Модифікований інсектицидний білок cry1са та спосіб боротьби з лускокрилими комахами з його використанням

Реферат: Даний винахід стосується модифікованих інсектицидних білків B.t. Cry1Ca, що включають білки, які позначаються в даному описі як DIG-109 і DIG-152, а також варіантів DIG-109 і DIG-152, нуклеїнових кислот, що кодують ці білки, способів боротьби з паразитами з використанням цих білків, способів продукування цих білків в трансгенних клітинах-хазяїнах і трансгенних рослин, які продукують ці білки. Білки DIG-109 і DIG-152 містять химерні пептиди, що складаються з сегмента центрального токсину B.t. Cry1Ca і сегмента протоксину Cry1Ab. Також описані інсектицидно активні варіанти білків DIG-109 і DIG-152. UA 112286 C2 (12) UA 112286 C2 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь винаходу Даний винахід стосується нових інсектицидних Cry-білків і їх застосування для боротьби з шкідливими комахами. Рівень техніки винаходу Совка трав'яна (FAW; Spodoptera frugiperda) викликає значні пошкодження кукурудзи і інших культур, таких як соя і бавовна. Bacillus thuringiensis (B.t.) являє собою бактерію, що передається через ґрунт, яка продукує пестицидні кристалічні білки, відомі як дельта-ендотоксини або Cry-білки. Cry-білки є пероральними токсичними речовинами, які функціонують, впливаючи на клітини середньої кишки сприйнятливих комах. Великий перелік дельта-ендотоксинів підтримується і регулярно оновлюється на web-сайті: lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html. Трансгенна кукурудза, що експресує гени, які кодують Cry-білки, особливо Cry1F, забезпечує ефективність проти FAW на комерційному рівні. Незважаючи на успіх FAW-стійкої трансгенної кукурудзи, можливість розвитку стійких популяцій комах загрожує тривалому терміну служби Cry-білків в боротьбі з FAW і створює необхідність у відкритті і розробці нових Cry-білків для боротьби з FAW та іншими паразитами. Стійкість комах до Cry-білків B.t. може розвинутися за допомогою декількох механізмів (Heckel et al., 2007, Pigott and Ellar, 2007). У комах була ідентифікована множина класів рецепторних білків для Cry-білків, і в кожному класі рецепторів існують множинні приклади. Стійкість до конкретного Cry-білка може розвиватися, наприклад, за допомогою мутації в частині домену, що зв'язує токсин, кадгерину рецепторного білка. Інший шлях стійкості може опосередковуватись протеазою, що здійснює процесинг протоксину. Таким чином, стійкість до токсинів Cry у видах Lepidoptera має комплексну генетичну основу щонайменше чотирма різними основними генами стійкості. Комахи Lepidopteran, стійкі до Cry-білка, розвинулися в польових умовах серед Plutella xylostella (Tabashnik, et al., 1994), Trichoplusia ni (Janmaat and Myers 2003, 2005), і Helicoverpa zeae (Tabashnik et al., 2008). Розробка нових високоефективних Cry-білків може забезпечити додаткові інструменти для контролю FAW і інших комах-паразитів. Cry-білки з різними механізмами дії, що продукуються в комбінації в трансгенній кукурудзі, можуть попередити розвиток стійкості у комах FAW і забезпечити тривалий термін застосовності технології B.t. для боротьби з шкідливими комахами. Короткий опис суті винаходу Даний винахід стосується інсектицидних Cry-білків B.t., що включають білки, що позначаються в даному описі як DIG-109 і DIG-152, а також варіантів DIG-109 і DIG-152, нуклеїнових кислот, що кодують ці білки, способів боротьби з паразитами з використанням цих білків, способів продукування білків в трансгенних клітинах-хазяїнах і трансгенних рослин, які продукують ці білки. Як описано в прикладі 1, білки DIG-109 і DIG-152 містять химерні пептиди, що складаються з сегмента центрального токсину. Також описані інсектицидно активні варіанти білків DIG-109 і DIG-152. Несподіване відкриття, описане в даному описі, полягає в тому, що білки DIG-109 і DIG-152 є активними проти популяцій личинок совки трав'яної і личинок очеретяної вогнівки, які є стійкими до Cry1F. Таким чином, білки DIG-109 і DIG-152 є ідеальними кандидатами для застосування в боротьбі з паразитами Lepidopteran. Ці білки можна використовувати окремо або в комбінації з іншими Cry-білками, такими як Cry1F, Cry1Ab і Cry1Ac, для боротьби з розвитком стійких популяцій комах. Для обговорення таких паразитів див., наприклад, Tabashnik, PNAS (2008), vol. 105 No. 49, 19029-19030. Іншим аспектом винаходу є інсектицидно активні фрагменти DIG-109 і DIG-152, і нуклеотиди, що кодують такі фрагменти. В одному варіанті здійснення винахід стосується виділеного поліпептиду білка DIG-109, що містить сегмент центрального токсину, вибраний з групи, що складається з: (a) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність із залишків 28-619 SEQ ID NO: 1; (b) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90% ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю із залишків 28-619 SEQ ID NO: 1; (с) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність із залишків 28-619 SEQ ID NO: 1 з аж до 20 амінокислотними замінами, делеціями або модифікаціями, які не чинять несприятливого ефекту на експресію або активність білка, що кодується SEQ ID NO: 1. В іншому варіанті здійснення винахід стосується виділеного поліпептиду токсину DIG-109, що містить сегмент центрального токсину DIG-109, вибраний з групи, що складається з: (a) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність із залишків 1-619 SEQ ID NO: 1; 1 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (b) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90% ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю із залишків 1-619 SEQ ID NO: 1; (с) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність із залишків 1-619 SEQ ID NO: 1 з аж до 20 амінокислотними замінами, делеціями або модифікаціями, які не чинять несприятливого ефекту на експресію або активність білка, що кодується SEQ ID NO: 1. В іншому варіанті здійснення винахід стосується рослини, що містить білок DIG-109. В іншому варіанті здійснення винахід стосується способу боротьби з популяцією паразитів, що включає контактування вказаної популяції з пестицидно ефективною кількістю білка DIG109. В іншому варіанті здійснення винахід стосується виділеної нуклеїнової кислоти, яка кодує білок DIG-109. В іншому варіанті здійснення винахід стосується конструкції ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок DIG-109, функціонально зв'язаний з промотором, який походить не з Bacillus thuringiensis і здатний запускати експресію в рослині. Також винахід стосується трансгенної рослини, яка містить конструкцію ДНК, стабільно вбудовану в його геном, і способу захисту рослини від паразитів, що включає введення конструкції у вказану рослину. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO: 1 сегмент центрального токсину Cry1Ca; 619 а. к. SEQ ID NO: 2 перший сегмент протоксину Cry1Ab; 545 а. к. SEQ ID NO: 3 химерний білок DIG-152; 1164 SEQ ID NO: 4 другий сегмент протоксину Cry1Ab; 545 а. к. SEQ ID NO: 5 химерний білок DIG-109; 1164 SEQ ID NO: 6 пептид Cry1Ca436; 10 а. к. SEQ ID NO: 7 пептид Cry1Ca591; 10 а. к. SEQ ID NO: 8 оптимізована для кукурудзи CDS, що кодує DIG-109; 3492 п. о. SEQ ID NO: 9 олігонуклеотид ZGP3S; 21 нуклеотид SEQ ID NO: 10 олігонуклеотид ZGP3A; 21 нуклеотид SEQ ID NO: 11 олігонуклеотид TQZGP3; 23 нуклеотиди SEQ ID NO: 12 олігонуклеотид DSM2S; 17 нуклеотидів SEQ ID NO: 13 олігонуклеотид DSM2A; 19 нуклеотидів SEQ ID NO: 14 олігонуклеотид DSM2FQ; 20 нуклеотидів SEQ ID NO: 15 олігонуклеотид Cry1CaS; 18 нуклеотидів SEQ ID NO: 16 олігонуклеотид Cry1CaA; 18 нуклеотидів SEQ ID NO: 17 олігонуклеотид Cry1Ca; 23 нуклеотиди SEQ ID NO: 18 олігонуклеотид AAD1S; 20 нуклеотидів SEQ ID NO: 19 олігонуклеотид AAD1A; 22 нуклеотиди SEQ ID NO: 20 олігонуклеотид AAD1; 24 нуклеотиди SEQ ID NO: 21 олігонуклеотид Y1CAS; 18 нуклеотидів SEQ ID NO: 22 олігонуклеотид Y1CAR; 18 нуклеотидів SEQ ID NO: 23 олігонуклеотид F6Y1CA; 23 нуклеотиди SEQ ID NO: 24 олігонуклеотид IVF-Taq; 18 нуклеотидів SEQ ID NO: 25 олігонуклеотид IVR-TAQ; 19 нуклеотидів SEQ ID NO: 26 олігонуклеотид IV-зонда; 26 нуклеотидів SEQ ID NO: 27 DIG-110; 1079 а. к. SEQ ID NO: 28 оптимізована для кукурудзи кодуюча область для DIG-110; 3237 п. о. SEQ ID NO: 29 DIG-111; 543 а. к. SEQ ID NO: 30 оптимізована для кукурудзи кодуюча область для DIG-111; 1629 п. о. SEQ ID NO: 31 DIG-112; 1044 а. к. SEQ ID NO: 32 оптимізована для кукурудзи кодуюча область для DIG-112; 3132 п. о. SEQ ID NO: 33 DIG-113; 508 а. к. SEQ ID NO: 34 оптимізована для кукурудзи кодуюча область для DIG-113; 1524 п. о. SEQ ID NO: 35 DIG-114; 582 а. к. SEQ ID NO: 36 оптимізована для кукурудзи кодуюча область для DIG-114; 1746 п. о. Докладний опис винаходу Білки DIG-109 і DIG-152 і інсектицидно активні варіанти. У доповнення до повнорозмірного білка DIG-109 з SEQ ID NO: 5 і білка DIG-152 з SEQ ID NO: 3, винахід стосується інсектицидно активних варіантів. Під терміном "варіант", заявники мають на увазі фрагменти, визначені делеційні і інсерційні мутанти і певні злиті білки. Сегмент центрального токсину Cry1Ca DIG-109 і DIG-152 являє собою класичний Cry-білок з трьох доменів. Як передмова для опису варіантів 2 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білків DIG-109 і DIG-152, які включені у винахід, корисно стисло розглянути архітектуру Cryбілків з трьох доменів загалом і білкових токсинів DIG-109 і DIG-152 зокрема. Більшість молекул кристалічного білка дельта-ендотоксину Bacillus thuringiensis складаються з двох функціональних сегментів. Стійкий до протеази центральний токсин являє собою перший сегмент, і він відповідає приблизно першій половині молекули білка. Повна молекула протоксину розміром ~130 кДа швидко процесується протеазами в кишечнику комах в стійкий центральний сегмент. Сегмент, який віддаляється шляхом цього процесингу, називають в даному описі "сегментом протоксину". Вважають, що сегмент протоксину бере участь в утворенні кристалів токсину (Arvidson et al., (1989). Таким чином, сегмент протоксину може надавати токсину часткової специфічності до комах шляхом обмеження доступності центральної частини комасі за допомогою зниження процесингу протеазою молекули токсину (Haider et al. (1986)) або за допомогою зниження розчинності токсину (Aronson et al., (1991). Токсини B.t., навіть в межах певного класу, варіюють в деякій мірі по довжині і по точному розташуванню точки переходу від сегмента центрального токсину до сегмента протоксину. Точка переходу від сегмента центрального токсину до сегмента протоксину, як правило, знаходиться на рівні від приблизно 50% до приблизно 60% повнорозмірного токсину. В SEQ ID NO: 3 представлена послідовність з 1164 амінокислот для повнорозмірного поліпептиду DIG152, серед яких N-кінцеві 619 амінокислот містять центральний токсин Cry1Ca, представлений як SEQ ID NO: 1. В SEQ ID NO: 5 представлена послідовність з 1164 амінокислот для повнорозмірного поліпептиду DIG-109, серед яких N-кінцеві 619 амінокислот містять центральний токсин Cry1Ca. Тривимірні кристалічні структури визначені для Cry1Aa1, Cry2Aa1, Cry3Aa1, Cry3Bb1, Cry4Aa, Cry4Ba і Cry8Ea1. Ці структури для центральних токсинів є виключно схожими і складаються з трьох різних доменів з ознаками, описаними нижче (розглянуто в Maagd et al., 2003). Домен I являє собою пучок з семи альфа-спіралей, де п'ята спіраль оточена шістьма амфіпатичними спіралями. Цей домен залучений до утворення пор і має гомологію з іншими білками, що утворюють пори, включаючи гемолізини і коліцини. Домен I білка центрального токсину Cry1Ca містить амінокислотні залишки 36-254 SEQ ID NO: 1. [Потрібно розуміти, що химерні білки DIG-109 і DIG-152 містять сегмент центрального токсину Cry1Ca, і, таким чином, координати, привласнені амінокислотній послідовності сегмента центрального токсину Cry1Ca, як описано в SEQ ID NO: 1, також застосовні до амінокислотної послідовності химерного білка DIG-109, представленого в SEQ ID NO: 5, і амінокислотної послідовності химерного білка DIG152, представленого в SEQ ID NO: 3.] Домен II утворений трьома антипаралельними бета-шарами, упакованими разом в бетапризму. Петлі цього домену відіграють важливу роль в зв'язуванні рецепторів середньої кишки комах. У білках Cry1A експоновані на поверхні петлі на вершинах бета-шарів домену II залучені до зв’язування з рецепторами кадгерину Lepidopteran. Петлі домену II Cry3Aa зв'язують асоційовану з мембраною металопротеазу Leptinotarsa decemlineata (Say) (колорадський жук) аналогічним чином (Ochoa-Campuzano et al., 2007). Домен II має гомологію з певними білками, що зв'язують вуглеводи, в тому числі з вітеліном і якаліном. Домен II білка центрального токсину Cry1Ca містить амінокислотні залишки 262-458 SEQ ID NO: 1. Домен III являє собою бета-сендвіч з двох антипаралельних бета-шарів. Структурно цей домен є спорідненим до вуглеводзв’язувальних доменів білків, таких як глюканази, галактозооксидази, сіалідази і інші. Домен III зв'язує певні класи рецепторних білків і, можливо, бере участь у вбудовуванні олігомерної препори токсину, яка взаємодіє з другим класом рецепторів, прикладами яких є амінопептидаза і лужна фосфатаза у разі Cry1A-білків (Pigott and Ellar, 2007). Аналогічні рецептори домену III Cry ще належить ідентифікувати в Coleoptera. Блоки 2 і 3 консервативної послідовності B.t. знаходяться поблизу N-кінця і С-кінця домену 2, відповідно. Таким чином, ці блоки 2 і 3 консервативної послідовності є приблизними прикордонними областями між трьома функціональними доменами. Ці області консервативної ДНК і гомології білків використовували для інженерії рекомбінантних токсинів Домен III білка Cry1Ca містить амінокислотні залишки 468-617 SEQ ID NO: 1. Було описано, що -спіраль 1 домену I віддаляється після зв’язування рецептора. Aronson et al. (1999) продемонстрували, що Cry1Ac, зв'язаний з BBMV, був захищений від розщеплення протеазою K, починаючи із залишку 59, безпосередньо після α-спіралі 1; схожі результати були цитовані для Cry1Ab. Gomez et al. (2002) виявили, що олігомери Cry1Ab, що утворилися при зв'язуванні рецептора BBMV, були позбавлені частини домену I у вигляді -спіралі 1. Також Soberon et al. (2007) показали, що N-кінцеві делеційні мутанти Cry1Ab і Cry1Ac, які позбавлені приблизно 60 амінокислот, що охоплюють -спіраль 1 на тривимірній структурі Cry, здатні до 3 UA 112286 C2 5 10 збирання мономерів з молекулярною масою приблизно 60 кДа в препори за відсутності зв’язування кадгерину. Було описано, що ці N-кінцеві делеційні мутанти є активними відносно стійких до Cry личинок комах. Більш того, Diaz-Mendoza et al. (2007) описали фрагменти Cry1Ab розміром 43 кДа і 46 кДа, які зберігали активність відносно середземноморської кукурудзяної совки (Sesamia nonagrioides). Було продемонстровано, що ці фрагменти включають амінокислотні залишки 116-423; однак точні амінокислотні послідовності не були встановлені і механізм активності цих протеолітичних фрагментів невідомий. Результати Gomez et al., (2002), Soberon et al., 2007 і Diaz-Mendoza et al., (2007) суперечать результатам Hofte et al., (1986), які описали, що делеція 36 амінокислот з N-кінця Cry1Ab приводила до втрати інсектицидної активності. Автори винаходу встановили початок і кінець спіралей 1, 2A, 2B, 3 і 4 і розташування спейсерних областей між ними в домені I центрального токсину Cry1Ca шляхом порівняння амінокислотної послідовності Cry1Ca з амінокислотною послідовністю Cry8Ea1, для якої структура відома. Ці положення описані в таблиці 1. 15 Таблиця 1 Координати амінокислот передбачуваних -спіралей білка центрального токсину Cry1Ca Спіраль Спіраль Спіраль Спіраль Спіраль Спейсер Спейсер Спейсер Спейсер 1 2A 2B 3 4 Залишки SEQ ID NO: 1 20 25 30 35 40 45 50 35-49 50-54 55-62 63-70 71-84 85-90 91-119 120-123 124-145 Варіанти DIG-109 і DIG-152 з N-кінцевою делецією. В одному з аспектів винахід стосується варіантів DIG-109 і DIG-152, в яких всі або частина альфа-спіралей 1, 2A і 2B видалені для збільшення інсектицидної активності і запобігання розвитку стійкості у комах. Ці модифікації вносять для отримання варіантів DIG-109 і DIG-152 з поліпшеними ознаками, такими як поліпшений спектр паразитів-мішеней, ефективність і контроль стійкості у комах. У деяких варіантах здійснення даного винаходу модифікації, що розглядаються, можуть впливати на ефективність активації протоксину і утворення пор, що приводить до інтоксикації комах. Більш конкретно, для отримання варіантів DIG-109 і DIG-152 з поліпшеними ознаками, описані покрокові делеції, які видаляють частину гену, що кодує N-кінець. Делеції видаляють всю спіраль 1 і всю або частину -спіралі 2 в домені I, при збереженні структурної цілісності αспіралей 3-7. Таким чином, даний винахід стосується, частково, збільшення ефективності білка Cry, досягнутого шляхом інженерії α-спіральних компонентів домену 1 для більш ефективного утворення пор. Більш конкретно, даний винахід стосується частково вдосконалених білків DIG109 і DIG-152, сконструйованих так, щоб вони мали N-кінцеві делеції в областях з передбачуваною гомологією вторинної структури з α-спіралями 1 і 2 в домені I білків Cry1. Делеції для поліпшення інсектицидних властивостей токсинів DIG-109 і DIG-152 можуть починатися до передбаченого початку -спіралі 2A, і можуть закінчуватися після закінчення спіралі 2B, переважно не продовжуючись на -спіраль 3. При конструюванні кодуючих послідовностей для варіантів з N-кінцевою делецією ініціюючий кодон ATG, що кодує метіонін, вбудовують на 5'-кінці нуклеотидної послідовності, призначеної для експресії варіанту з делецією. Для послідовностей, призначених для застосування в трансгенних рослинах, може бути корисним дотримуватися "правила N-кінця" Varshavsky (1997). Воно свідчить, що деякі амінокислоти можуть брати участь в нестабільності і деградації білка в еукаріотичних клітинах, коли вони експонуються як N-кінцевий залишок білка. Наприклад, дані, зібрані шляхом спостережень в клітинах дріжджів і ссавців вказують на те, що N-кінцевими дестабілізуючими амінокислотами є F, L, W, Y, R, K, Н, I, N, Q, D, Е і можливо P. В той час як особливості механізмів деградації білків можуть відрізнятися в деякій мірі між організмами, консервативність типу N-кінцевих дестабілізуючих амінокислот, вказаних вище, вказує на те, що в клітинах рослин можуть функціонувати схожі механізми. Наприклад, Worley et al. (1998) відкрили, що в рослинах правило N-кінця включає основні і ароматичні залишки. Можливо, що протеолітичне розщеплення протеазами рослин поблизу початку α-спіралі 3 інсектицидних білків B.t., що розглядаються, може експонувати дестабілізуючу N-кінцеву амінокислоту. Такий процесинг може націлювати розщеплені білки на швидке розщеплення і обмежувати накопичення інсектицидних білків B.t. до рівнів, недостатніх для ефективної боротьби з комахами. Таким чином, для варіантів з N-кінцевою делецією, які починаються з однієї з дестабілізуючих амінокислот, заявники вважають за краще додати кодон, який визначає 4 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислоту G (гліцин), між метіоніном, що ініціює трансляцію, і дестабілізуючою амінокислотою. У прикладах 13 і 14 наведені конкретні приклади варіантів з N-кінцевою делецією DIG-109 і DIG-152 згідно з винаходом. Додаткові придатні фрагменти можна ідентифікувати за допомогою біоаналізу на комахах фрагментів, отриманих розщепленням трипсином або хімотрипсином повнорозмірного солюбілізованого кристалічного білка, для визначення того, які фрагменти зберігають токсичність, або їх можна ідентифікувати шляхом визначення послідовності фрагмента токсичного білка, що кодується фрагментами ДНК кодуючої області Cry-білка.Цей білок, головним чином, буде мати коротке N-кінцеве і довге С-кінцеве укорочення в порівнянні з протоксином. N-кінець найменшого токсичного фрагмента звичайно визначають визначенням Nкінцевої амінокислотної послідовності обробленого трипсином або хімотрипсином розчинного кристалічного білка способами, загальнодоступними в даній галузі. Химерні токсини. Раніше були описані химерні білки, в яких використовується домен центрального токсину з одного токсину Cry, злитий з сегментом протоксину з іншого токсину Cry. Варіанти DIG-109 і DIG-152 включають токсини, що містять N-кінцевий центральний сегмент токсину з токсину Cry1Ca (який може бути повнорозмірним або має N-кінцеві делеції, описані вище), злитий з гетерологічним сегментом протоксину в точці закінчення сегмента центрального токсину. Перехід до гетерологічного сегмента протоксину може знаходитися приблизно в точці з'єднання центральний токсин/протоксин або, альтернативно, може бути збережена частина нативного протоксину (що продовжується після сегмента центрального токсину) з подальшим переходом до гетерологічного протоксину. Як приклад, химерний токсин за даним винаходом має повний сегмент центрального токсину Cry1Ca (амінокислоти 1-619) і гетерологічний протоксин (амінокислоти з 620 по С-кінець). У переважних варіантах здійснення гетерологічний сегмент протоксину походить з дельта-ендотоксину Cry1Ab, як проілюстровано в SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 4. Чутливі до протеаз варіанти. Протеази кишечника комах, як правило, функціонують, сприяючи отриманню комахами необхідних амінокислот з харчового білка. Найбільш добре вивченими травними протеазами комах є серинові протеази, які, як виявилося, є найбільш поширеним типом (Englemann and Geraerts, 1980), зокрема, у видах Lepidopteran. Комахи Coleopteran мають кишечники, які є в більшій мірі нейтральними, ніж кислими, в порівнянні з кишечниками Lepidopteran. Більшість личинок і дорослих особнів Coleopteran, наприклад, колорадський жук, мають середню кишку зі слабким кислим середовищем, і цистеїнові протеази забезпечують основну частину протеолітичної активності (Wolfson and Murdock, 1990). Точніше, Thie and Houseman (1990) ідентифікували і охарактеризували цистеїнові протеази, катепсин Вподібну і катепсин Н-подібну, і аспартильну протеазу, катепсин D-подібну, в колорадському жуку. Gillikin et al., (1992) охарактеризували протеолітичну активність в кишечниках личинок західного кукурудзяного кореневого жука і виявили, головним чином, цистеїнові протеази. У патенті США № 7230167 описано, що в західному кукурудзяному кореневому жуку є серинова протеаза, катепсин G. Різноманітність і різні рівні активності протеаз кишечника комах можуть впливати на чутливість комах до конкретного токсину B.t. В іншому варіанті здійснення винаходу, в бажані області можуть бути вбудовані ділянки розщеплення протеазами для впливу на процесинг білка в середній кишці сприйнятливих личинок певних шкідливих комах (Walters et al., 2008). Ці ділянки розщеплення протеазами можна вносити способами, такими як хімічний синтез генів або ПЛР зі сплайсингом по послідовностях, що перекриваються (Horton et al., 1989). Наприклад, послідовності для розпізнавання сериновими протеазами необов'язково можна вбудовувати в конкретні ділянки в структурі Cry-білка для впливу на процесинг білка в бажаних точках делеції в середній кишці сприйнятливих личинок. Серинові протеази, які можна використовувати таким шляхом, включають серинові протеази середньої кишки Lepidopteran, такі як трипсин або трипсин-подібні ферменти, хімотрипсин, еластаза і т.д. (Christeller et al., 1992). Крім того, можна вбудовувати делеційні ділянки, ідентифіковані емпірично шляхом секвенування продуктів розщеплення Cryбілка, отриманих за допомогою нефракціонованих препаратів протеаз личинок середнього кишечника, або шляхом зв’язування з везикулами мембрани щіткової облямівки, для забезпечення активації білка. Модифіковані Cry-білки, отримані або шляхом делеції гену, або шляхом внесення ділянок розщеплення протеазами, мають збільшену активність відносно паразитів Lepidopteran, включаючи Ostrinia nubilalis, Diatraea grandiosella, Helicoverpa zea, Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Diatraea saccharalis, Loxagrotis albicosta та інших цільових паразитів. Крім того, можна використовувати серинові протеази Coleopteran, такі як трипсин, хімотрипсин і катепсин G-подібна протеаза, цистеїнові протеази Coleopteran, такі як катепсини 5 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (В-подібна, L-подібна, О-подібна і K-подібна протеази) (Koiwa et al., (2000) і Bown et al., (2004), металопротеази Coleopteran, такі як ADAM10 (Ochoa-Campuzano et al., (2007)), і аспарагінові протеази Coleopteran, такі як D-подібний і Е-подібний катепсини, пепсин, плазмепсин і хімозин, шляхом вбудовування відповідних послідовностей для розпізнавання в бажаних ділянках процесингу для впливу на процесинг Cry-білка в середній кишці сприйнятливих личинок певних шкідливих комах. Переважна область для внесення таких ділянок розщеплення протеазами може знаходитися в "спейсерній" області між α-спіраллю 2B і -спіраллю 3, наприклад, в амінокислотах 85-90 білка центрального токсину Cry1Ca (SEQ ID NO: 1 і таблиця 1). Модифіковані Cry-білки, отримані або шляхом делеції гену, або шляхом внесення ділянок розщеплення протеазами, мають збільшену активність відносно шкідливих комах, включаючи, але не обмежуючись ними, совку трав'яну, очеретяну вогнівку і т. п. Існують різні технології для визначення послідовностей амінокислот, які містять N-кінцеві або С-кінцеві залишки поліпептидів. Наприклад, можна використовувати технологію автоматизованої деградації Едмана послідовним чином для визначення N-кінцевої амінокислотної послідовності з аж до 30 амінокислотних залишків з точністю 98% на залишок. Крім того, також можливе визначення послідовності амінокислот, що містить С-кінець поліпептидів (Bailey et al., (1992); патент США № 6046053). Таким чином, в деяких варіантах здійснення можна охарактеризувати Cry-білки B.t., активовані шляхом протеолітичного процесингу, наприклад, протеазами, отриманими з кишечника комахи, і ідентифікувати N-кінцеві або С-кінцеві амінокислоти активованого фрагмента токсину. В об'єм винаходу входять варіанти DIG-109 і DIG-152, що отримуються шляхом вбудовування або усунення ділянок процесингу протеазами у відповідних положеннях в кодуючій послідовності для забезпечення або усунення протеолітичного розщеплення більш великого варіанту білка протеазами комахи, рослини або мікроорганізму. Мається на увазі, що кінцевим результатом такого маніпулювання є отримання молекул фрагментів токсину, що мають таку ж або кращу активність, в порівнянні з незміненим (повнорозмірним) білком токсину. Домени токсинів DIG-109 і DIG-152. Очікується, що окремі домени сегмента центрального токсину Cry1Ca, як проілюстровано в токсинах DIG-109 і DIG-152 (і варіанти, які на 90%, 95% або 97% ідентичні таким доменам), є придатними для утворення комбінацій з доменами з інших токсинів Cry для отримання нових токсинів із збільшеним спектром токсичності, збільшеною ефективністю або збільшеною стабільністю білка. Домен I білка центрального токсину Cry1Ca складається з амінокислотних залишків 36-254 SEQ ID NO: 1. Домен II білка центрального токсину Cry1Ca складається з амінокислотних залишків 262-458 SEQ ID NO: 1. Домен III білка центрального токсину Cry1Ca складається з амінокислотних залишків 468-617 SEQ ID NO: 1. Обмін або шафлінг доменів є механізмом для отримання змінених білків дельта-ендотоксину. Домени II і III можна міняти місцями в білках дельта-ендотоксину з отриманням гібридних або химерних токсинів з поліпшеною пестицидною активністю або спектром мішеней. Домен II залучений до зв’язування рецептора. Домен III зв'язує певні класи рецепторних білків і, можливо, бере участь у вбудовуванні препори олігомерного токсину. Було показано, що деякі заміни в домені III інших токсинів викликають більш високу токсичність відносно Spodoptera exigua (de Maagd et al., (1996)) і існує керівництво по конструюванню токсину Cry з обміном доменами (Knight et al., (2004). Способи отримання рекомбінантних білків і тестування їх відносно пестицидної активності добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Naimov et al., (2001), de Maagd et al., (1996), Ge et al., (1991), Schnepf et al., (1990), Rang et al., (1999)). Домен I з білків Cry1A і Cry3A досліджували відносно здатності вбудовуватися в мембрани і утворювати пори в них. Альфа-спіралі 4 і 5 домену I відіграють ключові ролі у вбудовуванні в мембрану і утворенні пор (Walters et al., 1993, Gazit et al., 1998; Nunez-Valdez et al., 2001), в той час як передбачено, що інші спіралі контактують з поверхнею мембрани, такі як прути парасольки (Bravo et al., (2007); Gazit et al., (1998)). Варіанти DIG-109 і DIG-152, створені шляхом внесення обмеженої кількості амінокислотних делецій, замін або вставок. Амінокислотні делеції, заміни і вставки до амінокислотної послідовності сегмента центрального токсину Cry1Ca SEQ ID NO: 1 можна легко вносити послідовно, і ефекти таких змін на інсектицидну активність можна тестувати за допомогою біоаналізу. Враховуючи, що кількість змін обмежена, таке тестування не залучає зайвого експериментування. Винахід включає інсектицидно активні варіанти центрального токсину (амінокислоти 1-619 SEQ ID NO: 1), в які внесено аж до 10, аж до 15 або аж до 20 незалежних амінокислотних вставок, делецій або замін. 6 UA 112286 C2 5 10 Винахід включає варіанти DIG-109 і DIG-152, що мають сегмент центрального токсину, який на 90%, 95% або 97% ідентичний амінокислотам 1-619 SEQ ID NO: 1. Варіанти можна отримувати шляхом внесення випадкових мутацій або варіанти можна конструювати. У разі мутантів, що конструюються, існує висока імовірність отримання варіантів з активністю, схожою з нативним токсином, коли ідентичність амінокислот зберігають у важливих областях токсину, які відповідають за біологічну активність або залучені до визначення тривимірної конфігурації, яка в кінцевому результаті відповідальна за біологічну активність. Також є висока імовірність збереження активності, якщо заміни є консервативними. Амінокислоти можуть бути віднесені до наступних класів: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислоти. Консервативні заміни, при яких амінокислота одного класу замінюється іншою амінокислотою того ж типу, з найменшою імовірністю змінять біологічну активність варіанту. У таблиці 2 наведений перелік прикладів амінокислот, що стосуються кожного класу. Таблиця 2 Клас амінокислоти Приклади амінокислот Неполярні бокові ланцюги Незаряджені полярні бокові ланцюги Кислотні бокові ланцюги 30 35 40 45 Thr, Val, Ile Ароматичні бокові ланцюги 25 Lys, Arg, His Бета-розгалужені бокові ланцюги 20 Asp, Glu Основні бокові ланцюги 15 Ala, Val, Leu, He, Pro, Met, Phe, Trp Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Tyr, Phe, Trp, His У деяких випадках також можна вносити неконсервативні заміни. Важливим чинником є те, що ці заміни не повинні значно знижувати біологічну активність токсину. Варіанти включають поліпептиди, які відрізняються по амінокислотній послідовності внаслідок мутагенезу. Варіанти білків, що охоплюються даним винаходом, є біологічно активними, тобто вони продовжують мати бажану біологічну активність нативного білка, тобто пестицидну активність. Також можуть бути сконструйовані варіанти білків, які відрізняються на рівні послідовності, але зберігають ту ж або схожу загальну основну тривимірну структуру, розподіл поверхневого заряду і т. п. див., наприклад, патент США № 7058515; Larson et al., (2002); Stemmer (1994a, 1994b, 1995); і Crameri et al. (1996a, 1996b, 1997). Нуклеїнові кислоти. Виділені нуклеїнові кислоти, що кодують токсин DIG-109 або що кодують токсин DIG-152, є одним з аспектів даного винаходу. Він включає нуклеїнові кислоти, що кодують SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 і SEQ ID NO: 5, і комплементарні ним послідовності, а також інші нуклеїнові кислоти, які кодують інсектицидні варіанти SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 і SEQ ID NO: 5. Під "виділеними" заявники мають на увазі, що молекули нуклеїнових кислот були витягнуті з їх природного оточення і вміщені в інше середовище людиною. Внаслідок надмірності генетичного коду, множина різних послідовностей ДНК можуть кодувати амінокислотні послідовності, описані в даному описі. Фахівець в даній галузі здатний створити ці альтернативні послідовності ДНК, що кодують ті ж або по суті ті ж токсини. Аналіз генів. Гени, що кодують вдосконалені Cry-білки, описані в даному описі, можна отримувати різними способами, добре відомими в даній галузі. Наприклад, синтетичні сегменти генів і синтетичні гени можна отримувати за допомогою хімії складних триефірів фосфітів і фосфорамідитів (Caruthers et al., 1987), і для проведення синтезу генів по запиту доступні комерційні постачальники. Повнорозмірні гени можна збирати різними шляхами, включаючи, наприклад, лігування фрагментів рестрикції або збирання за допомогою полімеразної ланцюгової реакції олігонуклеотидів, що перекриваються (Stewart and Burgin, 2005). Крім того, кінцеві делеції генів можна вносити ампліфікацією за допомогою ПЛР з використанням сайтспецифічних кінцевих олігонуклеотидів. Нуклеїнові кислоти, що кодують токсин DIG-109 або токсин DIG-152, можна отримувати, наприклад, шляхом синтетичного конструювання способами, що застосовуються в даний час на практиці будь-яким з декількох комерційних постачальників. (Див. наприклад, патент США № 7482119B2). Ці гени або їх частини або варіанти також можна конструювати синтетично, наприклад, з використанням пристрою для синтезу генів і способів моделювання, наприклад, 7 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 згідно з патентом США № 5380831. Альтернативно варіанти синтетичних генів або генів, що зустрічаються в природі, можна легко конструювати з використанням стандартних способів молекулярної біології для внесення точкових мутацій. Фрагменти цих генів також можна отримувати з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз згідно зі стандартними методиками. Наприклад, ферменти, такі як Bal31, або сайт-направлений мутагенез можна використовувати для систематичного вирізування нуклеотидів з кінців цих генів. Також фрагменти генів, які кодують активні фрагменти токсинів, можна отримувати з використанням різних ферментів рестрикції. При наявності амінокислотної послідовності для токсину DIG-109 або токсину DIG-152 кодуючу послідовність можна конструювати зворотною трансляцією білкової послідовності з використанням кодонів, яким надає перевагу передбачуваний хазяїн, а потім коректування послідовності з використанням альтернативних (надмірних) кодонів для видалення послідовностей, які можуть викликати проблеми. Крім того, в некодуючі рамки зчитування можна вбудовувати періодичні стоп-кодони для усунення довгих ненавмисних відкритих рамок зчитування. Кількісне визначення ідентичності послідовностей. Для визначення процентної ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох послідовностей нуклеїнових кислот, послідовності вирівнюють для цілей оптимального порівняння. Процентна ідентичність між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних положень, що є загальними для послідовностей (тобто процентна ідентичність = кількість ідентичних положень/загальна кількість положень (наприклад, положення, що перекриваються)×100). В одному варіанті здійснення дві послідовності мають однакову довжину. Процентну ідентичність між двома послідовностями можна визначати з використанням способів, схожих зі способами, описаними нижче, допускаючи або не допускаючи пропуски. При обчисленні процентної ідентичності, як правило, підраховують точні збіги. Визначення процентної ідентичності між двома послідовностями можна провести з використанням математичного алгоритму. Необмежувальним прикладом такого алгоритму є BLAST (Altschul et al., 1990, і Karlin and Altschul, 1990), модифікований як в Karlin and Altschul (1993), і включений в програми BLASTN і BLASTX. Пошук в BLAST зручно використовувати для ідентифікації послідовностей, гомологічних (схожих) з послідовністю запиту в базах даних нуклеїнових кислот або білків. Пошук BLASTN можна провести (сума балів = 100, довжина слова = 12) для ідентифікації нуклеотидних послідовностей, що мають гомологію із заявленими молекулами нуклеїнових кислот за винаходом. Пошук BLASTX можна провести (сума балів = 50, довжина слова = 3) для ідентифікації амінокислотних послідовностей, що мають гомологію із заявленими інсектицидними білковими молекулами за винаходом. Gapped BLAST Altschul et al., (1997) можна використовувати для проведення вирівнювання з пропусками для мети порівняння. Альтернативно можна використовувати PSI-Blast для проведення ітераційного пошуку для встановлення віддаленої спорідненості між молекулами, Altschul et al. (там же). При використанні програми BLAST, Gapped BLAST і PSI-Blast можна використовувати параметри за умовчанням для відповідних програм. Див. www.ncbi.nlm.nih.gov. Необмежувальним прикладом математичного алгоритму, що використовується для порівняння послідовностей, є алгоритм ClustalW (Thompson et al., 1994). ClustalW порівнює послідовності і вирівнює повну амінокислотну послідовність або послідовність ДНК, і, таким чином, може надати дані про консервативність послідовності для всієї амінокислотної послідовності або нуклеотидної послідовності. Алгоритм ClustalW використовується в декількох комерційно доступних пакетах програм для аналізу ДНК/амінокислота, таких як модуль ALIGNX пакету програм Vector NTI (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). При вирівнюванні амінокислотних послідовностей за допомогою ALIGNX, зручно використовувати параметри за умовчанням з штрафом за внесення пропуску 10, штрафом за продовження пропуску 0,1 і матрицею порівняння blosum63mt2 для оцінки процентної схожості амінокислот (консенсус) або ідентичності між двома послідовностями. При вирівнюванні послідовностей ДНК за допомогою ALIGNX зручно використовувати параметри за умовчанням з штрафом за внесення пропуску 15, штрафом за продовження пропуску 6,6 і матрицею порівняння swgapdnamt для оцінки процентної ідентичності між двома послідовностями. Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, що використовується для порівняння послідовностей, є алгоритм Myers and Miller (1988). Такий алгоритм включений в програму wSTRETCHER, яка є частиною пакету програм для вирівнювання послідовностей wEMBOSS (доступного на http://emboss.sourceforge.net/). wSTRETCHER проводить оптимальне глобальне вирівнювання двох послідовностей з використанням модифікації класичного динамічного алгоритму програмування, який використовує лінійний простір. Можна 8 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 встановлювати підстановочну матрицю, штраф за внесення пропуску і штраф за подовження пропуску, що використовується для проведення вирівнювання. При використанні програми wSTRETCHER для порівняння нуклеотидних послідовностей, можна використовувати штраф за внесення пропуску 16 і штраф за продовження пропуску 4 з файлом оцінної матриці EDNAFULL. При використанні для порівняння амінокислотних послідовностей можна використовувати штраф за внесення пропуску 12 і штраф за продовження пропуску 2 з файлом оцінної матриці EBLOSUM62. Наступним необмежувальним прикладом математичного алгоритму, що використовується для порівняння послідовностей, є алгоритм Needleman and Wunsch (1970), який включений в пакет програм для вирівнювання послідовностей GAP Version 10 і wNEEDLE (http://emboss.sourceforge.net/). GAP Version 10 можна використовувати для визначення ідентичності або схожості послідовностей з використанням наступних параметрів: для нуклеотидної послідовності % ідентичність і % схожість обчислюють з використанням ваги пропуску 50 і ваги продовження 3, і оцінної матриці nwsgapdna.cmp. Для порівняння амінокислотних послідовностей % ідентичність або % схожість визначають з використанням ваги пропуску 8 і ваги продовження 2, і оцінної програми BLOSUM62. wNEEDLE зчитує дві введені послідовності, проводить оптимальне вирівнювання (включаючи пропуски) вздовж всієї довжини і записує їх оптимальне глобальне вирівнювання послідовностей в файл. Алгоритм досліджує всі можливі вирівнювання і вибирає найкраще з використанням оцінної матриці, яка містить значення для кожного можливого збігу залишку або нуклеотиду. wNEEDLE знаходить вирівнювання з максимальним можливим показником, де показник вирівнювання дорівнює сумі збігів, взятій з оцінної матриці, мінус штрафи внаслідок внесення і продовження пропусків в послідовностях, що вирівнюються. Підстановочна матриця і штрафи за внесення і продовження пропусків встановлюються користувачем. Коли порівнюють амінокислотні послідовності, використовують штраф за внесення пропуску 10, штраф за продовження пропуску 0,5 і матрицю порівняння EBLOSUM62 за умовчанням. При порівнянні послідовностей ДНК з використанням wNEEDLE, використовують штраф за внесення пропуску 10, штраф за продовження пропуску 0,5 і матрицю для порівняння EDNAFULL. Також можна використовувати еквівалентні програми. Під "еквівалентною програмою" мають на увазі будь-яку програму порівняння послідовностей, яка для будь-яких послідовностей, що розглядаються, проводить вирівнювання, що має ідентичні збіги нуклеотидних або амінокислотних залишків і ідентичну процентну ідентичність послідовностей при порівнянні з відповідним вирівнюванням, проведеним ALIGNX, wNEEDLE або wSTRETCHER. % ідентичність являє собою процент ідентичних збігів між двома послідовностями протягом вказаної вирівняної області (включаючи пропуски будь-якої довжини) і % схожість являє собою процент збігів між двома послідовностями протягом вказаної вирівняної області (включаючи пропуски будь-якої довжини). Вирівнювання також можна провести дослідженням вручну. Рекомбінантні хазяїни. Гени, що кодують токсин за даним винаходом, можна вводити в широку множину мікробних або рослинних хазяїнів. Експресія гену токсину приводить, прямо або опосередковано, до внутрішньоклітинної продукції і підтримки пестицидного білка. У разі придатних мікробних хазяїнів, наприклад, Pseudomonas, мікроби можуть бути застосовані в навколишньому середовищі паразитів, де вони будуть проліферувати і поглинатися. Результатом є боротьба з паразитами. Альтернативно, мікроорганізм, що містить ген токсину, можна обробляти в умовах, які продовжують активність токсину і стабілізують клітину. Потім оброблена клітина, яка зберігає токсичну активність, може бути застосована в навколишньому середовищі паразита-мішені. Коли ген токсину B.t. вводять через придатний вектор в мікробного хазяїна і вказаного хазяїна застосовують в навколишньому середовищі в живому стані, необхідно, щоб використовувалися певні мікроорганізми-хазяїни. Вибирають мікроорганізми-хазяїни, які відомі тим, що вони займають "фітосферу" (філоплан, філосферу, ризосферу і/або ризоплан) однієї або декількох культур, що представляють інтерес. Ці мікроорганізми вибирають так, щоб вони були здатні успішно конкурувати в конкретному середовищі (середовище проживання культури і інших комах) з місцевими мікроорганізмами дикого типу, при умові стабільної підтримки і експресії гену, що кодує поліпептидний пестицид, і, бажано, при умові поліпшеного захисту пестициду від зумовленої зовнішніми умовами деградації і інактивації. Відомо, що велику кількість мікроорганізмів населяють філоплан (поверхня листя рослин) і/або ризосферу (ґрунт, що оточує коріння рослин) широкої множини важливих культур. Ці мікроорганізми включають бактерії, водорості і гриби. Особливий інтерес представляють мікроорганізми, такі як бактерії, наприклад, роду Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, 9 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Sinorhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc і Alcaligenes; гриби, зокрема, дріжджі, наприклад, родів Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula і Aureobasidium. Особливий інтерес представляють такі бактеріальні види фітосфери, як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Sinorhizobium meliloti (раніше Rhizobium meliloti), Alcaligenes eutrophus і Azotobacter vinelandii; і види дріжджів фітосфери, такі як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, С. diffluens, С. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae і Aureobasidium pollulans. Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми. Способи боротьби з шкідливими комахами Коли комаха контактує з ефективною кількістю токсину, що доставляється за допомогою експресії в трансгенній рослині, приготованої композиції(ій) білка, композиції(ій) білка, що розпилюється, матриці з приманкою або іншої системи доставки, результатом, як правило, є загибель комахи або комахи не харчуються з джерела, яке робить токсини доступними для комах. Білкові токсини, що розглядаються, можна "застосовувати" або надавати для контактування комахам-мішеням різними шляхами. Наприклад, можна використовувати трансгенні рослини (де білок продукується рослиною і присутній в рослині), і вони добре відомі в даній галузі. Експресії генів токсинів також можна досягати селективно в конкретних тканинах рослин, таких як коріння, листя і т. д. Це можна здійснювати шляхом використання, наприклад, тканиноспецифічних промоторів. Іншим прикладом є нанесення розпиленням, і воно також відоме в даній галузі. Білки, що розглядаються, можна відповідним чином виготовляти для бажаного кінцевого застосування, а потім розпилювати (або іншим чином наносити) на рослину і/або навколо рослини/поблизу рослини, що підлягає захисту - до виявлення зараження паразитами, після виявлення комах-мішеней, як до, так і після, і т. п. Також можна використовувати, наприклад, гранули з приманкою і вони відомі в даній галузі. Трансгенні рослини Білки, що розглядаються, можна використовувати для захисту практично будь-якого типу рослин від пошкодження комахою Lepidopteran. Приклади таких рослин включають кукурудзу, соняшник, сою, бавовну, канолу, рис, сорго, тютюн, пшеницю, ячмінь, овочі, декоративні рослини, перець (включаючи гострий перець), цукровий буряк, плоди і трав'яний пласт, серед інших. Способи трансформації рослин добре відомі в даній галузі, і ілюстративні способи трансформації описані в прикладах. Переважним варіантом здійснення винаходу, що розглядається, є трансформація рослин генами, що кодують інсектицидний білок, що розглядається, або його варіанти. Трансформовані рослини є стійкими до атаки шкідливими комахами-мішенями внаслідок присутності кількостей, що здійснюють боротьбу, інсектицидного білка, що розглядається, або його варіантів в клітинах трансформованої рослини. Шляхом включення генетичного матеріалу, який кодує інсектицидні властивості інсектицидних токсинів B.t. в геном рослини, яким харчується шкідлива комаха, дорослі особні або личинки гинуть після вживання рослини, що служить їжею. Були трансформовані численні представники груп однодольних і дводольних рослин. Також комерційний інтерес представляють трансгенні агрономічні культури, а також фрукти і овочі. Такі культури включають, але не обмежуються ними, кукурудзу, рис, сою, канолу, соняшник, люцерну, сорго, пшеницю, бавовну, арахіс, томат, картопля і т. п. Існує декілька способів для введення чужорідного генетичного матеріалу в клітини рослин і для отримання рослин, які стабільно підтримують і експресують введений ген. Такі способи включають прискорення генетичного матеріалу, нанесеного на мікрочастинки, безпосередньо в клітини (патент США № 4945050 і патент США № 5141131). Рослини можна трансформувати з використанням технології Agrobacterium, див. патент США № 5177010, патент США № 5104310, патентну заявку Європи № 0131624B1, патентну заявку Європи № 120516, патентну заявку Європи № 159418B1, патентну заявку Європи № 176112, патент США № 5149645, патент США № 5469976, патент США № 5464763, патент США № 4940838, патент США № 4693976, патентну заявку Європи № 116718, патентну заявку Європи № 290799, патентну заявку Європи № 320500, патентну заявку Європи № 604662, патентну заявку Європи № 627752, патентну заявку Європи № 0267159, патентну заявку Європи № 0292435, патент США № 5231019, патент США № 5463174, патент США № 4762785, патент США № 5004863 і патент США № 5159135. Інша технологія трансформації включає технологію WHISKERSTM, див. патент США № 5302523 і патент США 10 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 № 5464765. Також для трансформації рослин використовують технологію електропорації, див. WO 1987/06614, патент США № 5472869, патент США № 5384253, WO 1992/09696 і WO 1993/21335. Всі з цих патентів і публікацій по трансформації включені в даний опис як посилання. У доповнення до численних технологій трансформації рослин, також можна варіювати тип тканини, який контактують з чужорідними генами. Така тканина може включати, але не обмежуватися ними, ембріогенну тканину, тканину калюсу типу I і II, гіпокотиль, меристему і т. п. Практичні всі тканини рослин можна трансформувати в процесі дедиференціювання з використанням відповідних способів, відомих фахівцеві в даній галузі. Гени, що кодують токсини DIG-109 або DIG-152 або їх варіанти, можна вбудовувати в клітини рослин з використанням різних способів, які добре відомі в даній галузі, як описано вище. Наприклад, для отримання і модифікації чужорідних генів для введення у вищі рослини доступна велика кількість клонуючих векторів, що містять маркер, який дозволяє селекцію трансформованих мікробних клітин, і реплікаційну систему, функціональну в Escherichia coli. Такі маніпуляції можуть включати, наприклад, внесення мутацій, укорочень, вставок або замін, бажаних для передбачуваного застосування. Вектори включають, наприклад, pBR322, серію pUC, серію M13mp, pACYC184 і т. д. Таким чином, послідовність, що кодує Cry-білок або його варіанти, можна вбудовувати у вектор у відповідну ділянку рестрикції. Отриману плазміду використовують для трансформації Е. coli, клітини яких культивують в придатному поживному середовищі, потім збирають і лізують, так, щоб виділити застосовні кількості плазміди. Як способи аналізу звичайно проводять аналіз послідовності, аналіз рестрикційних фрагментів, електрофорез і інші біохімічні і молекулярно-біологічні способи. Після кожного маніпулювання послідовність ДНК, що використовується, можна розщеплювати і зв'язувати з наступною послідовністю ДНК. Кожну піддану маніпулюванню послідовність ДНК можна клонувати в ту ж або інші плазміди. Застосування векторів, що містять Т-ДНК, для трансформації клітин рослин інтенсивно досліджується і в достатній мірі описано в патентній заявці Європи № 120516; Lee and Gelvin (2008), Fraley et al., (1986) і An et al., (1985), і є загальноприйнятим в даній галузі. Після вбудовування вбудованої ДНК в геном рослин, вона є відносно стабільною протягом подальших поколінь. Вектор, що використовується для трансформації клітини рослин, звичайно містить ген селективного маркера, кодуючий білок, який надає трансформованим клітинам рослин стійкості до гербіциду або антибіотика, такого як біалафос, канаміцин, G418, блеоміцин або гігроміцин, серед інших. Таким чином, ген селективного маркера, що індивідуально використовується, повинен дозволяти селекцію трансформованих клітин, в той час як ріст клітин, які не містять вбудовану ДНК, пригнічується селективною сполукою. Для введення ДНК в рослинну клітини-хазяїна доступна велика кількість способів. Ці способи включають трансформацію Т-ДНК, що доставляється Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як агент для трансформації. Крім того, можна використовувати злиття протопластів рослин з ліпосомами, що містять ДНК, що підлягає доставці, пряму ін'єкцію ДНК, біолістичну трансформацію (бомбардування мікрочастинками) або електропорацію, а також інші можливі способи. У переважному варіанті здійснення винаходу, що розглядається, рослини трансформують генами, де використання кодонів в кодуючій області білка оптимізоване для рослин. Див., наприклад, патент США № 5380831, який включений в даний опис як посилання. Також переважно використовують рослини, що кодують укорочений токсин. Укорочений токсин, як правило, кодує від приблизно 55% до приблизно 80% повнорозмірного токсину. Способи створення синтетичних генів B.t. для застосування в рослинах відомі в даній галузі (Stewart 2007). Незалежно від способу трансформації, ген переважно включають у вектор для перенесення генів, адаптований для експресії генів інсектицидного токсину B.t. і їх варіантів в рослинній клітині шляхом включення у вектор рослинного промотору. У доповнення до рослинних промоторів, для експресії чужорідних генів в рослинних клітинах можна ефективно використовувати промотори з різних джерел. Наприклад, можна використовувати промотори бактеріального походження, такі як промотор октопінсинтази, промотор нопалінсинтази, промотор манопінсинтази; промотори вірусів рослин, такі як промотори 35S і 19S віруси мозаїки цвітної капусти і т. п. Рослинні промотори включають, але не обмежуються ними, промотор малої субодиниці (ssu) рибулозо-1,6-біфосфат (RUBP) карбоксилази, промотор бетаконгліциніну, промотор фазеоліну, промотор ADH (алкогольдегідрогенази), промотори теплового шоку, промотор ADF (фактора деполімеризації актину) і тканиноспецифічні промотори. Промотори також можуть містити певні елементи енхансерної послідовності, які можуть збільшувати ефективність транскрипції. Типові енхансери включають, але не 11 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обмежуються ними, ADH1-інтрон 1 і ADH1-інтрон 6. Можна використовувати конститутивні промотори. Конститутивні промотори визначають постійну експресію гену практично у всіх типах клітин і практично весь час (наприклад, актин, убіквітин, CaMV35S). Тканиноспецифічні промотори відповідають за експресію гену в конкретних типах клітин або тканин, таких як листя або насіння (наприклад, зеїн, олеозин, напін, ACP (ацил-переносний білок)), і ці промотори також можна використовувати. Також можна використовувати промотори, які є активними в ході певної стадії розвитку рослини, а також є активними в конкретних тканинах і органах рослини. Приклади таких промоторів включають, але не обмежуються ними, промотори, які є специфічними до коріння, специфічними до пилка, специфічними до зародків, специфічними до кукурудзяних рилець, специфічними до бавовняних волокон, специфічними до ендосперми насіння, специфічними до флоеми і т. п. У певних випадках може бути бажаним використовувати індуцибельний промотор. Індуцибельний промотор відповідає за експресію генів у відповідь на специфічний сигнал, такий як: фізичний стимул (наприклад, гени теплового шоку); світло (наприклад, RUBP-карбоксилаза); гормон (наприклад, глюкокортикоїд); антибіотик (наприклад, тетрациклін); метаболіти; і стрес (наприклад, засуха). Можна використовувати інші бажані елементи транскрипції і трансляції, які функціонують в рослинах, такі як 5'-нетрансльовані лідерні послідовності, послідовності термінації транскрипції РНК і сигнальні послідовності поліаденілатної вставки. У даній галузі відомі численні специфічні для рослин вектори для перенесення генів. Трансгенні культури, що містять ознаки стійкості до комах (IR), поширені в рослинах кукурудзи і бавовни вздовж Північної Америки, і використання цих ознак розповсюджується по всьому світу. Комерційні трансгенні культури, що поєднують ознаки IR і стійкість до гербіцидів (HT), були розроблені множиною компаній по виробництву насіння. Вони включають комбінації ознак IR, що забезпечуються інсектицидними білками B.t., і ознак HT, таких як стійкість до інгібіторів ацетолактатсинтази (ALS), таких як сульфонілсечовини, імідазолінони, триазолопіримідин, сульфонаніліди і т. п., інгібітори глутамінсинтази (GS), такі як біалафос, глуфосинат і т. п., інгібітори 4-гідроксифенілпіруватдіоксигенази (HPPD), такі як мезотрион, ізоксафлутол і т. п., інгібітори 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (EPSPS), такі як гліфосат і т. п., і інгібітори ацетил-кофермент А-карбоксилази (ACCase), такі як галоксифоп, квізалофоп, диклофоп і т. п. Відомі інші приклади, в яких білки, що надаються трансгенно, забезпечують стійкість рослини до хімічних класів гербіцидів, таких як гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі піридилоксіацетатів ауксину (див. WO 2007/053482 A2), або гербіциди на основі феноксикислот і арилоксифеноксипропіонатні гербіциди (див. WO 2005107437 A2, A3). Можливість боротьби з множиною проблем, пов'язаних з паразитами, за допомогою ознак IR є цінною концепцією комерційного продукту, і зручність цієї концепції продукту збільшується, якщо ознаки боротьби з комахами і ознаки боротьби з бур'янами поєднуються в одній рослині. Крім того, збільшена корисність може бути досягнута за допомогою комбінацій в одній рослині ознак IR, що надаються інсектицидним білком B.t., таким як білок за даним винаходом, з одним або декількома додатковими ознаками HT, такими як ознаки, згадані вище, разом з однією або декількома додатковими внесеними ознаками (наприклад, стійкість до інших комах, що забезпечується білками, що походять з B.t., або іншими інсектицидними білками, стійкість до комах, що забезпечується механізмами, такими як РНК-i і т. п., стійкість до круглих черв'яків, що забезпечується білками, що походять з B.t., або іншими нематоцидними білками, стійкість до круглих черв'яків, що забезпечується механізмами, такими як РНК-i і т. п., стійкість до захворювання, стійкість до стресу, збільшене вживання азоту і т. п.), або ознаками продукції (наприклад, високий вміст масла, корисний склад масел, поліпшення поживних властивостей і т. п.). Такі комбінації можна отримувати або шляхом загальноприйнятого виведення (виведений набір), або спільно як нова трансформаційна подія, що залучає одночасне внесення множини генів (молекулярний набір). Переваги включають можливість контролю шкідливих комах і поліпшену боротьбу з бур'янами в культурній рослині, яка забезпечує повторну користь для виробника і/або споживача. Таким чином, даний винахід можна використовувати в комбінації з іншими ознаками для забезпечення повного агрономічного комплекту поліпшених якостей культури з можливістю універсально і економічно контролювати будь-яку кількість агрономічних проблем. Паразити-мішені Токсин DIG-109 і токсин DIG-152 за винаходом особливо придатні для застосування в боротьбі з комахами Lepidopteran. Lepidopterans є важливою групою сільськогосподарських, садівничих і побутових паразитів, які викликають дуже велику кількість пошкоджень кожний рік. Цей ряд комах охоплює личинки і дорослі особні, що харчуються листям і корінням. Шкідливі комахи Lepidopteran включають, але не обмежуються ними: Achoroia grisella, Acleris gloverana, 12 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon (совка-іпсилон), Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia feneralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella (південнозахідна кукурудзяна вогнівка), Diatraea saccharalis (очеретяна вогнівка), Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Esphestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea (совка бавовняна), Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantia cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxagrotis albicosta (західна бобова совка), Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis (європейський кукурудзяний метелик), Paleacrita vernata, Papiapema nebris (звичайний стеблевий метелик), Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella (моль капустяна), Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta (похідні черв'яки), Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonta ocellana, Spodoptera frugiperda (совка трав'яна), Spodoptera exigua (совка мала), Thaurnstopoea pityocampa, Ensola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curiails і Yponomeuta padella. Також передбачене застосування токсину DIG-109 і токсину DIG-152 і їх варіантів для боротьби з паразитами Coleopteran сільськогосподарських рослин. У деяких варіантах здійснення Cry-білки можна економічно використовувати для боротьби зі шкідливими комахами, які включають, але не обмежуються ними, наприклад, личинки, що пошкоджують коріння, такі як Diabrotica undecimpunctata howardi (південна блошка довговуса), Diabrotica longicornis barberi (північна блошка довговуса), і Diabrotica virgifera (західна блошка довговуса) і личинки, такі як личинки Cyclocephala borealis (хрущик північний), Cyclocephala immaculate (хрущик південний) і Popillia japonica (хрущик японський). Детекція токсинів DIG-109 і DIG-152 за допомогою антитіл Антитіла проти токсинів. Антитіла до токсинів B.t., описаних в даному описі, або до еквівалентних токсинів або фрагментів цих токсинів, можна легко отримувати з використанням стандартних методик в даній галузі, як описано, наприклад, Coligan et al., 2007 і його доповнення. Такі антитіла придатні для детекції присутності токсину DIG-109, токсину DIG-152 і їх варіантів. Після виділення інсектицидного токсину B.t. можна індукувати антитіла, специфічні до токсину, загальноприйнятими способами, які добре відомі в даній галузі. Повторювані ін'єкції вибраному хазяїну протягом періоду, що складає тижні або місяці, викликає імунну відповідь і приводить до значних сироваткових титрів антитіл проти B.t. Переважними хазяїнами є види ссавців і більш високо переважними видами є кролики, кози, вівці і миші. Взяття крові від таких імунізованих тварин можна провести будь-якими загальноприйнятими способами для отримання антисироватки (поліклональні антитіла), реактивної відносно інсектицидного токсину B.t. Потім антисироватку можна піддавати афінному очищенню шляхом адсорбції на токсин способами, відомими в даній галузі. Піддану афінному очищенню сироватку можна далі очищати шляхом виділення фракції імуноглобулінів в антисироватці з використанням методик, відомих в даній галузі. Отриманий матеріал являє собою гетерогенну популяцію імуноглобулінів, реактивних відносно інсектицидного токсину B.t. Антитіла проти токсину B.t. також можна отримувати шляхом отримання напівсинтетичного імуногену, що складається з синтетичного пептидного фрагмента інсектицидного токсину B.t., кон’югованого з імуногенним носієм. Численні схеми і інструменти, придатні для отримання пептидних фрагментів, добре відомі в даній галузі. Також в даній галузі добре відомі багато які придатні імуногенні носії, такі як бичачий сироватковий альбумін або гемоціанін лімфи равлика, а також способи зв’язування імуногену і білків-переносників. Після конструювання напівсинтетичного імуногену методика отримання антитіл, специфічних до фрагмента інсектицидного токсину B.t., ідентична методиці, що використовується для отримання антитіл, реакційноздатних відносно природного токсину B.t. Моноклональні антитіла (MAb) проти токсину B.t. легко отримувати з використанням очищеного інсектицидного токсину B.t. Способи отримання MAb застосовують на практиці 13 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 протягом понад 15 років, і вони добре відомі фахівцям в даній галузі. Повторювані внутрішньоочеревинні або підшкірні ін'єкції очищеного інсектицидного токсину B.t. в ад'юванті викличуть імунну відповідь у більшості тварин. Гіперімунізовані В-лімфоцити витягують з тварини і піддають злиттю з придатною для злиття клітинною лінією-партнером, здатною до необмеженого культивування. Переважними тваринами, В-лімфоцити яких можна гіперімунізувати і використовувати для отримання MAb, є ссавці. Більш переважними тваринами є щури і миші і найбільш переважною є лінія мишей BALB/с. Для отримання гібридом придатними партнерами по злиттю є численні клітинні лінії ссавців. Багато які такі лінії доступні від American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) і комерційних постачальників. Переважні клітинні лінії, що є партнером по злиттю, походять з мієлом миші, і найбільш переважною є клітинна лінія мієломи HL-1о Friendly myeloma-653 (Ventrex, Portland, ME). Після злиття отримані гібридоми культивують в селективному середовищі для росту протягом від одного до двох тижнів. Доступні дві добре відомих системи селекції для усунення незлитих клітин мієломи, або злитих один з одним клітин мієломи, із змішаної культури гібридом. Вибір системи селекції залежить від імунізованої лінії мишей і мієломного партнера по злиттю, що використовується. Можна використовувати систему селекції aaT, описану Taggart and Samloff, (1983); однак переважною є система селекції HAT (гіпоксантин, аміноптерин, тимідин), описана Littlefield (1964), внаслідок її сумісності з переважною лінією миші і партнером по злиттю, згаданими вище. Потім відпрацьоване середовище для росту піддають скринінгу відносно секреції імуноспецифічних MAb. Для цього найбільш придатні методики твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA); хоч також прийнятні радіоімунні аналізи, адаптовані для скринінгу у великому об'ємі. Можна провести множинні скринінги, призначені для послідовного усунення значної кількості непотрібних або менш бажаних культур. Культури, які секретують MAb, реактивні відносно інсектицидного токсину B.t., можна піддавати скринінгу відносно перехресної реактивності з відомими інсектицидними токсинами Переважними MAb є MAb класу IgG і більш високо переважними MAb є MAb субізотипів IgG1 і IgG2a. Культури гібридом, які секретують переважні MAb, можна субклонувати декілька разів для забезпечення моноклональності і стабільності. Добре відомі способи субклонування еукаріотичних клітинних культур, що не прикріпляються, включають лімітуюче розведення, способи з м'якою агарозою і способи активованого флуоресценцією сортування клітин. Після кожного субклонування отримані культури переважно повторно аналізують відносно секреції антитіл і ізотипу, щоб пересвідчитися у встановленні стабільної переважної секретуючої MAb культури. Антитіла проти токсину B.t. придатні в різних способах детекції заявленого інсектицидного токсину B.t. за даним винаходом і його варіантів або фрагментів. Добре відомо, що антитіла, мічені репортерною групою, можна використовувати для ідентифікації присутності антигенів в різному середовищі. Антитіла, мічені радіоізотопом, використовують протягом десятиріч в радіоімунних аналізах для ідентифікації з високою точністю і чутливістю присутності антигенів в різних біологічних рідинах. Пізніше стали використовувати мічені ферментом антитіла як субстрат для мічених радіоактивною міткою антитіл в аналізі ELISA. Крім того, антитіла, імунореактивні до інсектицидного токсину B.t. за даним винаходом, можна зв'язувати з імобілізуючою речовиною, такою як ямка планшета з полістиролу або частинка з полістиролу, і використовувати в імуноаналізах для визначення того, чи присутній токсин B.t. в зразку, що тестується. Детекція з використанням зондів Наступним способом для ідентифікації токсинів і генів за даним винаходом є ідентифікація з використанням олігонуклеотидних зондів. Ці зонди являють собою нуклеотидні послідовності, що піддаються детекції. Ці послідовності можна робити такими, що піддаються детекції, за допомогою прийнятної радіоактивної мітки або їх можна робити за своєю природою флуоресцентними, як описано в патенті США № 6268132. Як добре відомо в даній галузі, якщо молекула зонда і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються шляхом утворення сильних зв'язків спаровування основ між двома молекулами, можна обґрунтовано передбачити, що зонд і зразок мають істотну гомологію послідовностей. Переважно гібридизацію проводять в жорстких умовах способами, добре відомими в даній галузі, як описано, наприклад, в Keller and Manak (1993). Детекція зонду забезпечує засіб для визначення відомим чином того, чи сталася гібридизація. Такий аналіз зондів забезпечує швидкий спосіб для ідентифікації генів, що кодують токсин за даним винаходом. Нуклеотидні сегменти, які використовують як зонди згідно з винаходом, можна синтезувати з використанням пристрою для синтезу ДНК і стандартних методик. Ці 14 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидні послідовності також можна використовувати як праймери для ПЛР з метою ампліфікації генів за даним винаходом. Гібридизація Як добре відомо фахівцям в галузі молекулярної біології, схожість двох нуклеїнових кислот можна охарактеризувати за їх схильністю до гібридизації. Як використовують в рамках винаходу терміни "жорсткі умови " або "жорсткі умови гібридизації" стосуються умов, в яких зонд гібридизується (піддається відпалу) з його послідовністю-мішенню в більшій мірі на рівні, що піддається детекції, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше в 2-рази вище фонового рівня). Жорсткі умови залежать від послідовності і відрізняються в різних обставинах. Шляхом контролю жорсткості умов гібридизації і/або промивання, можна ідентифікувати послідовності-мішені, які на 100% комплементарні зонду (гомологічне дослідження). Альтернативно умови жорсткості можна коректувати, щоб дозволити деяку невідповідність послідовностей, так, щоб виявляти більш низький ступінь схожості (гетерологічне дослідження). Як правило, зонд має довжину менше ніж приблизно 1000 нуклеотидів, переважно менше ніж приблизно 500 нуклеотидів. Як правило, жорсткі умови являють собою умови, в яких концентрація солі являє собою концентрацію меншу ніж приблизно 1,5 M іонів Na, як правило, приблизно 0,01-1,0 M іонів Na (або інших солей) при pH від 7,0 до 8,3, і температура становить щонайменше приблизно 30°С для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60°С для довгих зондів (наприклад, більш ніж приблизно 50 нуклеотидів). Жорсткі умови також можна забезпечувати додаванням дестабілізаторів, таких як формамід. Ілюстративні умови низької жорсткості включають гібридизацію з буферним розчином 30%-35% формаміду, 1 M NaCl, 1% SDS (додецилсульфат натрію) при 37°С і промивання в 1X-2X SSC (20X SSC=3,0 M NaCl/0,3 M трицитраті натрію) при 50°С-55°С. Ілюстративні умови помірної жорсткості включають гібридизацію в 40%-45% формаміді, 1,0 M NaCl, 1% SDS при 37°С і промивання в 0,5 X-1X SSC при 55°С-60°С. Ілюстративні умови високої жорсткості включають гібридизацію в 50% формаміді, 1 M NaCl, 1% SDS при 37°С і промивання в 0,1 X SSC при 60°С-65°С. Необов'язково, буфери для промивання можуть містити від приблизно 0,1% до приблизно 1% SDS. Тривалість гібридизації, як правило, складає менше ніж приблизно 24 години, звичайно від приблизно 4 до приблизно 12 годин. Специфічність, як правило, залежить від промивань після гібридизації, причому найважливішими факторами є іонна сила і температура кінцевого розчину для промивання. Для гібридів ДНК/ДНК температура плавлення (Tm) являє собою температуру (при певній іонній силі і pH), при якій 50% комплементарної послідовності-мішені гібридизується з абсолютно відповідним зондом. Tm знижується приблизно на 1°С для кожної 1% невідповідності; таким чином, Tm, умови гібридизації і/або умови промивання можна коректувати для полегшення відпалу послідовностей з бажаною ідентичністю. Наприклад, якщо потрібні послідовності з >90% ідентичністю, температура може бути нижчою ніж T m на 10°С. Як правило, жорсткі умови вибирають так, щоб температура складала на 5°С нижче ніж T m для конкретної послідовності і комплементарної їй послідовності при певній іонній силі і pH. Однак в умовах високої жорсткості може використовуватися гібридизація і/або промивання при температурі, на 1°С, 2°С, 3°С або 4°С нижче ніж Tm; в умовах помірної жорсткості може використовуватися гібридизація і/або промивання при температурі, на 6°С, 7°С, 8°С, 9°С або 10°С нижче ніж T m, і в умовах низької жорсткості може використовуватися гібридизація і/або промивання при температурі, на 11°С, 12°С, 13°С, 14°С, 15°С або 20°С нижче ніж Tm. Tm (в °С) можна експериментально визначати або можна приблизно обчислювати. Для гібридів ДНК-ДНК Tm може бути приблизно обчислена з рівняння Meinkoth і Wahl (1984):) Tm (°C)=81,5C+16,6(log M)+0,41(%GC)-0,61(% формамід)-500/л; де M являє собою молярність одновалентних катіонів, %GC являє собою процент нуклеотидів гуанозину і цитозину в ДНК, % формамід являє собою процент формаміду в гібридизаційному розчині, і L являє собою довжину гібриду в парах основ. Альтернативно Tm описується наступною формулою (Beltz et al., 1983). Tm(°C)=81,5°C+16,6(log[Na+])+0,41(%GC)-0,61(% формамід)-600/л де [Na+] являє собою молярність іонів натрію, %GC являє собою процент нуклеотидів гуанозину і цитозину в ДНК, % формамід являє собою процент формаміду в розчині для гібридизації, і L являє собою довжину гібриду в парах основ. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що з використанням рівнянь, композицій для гібридизації і промивання і бажаною T m, по суті описують варіювання жорсткості розчинів для гібридизації і/або промивання. Якщо бажаний ступінь невідповідності приводить до T m менше за 45°С (водний розчин) або 32°С (розчин формаміду), переважно збільшити концентрацію SSC, 15 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 так, щоб використовувати більш високу температуру. Докладне керівництво по гібридизації нуклеїнових кислот може бути знайдене в Tijssen (1993) і Ausubel et al., 1995 і їх доповненнях). Також див. Sambrook et al., (1989) і його оновлення. Гібридизацію імобілізованої ДНК на саузерн-блотах з міченими радіоактивною міткою зондами можна провести стандартними способами Sambrook et al., вище. Радіоактивні ізотопи, що використовуються для мічення полінуклеотидних зондів, можуть включати 32P, 33P, 14C або 3H. Включення радіоактивних ізотопів в молекули полінуклеотидного зонда можна провести будь-яким з декількох способів, добре відомих фахівцям в галузі молекулярної біології. (Див., наприклад, Sambrook et al., вище.) Як правило, гібридизацію і подальші промивання можна провести в жорстких умовах, які дозволяють детекцію послідовностей-мішеней з гомологією заявленим генам, що кодують токсин. Для дволанцюгових генних ДНК-зондів гібридизацію можна провести протягом ночі при температурі на 20-25С нижче ніж Tm ДНК-гібрида в 6X SSPE, 5X розчині Денхардта, 0,1% SDS, 0,1 мг/мл денатурованій ДНК [20X SSPE являє собою 3M NaCl, 0,2 M NaHPO4 і 0,02 M EDTA (натрієва сіль етилендіамінтетраоцтової кислоти); 100X розчин Денхардта являє собою 20 г/л полівінілпіролідону, 20 г/л Ficoll типу 400 і 20 г/л бичачого сироваткового альбуміну (фракція V)]. Промивання, як правило, можна провести таким чином: Два рази при кімнатній температурі протягом 15 хвилин в 1X SSPE, 0,1% SDS (промивання більш низької жорсткості). Один раз при Tm - 20С протягом 15 хвилин в 0,2 X SSPE, 0,1% SDS (промивання більш високої жорсткості). Для олігонуклеотидних зондів гібридизацію можна проводити протягом ночі при температурі, на 10-20С нижче ніж Tm гібриду в 6X SSPE, 5X розчині Денхардта, 0,1% SDS, 0,1 мг/мл денатурованій ДНК. Tm для олігонуклеотидних зондів можна визначати по наступній формулі (Suggs et al., 1981). Tm(C)=2(число пар основ Т/А)+4(число пар основ G/С)) Промивання, як правило, можна провести таким чином: Два рази при кімнатній температурі протягом 15 хвилин в 1X SSPE, 0,1% SDS (промивання нижчої жорсткості). Один раз при температурі гібридизації протягом 15 хвилин в 1X SSPE, 0,1% SDS (промивання вищої жорсткості). Деякі приклади комбінацій концентрацій солей і температури є наступними (в порядку збільшення жорсткості): 2X SSPE або SSC при кімнатній температурі; 1X SSPE або SSC при 42С; 0,1X SSPE або SSC при 42С; 0,1X SSPE або SSC при 65С. Молекули зондів для гібридизації і гібридні молекули, утворені між зондом і молекуламимішенями, можна робити такими, що піддаються детекції, за допомогою засобів, відмінних від мічення радіоактивною міткою. Мають на увазі, що такі альтернативні способи знаходяться в об'ємі цього винаходу. Потрібно розуміти, що приклади і варіанти здійснення, описані в цьому документі, представлені тільки для ілюстративних цілей, і що різні модифікації або зміни, що враховують їх, можуть бути запропоновані фахівцям в даній галузі, і вони включені в суть і межі даної заявки і об'єм прикладеної формули винаходу. Якщо немає інших конкретних вказівок або позначень форма однини означає "щонайменше один", як використовують в рамках винаходу. Нижче представлені приклади, які ілюструють методики для застосування на практиці винаходу. Ці приклади не треба тлумачити як такі, що обмежують. Всі проценти надані по масі і всі співвідношення сумішей в розчиннику представлені по об'єму, якщо немає інших вказівок. Всі температури надані в градусах Цельсія. ПРИКЛАД 1 Конструювання химерних центральних токсинів Cry1Ca і протоксинів Cry1Ab Химерні токсини. Химерні білки, в яких використовується домен центрального токсину з одного токсину Cry, злитий з сегментом протоксину з іншого токсину Cry були описані раніше, наприклад, в патенті США № 5593881 і патенті США № 5932209. Послідовність білка дельтаендотоксину Cry1Ca3 депонована з реєстраційним номером GenBank AAA22343 під застарілою назвою Cry1C(b). Варіанти химерного білка Cry1Ca за винаходом включають токсини, що містять N-кінцевий сегмент центрального токсину, що походить з інсектицидного токсину Cry1Ca3, злитий з гетерологічним сегментом протоксину з дельта-ендотоксину в точці після закінчення сегмента центрального токсину. Перехід від центрального токсину до гетерологічного сегмента протоксину може відбуватися приблизно в точці з'єднання центральний токсин/протоксин або, 16 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 альтернативно, може бути збережена частина нативного протоксину (що продовжується після сегмента центрального токсину) з подальшим переходом до гетерологічного протоксину. Як варіант, центральний токсин і сегменти протоксину можуть містити точну амінокислотну послідовність нативних токсинів, з яких вони походять, або вони можуть включати амінокислотні вставки, делеції або заміни, які не знижують і можуть збільшувати біологічну функцію сегментів при їх злитті один з одним. Наприклад, химерний токсин за даним винаходом містить сегмент центрального токсину, що походить з Cry1Ca3, і гетерологічний протоксин. У переважному варіанті здійснення винаходу сегмент центрального токсину, що походить з Cry1Ca3 і описаний як сегмент центрального токсину Cry1Ca в SEQ ID NO: 1 (619 амінокислот), є злитим з гетерологічним сегментом, що містить сегмент протоксину, що походить з дельта-ендотоксину Cry1Ab. У SEQ ID NO: 2 представлена послідовність з 545 амінокислот для одного сегмента протоксину, що походить з Cry1Ab і придатного у варіантах Cry1Ca за винаходом. Звертається увага на останні приблизно 100-150 амінокислот цього сегмента протоксину SEQ ID NO: 2, який є важливим для включення в химерний токсин за даним винаходом. Таким чином, переважний варіант здійснення винаходу включає химерний білок, в якому сегмент центрального токсину Cry1Ca, представлений як SEQ ID NO: 1, сполучений з сегментом протоксину, що походить з Cry1Ab, представленим в SEQ ID NO: 2. Послідовність химерного білка з 1164 амінокислот, що позначається в даному описі як DIG-152, представлена як SEQ ID NO: 3 (версія pMYC2547). Другий переважний варіант здійснення винаходу включає химерний білок, в якому сегмент центрального токсину Cry1Ca, описаний як SEQ ID NO: 1, сполучений з другим сегментом протоксину з 545 амінокислот, що походить з Cry1Ab, представленим в SEQ ID NO: 4. Звертається увага на останні приблизно 100-150 амінокислот цього сегмента протоксину, який є важливим для включення в химерний токсин за даним винаходом. Послідовність другого химерного білка з 1164 амінокислот, що позначається як DIG-109, описана як SEQ ID NO: 5 (оптимізована для кукурудзи версія). Потрібно розуміти, що в об'єм цього винаходу входять інші химерні злиті конструкції, що містять варіанти центрального токсину Cry1Ca і протоксини, що походять з Cry1Ab. Потрібно зазначити, що сегменти протоксину, що походять з Cry1Ab, представлені в SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 4, є по суті функціональними еквівалентами один одного, що відрізняються по послідовності тільки в одному (першому) положенні. ПРИКЛАД 2 Конструювання експресуючих плазмід, що кодують химерні білки центральна частина Cry1Ca/протоксин Cry1Ab, і експресія в Pseudomonas Для конструювання експресуючої конструкції Pseudomonas fluorescens (Pf) pMYC2547, модифікованої способами інженерії для продукування повнорозмірного химерного білка, що містить центральну частину Cry1Ca, злиту з протоксином Cry1Ab (DIG-152; SEQ ID NO: 3), використовували стандартні способи клонування [як описано, наприклад, в Sambrook et al., (1989) і Ausubel et al., (1995), і їх доповнення]. Продукування білка проводили в штамі Pseudomonasfluorescens MB214 (похідне штаму MB101; Р. fluorescens біовару I), що має інсерцію модифікованого lac-оперону, як описано в патенті США № 5169760. Основна стратегія клонування залучала субклонування фрагмента ДНК, що кодує DIG-152, в плазмідні вектори, за допомогою чого він вміщується під контроль експресії промотором Ptac і термінатором rrnBT1T2 з плазміди pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). Одна така плазміда була названа pMYC2547, і ізолят MB214, що містить цю плазміду, названий Dpf108. Аналіз росту і експресії у обертових флаконах. Продукування білка DIG-152 для охарактеризації і біоаналізу на комахах проводили за допомогою вирощеного у обертових флаконах штаму Dpf108 P. fluorescens. Продукування білка DIG-152, що запускається промотором Ptac, проводили, як описано раніше в патенті США № 5527883. Експресію індукували додаванням ізопропіл--D-1-тіогалактопіранозиду (IPTG) після первинної інкубації протягом 24 годин при 30° при погойдуванні. Взяття зразків культур проводили під час індукції і в різні моменти часу після індукції. Щільність клітин вимірювали по оптичній густині при 600 нм (OD600). Фракціонування клітин і аналіз SDS-PAGE зразків з обертових флаконів. В кожний момент часу взяття зразка, щільність клітин в зразках доводили до OD600=20 і аліквоти об'ємом 1 мл центрифугували при 14000×g протягом п'яти хвилин. Клітинні осади заморожували при -80. Розчинні і нерозчинні фракції із заморожених зразків осаду з обертових флаконів отримували з TM використанням розчину для екстракції бактеріального білка EasyLyse (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI). Кожний клітинний осад ресуспендували в 1 мл розчину TM EasyLyse і далі розбавляли 1:4 в буфері для лізування і інкубували при обертанні при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Лізат центрифугували при 14000 об./хв. протягом 20 17 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хвилин при 4 і супернатант виділяли як розчинну фракцію. Потім осад (нерозчинна фракція) ресуспендували в рівному об'ємі фосфатно-сольового буфера (PBS; 11,9 мМ Na2HPO4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, pH7,4). Зразки змішували 1:1 з 2X буфером для зразка Laemmli, що містив β-меркаптоетанол (Sambrook et al., вище) і кип'ятили протягом 5 хвилин перед нанесенням на 12% Bis-Tris гелі Criterion XT (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Електрофорез проводили в рекомендованому буфері XT MOPS. Гелі забарвлювали барвником кумасі Bio-Safe згідно з протоколом виробника (BioRad) і візуалізували з використанням системи для візуалізації Alpha Innotech Imaging system (San Leandro, CA). Отримання тілець включення. Отримання тілець включення (IB) білка DIG-152 проводили на клітинах Р. fluorescens, що культивуються, які продукували нерозчинний інсектицидний білок B.t., як було продемонстровано за допомогою SDS-PAGE і MALDI-MS (мас-спектрометрія з лазерною десорбцією/іонізацією в присутності матриці). Осідання культивованих Р. fluorescens розморожували на водяній бані при 37°. Клітини ресуспендували до 25% мас./об. в буфері для лізування [50 мМ Tris, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 20 мМ динатрієва сіль EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота), 1% Triton X-100, і 5 мМ дитіотреїтол (DTT); 5 мл/л коктейля інгібіторів бактеріальних протеаз (каталожний номер P8465; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) додавали безпосередньо перед застосуванням]. Клітини суспендували з використанням переносного гомогенізатора при найнижчих параметрах (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). До суспензії клітин додавали лізоцим (25 мг Sigma L7651, з яєчного білка курки) шляхом перемішування металевим шпателем, і суспензію інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Суспензію охолоджували на льоду протягом 15 хвилин, потім обробляли ультразвуком з використанням Branson Sonifier 250 (дві сесії по 1 хвилині при 50% робочому циклі, 30% вихід). Лізис клітин перевіряв за допомогою мікроскопії. При необхідності додавали додаткові 25 мг лізоциму, і інкубацію і обробку ультразвуком повторювали. Після підтвердження лізису клітин за допомогою мікроскопії, лізат центрифугували при 11500×g протягом 25 хвилин (4) до отримання осаду IB, і супернатант відкидали. Осад IB ресуспендували за допомогою 100 мл буфера для лізису, гомогенізували переносним змішувачем і центрифугували, як описано вище. Осад IB багато разів промивали шляхом ресуспендування (в 50 мл буферу для лізування), гомогенізації, обробки ультразвуком, і центрифугуванням доти, поки супернатант не ставав безбарвним і осад IB не ставав твердим і не набував не зовсім білого кольору. Для кінцевого промивання осад IB ресуспендували в стерилізованій фільтруванням (0,22 мкм) дистильованій воді, що містила 2 мМ EDTA, і центрифугували. Кінцевий осад ресуспендували в стерилізованій фільтруванням дистильованій воді, що містила 2 мМ EDTA, і зберігали 1-мл аліквотами при -80. Аналіз SDS-PAGE і кількісне визначення білка в препаратах IBпроводили шляхом розмороження 1-мл аліквоти осаду IB і розбавлення його 1:20 стерилізованою фільтруванням дистильованою водою. Потім розбавлений зразок кип'ятили з 4X відновлювальним буфером для зразка [250 мМ Tris, pH 6,8, 40% гліцерин (об./об.), 0,4% бромфеноловий синій (мас./об.), 8% SDS (мас./об.) і 8% -меркаптоетанол (мас./мас.)] і наносили на 4-20% Tris-гліциновий гель з 12+2 ямками Novex (Invitrogen), проганяючи з 1X буфером Tris/гліцин/SDS (BioRad). Гель проганяли протягом 60 хв. при 200 Вольт, потім забарвлювали кумасі синім (50% G-250/50% R250 в 45% метанолі, 10% оцтовій кислоті), і видаляли барвник 7% оцтовою кислотою, 5% метанолом в дистильованій воді. Кількісне визначення намічених смуг проводили шляхом порівняння денситометричних величин для цих смуг проти стандартних зразків бичачого сироваткового альбуміну (BSA), прогнаних на тому ж гелі для отримання стандартної кривої. Солюбілізація тілець включення. Шість мл суспензії тілець включення DIG-152 з Pf клону DPf108 центрифугували при найвищих параметрах на мікроцентрифузі Eppendorf моделі 5415C (приблизно 14000×g) для осадження тілець включення. Супернатант буфера для зберігання видаляли і замінювали 25 мл 100 мМ натрію-карбонатного буфера, pH11, в 50-мл конічній пробірці. Включення ресуспендували з використанням піпетки і струшували для ретельного перемішування. Пробірку вміщували на платформу, що злегка коливається, при 4 протягом ночі для екстракції білка-мішені. Екстракт центрифугували при 30000×g протягом 30 хв. при 4, і отриманий супернатант концентрували 5 разів з використанням целюлозного фільтруючого пристрою, що регенерується, для центрифуги Amicon Ultra-15 (межа молекулярної маси 30000; Millipore). Потім буфер для зразка замінювали на 10 мМ CAPS [3-(циклогексаміно)-1пропансульфонова кислота], pH 10, з використанням одноразових колонок PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Солюбілізація і активація трипсином білка тілець включення. У деяких випадках суспензію тілець включення DIG-152 з Pf клону DPf108 центрифугували при найвищих параметрах 18 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мікроцентрифуги Eppendorf моделі 5415C (приблизно 14000×g) для осадження тілець включення. Супернатант у вигляді буфера для зберігання видаляли і замінювали 100 мМ CAPS, pH 11, з отриманням концентрації білка приблизно 50 мг/мл. Пробірку погойдували при кімнатній температурі протягом трьох годин до повної солюбілізації білка. Додавали трипсин в кількості, що дорівнює приблизно 5%-10%) (мас.:мас., з розрахунку на вихідну масу порошку IB) і розщеплення проводили шляхом інкубації при гойданні протягом ночі при 4 або шляхом погойдування протягом 90-120 хвилин при кімнатній температурі. Нерозчинний матеріал видаляли центрифугуванням при 10000×g протягом 15 хвилин, і супернатант наносили на аніонообмінну колонку MonoQ (10 мм на 10 см). Активований білок DIG-152 елюювали (як визначали за допомогою SDS-PAGE, див. нижче) за допомогою 0%-100% градієнта 1 M NaCl протягом 25 об'ємів колонки. Фракції, що містили активований білок, об'єднували і, коли необхідно, концентрували до менше ніж 10 мл з використанням целюлозного фільтруючого пристрою, що регенерується, для центрифуги Amicon Ultra-15, як указано вище. Потім матеріал пропускали через колонку Superdex 200 (16 мм на 60 см) в буфері, що містив 100 мМ NaCl. 10% гліцерин, 0,5% Tween-20 і 1 мМ EDTA. За допомогою аналізу SDS-PAGE було визначено, що активований (ферментативно укорочений) білок елююється при від 65 до 70 мл. Фракції, що містили активований білок, об'єднували і концентрували з використанням центрифугального концентратора, як описано вище. Гель-електрофорез. Препарати концентрованого білка отримували для електрофорезу розбавленням 1:50 в буфері для зразка NuPAGEо LDS (Invitrogen), що містив 5 мМ DTT як відновник, і нагрівали при 95 протягом 4 хвилин. Зразок наносили в дубльовані доріжки 4-12% NuPAGEо гелю разом з стандартами BSA в діапазоні від 0,2 мкг до 2 мкг/доріжку (для отримання стандартної кривої). Застосовували напругу 200 В з використанням SDS-буфера для прогону MOPS (Invitrogen) доти, поки барвник для відстеження не досягав нижньої частини гелю. Гель забарвлювали 0,2% кумасі синім G-250 в 45% метанолі, 10% оцтовій кислоті, і барвник видаляли, спочатку короткочасною обробкою 45% метанолом, 10% оцтовою кислотою, а потім тривало 7% оцтовою кислотою, 5% метанолом доти, поки фон не прояснявся. Після видалення барвника гель сканували за допомогою BioRad Fluor-S MultiImager. Програмне забезпечення пристрою Quantity One Software v.4.5.2 використовували для отримання величин з віднятим фоновим значенням для смуг забарвленого білка і для отримання стандартної кривої для BSA, яку використовували для обчислення концентрації химерного білка DIG-152 у вихідному розчині. ПРИКЛАД 3 Інсектицидна активність білка DIG-152, що продукується в Pseudomonas fluorescens Інсектицидна активність білка DIG-152 була продемонстрована на видах Lepidopteran, включаючи європейський кукурудзяний метелик (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)), Cry1F-стійкий ECB (rECB), кукурудзяну совку (CEW; Helicoverpa zea (Boddie)), совку-іпсилон (BCW; Agrotis ipsilon (Hufnagel)), совку трав'яну (FAW, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)), стійку до Cry1F FAW (rFAW) і південний кукурудзяний метелик (SWCB, Diatraea grandiosella). Готування зразка і біоаналіз. Препарати тілець включення (нативний повнорозмірний білок або активований трипсином білок) переносили в 10 мм буфер CAPS, pН 10, способами обміну, такими як діаліз або колонки PD-10. Потім зразки розбавляли відповідним чином у 10 мм CAPS p 10, і всі біоаналізи включали контрольну обробку, що складається з цього буфера, що служила як перевірка фонового рівня відносно смертності або інгібування росту. Концентрації білка в буфері для біоаналізу оцінювали за допомогою гель-електрофорезу з використанням BSA для одержання стандартної кривої для денситометрії в гелі, що проводили з використанням системи для візуалізації BioRad, як описано вище. Білки в гелевій матриці забарвлювали барвником на основі кумасі синього і перед зчитуванням даних барвник видаляли. Очищені білки тестували відносно інсектицидної активності в біоаналізах, проведених з новонародженими личинками Lepidopteran на штучному раціоні для комах. Личинки ECB, CEW, BCW, FAW і SWCB виводили з яєць, отриманих з колонії, підтримуваної комерційним інсектарієм (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). Личинки rECB і rFAW виводили з яєць, зібраних із власних колоній (Dow AgroSciences, Indianapolis, IN). Біоаналізи проводили в пластмасових лотках з 128 ямками, спеціально призначених для біоаналізів на комахах (C-D International, Pitman, NJ). Кожна ямка містила 1,0 мл раціону для множини видів Lepidoptera (Southland Products, Lake Village, AR). 40-мкл аліквоту зразка білка 2 доставляли піпеткою на поверхню для харчування розміром 1,5 см у кожній ямці (тобто 26,7 2 мкл/см ). Концентрації в раціоні обчислювали як кількість (нг) білка DIG-152 на квадратний 19 UA 112286 C2 5 10 15 20 сантиметр площі поверхні ямки. Оброблені лотки тримали у витяжній шафі доти, поки рідина на поверхні для харчування не упарювалась або не абсорбувалася на їжу. У межах декількох годин після вилуплення, окремі личинки відбирали за допомогою змоченої кисті з верблюжої вовни і поміщали на оброблену їжу, по одній личинці на ямку. Потім заражені ямки закривали адгезивними аркушами прозорої пластмаси, вентилювали для забезпечення газообміну (C-D International). Лотки для біоаналізу тримали в контрольованих умовах навколишнього середовища [28, відносна вологість приблизно 40% (RH), 16 год.:8 год. (світло:темрява)] протягом 5 діб, після чого реєстрували загальне число комах, на яких впливали кожним зразком білка, кількість загиблих комах і масу комах, що вижили. Для кожної обробки обчислювали процентну смертність і процентне інгібування росту. Процентне інгібування росту (GI) обчислювали в такий спосіб: %GI=[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]100, де TWIT являє собою загальну масу оброблюваних комах, TNIT являє собою загальну кількість оброблюваних комах TWIBC являє собою загальну масу комах при перевірці фонового рівня (контроль з буфером), і TNIBC являє собою загальну кількість комах при перевірці фонового рівня (контроль з буфером). GI50 визначали як концентрацію химерного білка DIG-152 у раціоні, при якій величина %GI складала 50. LC50 (50% летальна концентрація) реєстрували як концентрацію білка DIG-152 у їжі, при якій 50% тестованих комах знищувалася. Статистичний аналіз (однобічний ANOVA) проводили з використанням програмного забезпечення JMP (SAS, Cary, NC). У таблиці 3 представлені результати біоаналізів вживання білка DIG-152 на сімох типах протестованих личинок комах. 25 FAW rFAW SWCB ECB rECB CEW BCW GI50 LC50 GI50 LC50 GI50 LC50 GI50 LCso GI50 LC50 GI50 LC50 GI50 LC50 38,1 2828,7 78,9 2210,9 3000 1069,0 >3000 >3000 2689,4 >3000 неактивний 30 35 40 45 50 55 Ознакою білка DIG-152 за даним винаходом є те, що ріст новонароджених личинок совки трав'яної (Spodoptera frugiperda) і вогнівки кукурудзяної південно-західної (Diatraea grandiosella) інгібується після вживання білка DIG-152. Крім того, личинки совки трав'яної, котрі є стійкими до інтоксикації Cry1F, є настільки ж чутливими до активності DIG-152, як і личинки совки трав'яної дикого типу. ПРИКЛАД 4 Додаткова інсектицидна активність білка DIG-152, продукованого в Pseudomonas fluorescens Інсектицидну активність відносно Lepidopteran білка DIG-152 (не активованого трипсином) далі демонстрували на новонароджених личинках очеретяної вогнівки (SCB; Diatraea saccharalis) і стійких до Cry1Ab SCB (rSCB) в експериментах доза-ефект із використанням методик включення в їжу. Тільця включення DIG-152 солюбілізували, м'яким коливанням при 4 протягом 4 год. у 7,5 мл 100 мм CAPS p 11, 1 мм EDTA, куди було додано 200 мкл інгібітору бактеріальних протеаз (Sigma P4865; приготовлений відповідно до інструкцій постачальника). Після центрифугування для осадження нерозчинного матеріалу, вихідну концентрацію білка доводили до 4,0 мг/мл у 100 мм CAPS, pН 11. Для біоаналізу на комахах наготовлювали концентрації білка DIG-152 у діапазоні від 0,030 мкг до 102 мкг/г раціону шляхом змішування відповідних обсягів з денним раціоном (Bio-Serv, Frenchtown, NJ) безпосередньо перед розподілом приблизно 0,7 мл їжі в окремі ямки лотків з 128 ямками (Bio-Ba-128, C-D International). Активований трипсином білок Cry1Ab (використаний як позитивний контроль інсектицидної активності тестували в діапазоні від 0,03125 мкг до 32 мкг/г їжі (отриманий змішуванням ліофілізованого порошку з відповідними кількостями дистильованої води перед готуванням їжі). Їжу, отриману з дистильованою водою (порожній контроль, для тестів Cry1Ab) або тільки буфером (100 мМ CAPS p 11, для тестів DIG-152) використовували як контрольну обробку. У кожну ямку поміщали одну новонароджену личинку D. saccharalis (LB Для підготовки до трансформації Agrobacterium, клітини Escherichia coli, клонуючий штам DH5a, що містять плазміду pDAB7691 або плазміду pDAB100276, вирощували при 37° протягом ночі на середовищі з LB-агаром (г/л: триптон Bacto, 10; дріжджовий екстракт Bacto, 5; NaCl, 10; агар, 15), що містив спектиноміцин (100 мкг/мл). Клітини штаму DH5, що містили плазміду pRK2013, що мобілізує кон'югацію, вирощували на агарі LB, що містив канаміцин (50 мкг/мл). Після інкубації планшети поміщали на 4° для очікування приступності Agrobacterium tumefaciens штаму LBA4404, що містив плазміду pSB1. ПРИКЛАД 8 Трансформація Agrobacterium для отримання супербінарних векторів Для трансформації однодольних рослин-хазяїнів зручно використовувати супербінарну систему Agrobacterium, для якої використовуються Agrobacterium tumefaciens штаму LBA4404, що містять плазміду pSB1. Технології конструювання і перевірки супербінарних векторів є загальновизнаними, як представлено в керівництві по використанню для pSB1 (Japan Tobacco). Для отримання і перевірки супербінарної плазміди pDAS5162, яка являє собою об'єднану плазміду, що містить плазміди pSB1 і pDAB7691, і супербінарної плазміди pDAS5848, яка являє собою об'єднану плазміду, що містить плазміди pSB1 і pDAB 100276, використовували стандартні мікробіологічні і молекулярно-біологічні способи. ПРИКЛАД 9 Продукування білка DIG-109 в рослини кукурудзи Опосередковувана Agrobacterium трансформація кукурудзи. Насіння кукурудзи від схрещування Hi-II F1 (Armstrong et al., 1991) висівало в горщики об'ємом 5 галонів (19 л), що містили суміш 95 % безґрунтового середовища для росту Metro-Mix 360 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) і 5 % ґрунту глина/суглинок. Рослини вирощували в теплиці з використанням комбінації натрієвих ламп високого тиску і ламп галогенідів металів зі світловим періодом 16 год. світло: 8 год. темрява. Контрольовані споріднені запилення проводили для отримання зародків F2 для трансформації. Качани кукурудзи збирали приблизно через 8-10 діб після запилення, коли розмір незрілих зародків складав від 1,0 мм до 2,0 мм. Інфікування і кокультивування. Качани кукурудзи очищали, і їх поверхню стерилізували розтиранням з рідким милом, зануренням в 20 % комерційний відбілювач (що містить 5 % гіпохлорит натрію) протягом приблизно 20 хвилин, потім промиванням три рази стерильною водою. Суспензію клітин Agrobacterium tumefaciens, що містили pDAS5162, супербінарний вектор, що містить ген, що кодує білок DIG-109 і містить ген селективного маркера рослин DSM2, отримували перенесенням 1 або 2 петель бактерій [що вирощуються протягом 2-3 діб при 28° на твердому середовищі YEP (г/л: дріжджовий екстракт Bacto, 10; пептон Bacto, 10; NaCl, 5; агар, 15), 100, що містила мг/л спектиноміцину, 10 мг/л тетрацикліну і 250 мг/л стрептоміцину] в 5 мл рідкого середовища для інфікування [мінімальне середовище LS (Linsmaier and Skoog, 1965), вітаміни N6 (Chu et al., 1975), 1,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-D), 68,5 г/л сахарози, 36,0 г/л глюкози, 6 мМ L-проліну, pH 5,2], 100, що містила мкМ ацетосірингон. Альтернативно приготовляли суспензію клітин Agrobacterium tumefaciens, що містила pDAS5848, супербінарний вектор, що містить ген, що кодує білок DIG-109 і містить ген селективного маркера рослин AAD-1, шляхом перенесення 1 або 2 петель бактерій, вирощених як описано вище, в 5 мл рідкого середовища для інфікування, що містила від 100 до 200 мкМ ацетосірингон. В обох випадках розчин струшували до досягнення однорідної суспензії і концентрацію доводили до кінцевої густини 200 одиниць Клетт з використанням колоримера Klett-Summerson з фіолетовим фільтром (для трансформацій pDAS5162), або до оптичної густини 1,2 при 550 нм (для трансформацій pDAS5848). Незрілі ембріони виділяли безпосередньо в мікроцентрифугальній пробірці, що містила 2 мл середовища для інфікування. Середовище видаляли і замінювали 1 мл розчину Agrobacterium і розчин з Agrobacterium/зародок інкубували протягом 5-10 хвилин при кімнатній температурі. Потім зародки переносили в середовище для кокультивування [мінімальне середовище LS, вітаміни N6, 1,5 мг/л 2,4-D, 30,0 г/л сахарози, 6 мМ L-пролін, 0,85 мг/л AgNO3, 2,8 г/л геланової камеді (PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), pH 5,8], що містила 100 мкМ ацетосірингон (для трансформантів pDAS5162) або 100-200, що містила мкМ ацетосірингон (для трансформантів pDAS5848), і кокультивували протягом 3-4 діб при 20° в темряві. 26 UA 112286 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Після кокультивування ембріони переносили в середовище спокою, що містила солі MS і вітаміни, 6 мМ L-пролін, 100 мг/л міоінозитолу, 500 мг/л MES, 30 г/л сахарози, 1,5 мг/л 2,4-D, 0,85 мг/л AgNO3, 250 мг/л цефотаксиму, 2,8 г/л геланової камеді, pH 5,8. Приблизно через 7 діб ембріони переносили в те ж середовище, доповнене 3 мг/л біалафосу (для трансформантів pDAS5162) або доповнену 100 нМ галоксифопом (для трансформантів pDAS5848) (середовище для селекції). Трансформовані ізоляти ідентифікували приблизно через 8 тижнів і об'єднували шляхом перенесення в свіже селективне середовище з 2-тижневими інтервалами для регенерації і аналізу. Регенерація і продукування насіння. Для регенерації культури переносили в середовище для індукції "28" (солі MS і вітаміни, 30 г/л сахарози, 5 мг/л бензиламінопурину, 0,25 мг/л 2,4-D, 250 мг/л цефотаксиму, 2,5 г/л геланової камеді, pH 5,7), доповнену 3 мг/л біалафосу (для трансформантів pDAS5162) або доповнену 100 мМ галоксифопом (для трансформантів -2 -1 pDAS5848). Інкубацію проводили протягом 1 тижня в умовах низького освітлення (14 мкЕм с ), -2 -1 потім протягом 1 тижня в умовах високого освітлення (приблизно 89 мкЕм с ). Потім тканини переносили в середовище для регенерації "36" (те ж, що і середовище для індукції, за винятком відсутності регуляторів росту рослин). Коли проростки мали довжину 3-5 см, їх переносили в скляні пробірки для культивування, солі, що містили середовище SHGA [(і вітаміни Schenk and Hildebrandt (1972); PhytoTechnologies Labr.), 1,0 г/л міоінозитолу, 10 г/л сахарози і 2,0 г/л геланової камеді, pH 5,8] для забезпечення подальшого росту і розвитку пагонів і коріння. Рослини переносили в ту ж ґрунтову суміш, яка описана раніше, і вирощували до цвітіння в теплиці. Проводили контрольоване запилення для отримання насіння. Фахівцям в галузі трансформації кукурудзи буде зрозуміло, що для трансформації кукурудзи і для селекції трансформованих рослин доступні інші способи, коли використовують інші експресовані в рослинах гени селективних маркерів (наприклад, гени стійкості до гербіцидів). ПРИКЛАД 10 Біохімічний аналіз і біоаналізи на комахах рослин кукурудзи, що продукують білок DIG-109 Продукування білка DIG-109 в трансгенних рослинах кукурудзи досліджували в білках, екстрагованих з листя молодих рослин (покоління T0). Два диски з листя діаметром 6 мм вміщували в пробірку для зразка з коробки з 96 пробірками з глибокими ямками (Costar каталожний номер 3957) і заморожували при -80° до дня аналізу. У цей час в кожну TM (заморожену) пробірку додавали два 4,5-мм покритих цинком BB Daisy , разом з 200 мкл буфера для екстракції, що складався з PBS (фосфатно-сольовий буфер; Fisher, каталожний номер BP665-1) і 0,05 % Tween 20. Кожну пробірку закривали і коробку вміщували в кульовий TM млин (Kleco 4-96 Pulverizer; Garcia Manufacturing, Visalia, CA) при максимальних параметрах на три хвилини. Подрібнені зразки центрифугували протягом 5 хвилин при 2500×g і супернатант, що містив розчинні білки, використовували в імуноаналізах. Імуноблот-аналізи екстрагованих з листя кукурудзи білків показали, що поліклональне антитіло DIG152RPC1 не реагує перехресно з білками, екстрагованими з листя нетрансгенних рослин. В екстрактах рослин, трансформованих pDAS5162, за допомогою антитіла DIG152PRC1 було виявлено декілька типів білків. Як правило, виявлялося щонайменше чотири основні імунореактивні смуги. У багатьох випадках спостерігали тип білка, що часто зустрічається, який мігрував з рухливістю, що відповідає білку розміром приблизно 70 кДа. Інші основні типи білків мали молекулярні розміри, оцінені як 65 кДа, які були такими ж, як і розміри пептиду, отриманого розщепленням DIG-152 трипсином, з Dpf108 в прикладі 2), 60 кДа і 55 кДа. Коли екстракти листя трансгенної кукурудзи з pDAS5162 досліджували за допомогою імуноблоттингу з використанням поліклонального антитіла проти DIG-152, в деяких рослинах типи розміром 60 кДа і 55 кДа були найбільш поширеними. У разі будь-якого антитіла було виявлено, що тільки мало рослин мають повнорозмірний білок DIG-109 (130 кДа), і, коли він був виявлений, він був представлений як неосновний тип. Очевидно, що, хоч трансген, введений в кукурудзу шляхом трансформації pDAS5162, кодує повнорозмірний білок DIG-109, протеолітична активність в клітинах кукурудзи здійснює процесинг білка, що з'являється, у велику кількість стабільних типів з меншою молекулярною масою. Токсичність листя для комах, зібраних з незалежно вибраних трансгенних рослин кукурудзи, трансформованих конструкцією pDAS5162, тестували in vitro з використанням новонароджених личинок совки трав'яної (FAW, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)) і стійких до Cry1F личинок FAW (rFAW). Яйця FAW отримували з комерційного інсектарію (Benzon), і яйця rFAW були отримані з власної популяції (Dow AgroSciences). Зразки сегментів листя відбирали для біоаналізів на комахах з вирощених в теплиці рослин T0 приблизно через 2 тижні після перенесення рослин з лабораторії в теплицю. Два фрагменти листя від кожної рослини (кожний 27 UA 112286 C2 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 приблизно 1 квадратний дюйм (6,5 см )) вміщували в окремі ямки лотка з 32 ямками (CD International) зверху приблизно 3 мл застиглого 2 % агару. Яйця виводили на раціоні Lepidopteran для множини видів (Southland Products) і відбирали новонароджених личинок у віці менше 24 годин. Приблизно 10 личинок на сегмент листа обережно вміщували в кожну ямку з використанням кисті з верблюжої вовни. Заражені лотки закривали перфорованими кришками, що надаються з лотками, потім тримали при 28°, 40 % RH, 16 год. світло:8 год. темрява на протязі трьох діб. Після завершення тесту реєстрували процентне пошкодження (% DAM) кожного фрагмента листа. Показники пошкодження усереднювали і використали для визначення того, які рослини мали найменше пошкодження від кожного типу протестованих комах. Тести повторювали декілька разів для всіх комах. Дані аналізували з використанням статистичного програмного забезпечення JMP (SAS, Cary, NC), що усереднює показники % DAM для кожної рослини, для кожного типу комах. Для односторонніх аналізів ANOVA використовували модель "приведення у відповідність Y по X". При необхідності використовували розбиття середніх значень Тьюкі-Крамера для аналізу значущих відмінностей серед середніх показників %DAM для кожної обробки. Порівняння проводили з показниками %DAM, отриманими від контрольних рослин схожого віку. Рослини TM позитивного контролю вирощували з насіння комерційного гібриду Herculex I , який продукує токсин Cry1Fa B.t. Негативні контролі (тобто нетрансформовані рослини) були представлені TM TM лініями HiII і B104, і ізолінією Herculex I (Cry батько гібрида Herculex I , що не містить). На фіг. 1 узагальнено представлені результати, отримані в таких тестах з біоаналізами на комахах. Несподіваним відкриттям є те, що існує позитивна кореляція між продукуванням DIG2 109 в трансгенному листі і показником %DAM. Для FAW, F=35,3; d.f.=1,33; Р