Антитіло, яке специфічно зв’язується з нейропіліном-2в (nrp2b)

Реферат: UA 99292 C2 (12) UA 99292 C2 Винахід належить до антитіла, яке специфічно зв'язується з нейропіліном-2В (Nrp2В) або його функціонального антигензв'язувального фрагменту (антитіла, позначеного як YW68.4.2 або YW68.4.2.36), композиції, що його містить, та способу інгібування міграції ендотеліальних клітин лімфатичних судин. UA 99292 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується антагоністів нейропіліну-2 (Nrp2), зокрема, антитіл проти Nrp2 та їх використання для профілактики і лікування метастазів пухлини. У цей час точно встановлено, що ангіогенез бере участь у патогенезі ряду розладів. Такими розладами є солідні пухлини і метастази, атеросклероз, ретролентальна фіброплазія, гемангіоми, хронічне запалення, внутрішньоочні неоваскулярні захворювання, такі як проліферуючі ретинопатії, наприклад, діабетична ретинопатія, вікова дегенерація жовтої плями (AMD), неоваскулярна глаукома, імунне відторгнення трансплантованої тканини рогівки та інших тканин, ревматоїдний артрит і псоріаз Folkman et al., J. Biol, Chem., 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); і Garner A., “Vascular diseases”, In: nd Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2 Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710. У випадку росту пухлини ангіогенез, очевидно, є ключовим чинником, що відіграє важливу роль у переході гіперплазії в неоплазію і в забезпеченні поживними речовинами, необхідними для росту і метастазування пухлини. Folkman et al, Nature 339:58 (1989). На відміну від нормальних клітин, для росту пухлинних клітин і для їхньої автономної проліферації необхідна неоваскуляризація. Пухлини звичайно утворюються з однієї аберантної клітини, яка може проліферувати лише до певного розміру, що становить кілька кубічних міліметрів, що визначається її відстанню від капілярного русла, і така клітина може залишатися “сплячою”, тобто може не піддаватися подальшому росту і дисемінації протягом тривалого періоду часу. Потім деякі пухлинні клітини переключаються на ангіогенний фенотип із наступною активацією ендотеліальних клітин, які проліферують і дозрівають, утворюючи нові капілярні кровоносні судини. Ці знову утворені кровоносні судини забезпечують не тільки постійний ріст первинної пухлини, але також дисемінацію і реколонізацію метастатичних пухлинних клітин. Відповідно до цього спостерігається зв’язок між щільністю мікросудин у зрізах пухлини і виживаністю хворих раком молочної залози, а також із пухлинами деяких інших типів. Weidner et al., N. Engl. J. Med 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340:145-146 (1992). Точний механізм регуляції переключення ангіогенезу поки ще добре не вивчений, однак очевидно, що неоваскуляризація пухлинної маси обумовлена сумарним балансом безлічі стимуляторів та інгібіторів ангіогенезу (Folkman Nat. Med. 1(l):27-31 (1995)). У цей час вважають, що у випадку солідних пухлин переважна більшість, а за оцінкою фахівців 90% летальних випадків пов’язані з метастазами (Gupta and Massague, Cell 127, 679695 (2006)). Складний процес утворення метастазів складається з ряду окремих стадій, що включають відділення пухлинних клітин від первинної пухлини, інтравазацію пухлинних клітин у лімфатичні або кровоносні судини і екстравазацію і ріст пухлинних клітин у вторинних ділянках. Аналіз регіональних лімфовузлів при пухлинах багатьох типів дозволяє припустити, що лімфатична судинна сітка є важливим каналом дисемінації злоякісних пухлин людини. Крім того, майже при всіх карциномах присутність пухлинних клітин у лімфовузлах є найважливішим негативним прогностичним фактором. Хоча раніше вважалося, що такі метастази утворюються в результаті проходження злоякісних клітин по лімфатичним судинам, що вже існують біля пухлин, однак недавно проведені експериментальні дослідження і звіти з клінічних патологій(описані в публікації Achen et al., Br. J. Cancer 94 (2006), 1355-1360 і Nathanson, Cancer 98,413-423 (2003)) дозволяють припустити, що лімфангіогенез може бути індукований солідними пухлинами і, тим самим, може стимулювати поширення цих пухлин. Ці та інші недавно проведені дослідження дозволяють припустити, що спрямований вплив на лімфатичні судини і лімфангіогенез може бути терапевтичною стратегією обмеження розвитку метастазів раку, і така стратегія повинна забезпечувати значний сприятливий ефект у великої кількості пацієнтів. VEGFC, який є членом сімейства факторів судинних ендотеліальних клітин (VEGF), являє собою один із найбільш добре вивчених медіаторів розвитку лімфатичних судин. Було виявлено, що надекспресія VEGFC у пухлинних клітинах стимулює пухлинний лімфангіогенез, що призводить до посилення розвитку метастазів у регіональних лімфовузлах (Karpanen et al., Faseb. J.20, 1462-1472 (2001); Mandriota et al. EMBO J. 20, 672-682 (2001); Skobe et al., Nat. Med. 7, 192-198 (2001); Stacker et al., Nat. Rev. Cancer 2, 573-583 (2002); Stacker et al., Faseb. J. 16, 922-934 (2002)). Експресія VEGFC також корелює з пухлинним лімфангіогенезом і метастазами в лімфовузлах при різних злоякісних захворюваннях людини (як описано в публікації Achen et al., 2006, див. вище). Крім того, було виявлено, що блокада VEGFC-опосередкованої передачі сигналу призводить до пригнічення пухлинного лімфангіогенезу і до розвитку метастазів у лімфовузлах у мишей (Chen et al., Cancer Res 65, 9004-9011 (2005); He et al., J. Natl Cancer Inst 94, 8190825 (2002); Krishnan et al., Cancer Res 63, 713-722 (2003); Lin et al., Cancer Res 65, 69016909 (2005)). 1 UA 99292 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відомо, що VEGFC зв’язується принаймні із двома рецепторами, що стосуються сімейства рецепторів клітинної поверхні, такими як рецептори тирозинкінази VEGF і рецептори нейропіліну (Nrp). VEGFC, один із трьох рецепторів VEGF, може зв’язуватися з VEGFR2 і VEGFR3, що призводить до димеризації цього рецептора (Shinkai et al., J. Biol Chem 273, 31283-31288 (1998)), до активації кінази і до його автофосфорилування (Heldin, Cell 80, 213-223 (1995); Waltenberger et al., J. Biol Chem 269, 26988-26995 (1994)). Фосфорилований рецептор індукує активацію безлічі субстратів, що призводить до ангіогенезу і лімфангіогенезу (Ferrara et al., Nat. Med. 9, 669-676 (2003)). Сімейство нейропілінів (Nrp) складається із двох гомологічних білків, нейропіліну-1 (Nrp1) і нейропіліну-2 (Nrp2). З Nrp2, крім рецепторів VEGF, також зв’язується VEGFC, що був спочатку ідентифікований як рецептор семафорину класу 3 і медіатор регуляції дії аксонів (Favier et al., Blood 108, 1243-1250 (2006); Soker et al., J. Cell Biochem. 85, 357-368 (2002)). Існує безліч даних, що вказують на участь Nrp2 у розвитку судинної і лімфатичної систем. У гомозиготних мутантів за Nrp2 було показано значне зниження кількості дрібних лімфатичних судин і капілярів у пренатальному періоді (Yuan et al., Development 129, 4797-4806 (2002)). Крім того, серйозні порушення і дефекти, що призводять до загибелі ембріона, що спостерігали в мутантних мишей, гомозиготних за Nrp1, підсилюються в результаті втрати функції Nrp2, що призводить до раннього летального кінця (Takashima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 3657-3662 (2002)). Однак роль Nrp2 у модуляції біологічних процесів у кровоносних і лімфатичних судинах у дорослих і, зокрема, його роль у розвитку метастазів поки ще не зрозуміла. Нейропіліни (Nrp) мають короткі внутрішньоклітинні домени, однак невідомо, чи мають вони яку-небудь ферментативну активність або активність в передачі сигналу. Було висловлене припущення, що функція Nrp полягає в посиленні передачі сигналу VEGFR за рахунок підвищення рівня зв’язування рецептора VEGF з лігандом (Favier et al., 2006, див. вище; Soker et al., 2002, див. вище). Крім того, було виявлено, що sema3F, семафориновий ліганд Nrp2, модулює поведінку ендотеліальних клітин in vitro і in vivo (Bielenberg et al., J. Clin. Invest. 114, 1260-1271 (2004); Favier et al., Blood 1243-125O3 (2006)). Однак повідомлення, що з’явилися недавно, дозволяють висловити інше припущення, а саме, що Nrp можуть функціонувати незалежно від рецепторів VEGF, або семафорин діє як модулятор міграції ендотеліальних клітин (EC) (Murga et al., Blood 105, 1992-1999 (2005); Pan et al., Cancer Cell 11, 53-67 (2007); Wang et al., J Biol Chem 278, 48848-48860 (2003)). Антитіла, що нейтралізують VEGF, пригнічують ріст різних пухлинних клітинних ліній людини в “голих” мишей (Kim et al, Nature 362:841-844 (1993); Warren et al, J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995); Borgström et al, Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); Melnyk et al, Cancer Res. 56:921-924 (1996)), а також інгібують внутрішньоочний ангіогенез у моделей з ішемічною ретинопатією (Adamis et al, Arch. Ophthalmol 114:66-71 (1996)). Тому моноклональні антитіла проти VEGF та інші інгібітори дії VEGF є перспективними кандидатами для лікування пухлин і різних внутрішньоочних неоваскулярних захворювань. Такі антитіла описані, наприклад, в EP 817648, опублікованому 14 січня 1998; і в заявках WO98/45331 і WO98/45332, опублікованих 15 жовтня 1998. Одне з таких антитіл проти VEGF, а саме, бевацизумаб був дозволений Управлінням з контролю за якістю харчових продуктів, медикаментів і косметичних засобів (FDA) для використання в комбінації з хіміотерапією для лікування метастазуючого раку прямої та ободової кишки (CRC) і недрібноклітинного раку легенів (NSCLC). У цей час проводиться велика кількість клінічних випробувань із застосування бевацизумабу для лікування різних злоякісних пухлин. Фахівцям відомі також і інші антитіла проти VEGF і антитіла проти Nrp1, які описані, наприклад, у публікаціях Liang et al., J. Mol. Biol. 366, 815-829 (2007); Pan et al., Cancer Cell 11, 53-67 (2007; і Liang et al., J. Biol. Chem. 281, 951-961 (2006)). Даний винахід ґрунтується, принаймні частково, на експериментальних даних, одержаних для високоафінного антитіла, що блокує функцію Nrp2. Результати, одержані для цього антитіла, показали, що Nrp2 відіграє певну роль у модуляції міграції лімфатичних ендотеліальних клітин (LEC), і що його функція виходить за межі раніше приписуваної їй ролі підсилювача активації рецептора VEGF. Крім того, одержані результати продемонстрували, що блокування Nrp2 призводить до інгібування лімфангіогенезу і значного зниження метастазів у лімфовузлах і дистальних органах. В одному з аспектів даний винахід стосується способу інгібування міграції ендотеліальних клітин лімфатичних судин, що включає введення ссавцеві, за необхідності, ефективної кількості антагоніста нейропіліну-2 (Nrp2). 2 UA 99292 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому аспекті даний винахід стосується способу інгібування пухлинного лімфангіогенезу, що включає введення ссавцеві з пухлиною ефективної кількості антагоніста нейропіліну-2 (Nrp2). В іншому аспекті даний винахід стосується способу інгібування метастазів пухлини, що включає введення ссавцеві з пухлиною ефективної кількості антагоніста нейропіліну-2 (Nrp2). У всіх варіантах винаходу переважним ссавцем є людина, така як хворий зі злоякісною пухлиною, в якого можуть бути діагностовані метастази, або який може мати ризик розвитку метастазів. В одному з варіантів винаходу злоякісна пухлина вибрана із групи, що складається з карциноми, лімфоми, бластоми, саркоми і лейкозу. В іншому варіанті винаходу злоякісна пухлина вибрана із групи, що складається із плоскоклітинного раку, дрібноклітинного раку легенів, недрібноклітинного раку легенів, аденокарциноми легенів, плоскоклітинної карциноми легенів, перитонеального раку, гепатоцелюлярного раку, раку шлунка, раку шлунково-кишкового тракту, раку підшлункової залози, гліобластоми, раку шийки матки, раку яєчника, раку печінки, раку сечового міхура, гепатоми, раку молочної залози, раку товстої кишки, раку прямої та ободової кишки, карциноми ендометрію або матки, карциноми слинних залоз, раку нирок або ренального раку, раку печінки, раку передміхурової залози, раку вульви, раку щитовидної залози, карциноми печінки і раку голови і шиї різних типів, В-клітинної лімфоми, хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL); гострого лімфобластного лейкозу (ALL); волосато-клітинного лейкозу; хронічного мієлобластного лейкозу; лімфопроліферативного розладу після трансплантації (PTLD), патологічної проліферації судин, пов’язаної з факоматозом, набряків, пов’язаних із пухлинами головного мозку, і синдрому Мейгса. У ще одному варіанті винаходу В-клітинна лімфома вибрана із групи, що складається з низькозлоякісної/фолікулярної не-ходжкінської лімфоми (NHL); дрібноклітинної лімфоцитарної (SL) NHL; NHL середньої стадії диференціювання/фолікулярної NHL; дифузійної NHL середньої стадії диференціювання; високозлоякісної імунобластної NHL; високозлоякісної лімфобластної NHL; високозлоякісної дрібноклітинної недиференційованої NHL; генералізованої NHL; лімфоми клітин кори головного мозку; лімфоми, пов’язаної зі СНІД; і макроглобулінемії Вальденстрема. Антагоністами Nrp2 можуть бути, але ними не обмежуючись, антитіло проти Nrp2, включаючи антитіла проти Nrp2B і Nrp2A, такі як, наприклад, антитіла YW68.4.2, YW68.4.2.36, YW126.20, та їхні фрагменти і варіанти, такі як афінно-зрілі варіанти. В іншому аспекті даний винахід стосується антитіла проти Nrp2B, що містить послідовність варіабельної ділянки важкого і/або легкого ланцюга антитіла, вибраного із групи, що складається з YW68.4.2, YW68.4.2.36, і його фрагменту або варіанту. У ще одному аспекті даний винахід стосується антитіла проти Nrp2A, що містить послідовності варіабельних ділянок важкого і/або легкого ланцюга YW126.20, або його фрагменту або варіанту. Даний винахід також стосується композиції, що містить антитіло за будь-яким із пп. 33-38 формули винаходу в суміші з фармацевтично прийнятним носієм. В іншому аспекті даний винахід стосується фармацевтичної композиції для профілактики або лікування метастазів пухлин, що містить ефективну кількість антагоніста Nrp2 у суміші з фармацевтично прийнятним носієм. В інших аспектах даний винахід стосується антагоністів Nrp2, які можуть бути використані для профілактики або лікування метастазів, і застосування антагоністів Nrp2, таких як антитіла проти Nrp2, для профілактики або лікування метастазів пухлини. B B Фігура 1. Характеристика моноклональних антитіл (mAb) проти Nrp2 (анти-Nrp2 mAb). (A) Схематично представлена локалізація Sema- і VEGF-зв’язувальної ділянки на Nrp2 стосовно В ділянок епітопів для антитіла проти Nrp2 . (B) ELISA-аналіз, що демонструє зв’язування В антитіла проти Nrp2 з ECD hNrp2 (заштриховані квадрати) і доменами B1-B2 hNrp2 (заштриховані кільця), але не з ECD hNrp1 (незаштриховані квадрати) або з доменами A1-A2 hNrp2 (незаштриховані кільця). (C) Блокування зв’язування VEGFC із Nrp2 під дією антитіла B проти Nrp2 . mAb у зростаючих кількостях попередньо інкубували в планшетах, покритих ECD Nrp2 людини (5 мкг/мл) протягом 1-2 годин, а потім додавали попередньо відтитрований біотинільований VEGFC людини (1 нМ) протягом 15 хвилин. Відсоток зв’язаного VEGFC визначали з використанням кон’югатів “стрептавідин-HRP(ПХ)”. (D) Блокування зв’язування B VEGF165 із Nrp2 під дією антитіла проти Nrp2 . (Е) Блокування зв’язування Sema3F з LEC. LEC інкубували з кондиціонованим середовищем, що містить Sema3F, зв’язаний із лужною B фосфатазою (AP) (REF), у присутності або за відсутності антитіла проти Nrp2 . AP-активність зв’язаного з AP Sema3F детектували колориметрично з одночасним проявом. Будь-якого 3 UA 99292 C2 B 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв’язування з AP не спостерігалося (ліва панель). Антитіло проти Nrp2 не блокувало зв’язування Sema3F із LEC (середні панелі). ECD Nrp2 використовували як позитивний контроль для блокування зв’язування (права панель). Масштабна шкала. B Фігура 2. Антитіло проти Nrp2 пригнічує VEGFC-індуковану функцію in vitro і in vivo. (A) Приклади зображення забарвлених LEC, що мігрують у відповідь на дію 200 нг/мл VEGFC B протягом 18 годин у присутності або за відсутності антитіла проти Nrp2 (50 мкг/мл) або ECD VEGFR3 (50 мкг/мл). (B) Кількісна оцінка міграції LEC у відповідь на дію 200 нг/мл VEGFC (n=6 для кожної умови експерименту). (C) Кількісна оцінка міграції LEC у відповідь на дію 10 нг/мл B VEGF165 у присутності або за відсутності антитіла проти Nrp2 (50 мкг/мл) або ECD VEGFR3 (50 мкг/мл). N=6 для кожної умови експерименту. (D) Кількісна оцінка кількості пікселів, проведена за допомогою аналізу мікрокармана рогівки і описана в (E). *p