Спосіб підвищення виходу зелених рослин-регенерантів ячменю у культурі пиляків in vitro

Спосіб підвищення виходу зелених рослинрегенераторів ячменю в культурі пиляків in vitro, що включає культивування пиляків на штучному живильному середовищі і отримання з них калусів, ембріоїдів та рослин-регенерантів, який відрізняється тим, що як гелеутворюючий компонент штучного живильного середовища використовують крохмаль природного мутанту кукурудзи su2 з вмістом амілози 40-45% в концентрації 65г/л. (19) (21) u200900757 (22) 02.02.2009 (24) 25.06.2009 (46) 25.06.2009, Бюл.№ 12, 2009 р. (72) БІЛИНСЬКА ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА, ТИМЧУК СЕРГІЙ МИХАЙЛОВИЧ, ДУЛЬНЄВ ПЕТРО ГЕОРГІЄВИЧ, ДЕРЕБІЗОВА ОЛЬГА ЮРІЇВНА (73) ІНСТИТУТ РОСЛИННИЦТВА ІМ. В.Я. ЮР'ЄВА УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК 3 42192 порівняно з хімічно модифікованим крохмалем кількості гелеутворюючого компоненту. Недоліком прототипу є те, що після стерилізації в автоклаві попередньо розлитого у пробірки середовища значна частина клейстеру залишається на стінках пробірок при перенесенні їх у горизонтальне положення для застигання середовища, що ускладнює висаджування пиляків і подальше спостереження за культурою. У зв'язку з цим найбільш придатними культуральними посудинами для крохмалевмісного середовища є пластикові чашки Петрі одноразового використання іноземного виробництва, які мають істотно більшу вартість, ніж скляні пробірки вітчизняного виробництва. Метою запропонованої корисної моделі є розробка складу штучного живильного середовища для збільшення виходу гаплоїдів ячменю у культурі пиляків in vitro. Ця мета досягається шляхом заміни гелеутворюючих компонентів - агар-агару [1, 2], хімічно модифікованих крохмалів [6] і крохмалю природного високоамілозного мутанту кукурудзи ае [7] крохмалем природного високоамілозного мутанту кукурудзи su2. За рахунок цього досягається зростання частоти індукції новоутворень, підвищення інтенсивності їх росту і збільшення частоти регенерації рослин, а також отримання середовища, яке придатне для розливу не лише у чашки Петрі, а й у пробірки, що зменшує трудові і фінансові витрати на отримання гаплоїдів ячменю у пиляковій культурі. Суть корисної моделі полягає в тому, що на відміну від аналогів і прототипу у запропонованій 4 корисній моделі як гелеутворюючий компонент використовується кукурудзяний крохмаль природного походження з вмістом амілози 40-45%, виділений з зерна лінії-носія мутантного гену – su2. Важливими перевагами амілозного крохмалю su2 над прототипом є стимулювання регенерації рослин на тлі позитивного впливу на індукцію, ріст і розвиток новоутворень. Окрім цього, консистенція середовища після автоклавування дозволяє не лише розливати його у чашки Петрі, але й залишати у пробірках для застигання і подальшого культивування пиляків. Для отримання придатної для культивування експлантатів щільності гелю витрачається вдвічі менше крохмалів амілозного типу ае і su2, ніж хімічно модифікованого крохмалю [5, 6]. Гель, утворений з крохмалів високоамілозного типу su2 і ае, зберігає структуру без висихання і розтріскування впродовж 30 діб, що є достатнім терміном для індукції новоутворень. Порівняльний аналіз запропонованого способу з прототипом свідчить, що в якості гелеутворюючого компоненту штучного живильного середовища замість крохмалю природного мутанту кукурудзи ае з вмістом амілози 55-60% використовується крохмаль природного мутанту кукурудзи su2 з вмістом амілози 40-45% в концентрації 65г/л, який не зазнає хімічної модифікації. Порівняльні характеристики гелеутворюючих властивостей живильних середовищ на основі агар-агару, хімічно модифікованого крохмалю та крохмалю високоамілозних мутантів кукурудзи ае і su2 наведено в Таблиці 1. Таблиця 1 Гелеутворюючі властивості штучних живильних середовищ на основі різних полісахаридів Характеристики гелю 1 Колір Прозорість Термін викорисна основі агартання агару 2 на момент утворення гелю 15 діб 30 діб на момент утворення гелю 15 діб 30 діб 3 безбарвний молочно-білий молочно-білий молочно-білий безбарвний безбарвний молочно-білий молочно-білий молочно-білий молочно-білий молочно-білий молочно-білий прозорий непрозорий непрозорий непрозорий прозорий прозорий непрозорий непрозорий непрозорий непрозорий на момент утво- еластична, прурення гелю жна, без шпарин Структура 15 діб 30 діб Варіанти живильних середовищ на основі крох- на основі крохна основі хімічно малю природно- малю природномодифікованого го мутанту куку- го мутанту кукукрохмалю рудзи ае рудзи su2 4 5 6 еластична, пружна, без шпарин еластична, пружна, без шпарин непрозорий непрозорий еластична, пруеластична, пруж- еластична, пружна, без шпана, без шпарин жна, без шпарин рин мало еластична, еластична, прунепружеластична, пружна, без шпана,3шпаринами на жна, без шпарин рин поверхні мало еластична, еластична, прунепружна, з шпа- еластична, пружна, без шпаринами на поверх- жна, без шпарин рин ні та в товщі гелю 5 42192 6 Продовження таблиці 1 1 2 на момент утворення гелю Стабільність 15 діб 30 діб на момент утворення Водоутримуюча гелю здатність 15 діб 30 діб Вимоги до культуральних посудин 3 4 5 6 висока висока висока висока висока висока висока висока висока висока висока висока висока висока висока висока висока висока середня середня висока висока висока висока чашки Петрі, пробірки чашки Петрі, пробірки чашки Петрі чашки Петрі, пробірки За структурою, стабільністю та водоутримуючою здатністю гель з крохмалю природного мутанту кукурудзи su2 не поступається гелям, що отримані з агар-агару і крохмалю природного мутант кукурудзи ае і переважає гель, який отримано з хімічно модифікованого крохмалю. Живильне середовище, яке виготовлено згідно запропонованого способу, зберігає стабільну желеподібну структуру без висихання та розтріскування протягом 30 діб з моменту виготовлення, що є цілком достатнім терміном для індукції новоутворень в культурі пиляків in vitro. Для кращого розуміння опису корисної моделі наводяться конкретні приклади. Приклад 1 Приготування живильного середовища на основі крохмалю мутанту кукурудзи su2. Всі компоненти живильного середовища, окрім крохмалю, розчиняють в потрібних концентраціях у бідистильованій воді. Половину отриманого розчину переносять до окремої скляної колби або хімічного стакану і нагрівають до 50-60°С. До іншої половини розчину компонентів живильного середовища додають крохмаль з розрахунку 65г/л і ретельно перемішують до стану гомогенної суспензії. Суспензію тонкою цівкою переносять до нагрітого розчину компонентів живильного середовища і нагрівають суміш до температури кипіння при постійному перемішуванні. Отриманий клейстер негайно розливають по пробірках або колбах об'ємом 50-100см3 і піддають стерилізації в автоклаві при температурі 120 ± 2°С і тиску 78кПа протягом 20 хвилин. Стерилізований клейстер охолоджують до кімнатної температури і залишають для гелеутворення протягом 12 годин і далі використовують для отримання гаплоїдів ячменю. Приклад 2 Порівняльна оцінка морфогенетичного ефекту живильних середовищ з використанням різних гелеутворювачів у культурі пиляків in vitro ячменю. Для дослідження морфогенетичного ефекту гелеутворюючих речовин було використано лінію ДГОО-126, яка характеризується високою здатністю до андрогенезу in vitro. Рослини для отримання культури пиляків in vitro вирощували у польових умовах. Добирали колосся, яке містило пиляки з мікроспорами у се редній та пізній фазі розвитку. Попередню обробку колосся проводили, вміщуючи пагони у воду і витримуючи їх впродовж 5-6 діб при температурі +4°С у холодильнику. Асептичну культуру пиляків отримували за власною методикою [6]. Як контроль було використане розроблене нами для культивування пиляків ярого ячменю середовище NМSмод.2, яке містило макроелементи середовища N6 [8], мікроелементи середовища MS [9] і такі компоненти в мг/л: 2,4-Д - 2 (2,4дихлорфеноксіоцтова кислота); БАП (бензиламінопурин) - 0,5; В1 - 1; В6 і РР - по 0,5; гліцин - 2; аланін і пролін - 100; глутамін - 200; лактальбумін 300; міо-інозитол - 100; а також мальтозу - 90г/л; картопляний екстракт - 20%; картопляний крохмаль - 10г/л; агар-агар - 0,76% ("Difco", США). У відповідних дослідних варіантах агар-агар було замінено на хімічно модифікований крохмаль Д-2 [5] у концентрації 120г/л і кукурудзяні крохмалі, отримані з зерна природних мутантів ае і su2 у концентрації 65 г/л. Чашки Петрі і пробірки з висадженими на штучне живильне середовище пиляками вміщували у термостат і інкубували при температурі 24°С впродовж 30-35 діб. Новоутворення - калюс і ембріоїди - пересаджували на регенераційне живильне середовище Р: мінеральна основа MS, вітаміни В1, В6 і РР - по 0,5мг/л; глутамін, міо-інозитол по - 100мг/л; сахароза - 30г/л; агар-агар - 0,8%. Регенерацію проводили при освітленні 4-5клк, фотоперіоді 16 годин, температурі 22-24°С. Спостереження проводили, починаючи з 20-ї доби культивування пиляків in vitro. При цьому підраховували пиляки, на поверхні яких утворилася принаймні одна макроструктура (калюс, ембріоїд), і рослини-регенеранти як на індукційному, так і на регенераційному середовищі. Ефективність експериментального андрогенезу in vitro оцінювали за такими показниками (у відсотках від загальної кількості культивованих пиляків): - кількість пиляків з новоутвореннями; - кількість зелених рослин-регенерантів; Експериментальні дані оброблено за допомогою дисперсійного аналізу [10]. 7 42192 Результати дослідження впливу гелеутворюючих компонентів штучних живильних середовищ на процеси індукції новоутворень і регенерації рослин у культурі пиляків in vitro ячменю наведено у таблиці 2. Ці оцінки свідчать, що найвищу кількість пиляків з новоутвореннями і зелених рослинрегенерантів було отримано при застосуванні живильного середовища на основі крохмалю високоамілозного мутанту кукурудзи su2. 8 Запропонований спосіб одержання гаплоїдів ячменю в культурі пиляків in vitro дозволяє підвищити частоту морфогенних новоутворень - ембріоїдів і ембріогенного калюсу, збільшити частоту регенерації рослин, поліпшити структурномеханічні властивості штучного живильного середовища, знизити вартість та підвищити екологічну безпечність виробництва гелеутворювачів для культури тканин. Таблиця 2 Результативність культури пиляків in vitro у лінії ячменю ДГОО-126 з високою андрогенною здатністю в залежності від гелеутворюючого компоненту живильного середовища Варіанти живильних середовищ на основі агар-агару на основі хімічно модифікованого крохмалю на основі крохмалю природного мутанту кукурудзи ае на основі крохмалю природного мутанту кукурудзи su2 НІР05 Висаджено пиляків, шт. 352 Отримано пиляків з новоутвореннями шт. % 147 41,76 зелених рослин шт. 90 % 25,57 345 96 27,82 108 31,30 504 242 48,02 179 35,51 350 224 64,00 187 53,42 6,81 Джерела інформації: 1. Clapham P. Haploid Hordeum plants from anthers in vitro // Z. Pflanzenzucht. -1973.-69.-P.142155. 2. Hunter C.P. Plant regeneration method //Europian patent application. - 1987. №0245892.А2.-Р.8. 3. Kohlenbach H.W., Wemike W. Investigation on the inhibitory effect of agar and the function of active carbon in anther culture // Ztsch. PflanzenphysioL1978. - v.86, N5. - P.463-472. 4. Sorvari S. The effect of starch gelatinized nutrient media in barley anther culture // Annales Agr. Finnie. - 1986. - v.25. - P.127-133. 5. Деклараційний патент на винахід 52031, Україна, МПК7, С08В31/02, A01N57/00, A01N59/00, А01С1/06. Спосіб отримання полімерних матеріалів / П.Г. Дульнєв (Україна), C.I. Кондратенко (Україна), Т.В. Чернишенко (Україна), В.П. Мірошниченко (Україна), Т.В. Івченко (Україна), С.А. Гончарова (Україна). - Заявка №u2002010237; Заявл. 21.09. 2002; Опубл. 16.12.02, Бюл. №12. 6. Белинская Е.В., Дульнєв П.Г. Модифицированный крахмал ДКК мод. как компонент питате Комп’ютерна верстка А. Рябко 6,64 льной среды для получения гаплоидов ячменя в культуре пыльников // Физиология и биохимия культурных растений. -2007. - т.39, №2. - С. С.136-143. 7. Патент 34859 Україна, МПК А01G7/00, С12N5/00. Спосіб одержання гаплоїдів ячменю у культурі пиляків in vitro / О.В Білинська (Україна), С.М. Тимчук (Україна), П.Г. Дульнєв (Україна), О.Ю. Деребізова (Україна); Інститут рослинництва ім. В.Я. Юр'єва. - Заявка №u200803639; Заявл. 21.03.08; Опубл. 26.08.08, Бюл. № 16. - 4 с. 7. Білинська О.В. Генотипові особливості індукції гаплоїдів ячменю (H. vulgare L.) методом культури пиляків in vitro: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. - Харків: 1997. - 19с. 8. Chu C.-C. The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops // Plant Tissue Culture: Proc. Symp. - Peking: Science Press, 1978. P.43-45. 9. Murashige Т., Skoog F. A rivised medium for growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - v.15. - P.473-497. 10. Плохинский Н.А. Биометрия. - M.: Изд. Московского университета, 1964.- 367с. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601