A., Wang К. Assessment of transgenic maize events produced by particle bombardment or Agrobacteiium-mediated transformation // Molecular Breeding.2004. - V 13. N 2-P. 201-208. 8. Gould J., Devey M., Hasegawa O. et al. Transformation of Zea mays L. using Agroibacterium tumerfaciens and the shoot apex // Plant Physiol.-1991. - V. 95. - P. 426-434. 9. Sairam R.V., Parani M., Franklin G. et al. Shoot meristem: an ideal explant for Zea mays L. transformation // Genome.-2003. - V. 46. - P. 323-329. 10. Sidorov V., Gillertson L., Addae P., Duncan D. Agrohacterium-mediated transformation of seedling-derived maize callus // Plant Cell Rep.-2006. - V. 25. - P. 320-328. 11. Murashighe Т., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant.-1962. - V. 15. - P. 473 497. 12. Gamborg J.L, Miller R.A., Ojima K. Nutrient requirement of suspension cultures of soybean roots // Experim. Cell Res. 1968. - N 50. - P. 151-158. 13. Кочетов Л.В. Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несучих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогeназы / А.В. Кочетов, С.Е. Титов, Я.С. Колодежная и др. // Генетика.-2004. - Т. 40, № 2. - С. 282-285. 14. Sawada Н. PCR Detection of Ті and Ri Plasmids from Phytopathogenic Agrobacterium Strains / H. Sawada, H. Ieki. I. Matsuda // Applied and environmental microbiology.-1995. - Vol. 61, № 2-P. 828-831. 15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984.-480 с. 16. Olhoft P.M., Lin К., Galbraith J. et al. The role of thiol compounents in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells // Plant Cell Rep.-2001. V. 20. - P. 731-737. 17. Комисаренко А.Г., Михальская С.И., Малина А.Э. и др. Оптимизация метода индукции регенерации in vitro инбредных линий и гибридов подсолнечника // Физиол. биохим. культ, раст.-2009. - Т. 41, № 3. - С. 255-261. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб отримання трансгенних рослин-регенерантів кукурудзи методом Agrobacteriumопосередкованої трансформації, який полягає у інокуляції поперечно розрізаних сегментів вузлової зони пагонів 7-8-денних проростків господарсько-цінних інбредних ліній суспензією клітин обеззброєного штаму A. tumefаciens, регенерації пагонів, їх укорінення та селекції рослин-регенерантів з цільовим трансгеном, який відрізняється тим, що регенерацію пагонів і їх укорінення здійснювали на модифікованому середовищі В5 Гамборга одного складу без сахарози з додаванням нового компоненту - сорбітолу, а інокуляцію проводили з додаванням до модифікованого регенераційного середовища тіосульфату натрію без ацетосирінгону, що 3 UA 77323 U створило можливість суттєво прискорити процедуру отримання трансгенних рослинрегенерантів шляхом прямого органогенезу ряду елітних інбредних ліній вітчизняної селекції. 4 UA 77323 U 5 UA 77323 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6