Спосіб оптимізації виділення днк мікобактерій з проб мокротиння хворого на легеневий туберкульоз для проведення молекулярно-генетичного дослідження

Реферат: Спосіб оптимізації виділення ДНК мікобактерій з проб мокротиння хворого на туберкульоз легень для проведення молекулярно-генетичного дослідження включає забір мокротиння, додавання до нього муколізину та доведення розчину до однорідного стану. З мокротиння хворого відбирають дослідний матеріал у кількості 1-1,5 мл, після чого поміщують його у центрифужну пробірку об'ємом не менше 10 мл, додають скляну кульку діаметром 3-4 мм для ретельного розбивання білкових фібрил мокротиння, переносять отриману пробу в термостат з температурою 37 °C на 45-50 хв, періодично, через кожні 3-5 хв, збовтують вміст пробірки, потім суміш центрифугують протягом 15-20 хв при 1500 об/хв, видаляють надосад, додають до залишеного в пробірці осаду 300-350 мкл лізуючого розчину, ресуспендують розчин і переносять його до робочої пробірки для виділення ДНК M.Tuberculosis для подальшого молекулярно-генетичного дослідження. UA 84490 U (54) СПОСІБ ОПТИМІЗАЦІЇ ВИДІЛЕННЯ ДНК МІКОБАКТЕРІЙ З ПРОБ МОКРОТИННЯ ХВОРОГО НА ЛЕГЕНЕВИЙ ТУБЕРКУЛЬОЗ ДЛЯ ПРОВЕДЕННЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ UA 84490 U UA 84490 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель відноситься до медицини, а саме фізіопульмонології, і може бути застосована для підготовки проб мокротиння хворого на туберкульоз для проведення молекулярно-генетичного дослідження. В останні роки для діагностики захворювання на туберкульоз використовують полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), висока чутливість якої дозволяє виявити в дослідному матеріалі поодинокі клітини або фрагменти ДНК. Метод ПЛР є високо специфічним, дозволяє диференціювати різні форми туберкульозу навіть при негативних результатах мікробіологічних досліджень. Проте визначення чутливе лише за наявності в середньому не менше 100 ДНКкопій у 5 мкл зразка із виділеною ДНК. Тому багато досліджень направлені саме на удосконалення процесу отримання геномної ДНК М. tuberculosis у достатній кількості для подальшого проведення молекулярно-генетичних досліджень. Найбільш близьким до запропонованого технологічного рішення є розробка, в якій готовлять мокротиння хворого шляхом розбавлення 100 мкл мокротиння муколізином у співвідношенні 1:5, підігріванням розбавлених проб при температурі 37 °C, 20-30 хв до повного розчинення білкових фібрил та подальшим виділення ДНК (1). Недоліком цього методу є низька результативність подальшої молекулярно-генетичної діагностики, що спричинена недостатньою кількістю виділеної ДНК через обмежений об'єм дослідного матеріалу (100 мкл) та, як наслідок, малу концентрацію М.tuberculosis. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалення способу оптимізації виділення ДНК мікобактерій з проб мокротиння хворого на легеневий туберкульоз для проведення молекулярно-генетичного дослідження шляхом додавання муколізину до 1-1,5 мл мокротиння хворого і подальшої роботи з осадом після центрифугування суміші за заявленим способом, що дозволить збільшити число мікобактерій на одиницю дослідного матеріалу, що підвищує чутливість і точність молекулярно-генетичної діагностики наявності мікобактерій в мокротинні. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з корисною моделлю, з мокротиння хворого відбирають дослідний матеріал у кількості 1-1,5 мл, після чого поміщують його у центрифужну пробірку об'ємом не менше 10 мл, додають скляну кульку діаметром 3-4 мм для ретельного розбивання білкових фібрил мокротиння, переносять отриману пробу в термостат з температурою 37 °C на 45-50 хв, періодично, через кожні 3-5 хв, збовтують вміст пробірки, потім суміш центрифугують протягом 15-20 хв при 1500 об/хв, видаляють надосад, додають до залишеного в пробірці осаду 300-350 мкл лізуючого розчину, ресуспендують розчин і переносять його до робочої пробірки для виділення ДНК M.Tuberculosis для подальшого молекулярно-генетичного дослідження. Спосіб виконується наступним чином У пластикові центрифужні пробірки об'ємом 10 мл розміщують 1-1,5 мл мокротиння, залежно від об'єму отриманого від хворого, додають муколізин у співвідношенні 1:5, занурюють скляну кульку для кращого розбивання білкових фібрил, розміщують проби в термостаті при температурі 37 °C на 45-50 хв, періодично збовтуючи до повного розчинення білкових фібрил, далі проби центрифугують протягом 15 хв при 1500 об/хв, надосад відбирають, осад переносять у пробірки типу "Епендорф" та проводять подальше виділення ДНК M.tuberculosis з використанням комерційного набору "ДНК-сорб-Б" ("Амплісенс", Москва), згідно інструкції. Проведений аналіз результату генотипування M.tuberculosis виявив наступне. Частота виділення ДНК з проб мокротиння (МБТ + за результатами мікроскопії) за методикою фірми "Амплісенс" методом (21/38 проб, 55,26 %,) достовірно нижче (р