Спосіб одержання стійкої до гербіцидів рослини
Номер патенту: 103887
Опубліковано: 10.12.2013
Автори: Уолкер Кейт, Бітем Пітер Р., Шопке Крістіан, Гокал Грег Ф. У.
Формула / Реферат
1. Спосіб одержання стійкої до гербіцидів рослини, який включає:
(a) введення в клітину рослини одноланцюгового олігонуклеотиду репарації генів (GRON) зі спрямованою мутацією у гені синтази ацетогідроксикислот (AHAS) з одержанням клітини рослини з геном AHAS, що експресує білок AHAS, який містить мутацію, вибрану з групи, що включає:
заміну аланіну на валін у положенні, що відповідає положенню 205 послідовності SEQ ID NO: 1; та
заміну аланіну на аспарагінову кислоту у положенні, що відповідає положенню 205 послідовності SEQ ID NO: 1;
(b) ідентифікацію клітини рослини, що має по суті нормальний ріст і каталітичну активність у порівнянні з клітиною рослини дикого типу у присутності AHAS-інгібуючого гербіциду; та
(с) регенерування нетрансгенної стійкої до гербіцидів рослини, що несе мутований ген AHAS, із зазначеної клітини рослини.
2. Спосіб за п. 1, у якому ген AHAS кодує білок, який є стійким до інгібування AHAS-інгібуючим гербіцидом.
3. Спосіб за п. 2, у якому AHAS-інгібуючий гербіцид вибраний з групи, що включає гербіциди класів: імідазолінону, сульфонілсечовини, триазолопіримідину, піримідинілтіобензоату, сульфоніламіно-карбонілтриазоліну та їх суміші.
4. Спосіб за п. 1, 2 або 3, у якому ген AHAS кодує білок, що має 70% або більше ідентичність до однієї або більше з послідовностей амінокислот SEQ ID NO:21 – SEQ ID NO:62.
5. Спосіб за п. 1, 2, 3 або 4, у якому стійка до гербіцидів рослина вибрана з групи, що включає цукровий буряк, олійний рапс та канолу; при цьому гербіцид являє собою сульфонілсечовинний гербіцид.
Текст
Реферат: Спосіб одержання стійкої до гербіцидів рослини, який включає введення в клітину рослини одноланцюгового олігонуклеотиду репарації генів (GRON) зі спрямованою мутацією у гені синтази ацетогідроксикислот (AHAS) з одержанням клітини рослини з геном AHAS, що експресує мутований білок AHAS. UA 103887 C2 (12) UA 103887 C2 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТИ Ця заявка заявляє пріоритет відповідно до попередньої заявки на патент США № 60/977,944, поданої 5 жовтня 2007 р., зміст якої повністю включено в цю заявку за допомогою посилання, включаючи опис, фігури і таблиці, і для всіх цілей. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід відноситься до галузі стійких до гербіцидів рослин і насінь, а ще конкретніше, до мутацій у гені і білку синтази ацетогідроксикислот (AHAS). РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Наступний опис наведений винятково для того, щоб полегшити розуміння винаходу, при цьому жодним чином не передбачається, що воно описує рівень техніки цього винаходу або становить його частину. Переваги стійких до гербіцидів рослин відомі. Наприклад, стійкі до гербіцидів рослини можуть знижувати потребу в обробці ґрунту для боротьби з бур'янами, що забезпечує зменшення ерозії ґрунту. Введення екзогенних мутантних генів у рослини добре описано в літературі. Наприклад, патент США № 4 545 060 відноситься до підвищення стійкості рослин до гліфосату шляхом введення в геном рослин гена, що кодує варіант EPSPS, що містить щонайменше одну мутацію, яка надає ферменту більшу стійкість до впливу його конкурентного інгібітору, тобто, гліфосата. Відомі приклади деяких мутацій у генах AHAS. Див., наприклад, патент США № 7 094 606. Шляхом хімічного мутагенезу виявили мутацію в гені AHAS I зі зниженим рівнем експресії. Цю мутацію називають PM-1 (мутація в еквівалентному положенні відома як 653 (за послідовністю амінокислот в ацетолактат-синтазі (ALS) Arabidopsis), заміна серину на аспарагін, що кодуються відповідно AGT і AAT). У гені AHAS III з ще вищим рівнем експресії виявили іншу мутацію, що називається PM-2 (мутація в еквівалентному положенні відома як 574, заміна амінокислот із триптофану на лейцин, що відповідно кодується - TGG і TTG). Ці дві мутації, PM1 і PM-2, сполучать у комерційному різновиді канолу, відомого як Clearfield Canola (Tan et al., 2005). КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Цей винахід відноситься, зокрема, до мутованих нуклеїнових кислот і білкам синтази ацетогідроксикислот (AHAS), що кодуються мутованими нуклеїновими кислотами. Також винахід відноситься, зокрема, до рослин, клітин і насінню канолу, що містять такі мутовані нуклеїнові кислоти і білки. Відповідно до одного аспекту, запропонована ізольована нуклеїнова кислота, що кодує білок синтазу ацетогідроксикислот капусти Brassica, що містить мутацію в одному або більше положень амінокислот, що відповідає положенню, вибраному із групи, що включає: A205, D376, W574, R577, і S653 послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких інших варіантів реалізації, ізольована нуклеїнова кислота кодує білок, що містить одну або більше мутацій, вибраних із групи, що включає: заміну аланіну на валін у положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аланіну на аспарагінову кислоту у положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аспарагінової кислоти на глютамінову кислоту у положенні, що відповідає положенню 376 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на цистеїн у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на лейцин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на метіонін у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на серин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аргініну на триптофан у положенні, що відповідає положенню 577 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну серину на аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1, і заміну серину на треонін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну серину на аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1, де мутація не є мутацією S653N у гені AHAS I Brassica. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну серину на аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну триптофану на лейцин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, де мутація не є мутацією W574L у гені AHAS III Brassica. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну аланіну на валін у положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до іншого варіанта реалізації, мутація являє собою заміну аланіну на аспарагінову кислоту в положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до іншого варіанта реалізації, ізольована нуклеїнова кислота кодує білок з мутацією, вибраною з 1 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мутацій, показаних у Таблиці 2. Відповідно до певних варіантів реалізації, ізольована нуклеїнова кислота кодує білок із двома або більше мутаціями. Відповідно до деяких варіантів реалізації, дві або більше мутації вибирають із Таблиці 2. Відповідно до деяких варіантів реалізації, ізольована нуклеїнова кислота кодує білок з мутацією в положенні, що відповідає положенню S653 у послідовності SEQ ID NO: 1, і з мутацією в одному або більше положеннях амінокислот, що відповідають положенню, вибраному із групи, що включає: A205, D376, W574 і R577 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до інших варіантів реалізації, ізольована нуклеїнова кислота кодує білок з мутацією в положенні, що відповідає положенню W574 у послідовності SEQ ID NO: 1, і з мутацією в положенні, що відповідає положенню R577 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до певних варіантів реалізації, ізольована нуклеїнова кислота кодує білок синтази ацетогідроксикислот (AHAS), який стійкий до інгібування AHASінгібуючим гербіцидом. Відповідно до деяких варіантів реалізації, AHAS-інгібуючий гербіцид вибирають із групи, що включає гербіциди класів: імідазолінону, сульфонілсечовини, піримідинілтіобензоату, сульфоніламіно-карбонілтриазоліну і їх суміші. Відповідно до деяких варіантів реалізації, гербіцид являє собою гербіцид класу імідазолінону. Відповідно до деяких варіантів реалізації, гербіцид являє собою гербіцид класу сульфонілсечовини. Відповідно до деяких варіантів реалізації, ізольована нуклеїнова кислота кодує білок AHAS, що містить послідовність амінокислот, на 70 % або більше ідентичну послідовностям амінокислот, представленим на Фіг. 2. Відповідно до певних варіантів реалізації, ізольована нуклеїнова кислота кодує білок AHAS Brassica napus. Відповідно до інших варіантів реалізації, ізольована нуклеїнова кислота кодує білок AHAS III Brassica napus. Відповідно до іншого аспекту, запропонований вектор експресії, що містить ізольовану нуклеїнову кислоту, що кодує білок синтазу ацетогідроксикислот Brassica з мутацією в одному або більше з положень амінокислот, що відповідають положенню, вибраному із групи, що включає A205, D376, W574, R577 і S653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, вектор експресії містить ізольовану нуклеїнову кислоту, що кодує білок з однієї або більше мутаціями, вибраними із групи, що включає: заміну аланіну на валін у положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аланіну на аспарагінову кислоту в положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аспарагінової кислоти на глютамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню 376 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на цистеїн у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на лейцин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на метіонін у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на серин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аргініну на триптофан в положенні, що відповідає положенню 577 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну серину на аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1 і заміна серину на треонін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну серину на аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1, де мутація не є мутацією S653N у гені AHAS I Brassica. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну серину на аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну триптофану на лейцин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, причому мутація не є мутацією W574L у гені AHAS III Brassica. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну аланіну на валін у положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до іншого варіанта реалізації, мутація являє собою замінуаланіну на аспарагінову кислоту в положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1. Згідно з ще одним аспектом, запропонована рослина, що несе ген синтази ацетогідроксикислот (AHAS) Brassica, де ген кодує білок з мутацією в одному або більше положеннях амінокислот, що відповідають положенням, вибраним із групи, що включає A205, D376, W574, R577 і S653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Згідно з ще одним аспектом, запропонована рослина, що несе ген синтази ацетогідроксикислот (AHAS) Brassica, причому зазначена рослина стійка до AHAS-інгібуючого гербіциду, і при цьому ген кодує білок з мутацією в одному або більше положеннях амінокислот, що відповідають положенням, вибраним із групи, що включає A205, D376, W574, R577 і S653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації перерахованих вище аспектів, рослина несе ген AHAS, який кодує білок з однією або більше мутаціями, вибраними із групи, що включає: заміну аланіну на валін у положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аланіну на 2 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аспарагінову кислоту в положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аспарагінової кислоти на глютамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню 376 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на цистеїн у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на лейцин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на метіонін у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на серин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аргініну на триптофан у положенні, що відповідає положенню 577 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну серину на аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1 і заміну серину на треонін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну серину на аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1, причому мутація не є мутацією S653N у гені AHAS I Brassica. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну серину на аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну триптофану на лейцин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, причому мутація не є мутацією W574L у гені AHAS III Brassica. Відповідно до інших варіантів реалізації, мутація являє собою заміну аланіну на аспарагінову кислоту в положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до інших варіантів реалізації, мутацію вибирають із мутацій, представлених у Таблиці 2. Відповідно до певних варіантів реалізації, рослина несе ген AHAS, який кодує білок з однією або більше мутаціями у положенні, що відповідає положенню S653 у послідовності SEQ ID NO: 1 і мутацію в одній або більше положеннях амінокислот, вибраних із групи, що включає A205, D376, W574 і R577 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до інших варіантів реалізації, рослина несе ген AHAS, який кодує білок з однією або більше мутаціями у положенні, що відповідає положенню R577 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослина несе ген AHAS, який кодує білок, що стійкий до інгібування AHAS-інгібуючим гербіцидом. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослина несе ген AHAS, який кодує білок, що містить послідовність амінокислот, на 70 % або більше ідентичну послідовностям амінокислот, представлених на Фіг. 2. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослина стійка до обробки щонайменше одним AHAS-інгібуючим гербіцидом. Відповідно до деяких варіантів реалізації, AHAS-інгібуючий гербіцид вибраний із групи, що включає гербіциди класів: імідазолінону, сульфонілсечовини, піримідинілтіобензоату, сульфоніламіно-карбонілтриазоліну та їх суміші. Відповідно до деяких варіантів реалізації, гербіцид являє собою гербіцид класу імідазолінону. Відповідно до деяких варіантів реалізації, гербіцид являє собою гербіцид класу сульфонілсечовини. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослину Brassica одержують шляхом вирощування насіння лінії, вибраної з ліній, перерахованих у Таблиці 2. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослина являє собою вид Brassica. Відповідно до інших варіантів реалізації рослина являє собою Brassica napus. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослина вибрана з ярового олійного рапсу і озимого олійного рапсу. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослина несе ген AHAS, який кодує білок AHAS I Brassica napus. Відповідно до інших варіантів реалізації, рослина несе ген AHAS, який кодує білок AHAS I Brassica napus. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослина несе ген AHAS, який кодує білок AHAS III Brassica napus. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослина є не трансгенною. Відповідно до одного аспекту запропоноване насіння, що несе ген синтази ацетогідроксикислот (AHAS) Brassica, кодуючий білок з мутацією в положеннях амінокислот, що відповідають положенням, вибраним із групи, що включає A205, D376, W574, R577 і S653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, насіння несе ген AHAS, який кодує білок з однією або більше мутаціями, вибраними із групи, що включає: заміну аланіну на валін у положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аланіну на аспарагінову кислоту у положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аспарагінової кислоти на глютамінову кислоту у положенні, що відповідає положенню 376 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на цистеїн у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на лейцин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на метіонін у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну триптофану на серин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну аргініну на триптофан у положенні, що відповідає положенню 577 у послідовності SEQ ID NO: 1, заміну серину на аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1 і заміну серину на треонін у положенні, що відповідає 3 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну серину на аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1, причому мутація не є мутацією S653N у гені AHAS I Brassica. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну серину на треонін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація являє собою заміну триптофану на лейцин у положенні, що відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO: 1, причому мутація не є мутацією W574L у гені AHAS III Brassica. Відповідно до інших варіантів реалізації, мутація являє собою заміну аланіну на валін у положенні, що відповідає положенню 205 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до інших варіантів реалізації, мутацію вибирають із мутацій, представлених у Таблиці 2. Відповідно до певних варіантів реалізації, насіння несе ген AHAS, який кодує білок із двома або більше мутаціями, вибраними з Таблиці 2. Відповідно до деяких варіантів реалізації, насіння несе ген AHAS, який кодує білок з мутацією у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO: 1 і з мутацією в одному або більше положеннях амінокислот, вибраних із групи, що включає A205, D376, W574, R577 і S653 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до інших варіантів реалізації, насіння несе ген AHAS, який кодує білок з мутацією у положенні, що відповідає положенню W574 у послідовності SEQ ID NO: 1, і з мутацією у положенні, що відповідає положенню R577 у послідовності SEQ ID NO: 1. Відповідно до деяких варіантів реалізації, насіння несе ген AHAS, який кодує білок, що резистентний до AHASінгібуючого гербіциду. Відповідно до деяких варіантів реалізації, насіння несе ген AHAS, який кодує білок, що містить послідовність амінокислот, на 70 % або більше ідентичну послідовностям амінокислот, представлених на Фіг. 2. Відповідно до деяких варіантів реалізації, насіння резистентне до обробки щонайменше одним AHAS-інгібуючим гербіцидом. Відповідно до деяких варіантів реалізації, AHAS-інгібуючий гербіцид вибраний із групи, що включає гербіциди класів: імідазолінону, сульфонілсечовини, піримідинілтіобензоату, сульфоніламінокарбонілтриазоліну та їх суміші. Відповідно до деяких варіантів реалізації, гербіцид являє собою гербіцид класу імідазолінону. Відповідно до деяких варіантів реалізації, гербіцид являє собою гербіцид класу сульфонілсечовини. Відповідно до деяких варіантів реалізації, насінням є насіння Brassica. Відповідно до деяких варіантів реалізації, насіння несе ген AHAS, який кодує білок AHAS Brassica napus. Відповідно до інших варіантів реалізації, насіння несе ген AHAS, який кодує білок AHAS I Brassica napus. Відповідно до певних варіантів реалізації, насіння несе ген AHAS, який кодує білок AHAS III Brassica napus. Відповідно до деяких варіантів реалізації, насінням є насіння лінії рослин Brassica, де цю лінію вибирають із ліній, перерахованих у Таблиці 2. Відповідно до деяких варіантів реалізації, насіння не є трансгенним. Відповідно до деяких варіантів реалізації, запропоновано насіння, отримане від рослини рослиною способами, розкритими у цій заявці. Відповідно до інших варіантів реалізації, насіння є насінням канолу. Згідно з ще одним аспектом запропонований спосіб одержання стійкої до гербіциду рослини шляхом введення в клітину рослини олігонуклеотиду репарації генів (GRON) зі спрямованою мутацією в гені синтази ацетогідроксикислот (AHAS) з одержанням клітини рослини з геном AHAS, яка експресує AHAS з мутацією в одному або більше положеннях амінокислот, що відповідають положенню, вибраному із групи, що включає A205, D376, W574 і S653 у послідовності SEQ ID NO: 1; та ідентифікації клітини рослини, що має по суті нормальний ріст і каталітичну активність у порівнянні із клітиною відповідної рослини дикого типу, у присутності AHAS-інгібуючого гербіциду; і регенерації нетрансгенної стійкої до гербіцидів рослини, що несе мутований ген AHAS, із зазначеної клітини рослини. Згідно з ще одним аспектом, запропонований спосіб підвищення стійкості рослини шляхом: (а) схрещування першої рослини Brassica із другою рослиною Brassica, причому перша рослина містить ген синтази ацетогідроксикислот (AHAS), при цьому ген кодує білок з мутацією в одному або більше положеннях амінокислот, що відповідають положенню, вибраному із групи, що включає A205, D376, W574, R577 і S653 у послідовності SEQ ID NO: 1; (b) скринінга популяції, отриманої при схрещуванні з метою підвищення стійкості AHAS до гербіцидів; і (d) одержання насіння, що утворюється при схрещуванні. Відповідно до деяких варіантів реалізації, гібридні насіння одержують кожним з перерахованих вище способів. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослини вирощують із насіння, отриманого кожним з перерахованих вище способів. Відповідно до іншого аспекту, запропонований спосіб боротьби з бур'янами на полі, де перебувають рослини, шляхом обробки ефективною кількістю щонайменше одного AHAS-інгібуючого гербіциду поля, на якому перебувають зазначені бур'яни і рослини, причому зазначена рослина містить ген синтази ацетогідроксикислот (AHAS) Brassica, і при цьому ген кодує білок з мутацією в одному або більше положеннях амінокислот, що відповідають положенню, вибраному із групи, що включає A205, D376, W574, R577 і S653 у послідовності SEQ ID NO: 1. 134. Відповідно до 4 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 деяких варіантів реалізації, AHAS-інгібуючий гербіцид вибраний із групи, що включає гербіциди класів: імідазолінону, сульфонілсечовини, піримідинілтіобензоату, сульфоніламінокарбонілтриазоліну та їх суміші. Відповідно до інших варіантів реалізації, AHAS-інгібуючий гербіцид являє собою гербіцид класу імідазолінону. Відповідно до інших варіантів реалізації, AHAS-інгібуючий гербіцид являє собою гербіцид класу сульфонілсечовини. Термін "нуклеїнова кислота" або "послідовність нуклеїнової кислоти" відноситься до олігонуклеотиду, нуклеотиду або полінуклеотиду, і до їх фрагментів або частин, які можуть бути одноланцюговими або дволанцюговими і являють собою смислові або антисмислові нитки. Нуклеїнова кислота може включати ДНК або РНК, і може бути природного або синтетичного походження. Наприклад, нуклеїнова кислота може включати мРНК або кДНК. Нуклеїнова кислота може включати нуклеїнову кислоту, що була ампліфіційована {наприклад, шляхом полімеразно-ланцюгової реакції}. Умовну позначку "NTwt###NTmut" застосовують для позначення нуклеотиду дикого типу NTwt у положенні ### в нуклеїновій кислоті, який був замінений на NTmut. Однобуквений код для нуклеотидів описаний у Посібнику з методики патентної експертизи для Патентів США, розділ 2422, таблиця 1. Щодо цього, позначення нуклеотиду "R" позначає пурин, такий як гуанін або аденін, "Y" позначає піримідин, такий як цитозин або тимін (урацил у випадку РНК); "М" позначає аденін або цитозин; "K" позначає гуанін або тимін; а "W" позначає аденін або тимін. Термін "ген" відноситься до послідовності ДНК, яка містить регуляторні і послідовності, що кодують, необхідні для вироблення РНК, яка може виконувати некодуючу функцію {наприклад, рибосомна або транспортна РНК}, або яка може включати поліпептид або попередник поліпептиду. РНК або поліпептид можуть кодуватися повнорозмірною послідовністю, що кодує, або будь-якою частиною послідовності, що кодує, поки зберігається бажана активність або функція. Термін "ген AHAS" у цій заявці відноситься до гена, що має гомологію з геном AHAS Brassica. Відповідно до деяких варіантів реалізації, ген AHAS ідентичний конкретному гену AHAS Brassica на 70 %; 75 %; 80 %; 85 %; 90 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 %; 99 % або 100 %, наприклад, гену I AHAS Brassica napus або гену III AHAS Brassica napus. Відповідно до деяких варіантів реалізації, ген AHAS має 60 %; 70 %; 75 %; 80 %; 85 %; 90 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 %; 99 % або 100 % гомологію з послідовністю, вибраною з послідовностей на Фіг. 3. Відповідно до деяких варіантів реалізації, ген AHAS модифікований і включає щонайменше одну мутацію. Відповідно до інших варіантів реалізації, ген AHAS модифікований і включає щонайменше дві мутації. Відповідно до деяких варіантів реалізації, ген AHAS модифікований і включає щонайменше одну мутацію, вибрану з мутацій, показаних у Таблиці 2. Відповідно до деяких варіантів реалізації, ген AHAS модифікований і включає щонайменше дві мутації, вибрані з мутацій, показаних у Таблиці 2. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація є консервативною мутацією. Під "послідовністю, що кодує", розуміють послідовність нуклеїнових кислот або комплементарну їй послідовність, або їх частину, які можуть транскрибуватися і/або транслюватися з утворенням мРНК і/або поліпептиду, або їх фрагменту. Послідовності, що кодують, містять екзони в геномній ДНК або незрілих транскриптах первинної РНК, які біохімічний апарат клітини з'єднує разом, виробляючи зрілу мРНК. Антисмислова нитка являє собою комплемент такої нуклеїнової кислоти, і по ній можна вивести послідовність, що кодує. Під "послідовністю, що не кодує" розуміють послідовність нуклеїнових кислот або комплементарну їй послідовність, або їх частину, які не транскрибуються в амінокислоту in vivo, або у випадку, коли тРНК не вбудовує амінокислоту або не "намагається" вбудовувати амінокислоту. Послідовність, що не кодує, включає послідовності інтронів у геномній ДНК або незрілих транскриптах первинної РНК, і пов'язані з геном послідовності, такі як промотори, енхансери, сайленсери та ін. Нуклеотидна основа - це основа, яка у деяких кращих варіантах реалізації є пурином, піримідином або їх похідним, або аналогом. Нуклеозиди - це нуклеотидні основи, що містять фрагмент пентозофуранозилу, наприклад, можливо заміщений рибозид або 2'-дезоксирибозид. Нуклеозиди можуть бути зв'язані одним або декількома лінкерними компонентами, які можуть містити фосфор, а можуть і не містити його. Нуклеозиди, які зв'язані незаміщеними фосфоефірними зв'язками, називають нуклеотидами. У цьому описі термін "нуклеотидна основа" включає пептидні нуклеотидні основи, субодиниці нуклеїнових кислот пептидів і морфолінові нуклеотидні основи, а також нуклеозиди та нуклеотиди. Олігонуклеотид - це полімер, що містить нуклеотидні основи; краще, щонайменше частину якого можна гібридизувати відповідно до моделі спарювання Уотсона-Кріка із ДНК, що має комплементарну послідовність. Ланцюг олігонуклеотиду може містити один 5'-кінець і один 3'кінець, які являють собою останні нуклеотидні основи в полімері. Конкретний ланцюг 5 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 олігонуклеотиду може містити нуклеотидні основи всіх типів. Сполука олігонуклеотиду являє собою сполуку, що містить один або більше ланцюгів олігонуклеотидів, які можуть бути комплементарні та гібридизовані відповідно до моделі спарювання основ Уотсона-Кріка. Нуклеотидні основи рибозного типу включають пентозофуранозил, що містить нуклеотидні основи, у яких 2'-вуглець являє собою метилен, заміщений гідроксилом, алкоксигрупою або галогеном. Нуклеотидні основи дезоксирибозного типу являють собою нуклеотидні основи, відмінні від основ нуклеотидів рибозного типу, які включають всі нуклеотидні основи, які не містять пентозофуранозиловий фрагмент. Відповідно до деяких варіантів реалізації, нитка олігонуклеотиду може включати ланцюги олігонуклеотидів, а також сегменти або ділянки ланцюгів олігонуклеотидів. Нитка олігонуклеотиду може містити 3'-кінець і 5'-кінець, і коли нитка олігонуклеотиду має довжину, рівну довжині ланцюга, 3'- і 5'-кінці нитки є також 3'- і 5'-кінцем ланцюга. У цій заявці термін "олігонуклеотид репарації генів" позначає олігонуклеотиди, що включають змішані дуплексні олігонуклеотиди, молекули, що містять не нуклеотиди, одноланцюгові олігодеоксинуклеотиди та інші молекули репарації генів. Під "ізольованою" стосовно нуклеїнової кислоти (наприклад, олігонуклеотиду, такого як РНК, ДНК або змішаний полімер) розуміють нуклеїнову кислоту, яка відділена від значної частини генома, у якому вона в природі існує, і/або по суті відділена від інших компонентів клітини, які зустрічаються разом з нею в природі. Наприклад, будь-яку нуклеїнову кислоту, яку одержали синтетичним шляхом (наприклад, шляхом послідовної конденсації основ), вважають ізольованою. Термін "послідовність амінокислот" відноситься до послідовності поліпептиду або білка. Умовне позначення "AAwt###AAmut" застосовують для позначення мутації, яка приводить до заміни амінокислоти дикого типу ААwt у положенні ### у поліпептиді на мутантну ААmut. Під "комплементом" розуміють послідовність, комплементарну до послідовності нуклеїнової кислоти, у відповідності зі стандартними принципами комплементарності Уотсона-Кріка. Комплементарна послідовність також може бути послідовністю РНК, комплементарною послідовності ДНК або комплементарною їй послідовності, а також може являти собою кДНК. "По суті комплементарній" означає, що дві послідовності гібридизуються в строгих умовах гібридизації. Фахівець у даній галузі повинен розуміти, що по суті комплементарні послідовності не обов'язково повинні гібридизуватися по всій своїй довжині. У цьому описі термін "кодон" відноситься до послідовності із трьох сусідніх нуклеотидів (або РНК, або ДНК), що складають генетичний код, який визначає вбудовування конкретної амінокислоти в ланцюг поліпептиду в ході біосинтезу білка або сигнал про припинення синтезу білка. Термін "кодон" також застосовують для позначення відповідних (і комплементарних) послідовностей із трьох нуклеотидів в матричній РНК, у яку транскрибується вихідна ДНК. У цьому описі термін "білок AHAS" відноситься до білка, який гомологічний білку AHAS Brassica. Відповідно до деяких варіантів реалізації, білок AHAS ідентичний на 70 %; 75 %; 80 %; 85 %; 90 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 %; 99 % або 100 % конкретному білку AHAS Brassica, такому як, наприклад, білок AHAS I Brassica napus або білок AHAS III Brassica napus. Відповідно до деяких варіантів реалізації, білок AHAS ідентичний на 70 %; 75 %; 80 %; 85 %; 90 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 %; 99 % або 100 % послідовності, вибраної з послідовностей, наведених на Фіг. 2. Відповідно до деяких варіантів реалізації, білок AHAS модифікований і включає щонайменше одну мутацію. Відповідно до інших варіантів реалізації, білок AHAS модифікований і включає щонайменше дві мутації. Відповідно до деяких варіантів реалізації, білок AHAS модифікований і включає щонайменше одну мутацію, вибрану з мутацій, наведених у Таблиці 2. Відповідно до деяких варіантів реалізації, білок AHAS модифікований і включає щонайменше дві мутації, наведені в Таблиці 2. Відповідно до деяких варіантів реалізації, мутація є консервативною мутацією. Термін "дикого типу" відноситься до гену або продукту гену, який має характеристики цього гену або продукту гену, виділеного із природного джерела. Ген дикого типу - це ген, який найчастіше зустрічається в популяції, і, відповідно, його позначають як "нормальну" форму або форму гену "дикого типу". Термін "Дикого типу" також може відноситися до послідовності в конкретному положенні або положеннях нуклеотидів, або до послідовності в конкретному положенні або положеннях кодону, або до послідовності в конкретному положенні або положеннях амінокислот. У цій заявці термін "мутантний" або "модифікований" відноситься до нуклеїнової кислоти або білка, що має зміни послідовності і/або у функціональних властивостей (тобто, змінені характеристики) у порівнянні з геном або продуктом гену дикого типу. "Мутантний" або "модифікований" також відноситься до послідовності в конкретному положенні або положеннях 6 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидів, або до послідовності в конкретному положенні або положеннях кодону, або до послідовності в конкретному положенні або положеннях амінокислот, яка має зміни в послідовності і/або у функціональних властивостях (тобто, змінені характеристики) у порівнянні з геном або продуктом гену дикого типу. Термін "мутація" включає зміну щонайменше одного нуклеотиду у послідовності нуклеїнової кислоти або зміна однієї амінокислоти в поліпептиді у порівнянні з нормальною послідовністю або послідовністю дикого типу. Мутація може включати заміну, делецію, інверсію або вставку. У цьому описі термін "гомологія" відноситься до подібності послідовностей білків і ДНК. Термін "гомологія" або "гомологічний" відноситься до ступеня ідентичності. Може мати місце часткова гомологія або повна гомологія. Часткова гомологічна послідовність - це послідовність, яка ідентична іншій послідовності менше ніж на 100 %. Термін "гетерозиготний" відноситься до присутності різних алелей в одному або більше локусах генів у сегментах гомологічних хромосом. У цьому описі термін "гетерозиготний" також може відноситися до зразка, клітини, популяції клітин або до організму, у якому можна виділитирізні алелі в одному або більше локусах генів. Гетерозиготні зразки також можна визначити за допомогою відомих у даній галузі способів, таких як, наприклад, секвенування нуклеїнових кислот. Наприклад, якщо електроферограма при секвенуванні показує два піки в одному локусі, і обидва піки мають приблизно однаковий розмір, зразок можна охарактеризувати як гетерозиготний. Або, якщо один пік менше іншого, але становить за розміром щонайменше 25 % від більшого піка, зразок можна охарактеризувати як гетерозиготний. Відповідно до деяких варіантів реалізації, менший пік становить щонайменше 15 % від більшого піка. Відповідно до інших варіантів реалізації, менший пік становить щонайменше 10 % від більшого піка. Відповідно до інших варіантів реалізації, менший пік становить щонайменше 5 % від більшого піка. Відповідно до інших варіантів реалізації, детектують мінімальне значення меншого піка. У цьому описі термін "гомозиготний" відноситься до присутності ідентичних алелей в одному або більше локусах генів у сегментах гомологічних хромосом. Також термін "гомозиготний" може відноситися до зразка, клітини, популяції клітин або організму, у якому можна визначити ту саму алель в одному або більше локусах генів. Гомозиготні зразки можна визначити за допомогою способів, відомих у даній галузі, таких як, наприклад, секвенування нуклеїнових кислот. Наприклад, якщо електроферограма при секвенуванні показує один пік у певному локусі, зразок можна називати "гомозиготним" за даним локусом. У цьому описі термін "гемізиготний" відноситься до гену або сегмента гену, що присутній тільки один раз у генотипі клітини або організму, оскільки друга алель відсутня (вилучені). У цьому описі термін "гемізиготний" також може відноситися до зразка, клітини, популяції клітин або організму, у яких алель в одному або більше локусах генів вилучена з генотипу однократно. У цьому описі термін "статус зиготності" (зиготність) відноситься до зразка, популяції клітин або організму, які проявляють себе як гетерозиготні, гомозиготні або гемізиготні при тестуванні способами, відомими в техніці і описаними в цій заявці. Термін "статус зиготності нуклеїнової кислоти" позначає визначення того, проявляє себе джерело нуклеїнової кислоти як гетерозиготне, гомозиготне або гемізиготне. Термін "статус зиготності" може відноситися до розходжень в одному нуклеотиді або в послідовності. Відповідно до деяких способів, статус зиготності зразка відносно одиночної мутації можна класифікувати як гомозиготний дикий тип, гетерозиготний (один алель дикого типу і один мутантний алель), гомозиготнй мутант, або гемізигота (тобто, одинична копія або алеля дикого типу, або мутантного алеля). У цьому описі термін "RTDS" відноситься до Системи Швидкого Виявлення Ознаки™ (RTDS), розробленого Cibus. RTDS - це система сайт-специфічної модифікації гену, яка ефективна при здійсненні точних змін у послідовності гену без вбудовування чужорідного гену або регуляторної послідовності. У цьому описі термін "приблизно" відноситься до кількісних значень плюс/мінус 10 %. Наприклад, "приблизно 3 %" буде включати 2,7-3,3 %, а "приблизно 10 %" буде включати 911 %. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР На Фіг. 1 показана відповідність (сполучення) синтази ацетогідроксикислот AHAS Arabidopsis (SEQ ID NO: 1), AHAS I Brassica napus (SEQ ID NO: 2) і AHAS III Brassica napus (SEQ ID NO: 3 і 4). SEQ ID NO: 1 – це послідовність амінокислот AHAS Arabidopsis At3g48560 на основі анотованих послідовностей геномних ДНК бази даних Genebank, номер доступу NC003074. SEQ ID NO: 2 - це послідовність амінокислот AHAS I Brassica napus з елітних ліній Cibus BN-2 і BN-11. Ця послідовність ідентична трансльованому продукту Genebank, номер доступу Zl 1524. SEQ ID NO: 3 - це послідовність амінокислот AHAS III Brassica napus з лінії Cibus elite BN-2. Дана послідовність ідентична трансльованому продукту Genebank, номер доступу Zl 1526, за 7 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 винятком заміни D325E в амінокислоті 325. SEQ ID NO: 4 - це послідовність амінокислот AHAS III Brassica napus з лінії Cibus elite BN-11. Дана послідовність ідентична трансльованому продукту SEQ ID NO: 3, за винятком E343 в амінокислоті 343 у послідовності SEQ ID NO: 1. На Фіг. 2 показана послідовність амінокислот трансльованих генів, наведених у Таблиці 2. Амінокислоти, показані жирним шрифтом, позначають мутацію. На Фіг. 3 показані послідовності нуклеотидів, наведені в Таблиці 2. Нуклеотиди, показані жирним шрифтом, позначають мутацію. На Фіг. 4 показані результати дослідження розпилення, описаного в Прикладі 4. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Запропоновані композиції і способи, що відносяться, зокрема, до успішного спрямованого впливу на гени синтази ацетогідроксикислот (AHAS) у рослин Brassica за допомогою, наприклад, технології Системи Швидкого Розвитку Ознаки (RTDS™), розробленої Cibus. У сполученні або самі по собі, рослини, що містять будь-яку з мутацій, що розкриваються у цій заявці, можуть давати основу для нових стійких до гербіцидів продуктів. Також запропоноване насіння, вироблене мутантними рослинами, у яких гени або гомозиготні, або гетерозиготні за цими мутаціями. Мутації, розкриті в цьому описі, можна комбінувати з будь-якою іншою відомою мутацією або з мутацією, яка буде відкрита надалі. RTDS заснована на зміні гену-мішені за рахунок використання власної системи репарації клітини, що дозволяє специфічно модифікувати послідовність гену in situ без введення чужорідної ДНК і послідовностей, що контролюють експресію гену. Ця процедура дозволяє провести точну зміну генетичної послідовності, і при цьому інший геном залишиться без змін. На відміну від традиційних трансгенних ГМО, інтеграції чужорідного генетичного матеріалу не відбувається, і ніякий чужорідний генетичний матеріал не залишається в рослині. Зміни в генетичній послідовності проводять за допомогою RTDS, а не вводять випадковим чином. Оскільки змінені гени залишаються в їх нативному розташуванні, ніякої випадкової, неконтрольованої або небажаної експресії не відбувається. RTDS, яка дозволяє здійснювати цю зміну, являє собою хімічно синтезований нуклеотид, який може складатися як з основ ДНК і модифікованих основ РНК, так і з інших хімічних компонентів, і призначений для гібридизації в цільовому положенні гену з утворенням пар основ, що спарюються всупереч принципу комплементарності. Така "незбіжна" (некомплементарна) пара основ діє як сигнал до залучення власне природної системи репарації клітини в цей сайт і до виправлення (заміни, вставки або делеції) певного нуклеотиду в гені. Як тільки процес виправлення завершений, молекула RTDS руйнується і знову модифікований або репарований ген експресується під контролем нормальних ендогенних контролюючих механізмів для даного гену. Цільові мутації в генах AHAS I і III були описані для генів і білків AHAS Brassica napus (див. SEQ ID NO: 2, 3 і 4). Композиції і способи також включають мутантні гени AHAS інших видів (паралоги). Однак через розмаїтість генів AHAS різних видів число залишків амінокислот, яке потрібно змінити в одного виду, може відрізнятися в іншого виду. Проте, фахівець у даній галузі техніки легко ідентифікує аналогічне положення за гомологією послідовностей. Наприклад, на Фіг. 1 показані сполучені послідовності амінокислот паралогів AHAS Arabidopsis (SEQ ID NO: 1) і AHAS I (SEQ ID NO: 2) і AHAS III Brassica napus (SEQ ID NO: 3 і SEQ ID NO: 4). Відповідно, аналогічні положення в цих та інших паралогів можна ідентифікувати і піддати мутації. Композиції та способи відносяться частково до мутацій у гені AHAS, які надають рослині стійкість або толерантність до гербіциду із сімейства AHAS-інгібуючих або ALS-інгібуючих гербіцидів. Композиції і способи також відносяться до застосування олігонуклеотиду репарації генів для одержання бажаної мутації в послідовностях хромосоми або епісоми рослини в гені, AHAS, що кодують білок. Мутований білок, який по суті зберігає каталітичну активність білка дикого типу, дозволяє збільшити стійкість або толерантність рослини до гербіциду із сімейства AHAS-інгібуючих гербіцидів, і дозволяє по суті нормально рости і розвиватися рослині, його органам, тканинам або клітинам у порівнянні з рослиною дикого типу незалежно від наявності або відсутності гербіциду. Композиції і способи також пов'язані із клітиною нетрансгенної рослини, у якій був мутований ген AHAS, з нетрансгенною рослиною, регенерованим з неї, а також з рослиною, отриманою шляхом схрещування регенерованого нетрансгенної рослини з рослиною, що має мутацію в іншому гені AHAS, або з рослиною, що має мутований ген EPSPS, наприклад. Імідазолінони являють собою одне з п'яти хімічних сімейств AHAS-інгібуючих гербіцидів. Інші чотири сімейства - це похідні сульфонілсечовини, триазолопіримідини, піримідинілтіобензоати і сульфоніламіно-карбонілтриазоліни (Tan et al., 2005). 8 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також запропонована трансгенна або нетрансгенна рослина або клітина рослини з однією або більше мутаціями в гені AHAS, наприклад, такими, як розкриваються в цій заявці. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослина або клітина рослини з однієї або більше мутаціями в гені AHAS має підвищену стійкість або толерантність до члена сімейства AHASінгібуючих гербіцидів. Відповідно до деяких варіантів реалізації, рослина або клітина рослини з однією або більше мутаціями в гені AHAS може проявляти по суті нормальний ріст або розвиток рослини, її органів, тканин або клітин у порівнянні з відповідною рослиною або клітиною дикого типу. Відповідно до конкретних аспектів і варіантів реалізації, запропоновані нетрансгенні рослини з мутацією в гені AHAS, наприклад, такий, як розкриваються в цій заявці, яка відповідно до деяких варіантів реалізації збільшує стійкість або толерантність до члена сімейства AHASінгібуючих гербіцидів, які можуть проявляти по суті нормальний ріст або розвиток рослини, її органів, тканин або клітин у порівнянні з відповідною рослиною або клітиною дикого типу, тобто, у присутності одного або більше гербіцидів, таких як, наприклад, імідазолінон і/або сульфонілсечовина, мутований білок AHAS має по суті таку ж каталітичну активність, що й білок AHAS дикого типу. Додатково запропонований спосіб одержання рослини, що містить мутантний ген AHAS, наприклад, що містить одну або більше мутацій, описаних у цій заявці; краще, щоб рослина по суті зберігала каталітичну активність білка дикого типу, незалежно від присутності або відсутності відповідного гербіциду. Відповідно до деяких варіантів реалізації, способи включають введення в клітину рослини олігонуклеотиду репарації генів з однією або більше цільовими мутаціями в гені AHAS (наприклад, такими, як описано в цій заявці) та ідентифікацію клітини, насіння або рослини, що несе мутований ген AHAS. Відповідно до різних варіантів реалізації, рослини, розкриті в цьому описі, належать до будьякого виду дводольних, однодольних або голосім'яних х рослин, включаючи будь-який вид деревної рослини, яка росте у вигляді дерева або куща, будь-який трав'янистий вид, який дає їстівні плоди, насіння або овочі, або будь-який вид, який дає яскраві або ароматні квіти. Наприклад, рослина може бути вибрана із групи, що включає канолу (рапс), соняшник, тютюн, цукровий буряк, бавовну, кукурудзу, пшеницю, ячмінь, рис, сорго, томати, манго, персик, яблуню, грушу, полуницю, банан, диню, картоплю, моркву, салат-латук, цибулю, сою, цукровий очерет, горох, кінський біб, тополю, виноград, цитрус, люцерну, жито, овес, дерен і кормові трави, льон, олійні культури, огірок, іпомею плющеподібну, бальзамін, перець, баклажан, чорнобривці, лотос, капусту, маргаритки, гвоздику, тюльпани, ірис, лілії і рослини, що дають горіхи, за умови, що вони не згадувалися раніше. Олігонуклеотид репарації генів може бути введений у клітину рослини за допомогою будьякого способу, що зазвичай застосовується в даній галузі техніки, включаючи мікроносії (біолістична доставка), мікроволокна, полі етиленгліколь (ПЕГ)-опосередковуване захоплення, електропорацію та мікроін'єкцію. Також запропоновані способи і композиції, що відносяться до культури клітин, підданих мутації у відповідності зі способами, що розкриваються в цій заявці, з одержанням рослини, яка виробляє насіння, далі іменованого "фертильною рослиною", і до одержання насіння та інших рослин з такої фертильної рослини. Також запропоновані способи селективної боротьби з бур'янами на полі, на якому перебувають рослини змінами в гені AHAS згідно із цим винаходом, причому спосіб включає обробку поля гербіцидом, до якого рослина була зроблена стійкою. Також запропоновані мутації в гені AHAS, які надають рослині стійкість або толерантність до члена відповідного сімейства гербіцидів, або при яких мутований ген AHAS по суті має ту ж ферментативну активність у порівнянні з AHAS дикого типу. Олігонуклеотиди репарації генів Способи і композиції, розкриті в цьому описі, можуть бути здійснені або отримані за допомогою "олігонуклеотидів репарації генів", що мають конформацію і хімічні особливості, описані ще докладніше нижче. "Олігонуклеотиди репарації генів" згідно із цим описом також описані в опублікованій науковій і патентній літературі під іншими назвами, включаючи "рекомбінагенні олігонуклеотиди"; "РНК/ДНК химерні олігонуклеотиди"; "химерні олігонуклеотиди", "змішані дуплексні олігонуклеотиди" (MDON); "РНК/ДНК олігонуклеотиди" (RDO); "цільові олігонуклеотиди генів", "генопласти"; "одноланцюгові модифіковані олігонуклеотиди"; "мутаційні вектори на основі одноланцюгових олігонуклеотидів" (SSOMV); "дуплексні мутаційні вектори" і "гетеродуплексні мутаційні вектори". Олігонуклеотиди, що мають конформацію і хімічні особливості, описані в Патенті США № 5 565 350 Kmiec (Kmiec I) і в Патенті США №. 5 731 181 Kmiec (Kmiec II), включених у цю заявку за допомогою посилання, придатні для застосування як "олігонуклеотиди репарації генів" 9 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідно до даного винаходу. Олігонуклеотиди репарації генів в Kmiec I і Kmiec II містять дві комплементарних нитки, одна з яких містить щонайменше один сегмент нуклеотидів РНК-типу ("РНК-сегмент"), які є основами, що спарюються з нуклеотидами ДНК-типу іншої нитки. У Патенті Kmiec II розкривається, що нуклеотиди можуть бути замінені на ненуклеотиди, що містять пуринові і піримідинові основи можна заміняти. Додаткові молекули репарації генів, які можна застосовувати для даного винаходу, описані в Патентах США № 5 756 325; 5 871 984; 5 760 012; 5 888 983; 5 795 972; 5 780 296; 5 945 339; 6 004 804 і 6 010 907 і в Міжнародній заявціі № PCT/USOO/23457; і в Публікації міжнародних заявок № WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; і WO 99/40789, кожна з яких включена у цей опис за допомогою посилання на їх повну версію. Відповідно до одного варіанта реалізації, олігонуклеотиди репарації генів є змішаними дуплексними олігонуклеотидами (MDON), у яких нуклеотиди РНК-типу в змішаному дуплексному нуклеотиді стають стійкими до дії РНКаз внаслідок заміни 2'~гідроксилу на фтор, хлор або бром або внаслідок поміщення замісника на 2'-O. Придатні замісники включають замісники, запропоновані в Kmiec II. Альтернативні замісники включають замісники, запропоновані в Патенті США No. 5 334 71 1 (Sproat), і замісники, запропоновані в патентних публікаціях EP 629 387 і EP 679 657 (колективно, Заявки Martin), які включені в цю заявку за допомогою посилання. У цьому описі 2'-фтор-, хлор- або бром-похідні рибонуклеотиду або рибонуклеотид, у якому Т-ОН має замісник, описаний у Заявках Martin або Sproat, називають "Тзаміщений рибонуклеотид". У цьому описі термін "нуклеотид РНК-типу" позначає Т-гідроксил або 2'-заміщений нуклеотид, який пов'язаний з іншими нуклеотидами змішаного дуплексного нуклеотиду незаміщеним фосфоефірним зв'язком або будь-якими неприродними зв'язками, запропонованими в Kmiec I або Kmiec II. У цьому описі термін "нуклеотид дезоксирибо-типу" позначає нуклеотид, що містить Т-Н, який може бути пов'язаний з іншими нуклеотидами олігонуклеотиду репарації генів незаміщеним фосфоефірним зв'язком або будь-якими неприродними зв'язками, запропонованими в Kmiec I або Kmiec II. Відповідно до деяких варіантів реалізації цього винаходу, олігонуклеотид репарації генів являє собою змішаний дуплексний олігонуклеотид (MDON), який зв'язаний винятково незаміщеними фосфоефірними зв'язками. Відповідно до альтернативних варіантів реалізації, зв'язок здійснюється заміщеними фосфодиефірами, похідними фосфодиефірів і зв'язками, не заснованими на фосфорі, згідно Kmiec II. Згідно з ще одним варіантом реалізації, кожний нуклеотид РНК-типу в змішаному дуплексному олігонуклеотиді являє собою 2'-заміщений нуклеотид. Особливо кращі варіанти реалізації 2'-заміщених рибонуклеотидів - це 2'-фтор, Tметокси, 2'-пропілокси, 2'-алілокси, 2'-гідроксилетилокси, 2'-метоксиетилокси, Т-фторпропілокси і 2'-трифторпропілокси-заміщені рибонуклеотиди. Ще кращі варіанти реалізації 2'-заміщених рибонуклеотидів - це 2'-фтор, 2'-метокси, 2'-метоксиетилокси і 2'- алілокси-заміщені рибонуклеотиди. Відповідно до іншого варіанту реалізації змішаний дуплексний нуклеотид зв'язаний незаміщеними фосфоефірними зв'язками. Хоча змішані дуплексні нуклеотиди (MDON), що містять тільки один тип 2'-заміщеного нуклеотиду РНК-типу синтезувати зручніше, способи згідно із цим винаходом можна здійснювати із застосуванням змішаних дуплексних нуклеотидів, що містять два або більше типи нуклеотидів РНК-типу. Функція сегменту РНК може не змінюватися при розриві, що викликаний введенням дезоксинуклеотиду між двома тринуклеотидами РНК-типу, відповідно, термін "РНК-сегмент" включає терміни, такі як "перерваний РНК-сегмент". Безперервний РНКсегмент безперервний РНК-сегмент (що складається з послідовних нуклеотидів НРК-типу). Відповідно до альтернативного варіанта реалізації сегмент РНК може містити альтернативні стійкі до дії РНКази і незаміщені 2'-OH нуклеотиди. Змішані дуплексні нуклеотиди краще повинні містити менше 100 нуклеотидів, і ще краще - менше 85 нуклеотидів, але більше 50 нуклеотидів. Перша і друга нитки спарені відповідно до моделі спарювання основ Уотсона-Кріка. Відповідно до одного варіанта реалізації нитки змішаного дуплексного олігонуклеотиду ковалентно пов'язані з лінкером, таким як одиночний гекса-, пента- або тетрануклеотид так, що перша і друга нитки є сегментами одного ланцюга олігонуклеотиду, що містить один 3'- і один 5'-кінець. 3'- і 5'-кінці можна захистити шляхом приєднання "кепа-шпильки", у якому 3' і 5'-кінцеві нуклеотиди спарені із сусідніми нуклеотидами за принципом Уотсона-Кріка. Другий кеп-шпильку можна додатковопомістити на з'єднання між першою і другою ниткою на деякій відстані від 3'- і 5'-кінців так, щоб стабілізувати спарювання за принципом Уотсона-Кріка між першою і другою ниткою. Перша і друга нитки містять дві галузі, які гомологічні двом фрагментам цільового гену, тобто, містять ту ж послідовність, що й цільовий ген. Гомологічна галузь містить нуклеотиди сегменту РНК і може містити один або більше нуклеотидів ДНК-типу у зв'язаному сегменті ДНК, і 10 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 також може містити нуклеотиди ДНК-типу, які не перебувають усередині перехідного сегменту ДНК. Дві галузі гомології розділені, областю, що містить послідовність, яка відрізняється від послідовності цільового гену, що називається "гетерологічною областю", і кожна галузь гомології є сусідньою відносно зазначеної "гетерологічної галузі". Гетерологічна галузь може містити один, два або три нуклеотиди, спарених всупереч принципу комплементарності. Нуклеотиди, спарені всупереч принципу комплементарності, можуть бути суміжними або, в альтернативному варіанті, можуть бути розділені двома нуклеотидами, які гомологічні цільовому гену. Як альтернатива гетерологічна галузь може також містити вставку одного, двох, трьох або п'яти, або менше нуклеотидів. Як альтернатива, послідовність змішаного дуплексного олігонуклеотиду може відрізнятися від послідовності цільового гену тільки делецією одного, двох, трьох, п'яти або менше нуклеотидів зі змішаного дуплексного олігонуклеотиду. Довжина і положення гетерологічної галузі, як передбачається в цьому випадку, має довжину делеції, навіть якщо нуклеотиди змішаного дуплексного олігонуклеотиду перебувають усередині гетерологічної галузі. Відстань між фрагментами цільового гену, який комплементарний двом гомологічним областям, ідентична довжині гетерологічної галузі, де передбачається зробити заміну або заміни. Якщо гетерологічна галузь містить вставку, гомологічні області в змішаному дуплексному олігонуклеотиді розходяться на більшу відстань, ніж та, на яку комплементарні їм гомологічні фрагменти розташовані в гені. Якщо гетерологічна галузь кодує делецію, справедливо зворотне твердження. Кожний РНК-Сегмент змішаного дуплексного олігонуклеотиду є частиною гомологічної області, тобто, області, що ідентична за послідовністю фрагменту цільового гену, сегменти якого разом краще містять щонайменше 13 нуклеотидів РНК-типу і краще від 16 до 25 нуклеотидів РНК-типу, або ще краще - 18-22 нуклеотидів РНК-типу, і найкраще - 20 нуклеотидів. Відповідно до одного варіанта реалізації, РНК-сегменти гомологічних областей розділені проміжним ДНК-сегментом, і є сусідніми стосовно нього, тобто, "з'єднані з ним". Відповідно до одного варіанта реалізації, кожний нуклеотид гетерологічної галузі є нуклеотидом перехідного ДНК-сегменту. Проміжний ДНК-сегмент, який містить гетерологічну галузь змішаного дуплексного олігонуклеотиду, називають "сегмент-мутатор". Відповідно до іншого варіанта реалізації цього винаходу, олігонуклеотид репарації генів (GRON) являє собою мутаційний вектор з одноланцюгового олігодезоксинуклеотиду (SSOMV), який розкритий у Міжнародній Заявці на Патент PCT/USOO/23457, у Патентах США № 6 271 360, 6 479 292 і 7 060 500, які включені в цю заявку за допомогою посилання на їх повну версію. Послідовність SSOMV заснована на тих же принципах, що й мутаційні вектори, описані в Патентах США № 5 756 325; 5 871 984; 5 760 012; 5 888 983; 5 795 972; 5 780 296; 5 945 339; 6 004 804; і 6 010 907, і в Міжнародних Публікаціях № WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; і WO 99/40789. Послідовність SSOMV містить дві галузі, які гомологічні цільовій послідовності, розділені областю, яка містить бажану генетичну зміну, що називається областюмутатором. Область-мутатор може мати послідовність, яка має ту ж довжину, що й послідовність, яка розділяє гомологічні області в цільовій послідовності, але і така, що має відмінну послідовність. Така галузь-мутатор може приводити до заміни. Як альтернатива, гомологічні області в SSOMV можуть бути сусідніми відносно одна одної, а області в цільовому гені, що мають ту ж послідовність, розділені одним, двома або більше нуклеотидами. Такий SSOMV приводить до делеції нуклеотидів із цільового гену, які відсутні в SSOMV. Нарешті, послідовність цільового гену, яка ідентична гомологічним галузям, може в цільовому гені бути сусідньою, але бути відділена одним, двома або більше нуклеотидами в послідовності SSOMV. Такий SSOMV приводить до вставки в послідовність цільового гену. Нуклеотиди SSOMV є дезоксирибонуклеотидами, які зв'язані немодифікованими фосфоефірними зв'язками за винятком зв'язку між нуклеотидами на 3'- і/або 5'-кінці, або як альтернатива, два зв'язки між нуклеотидами на 3'- і/або 5'-кінці можуть бути фосфотіоатними або фосфоамідатними. У цьому описі зв'язок між нуклеотидами являє собою зв'язок між нуклеотидами SSOMV, і не включає зв'язок між нуклеотидом 3'-кінця або нуклеотидом 5'-кінця і замісником, що блокує. Відповідно до конкретного варіанта реалізації довжина SSOMV становить від 21 до 55 дезоксинуклеотидів, а гомологічні області спільно мають довжину щонайменше 20 дезоксинуклеотидів, і щонайменше дві гомологічні області повинні мати довжину щонайменше 8 дезоксинуклеотидів кожна. SSOMV може мати таку конструкцію, щоб бути комплементарним нитці цільового гену, яка кодує або яка не кодує. Коли бажаною мутацією є заміна однієї основи, краще, щоб і нуклеотидмутатор, і цільовий нуклеотид, були піримідинами. Якщо це погодиться з бажаним функціональним результатом, краще, щоб і нуклеотид-мутатор, і цільовий нуклеотид у комплементарному ланцюзі були піримідинами. Особливо кращі SSOMV, які кодують мутації 11 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 трансверсії, тобто, нуклеотид-мутатор С або Т спарюється всупереч принципам комплементарності, відповідно, з нуклеотидом С або Т у комплементарному ланцюзі. Крім олігодезоксинуклеотидів, SSOMV можуть містити 5'-блокуючий замісник, який приєднаний до атомів вуглецю 5'-кінця через лінкер. Хімічна будова лінкера не є критичною, за винятком його довжини, яка повинна становити краще щонайменше 6 атомів, і необхідності, щоб лінкер був гнучким. Можна застосовувати цілий ряд нетоксичних замісників, таких як біоіпн, холестерин або інші стероїди, або неінтеркалюючий катіонний флуоресцентний барвник. Особливо кращі реагенти для одержання SSOMV являють собою реагенти, що продаються під маркою Cy3™ і Cy5™ компанією "Glen Research, Sterling Va." (у цей час "GE Healthcare"), які являють собою заблоковані фосфороамідити, які при включенні в олігонуклеотид дають 3,3,3',3'-тетраметил N,N'-ізопропіл-заміщений індомонокарбоцианіновий та індодикарбоцианіновий барвники, відповідно. Cy3 особливо кращий. У випадку, якщо індокарбоцианін являють собою заміщений N-оксиалкіл, його зручно зв'язати з 5'-кінцем олігодезоксинуклеотиду як фосфодиефір з 5'-кінцевим фосфатом. Хімічні особливості лінкера барвника, розташованого між барвником і олігодезоксинуклеотидом не є критичними, і його вибирають із міркувань зручності синтезу. Якщо для зазначених цілей застосовують комерційний фосфорамідит Cy3, одержувана модифікація 5' складається із замісника, що блокує, і лінкера, разом з яким присутній N-гідроксипропіл, N'-фосфатидилпропіл 3,3,3',3'тетраметил індомонокарбоциамін. Відповідно до кращого варіанта реалізації, індокарбоцианіновий барвник є чотиризаміщеним у положенні 3 і 3' індольних кілець. Без певного теоретичного обґрунтування, ці замісники не дають барвнику бути інтеркалюючим барвником. Ідентичність замісників у цих положеннях не є критичною. Додатково SSOMV може містити 3'-блокуючий замісник. Знову ж, хімічні особливості 3'-блокуючого замісника не є критичними. Розкриті в цій заявці мутації також можна одержати шляхом мутагенезу (випадкового, соматичного або спрямованого) і методик редагування або рекомбінації, включаючи спрямовано вплив на ген із застосуванням сайт-специфічної гомологічної рекомбінації за допомогою нукелеаз із цинковими пальцями, але не обмежуючись ним. Доставка олігонуклеотидів репарації генів у клітини рослин Для доставки олігонуклеотидів репарації генів можна застосовувати будь-який широко відомий спосіб трансформації клітин рослин. Приклади способів перераховані нижче. Мікроносії і мікроволокна Застосування металевих мікроносіїв (мікросфер) для введення великих фрагментів ДНК у клітини рослин, що мають клітинну стінку із целюлози, шляхом "бомбардування", добре відомо фахівцям у цій галузі техніки (надалі – біолістична доставка). У Патентах США № 4 945 050; 5 100 792 і 5 204 253 описані звичайні методики вибору мікроносіїв і пристроїв для їх проектування. Специфічні умови для застосування мікроносіїв у способах згідно із цим винаходом описані в Міжнародній Публікації WO 99/07865. У прикладі способу охолоджені на льоду мікроносії (60 мг/мл), змішаний дуплексний нуклеотид (960 мг/мл), 2,5 М CaCl2 і 0,1 M спермідин додають у порядку згадування; суміш обережно збовтують, наприклад, шляхом перекидання, протягом 10 хвилин і потім залишають при кімнатній температурі на 10 хвилин, після чого мікроносії розбавляють в 5 об'ємах етанолу, центрифугують і ресуспендують в 100 % етанолі. Хороші результати можна одержати при наступних концентраціях у розчині для прикріплення: 8-10 мкг/мл мікроносіїв, 14-17 мкг/мл змішаного дуплексного олігонуклеотиду, 1,1-1,4 М CaCl2 і 18-22 мМ спермідину. Оптимальні результати одержували при умовах: 8 мкг/мл мікроносіїв, 16,5 мкг/мл змішаного дуплексного олігонуклеотиду, 1,3 М CaCl2 і 21 мМ спермідину. При здійсненні цього винаходу олігонуклеотиди репарації генів також можна вводити в клітини рослин за допомогою мікроволокон, що проникають через клітинну стінку і мембрану клітини. У патенті США № 5 302 523 (Coffee і ін.) описане застосування 30 × 0,5 мкм м 10 × 0,3 мкм волокон карбіду кремнію для полегшення трансформації суспензії культур кукурудзи Black Mexican Sweet. Для доставки олігонуклеотидів репарації генів з метою трансмутації можна застосовувати будь-який механічний метод, який можна застосовувати для введення ДНК з метою трансформації клітини рослини із застосуванням мікроволокон. Приклад методики доставки олігонуклеотидів репарації генів за допомогою мікроволокна, полягає в наступному: Стерильні мікроволокна (2 мкг) суспендують в 150 мкл культурального середовища для культивування рослин, що містить близько 10 мкг змішаного дуплексного олігонуклеотиду. Суспензії культури дають осісти, і рівні обсяги упакованих клітин і стерильної суспензії волокна/нуклеотиду збовтують протягом 10 хвилин, і наносять на чашку Петрі. 12 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Селективне середовище наносять негайно або із затримкою приблизно до 120 год., як треба для конкретної ознаки. Електропорація протопластів Відповідно до альтернативного варіанта реалізації, олігонуклеотиди репарації генів можуть бути доставлені в клітину рослини шляхом електропорації протопласта, отриманого із частини рослини. Протопласти одержують шляхом ферментативної обробки частини рослини, зокрема листа, відповідно до методів, добре відомих фахівцям у цій галузі техніки. Див., наприклад, Gallois et al., 1996, в Methods in Molecular Biology 55: 89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp et al., 1999, в Methods in Molecular Biology 133: 213-221, Humana Press, Totowa, NJ. Протопласти не потрібно культивувати в ростовому середовищі перед електропорацією. Приклади умов для 5 електропорації – це 3 × 10 протопластів у загальному об'ємі 0,3 мл при концентрації олігонуклеотиду репарації генів від 0,6 до 4 мкг/мл. Опосередковане ПЕГ поглинання ДНК протопластами Відповідно до альтернативного варіанта реалізації, протопласти рослин поглинають нуклеїнові кислоти в присутності мембрано-модифікуючого агента - поліетиленгліколя, відповідно до методів, добре відомих фахівцям у цій галузі техніки (див., наприклад, GhartiChhetri et al., 1992; Datta et al., 1992). Мікроін'єкції Відповідно до альтернативного варіанта реалізації, олігонуклеотиди репарації генів можна доставляти шляхом ін'єкції за допомогою мікрокапіляра в клітини рослин або в протопласти (див., наприклад, Miki et al., 1989; Schnorf et al., 1991). Добір стійких до гербіцидів рослин і обробка гербіцидом Рослини і клітини рослин можна тестувати на стійкість або толерантність до гербіциду за допомогою широко відомих методів, наприклад, шляхом вирощування рослини або клітини рослини в присутності гербіциду і вимірювання швидкості росту у порівнянні з ростом у відсутності гербіциду. У цьому описі по суті нормальний ріст рослини, органу рослини, тканини рослини або клітини рослини визначають як швидкість росту або швидкість розподілу клітин рослини, органу рослини, тканини рослини або клітини рослини, яка становить щонайменше 35 %, щонайменше 50 %, щонайменше 60 %, щонайменше 75 % від швидкості росту або швидкості розподілу відповідної рослини, органу рослини, тканини рослини або клітини рослини, що експресують білок AHAS дикого типу. У цьому описі по суті нормальний розвиток рослини, органу рослини, тканини рослини або клітини рослини визначають як одну або більше подій розвитку в рослині, органі рослини, тканині рослини або клітині рослини, які по суті подібні з такими подіями, що мають місце у відповідній рослині, органі рослини, тканині рослини або клітині рослини, що експресують білок AHAS дикого типу. Відповідно до деяких варіантів реалізації, органи рослини згідно із цим винаходом включають листя, стебла, коріння, вегетативні бруньки, квітобруньки, меристему, ембріони, сім'ядолі, ендосперми, чашолистки, пелюстки, маточки, плодолисточки, тичинки, пильовики, мікроспори, пилок, пильцеві трубки, сім'ябруньки, зав'язі і плоди, або зрізи, шари або диски, отримані із зазначених елементів, але не обмежуються ними. Тканини рослин включають тканину калуса, основну паренхіму, тканину, що проводить, запасаючу тканину, меристематичні тканини, тканини листя, тканини пагонів, тканини кореня, тканини гала, тканини пухлин рослин і репродуктивні тканини, але не обмежуються ними. Клітини рослин включають ізольовані клітини із клітинною стінкою, різного розміру, агрегати і протопласти таких клітин, але не обмежуються ними. Рослини по суті "толерантні" до відповідного гербіциду, якщо при впливі на них даного гербіциду вони дають криву "доза-відповідь", яка зрушена вправо при порівнянні із кривою, отриманою для подібної нетолерантної рослини при аналогічній обробці. На таких кривих "дозавідповідь" "дозу" відкладають по осі Х, а "відсоток поразки", "гербіцидна дія" та ін., будують по осі Y. Для толерантних рослин потрібно більше гербіциду, ніж для подібних рослин, що не мають толерантності, щоб одержати той же ефект гербіциду. У рослинах, які по суті "стійкі" до гербіциду, спостерігають малі некротичні, літичні, хлорозні або інші ураження, якщо такі ураження взагалі виникають, при впливі на рослину гербіцидом при концентраціях і кількостях, які зазвичай застосовують у співтоваристві агрохіміків для знищення бур'янів на полі. Рослини, які стійкі до гербіциду, також толерантні до гербіциду. ПРИКЛАДИ 13 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 Далі випливають приклади, які ілюструють процедури здійснення цього винаходу на практиці. Ці приклади не слід розглядати як обмежуючі. Всі відсотки наведені як масові частки, а всі співвідношення сумішей розчинників - в об'ємних частках, якщо не зазначено інше. Приклад 1: Приготування стійких до гербіциду зразків Brassica Якщо не зазначено інше, нумерація гену(ів), що застосовується в цьому описі, заснована на послідовності амінокислот синтазсинтази ацетолактату (ALS) або синтази ацетогідроксикислот (AHAS) Arabidopsis At3g48560 (SEQ ID NO: 1). У лабораторних довідниках до жовтня 2005 року положення S653 (на основі послідовності амінокислот в Arabidopsis) називали S621 на основі послідовності амінокислот зернових ZmAHAS 108 і ZmAHAS 109 (Fang et al., 1992). Одна ціль полягала в тому, щоб одержати резистентну до імазетапіру (Imi) заміну амінокислоти S653N або і в BnAHAS I і III ярового канолу (Brassica napus, яровий олійний рапс – що позначається BN-2) і озимого олійного рапсу (WOSR, також Brassica napus – що позначається BN-11). Щоб ампліфікувати цільові області BnAHAS I і III з Brassica napus (спочатку елітна лінія канолу BN-2), розробили пару олігонуклеотидів BnALS1 і BnALS2 (SEQ ID NO: 9 і 10). Оскільки BnAHAS I і III не містять інтронів, BnALS1 і BnALS2 ампліфіціюють цільову область із 284 п.о. як з геномної ДНК, так і з кДНК, що фланкує сайт S653. Дана пара праймерів також призначена для забезпечення можливості ампліфікації цільової області ALS з Arabidopsis. Праймери одержували і ресуспендували в стерильній воді. Спочатку пару праймерів BnALS1/BnALS2 використовували в ПЦР для ампліфікації Скінцевих областей BnAHAS I і III з BN-2. Далі, цільові області ампліфіціювали з додаткових зразків BN-2 і клонували в pGEM-T. Готували клоновані вставки з 12 колоній з кожної з 3 проб геномних ДНК і кДНК, вирощених у нічних культурах, і секвенували за допомогою плазмід, підтверджуючи цільову послідовність. Матричні розчини в гліцерині готували для BN-2 ALS 2c21, як для представника BnAHAS I, і для BN-2 ALS YB10-2g-14, як для представника BnAHAS III для даних цільових областей в 284 п.о. Досліджували цільову область BnALS геномної ДНК і кДНК із BN-2 і реєстрували помилки ПЦР. На основі послідовності BnAHAS I і III з BN-2 створювали один GRON (Олігонуклеотид репарації генів) BnALS1621/C/41/5'Cy3/3'id (SEQ ID NO: 5), щоб здійснити заміну серину на аспарагінову кислоту (AGT → AAT) у положенні 653 (див. Таблицю 1). Вихідні продукти синтезу ресуспендували і визначали їх концентрації. Ресуспендовані олігонуклеотиди зберігали замороженими при -70 °C. Варіант, що некодує, позначили BnALS1621/NC/41/5'Cy3/3'id (SEQ ID NO: 6). Пізніше BnALS1621/NC порівнювали з послідовностями з Genebank. При цьому тільки послідовності з >16 нуклеотидами з 41 гібридизованих були BnAHAS I і III, і при цьому олігонуклеотиди містили єдиний G→A, що спаровується всупереч принципам комплементарності, призначений для введення заміни амінокислот S653. ТАБЛИЦЯ 1 ПОСЛІДОВНОСТІ GRON GRON BnALS1621/C/41/5'Cy3/3'id BnALS1621/NC/41/5'Cy3/3'id BnALS1574/C/41/5'Cy3/3'id BnALS1574/NC/41/5'Cy3/3'id Послідовність VTGTGTTACCGATGATCCCAAATGGTGGCACTTTC AAAGATGH (SEQ ID NO: 5) VCATCTTTGAAAGTGCCACCATTTGGGATCATCGG TAACACAH (SEQ ID NO: 6) VCTTGGGATGGTCATGCAATTGGAAGATCGGTTCT ACAAAGCH (SEQ ID NO: 7) VGCTTTGTAGAACCGATCTTCCAATTGCATGACCA TCCCAAGH (SEQ ID NO: 8) Перетворення основ показане жирним шрифтом. V=CY3; H=3'DMT dC CPG. 40 Цільові області BnALS з елітної лінії Озимого олійного рапсу (WOSR) Cibus BN-11 ампліфіціювали з геномної ДНК і кДНК окремих рослин, встановлених представників BN-11. Послідовності BN-11 BnALS аналізували і реєстрували помилки ПЦР. Додатково до дослідження цільових областей BnALS з BN-2 і BN-11, ті ж цільові області досліджували в комерційному різновиді Clearfield Canola (BN-15). Послідовності BnAHAS з Clearfield Canola аналізували і реєстрували помилки ПЦР, що демонструють очікувані зміни 14 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислот, S653N (AGT → AAT) в BnAHAS I і W574L (TGG → TTG) в BnAHAS III. У підсумку, повні послідовності, що кодують, для BnAHAS I і III ампліфіціювали із застосуванням BnALS3/BnALSOR2 (SEQ ID NOs: 11 і 12) і BnALS3/BnALSOR3 (SEQ ID NO: 11 і 13) відповідно, клонували і секвенували з ліній BN-2, BN-11 і BN-15, які служили еталонними послідовностями для цілей порівняння. Зразки калуса Imi-стійкого BN-2 (Канолу) BnALS1621 N-44-53, отримані при різних видах обробки, піддавали екстракції із застосуванням способу Edwards et al. (1991). Геномну ДНК із цього матеріалу піддавали скринінгу, застосовуючи мікс алель-специфічної ПЦР (AS-PCR) (MM#23, що складається з олігонуклеотидів BnALSOF1, BnALSOR2, BnALSOR3 і BnALSIR1) (SEQ ID NO: 14, 12, 13, і 15, відповідно) для специфічної детекції зміни S653N і мікс алельспецифічної ПЦР (MM#29, що складається з олігонуклеотидів BnALSOF2, BnALSOR4 і BnALSIF1T) (SEQ ID NOs: 16, 17 і 18, відповідно) для специфічної детекції зміни W574L в BnAHAS I або III. Такі первинні результати AS-PCR були невизначеними, і відповідно, брали додаткові зразки BnALS1621 N-54-58 для більшості зразків BnALS1621 N-44-53, і піддавали їх екстракції із застосуванням способу Edwards et al. (1991) з додатковими етапами очищення з метою одержання ще чистішої геномної ДНК. У даному пункті, зразки BnALS1621N-54-58 ампліфіціювали зі сполученням праймерів BnALSOF2, BnALSOR2 і BnALSOR3, і одержували невелику кількість ампліфіційованого продукту. Ці продукти звичайним способом клонували в pGEM-T, і 12 білих колоній на лінію одержували як нічні культури, приготовлені за допомогою плазмід (із застосуванням набору Qiagen plasmid miniprep), і секвенували з використанням реагентів для секвенування BigDye 3.1. Попередній аналіз послідовностей дозволив визначити, що BnALS1621N-55-13 містить мутацію S653N в BnAHAS III (AGT → AAT), а два інших клони з даної лінії, BnALS1621N-55-15 і 19, були дикого типу за BnAHAS III. Реєстрували результат повного аналізу послідовності. Щоб підтвердити, що цей єдиний позитивний результат не є наслідком помилки ПЦР, ще 38 колоній з даної лінії за допомогою скринінгу піддали методом алель-специфічної ПЦР. 8 найсильніших за результатом даного добору методом AS-PCR позитивних зразків BnALS1621N-55-1-8 вирощували як нічні культури, ізолювали і секвенували ДНК плазмід. Сім з 8 позитивних колоній BnALS1621N-55-2-8 за даними секвенування методом AS-PCR були позитивними на мутацію S653N в BnAHAS III; інший BnALS1621N-55-l являв собою послідовність BnAHAS I дикого типу. У сукупності ці результати вказували на те, що лінія BnALS1621N-55 гетерозиготна за мутацією S653N в BnAHAS III. Зразок BnALS1621N-55 був паралельним зразком калуса з того ж вихідного Imi-стійкого калуса, що й BnALS1621N-49. Геномну ДНК із цих зразків ампліфіціювали зі сполученням праймерів BnALSOF2, BnALSOR2 і BnALSOR3, і фрагменти легко клонували в pGEM-T і трансформували. MM#23 застосовували для скринінга 38 білих колоній на мутацію S653N, та ідентифікували 4 позитивні колонії (BnALS1621N-49-9-12). Ці колонії були секвеновані. Три з чотирьох колоній (BnALS1621N-49-9, 10 і 12) містили мутацію S653N в BnAHAS III. Аналогічний спосіб клонування цільової області за допомогою алель-специфічної-ПЦР з підтвердженням послідовності застосовували для ідентифікації інших ліній з поліморфізмом S653N. Серед них була лінія BnALS-97. BnALS-97 регенерували в рослину і чекали, поки воно дасть насіння. Оскільки дана лінія була прототипом (як рослина), клонували і секвенували повні послідовності, що кодують, і BnAHAS I, і III. У цій лінії єдиним поліморфізмом у порівнянні з послідовністю BN-2 дикого типу була зміна в кодоні AGT → AAT, що приводило до заміни амінокислот S653N в BnAHAS III. Попередній аналіз послідовності клонованих випадковим чином ампліконів BnALSOF2/BnALSOR2 і BnALSOF2/BnALSOR3 з лінії BnALS1621N-57 вказував на те, що обидва клони BnALS1621N-57-43 і 46 містили мутацію W574L (TGG → TTG) в BnAHAS I. Провели аналіз повної послідовності, і показали, що лінія 57 гетерозиготна, оскільки клони 38 і 41 включали W574. Відповідно, для ампліфікації даного фрагмента з BnALS1621N-57 і BnALS1621N-45 застосовували сполучення праймерів BnALSOF2, BnALSOR2 і BnALSOR3, паралельний зразок калуса з того ж вихідного Imi-стійкого калуса як BnALS1621N-57, що вшивається звичайним чином в pGEM-T, трансформували і наносили на чашки із застосуванням синьої/білої селекції. MM#29 застосовували для скринінга 19 білих колоній на наявність W574L з кожної чашки на BnALS1621N-57 і BnALS1621N-45, причому з 4 позитивні колонії для кожного (BnALS1621N-451, 2, 9 і 18, і BnALS1621N-57-1, 7, 13 і 16) одержували плазміди і секвенували їх. Аналіз послідовностей показав, що всі 8 колоній містили мутацію W574L в BnAHAS I. Оптимізували температуру відпалу для MM#29, і проводили скринінг додаткових 19 колоній із застосуванням новихумов. З трьох позитивних колоній (BnALS1621N-57-17, 18 і 19) одержували плазміди і секвенували їх. 15 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 Одержували додаткові зразки Imi-стійкого Канолу BnALS-68-91 і екстрагували ДНК за допомогою способу Edwards et al., (1991). З кожного зразка для ампліфікації фрагментів BnAHAS I та III застосовували сполучення праймерів BnALSOF2, BnALSOR2 і BnALSOR3, і легко їх клонували в pGEM-T. Застосовуючи MM#23 у реакціях AS-ПЦР для детекції мутації S653N, проводили скринінг 12 колоній на одну лінію, і результати виявили 2 позитиви з лінії BnALS-81 (BnALS-81-203 і 208) і 4 з лінії BnALS-76 (BnALS-76-153, 154, 156 і 162) на вміст мутації S653N мутації в BnAHAS III шляхом секвенування. Проводили аналіз повної послідовності. Шляхом скринінга методом алель-специфічної ПЦР із MM#23, визначили, що й ампліфіційовані шляхом ПЦР цільові області і області колоній бактерій з одиночними клонованими вставками, лінії BnALS-159 (молекулярно-біологічний зразок 102; колонія 655) мають мутацію S653N в BnAHAS I (S653N у вихідній послідовності Cibus) у даному гені. Нарешті, визначили, що в лінії BnALS-83 (молекулярно-біологічний зразок 91), дикий тип (колонія 408) і мутант (колонії 403, 405 і 406), гетерозиготні за мутацією S653T (AGT → ACT) в BnAHAS I. Що стосується рослин, було підтверджено, що лінія BnALS-83 була гетерозиготною за BnAHAS I відносно мутації S653T. Провели подальший скринінг із застосуванням MM#23 (S653N) і MM#29 (W574L) нових Imi-стійких ліній Канолу BN-2 BnALS-76 і BnALS-123. Оскільки вищезгадані очікувані мутації не виявили в даних зразках, 12 BnALSOF2/OR2/3 клонували і секвенували. Всі 7 клонів BnAHAS III по BnALS-123 (колонії 5, 17-19, 21, 22, 26 і 28) були позитивними відносно мутації S653T. Однак насіння від Rl генотипували як гетерозиготи. Крім того, N-кінцеві фрагменти кожного з BnAHAS I та III, отримані шляхом ПЦР, клонували і секвенували на BnALS-58, 68 і 69 із застосуванням, відповідно, сполучень олігонуклеотидів BnALS3/BnALS8 (SEQ ID NO: 11 і 19, відповідно). Одержували новий зразок тканини на BnALS96, і N-кінцеві фрагменти BnAHAS I та III, отримані шляхом ПЦР, клонували і секвенували, і показали, що лінія на BnALS-96 містить мутацію A205V (GCC → GTC) в BnAHAS I. Всі чотири клони повнорозмірної кодуючої послідовності амплікону BnALS3/OR2 з матеріалу рослини, отриманої з калуса лінії BnALS-68, містили зміну A205V (GCG → GTG) в BnAHAS III, ідентичну зміні в BnALS-69. У ліній визначали наявність мутації; експеримент, у ході якого їх одержували, і обробка, представлені в узагальненому вигляді в Таблиці 2. Лінія BnALS-159 загинула як лінія калуса і не дала пагонів. У Таблиці 3 представлені приклади олігонуклеотидів, що застосовуються в експериментах, які описані у цій заявці. ТАБЛИЦЯ 2 МУТАЦІЇ В ЗРАЗКАХ IMI-СТІЙКИХ ТКАНИН BN КАНОЛУ Лінія (CS#) BnALS-96 BnALS-68 BnALS-69 BnALS-58 BnALS-63 BnALS-57 BnALS-67 BN02-204-A01 BN02-224-C01 BN02-224-B01 BnALS-76 BnALS-159* BnALS-55 BnALS-97 BnALS-61 BnALS-84 BnALS-83 BnALS-123 BN02-139-E07 BN02-139-D05 Мутація A205V A205V A205V A205D W574C W574L W574L W574L;R577W W574L (НЕМАЄ) W574M (НЕМАЄ) W574S S653N S653N S653N S653N S653N S653T S653T W574C(het);S653N A205V;S653N SNP GCC → GTC GCG → GTG GCG → GTG GCC → GAC TGG → TGT TGG → TTG TGG → TTG TGG → TTG; CGG → TGG TGG → TTG TGG → ATG TGG → TCG AGT → AAT AGT → AAT AGT → AAT AGT → AAT AGT → AAT AGT → ACT AGT → ACT TGG → TGC; AGT → AAT GCG → GTG;AGT → AAT 16 Ген I III III I III I I III III III III I III III III III I III III III Лінія BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 UA 103887 C2 Лінія (CS#) BN02-139-F08 BN02-139-C03 BN02-139-D06 BN02-139-E10 BN02-139-A13 BN02-139-A12 BN02-139-F09 BN02-139-A01 BN02-139-D-04 BN02-139-B11 Мутація A205V;S653N A205V(het);S653N W574C;S653N W574L;S653N W574L(het);S653N D376E;S653N A122V;S653N A205D, S653N W574C; S653N W574C; S653N SNP GCG → GTG;AGT → AAT GCC → GTC; AGT → AAT TGG→TGC; AGT→AAT TGG→ TTG; AGT→AAT TGG→TTG; AGT→AAT GAC→ GAG; AGT→AAT GCT→GTT; AGT →AAT GCG→ GAC; AGT→AAT TGG→TGC; AGT→AAT TGG→TGC; AGT→AAT Ген III I;III I;III I;III III III I;III I;III I;III I;III Лінія BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 ТАБЛИЦЯ 3 ПРИКЛАДИ ОЛІГОНУКЛЕОТИДІВ Назва BnALSl (SEQID NO: 9) BnALS2 (SEQ ID NO: 10) BnALS3 (SEQ ID NO: 11) BnALSOR2 (SEQ ID NO: 12) BnALSOR3 (SEQ ID NO: 13) BnALSOF1 (SEQ ID NO: 14) BnALSIR1A (SEQ ID NO: 15) BnALSOF2 (SEQ ID NO: 16) BnALSOR4 (SEQ ID NO: 17) BnALSIF1T (SEQID NO: 18) BnALS8 (SEQ ID NO: 19) BnALS9 (SEQ ID NO: 20) 5 10 15 20 25 30 Довжина 24 29 20 28 28 28 30 28 28 26 21 21 Послідовність олігонуклеотиду ATGCAATGGGAAGATCGGTTCTAC CCATCYCCTTCKGTTATKACATCKTTGAA CTAACCATGGCGGCGGCAAC AGTCTGGGAACAAACCAAAAGCAGTACA CGTCTGGGAACAACCAAAAGTAGTACAA AGTGACGAAGAAAGAAGAACTCCGAGAA CTGTTATTACATCTTTGAAAGTGCCACAAT TGACGGTGATGGAAGCTTCATAATGAAC GTCCWGGTGTATCCAGCATTGTCTGAAT CAGCATCTTGGGATGGTCATGCAGTT CCCATCAAAGTACTCGCACCG CCCATCAACGTACTCGCACCA Після появи пагонів проводили схрещування у всіх перестановках і сполученнях. Лінія BnALS-97 є еталоном S653N в BnAHAS III. Лінія BnALS-57 є еталоном is W574L в BnAHAS I. І BnALS-68, і 69 висунули як еталонні лінії для A205V в BnAHAS III. Лінія BnALS-83 є першою лінією, яка була гетерозиготною за S653T в BnAHAS I як калус, який також повинен бути гетерозиготним, як і рослина. Приклад 2: Матеріали і методи Робочий опис культури клітин. Пагони, отримані з насіння і з ембріонів, отриманих з мікроспор, вирощували в стерильних умовах in vitro. Черешки субкультивували кожні 2-4 тижня і культивували на чашках Петрі (25 мм 90 мм) в об'ємі 40-45 мл середовища RS (Dovzhenko, 2001). Чашки запечатували стрічкою Micropore (3M Company). Молоде листя застосовували для виділення протопластів. Виділення і очищення протопластів. Приблизно 600 мг тканини листя 2-3 пагонів тижневого віку, вирощених in vitro, розрізали на маленькі смужки скальпелем у чашку Петрі з 5 мл середовища В (Pelletier et al., 1983), pH доводили до 5,8. Через приблизно 1 год., середовище В заміняли на розчин ферментів, що складається із середовища В, у якому були розчинені 0,5 % (м/о) Целюлази YC і 0,75 % (м/о) Мацерозиму RIO (обоє від компанії "Karlan Research Products", Коттонвуд, Арізона), 1 г/л бичачого сироваткового альбуміну і 1 г/л 2морфоліноетансульфонової кислоти. Розчин ферментів нагнітали під вакуумом у тканину листя, і чашку зі шматочками листя у розчині ферментів інкубували при 25 °C у темряві. Очищення протопласта проводили за допомогою градієнта щільності йодиксанолу (адаптовано з короткої інструкції Optiprep Cl 8; Очищення інтактних протопластів рослин; Axis-Shield USA, 10 Commerce Way, Norton, MA 02776). Після центрифугування в градієнті щільності смугу з очищеними протопластами відбирали разом із приблизно 5 мл середовища W5 (Frigerio et al., 1998). Вихід протопласта визначали за допомогою гемоцитометра, і протопласти зберігали протягом 2 год. при 4 °C. Введення олігонуклеотиду репарації генів. Суспензію протопластів змішували з рівним обсягом середовища W5, переносили в пробірку для центрифугування об'ємом 50 мл і центрифугували протягом 5 хвилин при мінімальній установці клінічної центрифуги (близько 50 g). Надосадову рідину відбирали і заміняли на середовище ТМ (Klaus, 2001), коректуючи 17 UA 103887 C2 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6 щільність протопласта до 5 × 10 /мл. Аліквоти по 100 мкл, що містять 5 × 10 протопластів у кожній, розподіляли в пробірки для центрифугування із круглим дном. Після цього GRON, призначені для забезпечення мутацій в одному з генів AHAS, вводили в протопласти шляхом обробки ПЕГ. Щоб ввести GRON у протопласти, 1 2,5 мкг GRON розчиняли в 25 мкл очищеної води і 125 мкл розчину поліетиленгліколю (5 г ПЕГ MW 1500, 638 мг манітолу, 207 мг CaNO 3 × 4H2O і 8,75 мл очищеної води); рН доводили приблизно до 9,0). Через 30 хвилин інкубації на льоду суспензію протопластів-ПЕГ промивали середовищем 5W і ресуспендували в середовищі В. Суспензію зберігали протягом ночі в холодильнику приблизно при 4 °C. Введення протопластів в альгінат кальцію. Через один день після введення GRON. Протопласти вводили в альгінат кальцію. Було показано, що впровадження протопластів у гелієві субстрати (наприклад, агароза, альгінат) збільшує виживання протопластів і підвищує частоту поділу клітин, отриманих із протопластів. Застосовуваний спосіб був заснований на способі, описаному Dovzhenko (2001). Культура протопластів і селекція імазетапір-стійких клітин. Селекцію імазетапір-стійких калусів проводили із застосуванням послідовних підкультур альгінатів у середовищі за Pelletier et al. (1983). Селекцію починали через тиждень після обробки ПЕГ/GRON при концентрації 0,5 мкм імазетапіру. Гербіцид не мав негайного ефекту. Спочатку всі мікроколонії, які сформувалися в ранній фазі культивування без імазетапіру, продовжували рости, але повільніше, ніж контроль без додавання гербіциду. Через один - два тижні після початку селекції колонії сповільнювали ріст або припиняли рости. Перед закінченням фази селекції в рідкому середовищі клітини і колонії виділяли з альгінату шляхом обробки їх протягом 30-45 хвилин культуральним середовищем, що містить 50 мМ цитрату натрію. У момент переносу виділених колоній з рідкого середовища у тверде, більшість колоній або гинули, або утворювали зеленуватий центр, покритий зовнішніми шарами відмерлих клітин. На затверділому середовищі Е для селекції більшість мікрокалусів, які зберігали живі клітини, припиняли рости і ставали коричнюватими. Обмежений ріст окремих калусів тривав у рідких випадках, але калуси, що не мають стійкості, у підсумку ставали коричневими і гинули. Через два - три тижні після переносу на затверділе середовище для селекції (рідко - раніше) серед фону коричнюватих клітин і мірокалусів з'являлися калуси, що ростуть активно. Регенерація рослин зі стійких до гербіцидів калусів, отриманих із протопластів з підтвердженою мутацією в гені AHAS. Imi-стійкі калуси, які розвилися на отверділому середовищі для селекції, і в яких при аналізі визначили наявність у ДНК мутації, переносили в середовище Е без гербіциду (Pelletier et al., 1983), щоб прискорити розвиток. Окремі лінії калусів варіювали за швидкістю росту і за морфологією. У цілому, розвиток у напрямку регенерації пагонів проходив наступні стадії: Недиференційований, зелений калус > калус із темно-зеленими областями > розвиток коріння > розвиток перших пагонів > розвиток дрібних пагонів з гіпергідрованим (засклованим) листям. Розвиток окремої лінії калуса варіювало, але внаслідок постійного субкультивування і розмноження на середовищі Е або модифікаціях середовища Е зі ще нижчою концентрацією альфа-нафталін оцтової кислоти (NAA) у підсумку багато ліній калусів дали пагони. Після того, як середовищу Е формувалися пагони із трьома або чотирма листками, їх переносили на середовище RS (Dovzhenko, 2001). На цьому середовищі згодом тканина пагонів і листя розвивалася так, що була морфологічно "нормальною" (тобто, не гіпергідрованою). Після того, як in vitro паростки давали корінь, застосовували стандартні методики адаптації у тепличних умовах. Приклад 4: Результати розпилення гербіцидів Рослини B. napus на стадії 5-6 листків обприскували різними AHAS-інгібуючими гербіцидами. Рослини B. napus, включаючи материнську лінію BN02 (або при необхідності BN 11), BN 15 (Clearfield, перевірка двох комерційних генів) і мутанти, обприскували, як докладно описано нижче. Гербіциди розпорошували в присутності 0,25 % сурфактанту AU391 у наступних кількостях (витрата): Імазамокс (Beyond™) 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 32 і 48 унцій активного інгредієнту/акр (аі/A) Тифенсульфурон 0,028, 0,056, 0,112, 0,168 фунтів аі/А Трибенурон 0,015, 0,03, 0,06, 0,12, 0,18 фунтів аі/А Нікосульфурон фунтів 0,06, 0,120, 0,24, 0,36 аі/А Римсульфурон 0,015, 0,03, 0,06, 0,12, 0,18 фунтів аі/А 2:1 маси:маси Тифенсульфурон / Трибенурон 0,056, 0,1 12, 0,224, 0,336 фунтів аі/А 2,22:1 Тифенсульфурон / Нікосульфурон 0,058, 0,1 16, 0,232 фунтів аі/А 18 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Примісульфурон 0,035, 0,070, 0,140 фунтів аі/А Флуметсулам 0,040, 0,080, 0,16 фунтів аі/А Хлорамсулам 0,039, 0,078, 0,156 фунтів аі/А. Гербіциди наносили шляхом обприскування листя, причому контрольні рослини не обприскували. За винятком імазамоксу, всі досліджені AHAS-інгібуючі гербіциди оцінювали через 14 днів після розпилення за шкалою ушкодження 1-10, де 1 означало загибель, а 10 означало неушкоджений неопрацьований контроль. Індивідуальні лінії рослин оцінювали при кожному об'ємі розпилення у порівнянні з поводженням контролю при цьому об'ємі. Результати досліджень розпилення представлені на Фіг. 4. Хімікати, що тестуються: Генотип (число сіянців при всіх об'ємах) Тифенсульфурон: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18) Трибенурон: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18), 63 (9) Нікосульфурон: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18) THI / TRI: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18) Римсульфурон: BN2 (6), BN15 (6), BN15 xBnALS-57 (18), 63 (9) THI / Nic: BN2 (18), 63 (9), BN15xBnALS-57 (36), BN15 (18) Примісульфурон: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15 xBnALS-57 (18) Флуметсулам: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18) Хлорамсулам: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18) Дослідження з Імазамоксом оцінювали в такий спосіб: 10 балів за: 8, 16, 32 і 48 унцій/А BnALS-83xBnALS-123, BnALS-96xBnALS-123, BnALS97xBnALS-57, BN15 xBnALS-57, BN2, BN15, BnALS-97xBN15 17 балів за: 4 і 12 унцій/А BnALS-97xBnALS-57, BN15xBnALS-97, BN2 28 балів за: 2, 4, 6, 8 унцій/А для всіх окремих факторів мутацій. Імазамокс: 2 унцій/А: BN2 (18), BnALS-123 (9), BnALS-96 (9), BnALS-97 (18), BnALS-83 (6), BnALS-76 (18), BnALS-58 (9), BnALS-57 (12) 4 унцій/А: BN2 (18), BnALS-123 (9), BnALS-96 (9), BnALS-97 (18), BnALS-83 (9), BnALS-76 (18), BnALS-58 (9), BnALS-57 (12), BnALS-97xBN15 (15), BnALS-97xBnALS-57 (14) 6 унцій/А: BN2 (9), BnALS-123 (9), BnALS-96 (12), BnALS-97 (9), BnALS-83 (12), BnALS-76 (9), BnALS-57 (12) 8 унцій/А: BnALS-123 (9), BnALS-96 (12), BnALS-83 (12), BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS96xBnALS-123 (18), BN2 (18), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (15), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18) 12 унцій/А: BnALS-97xBN15 (15), BnALS-97xBnALS-57 (14), BN2 (12) 16 унцій/А: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (15), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18) 32 унцій/А: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (13), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18) 48 унцій/А: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (6), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18) Посилання Datta SK, Datta K, Soltanifar N, Donn G, Potrykus 1 (1992) Herbicide-resistant Indica rice plants from IRRl breeding line IR72 after PEG-mediated transformation of protoplasts. Plant Molec. Biol. 20:619-629. Dovzhenko A (2001) Towards plastid transformation in rapeseed (Brassica napus L.) and sugarbeet (Beta vulgaris L.). PhD Dissertation, LMU Munich, Faculty of Biology. Edwards K, Johnstone C, Thompson C (1991) A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19:1349. Frigerio L, Vitale A, Lord JM, Ceriotti A, Roberts LM (1998) Free ricin A chain, proricin, and native toxin have different cellular fates when expressed in tobacco protoplasts. J Biol Chem 273: 1419414199. Fang LY, Gross PR, Chen CH, Lillis M (1992) Sequence of two acetohydroxyacid synthase genes from Zea mays. Plant MoI Biol. 18(6): 1185-7. Gharti-Chhetri GB, Cherdshewasart W, Dewulf J, Jacobs M, Negrutiu I (1992) Polyethylene glycol-mediated direct gene transfer in Nicotiana spp. Physiol. Plant. 85:345-351. Klaus S (2003) Markerfreie transplastome Tabakpflanzen (Marker-free transplastomic tobacco plants). PhD Dissertation, LMU Munich, Faculty of Biology. Miki B, Huang B, Bird S, Kemble R, Simmonds D, Keller W (1989) A procedure for the microinjection of plant cells and protoplasts. Meth. Cell Science 12: 139-144. 19 UA 103887 C2 5 10 15 20 25 30 Pelletier G, Primard C, Vedel F, Chetrit P, Remy R, Rouselle P, Renard M (1983) Intergeneric cytoplasm hybridization in Cruciferae by protoplast fusion. MoI. Gen. Genet. 191: 244-250. Schnorf M, Neuhaus-Url G, Galli A, Iida S, Potrykus I, Neuhaus G (1991) An improved approach for transformation of plant cells by microinjection: molecular and genetic analysis. Transgen. Res. 1:23-30. Tan S, Evans RR, Dahmer ML, Singh BK, Shaner DL (2005) Imidazolinone-tolerant crops: history, current status and future. Pest Manag Sci. 61(3):246-57. Якщо не зазначено інше, всі технічні і наукові терміни в цій заявці мають ті ж значення, які зазвичай має на увазі будь-який фахівець у цій галузі, до якої відноситься цей винахід. Приклади реалізації винаходу, наведені в цій заявці, можуть бути коректно здійснені і під час відсутності якого-небудь елемента або елементів, обмеження або обмежень, які не зазначені особливо. Так, наприклад, терміни "що містить", "що включає" та ін. варто розуміти широко і без обмежень. Крім того, терміни та висловлювання, що застосовуються в цій заявці, застосовуються для опису, а не для обмеження, без наміру застосовувати такі терміни і висловлювання для виключення яких-небудь ознак, еквівалентних показаних і описаним, або їх частин. Варто розуміти, що різні модифікації можливі в межах області заявленого винаходу. Таким чином, варто розуміти, що хоча цей винахід розкритий зокрема шляхом опису кращих варіантів реалізації і можливих ознак, фахівці в цій галузі техніки можуть прибігати до модифікацій, удосконалень і варіацій винаходів, розкритих у цьому описі. Такі модифікації, удосконалення і варіації вважаються включеними в обсяг даного винаходу. Матеріали, способи і приклади, представлені в цій заявці, є прикладами кращих варіантів реалізації, наведені як приклади, і не призначені для обмеження обсягу винаходу. Винахід був розкритий у цьому описі і у загальному. Кожний зі ще вужчих видів і підродів, що підпадають під родові поняття, також є частиною винаходу. Також включений загальний опис винаходу із застереженням або негативним обмеженням, що виключає які-небудь об'єкти з родового поняття, незалежно від того, чи цитувався виключений матеріал у цій заявці. Крім того, коли ознаки або аспекти винаходу розкриваються в термінах груп Маркуша, фахівці в цій галузі техніки повинні розуміти, що винахід так само описаний у термінах будьякого окремого члена або підгрупи членів групи Маркуша. Всі публікації, заявки на патенти, патенти та інші джерела, що згадуються в цій заявці, прямо включені в цю заявку за допомогою посилання на їх повну версію, так само як якби кожне джерело було включено за допомогою посилання індивідуально. У випадку невідповідностей, цей опис, включаючи визначення, буде пріоритетним. Інші варіанти реалізації викладені нижче у формулі винаходу. 35 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 40 45 50 55 60 1. Спосіб одержання стійкої до гербіцидів рослини, який включає: (a) введення в клітину рослини одноланцюгового олігонуклеотиду репарації генів (GRON) зі спрямованою мутацією у гені синтази ацетогідроксикислот (AHAS) з одержанням клітини рослини з геном AHAS, що експресує білок AHAS, який містить мутацію, вибрану з групи, що включає: заміну аланіну на валін у положенні, що відповідає положенню 205 послідовності SEQ ID NO: 1; та заміну аланіну на аспарагінову кислоту у положенні, що відповідає положенню 205 послідовності SEQ ID NO: 1; (b) ідентифікацію клітини рослини, що має по суті нормальний ріст і каталітичну активність у порівнянні з клітиною рослини дикого типу у присутності AHAS-інгібуючого гербіциду; та (с) регенерування нетрансгенної стійкої до гербіцидів рослини, що несе мутований ген AHAS, із зазначеної клітини рослини. 2. Спосіб за п. 1, у якому ген AHAS кодує білок, який є стійким до інгібування AHAS-інгібуючим гербіцидом. 3. Спосіб за п. 2, у якому AHAS-інгібуючий гербіцид вибраний з групи, що включає гербіциди класів: імідазолінону, сульфонілсечовини, триазолопіримідину, піримідинілтіобензоату, сульфоніламіно-карбонілтриазоліну та їх суміші. 4. Спосіб за п. 1, 2 або 3, у якому ген AHAS кодує білок, що має 70% або більше ідентичність до однієї або більше з послідовностей амінокислот SEQ ID NO: 21 - SEQ ID NO: 62. 5. Спосіб за п. 1, 2, 3 або 4, у якому стійка до гербіцидів рослина вибрана з групи, що включає цукровий буряк, олійний рапс та канолу; при цьому гербіцид являє собою сульфонілсечовинний гербіцид. 20 UA 103887 C2 21 UA 103887 C2 22 UA 103887 C2 23 UA 103887 C2 24 UA 103887 C2 25 UA 103887 C2 26 UA 103887 C2 27 UA 103887 C2 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMutated acetohydroxyacid synthase genes in brassica
Автори російськоюSchopke, Christian, Gocal, Greg F. W., Walker, Keith, Beetham, Peter, R.
МПК / Мітки
МПК: A01H 1/06, C12N 5/04, C12N 15/82, C12Q 1/68
Мітки: спосіб, рослини, стійкої, гербіцидів, одержання
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/85-103887-sposib-oderzhannya-stijjko-do-gerbicidiv-roslini.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб одержання стійкої до гербіцидів рослини</a>
Попередній патент: Спосіб обробки алюмінієвих розплавів
Наступний патент: Спосіб одержання розплаву сталі із вмістом марганцю до 30 мас. %
Випадковий патент: Кристалічний хіміотерапевтичний засіб