Рослина помідора зі зменшеною активністю малатдегідрогенази та спосіб її отримання

Реферат: Винахід стосується рослини помідора, яка містить одну або більше клітин рослини, у яких послідовність ендогенного гена мітохондріальної малатдегідрогенази (mMDH) модифікована нуклеазою, яка зв'язується з послідовністю-мішенню так, що активність експресованого білка mMDH знижується. Винахід також стосується способу отримання рослини помідора зі зменшеною активністю малатдегідрогенази. UA 115875 C2 (12) UA 115875 C2 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Опис Перехресне посилання на споріднені заявки За даною заявкою запитується пріоритет тимчасової заявки на патент США № 61/641776, яка подана 2 травня 2012 р., і тимчасової заявки на патент США № 61/780512, яка подана 13 березня 2013 р., описи яких включені у такий спосіб за допомогою посилання в їх повному обсязі. Заява прав на винаходи, зроблені в процесі дослідження, фінансованого із федерального бюджету Не застосовно. Галузь техніки Даний опис стосується галузі геномної інженерії, зокрема, зміненої експресії і/або спрямованої модифікації ендогенного гена малатдегідрогенази (MDH) рослин. Передумови створення винаходу Біотехнологія виникла, як важливий засіб, у спробах вирішити проблему світової потреби у виробництві харчових продуктів, яка збільшується. Традиційні підходи до збільшення продуктивності сільського господарства, наприклад, збільшенню врожаю або генно-інженерної стійкості до шкідників, засновані або на мутаційній селекції, або на введенні нових генів у геноми видів культур за допомогою трансформації. Обидва процеси по своїй суті є неспецифічними і відносно неефективними. Наприклад, за допомогою традиційних способів трансформації рослин доставляється екзогенна ДНК, яка інтегрується в геном у довільних положеннях. Таким чином, для ідентифікації і ізоляції трансгенних ліній із бажаними властивостями необхідне створення тисяч унікальних подій довільної інтеграції і наступний скринінг на предмет бажаної події. У результаті, традиційна інженерія особливості рослини є важким, трудомістким і непередбаченим засобом. Крім того, неспецифічна природа цих інтеграцій ускладнює передбачення того, чи виникли плейотропні ефекти внаслідок ненавмисного руйнування геному. У результаті, створення, ізоляція або визначення характеристик ліній рослин із конструйованими трансгенами або генно-інженерними властивостями було дуже важким і витратним процесом із низькою ймовірністю успіху. Спрямована модифікація генів дозволяє перебороти логістичні проблеми традиційних технологічних прийомів у випадку рослинних систем і як така була багаторічною, але важкодосяжною метою і в основному біологічному дослідженні рослин, і сільськогосподарської біотехнології. Однак, за винятком "спрямованого впливу на ген" через позитивно-негативну селекцію із використанням лікарських засобів у випадку рису або використання заздалегідь сконструйованих рестрикційних сайтів, спрямована модифікація геному у всіх видах рослин, і модельних рослинах, і культурних рослинах, виявлялася донедавна дуже важкою. Terada et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10): 1030; Terada et al. (2007) Plant Physiol 144(2): 846; D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnology J. 6(1): 93. Нещодавно були описані способи і композиції для спрямованого розщеплення геномної ДНК. Такі події спрямованого розщеплення можуть використовуватися, наприклад, для індукції спрямованого мутагенезу, для індукції спрямованих мутацій (наприклад, делецій, замін і/або вставок) клітинних послідовностей ДНК і сприяння спрямованій рекомбінації і інтеграції в заданий локус хромосоми. Див., наприклад, Urnov et al. (2010) Nature 435(7042): 646-51; публікації заявок на патенти США № 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20090263900; 20090117617; 20100047805; 20110207221; 20110301073; 2011089775 і публікацію міжнародної заявки WO 2007/014275, описи яких включені за допомогою посилання в їх повному обсязі для всіх цілей. Розщеплення може відбуватися завдяки використанню специфічних нуклеаз, таких як сконструйовані нуклеази із доменами "цинкові пальці" (ZFN), активатора транскрипції начебто ефекторних нуклеаз (TALEN), хомінгендонуклеаз, або використовуючи систему CRISPR/Cas разом зі сконструйованою CRISPR РНК (РНК у вигляді коротких паліндромних повторів, регулярно розташованих групами)/трансактивуючої CRISPR РНК ("єдиної спрямованої РНК") для проведення специфічного розщеплення. У публікації заявки на патент США № 20080182332 описується використання нуклеаз із доменами "неканонічні цинкові пальці" (ZFN) для спрямованої модифікації геномів рослин; у публікації заявки на патент США № 20090205083 описується ZFNопосередкована спрямована модифікація локусу EPSPS у рослин; у публікації заявки на патент США № 20100199389 описується спрямована модифікація локусу Zp15 у рослин, а в публікації заявки на патент США № 20110167521 описується спрямована модифікація генів, які беруть участь у біосинтезі жирних кислот. Крім того, у Moehle et al. (2007) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 104(9): 3055-3060 описується використання сконструйованих ZFN для спрямованого додавання гена у конкретний локус. 1 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Асиміляція вуглецю є основною у метаболічному функціонуванні всіх живих організмів. Здатність синтезувати АТФ і використовувати його енергію для гомеостазу, росту і розмноження зберігається у всіх царствах і впливає на більшість відомих біологічних процесів. Основним компонентом синтезу АТФ у еукаріот є цикл трикарбонових кислот (ТКК), також відомий як цикл лимонної кислоти або цикл Кребса, у ході якого електрони із органічних кислот переходять до окислених редокс-кофакторів НАД+ і ФАД, утворюючи НАДН, ФАДН2 і вуглекислий газ. Цикл ТКК протікає в мітохондріях; у рослинах проміжні продукти, утворені в ході його реакцій, служать як субстрати для численних шляхів біосинтезу; основні постачання для утворення аспартату, глютамату, нуклеїнових кислот, порфіринів і жирних кислот йдуть із циклу ТКК. Крім того, проміжні продукти циклу ТКК відіграють ключову роль в енергетичних процесах фотодихання і фотосинтезу. Тому вважають, що цикл ТКК діє як з'єднувальна ланка між окислювальновідновними функціями хлоропластів, мітохондрій і цитозоля. Малат є одним із проміжних продуктів циклу ТКК і функціонує як субстрат і для декарбоксилуючої малатдегідрогенази, яка породжує піруват, і для малатдегідрогенази (MDH). MDH каталізує зворотне відновлення оксалоацетату (OAA) до малату через НАДН і включена в малат-аспартатну човникову систему. Більшість рослин містять множину ізоформ MDH, зокрема мітохондріальні і цитозольні ферменти, які кодуються ядерними генами. Мітохондріальна MDH (mMDH) рослин бере участь у 3 типах реакцій: перетворенні малату в OAA, відновленні OAA до малату і відновленні OAA у С4-шляху фотосинтезу. У кукурудзи (C4 злакової трави) існує 5 різних локусів MDH у 5 незалежних хромосомах, 2 із яких кодують цитозольні ізоформи, у той час як інші 3 кодують мітохондріальні ферменти. Використовуючи класичні аналізи мутацій, було показано, що повна втрата функції 2 цитозольних форм MDH не впливала негативно на ріст і розмноження рослин - функція в цитозолі, очевидно, була несуттєвою. Навпаки, повна втрата 3 мітохондріальних ферментів приводила до летальності - рослинам потрібний був принаймні один функціональний алель, щоб бути життєздатними (Goodman et al. (1981) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 1783-1785). Так само дані спостережень мимовільних мовчазних алелів мітохондріальної MDH-1 (Mdh1-n) у сої, які зустрічаються в природі, показали, що не було помітної зміни фенотипу рослини доти, доки ген мітохондріальної Mdh2 залишався стабільним (Imsande et al. (2001) J. Heredity 92:333-338). Незважаючи на основну роль малату в метаболізмі рослин, його функції в циклі ТКК усе ще не повністю зрозумілі. Мутантні по MDH рослини демонструють повільніші швидкості росту і змінені характеристики фотодихання. Див., наприклад, Tomaz et al. (2010) Plant Physiol. 154(3): 1143-1157. Дослідження антисмислових олігонуклеотидів і РНК-інтерференції в цілих рослинах або плоді дали суперечливі результати, які включають рослини із збільшеною масою сухого (не сирого) плоду, а також рослини із вищими рівнями аскорбату у їх листках, ніж у контролях дикого типу, але при вирощуванні у світлових умовах короткого дня (які сприяють фотодиханню) рослини продемонстрували фенотип карликовості і мали зменшену біомасу листків, стебел і коренів. Nunes-Nesi et al. (2005) Plant Physiol. 137: 611-622; Nunes-Nesi et al. (2007) Physiol. Plant. 129: 45-56; Nunes-Nesi (2008) J. Exp. Bot. 59: 1675-1684; Finkmeier and Sweetlove (2009) F1000 Biology Reports I:47; doi: 10.3410/B1-47. Крім того, піддані впливу антисмислових олігонуклеотидів для гена mMDH лінії із зменшеною експресією mMDH продемонстрували зменшену активність (39 % від такої дикого типу) цього ферменту, яка привела до зменшення кореневої зони і зупинки росту коренів. Van der Merwe et al. (2009) Plant Physiol. 149: 653-669; Van Der Merwe et al. (2010) Plant Physiol. 153: 611-621. Крім того, піддані впливу антисмислових олігонуклеотидів для гена mMDH лінії продемонстрували збільшення висихання плоду (велику втрату H2О) і збільшену схильність зараження грибами. Centeno et al. (2011) Plant Cell 23: 162184. У публікації заявки на патент США № 20090123626 описується використання РНКінтерференції для MDH для зменшення рівня аспарагіну, що у свою чергу приводить до зниження рівня акриламіду, який накопичується в результаті пов'язаного із обробкою нагрівання рослин і рослинних продуктів. Таким чином, залишаються потреби в композиціях і способах для зміни експресії генів MDH, наприклад, за допомогою спрямованої геномної модифікації генів MDH, у рослинах для створення стабільних, наслідуваних генетичних модифікацій у рослині і її потомстві. Короткий виклад суті винаходу У даному описі представлені способи і композиції для спрямованої модифікації гена(ів) MDH, а також клітини (наприклад, насіння), лінії клітин, організми (наприклад, рослини) і т. д., які включають одну або більше спрямованих мутацій у MDH. Геном MDH може бути, наприклад, ген мітохондріальної MDH (mMDH). Як відзначено вище, дослідження, які демонструють зменшення ферментативної функції MDH за допомогою технології антисмислових олігонуклеотидів і РНК-інтерференції, дають суперечливі результати, які стосуються ефекту(ів) 2 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інгібування MDH, наприклад, на врожай плодів. Ґрунтуючись на цих дослідженнях можна було очікувати, що інгібування протікання реакцій циклу ТКК буде здійснювати негативний ефект на фотосинтез. Таким чином, є раптовим і неочікуваним, що автори даного винаходу показали, що рослини (і клітини рослин), які включають спрямовані мутації в MDH, які зменшують функцію (активність) MDH, приводять до збільшеної врожайності від рослин, які включають MDHмодифіковані клітини. Збільшений врожай може включати, наприклад, збільшену величину врожаю плодів, збільшену біомасу рослини (або плоду рослини), більший вміст м'якоті плоду, рослини більшого розміру, збільшену суху масу, збільшений твердий вміст, вищу загальну масу при зборі врожаю, збільшену інтенсивність і/або однорідність кольору культури, змінені хімічні характеристики (наприклад, які мають відношення до олій, жирних кислот, вуглеводів, білків) і т. д. Таким чином, в одному аспекті, тут описуються рослини, які включають клітини рослин, у яких експресія ендогенного гена MDH модифікована так, що експресія MDH є зменшеною, і які демонструють збільшену врожайність. У деяких варіантах здійснення експресію ендогенного гена MDH змінюють, використовуючи складений білок, який включає ДНК-зв'язувальний білок (наприклад, білок із цинковими пальцями, ефекторний домен TAL) і функціональний домен. У деяких варіантах здійснення клітини рослин містять спрямовану модифікацію гена MDH (наприклад, mMDH), причому спрямовану модифікацію, яка зменшує експресію MDH, індукує нуклеазу, наприклад, складений білок, який включає ДНК-зв'язувальний домен і функціональний домен (наприклад, нуклеаза із доменами "цинкові пальці"), що розщеплює ендогенний ген і зменшує його експресію. Модифікація (наприклад, делеція, заміна і/або вставка) може бути, наприклад, модифікацією однієї або більше амінокислот у НАДН-зв'язувальній ділянці гена MDH (наприклад, першій і/або другій НАДН-зв'язувальній ділянці гена). У деяких варіантах здійснення модифікація включає зміну однієї або більше амінокислот у першій і/або другій НАДНзв'язувальній ділянці ендогенного гена MDH у клітині рослини, наприклад, одній або більше амінокислот у положеннях 104-136 і/або 171-220, пронумерованих стосовно амінокислотної послідовності MDH дикого типу (наприклад, SEQ ID NO: 1 (послідовності MDH помідора дикого типу), SEQ ID NO: 126 (послідовності MDH кукурудзи дикого типу) і/або SEQ ID NO: 125 (послідовності MDH сої дикого типу)) і суміщених із нею (наприклад, Фіг. 10). Білок із цинковими пальцями може включати розпізнавальні спіральні ділянки, які продемонстровані в одному ряді таблиці 1A, і/або зв'язуватися із послідовністю-мішеню, яка продемонстрована в таблиці 1B. В інших варіантах здійснення нуклеаза включає ефекторний домен TAL, хомінг-нуклеазу і/або Crispr/Cas єдину спрямовуючу РНК. Спрямована зміна експресії MDH (наприклад, спрямована геномна модифікація) може збільшити або зменшити активність MDH, наприклад, зменшення активності MDH може бути в результаті створення мутації, яка приводить до аберантної транскрипції продукту гена (наприклад, через зсув рамки зчитування, новий стоп-кодон або іншу мутацію). У деяких варіантах здійснення спрямована модифікація, використовуючи нуклеазу, включає невелику вставку і/або делецію, також відому як вставка або делеція, наприклад, вставка або делеція, продемонстрована в таблиці 4. Модифікація в клітині може бути модифікацією одного або більше алелів (наприклад, у гомозиготах, гетерозиготах, у паралогічних генах). Будь-яка із клітин рослин, які описуються тут, може знаходитися в рослині або частині рослини (наприклад, насінні, квітці, плоді), наприклад, будь-якого сорту: помідора (наприклад, M82 або Moneymaker), сої, кукурудзи, картоплі, люцерни або т. п. В іншому аспекті тут описується ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, білок із цинковими пальцями (ZFP)), який специфічно зв'язується із геном MDH. Білок із цинковими пальцями може включати один або більше цинкових пальців (наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або більше цинкових пальців), і може бути сконструйований білок із цинковими пальцями, який зв'язується із будь-якою послідовністю в будь-якому гені MDH. Будь-який із білків із цинковими пальцями, який тут описується, може зв'язуватися із сайтом-мішеню в кодуючій послідовності MDH або в прилеглих послідовностях (наприклад, промоторі або інших контролюючих експресію елементах) за умови, що досягається модифікація експресії MDH. У деяких варіантах здійснення білок із цинковими пальцями зв'язується із сайтом-мішеню в гені mMDH, наприклад, який є мішеню послідовності, яка продемонстрована в таблиці 1B. В інших варіантах здійснення розпізнавальні спіральні ділянки компонентних цинкових пальців розташовані в порядку від пальця 1 до пальця 5 (від F1 до F5) або від пальця 1 до пальця 6 (від F1 до F6), як продемонстровано в одному ряді таблиці 1A. Один або більше компонентних зв'язувальних доменів "цинкові пальці" білка із цинковими пальцями може бути канонічним (C 2H2) цинковим пальцем або неканонічним (наприклад, C3H) цинковим пальцем (наприклад, N-кінцевий і/або Cкінцевий цинковий палець може бути неканонічним пальцем). 3 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому аспекті тут описуються складені білки, при цьому кожен складений білок включає ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, білок із цинковими пальцями), який специфічно зв'язується із одним або більше генів MDH. У деяких варіантах здійснення білками є складені білки, які включають білок із MDH-зв'язувальними цинковими пальцями і функціональний домен, наприклад, активуючий транскрипцію домен, пригнічуючий транскрипцію домен і/або розщеплюючий домен (або півдомену для розщеплення). У деяких варіантах здійснення складеним білком є нуклеаза із доменами "цинкові пальці" (ZFN). Розщеплюючі домени і половини доменів для розщеплення можна отримати, наприклад, із різних ендонуклеаз рестрикції і/або хомінг-ендонуклеаз. В одному варіанті здійснення половини доменів для розщеплення походять із ендонуклеази рестрикції типу IIS (наприклад, FokI). В інших аспектах тут забезпечуються полінуклеотиди, які кодують будь-який із ДНКзв'язувальних доменів (наприклад, білки із цинковими пальцями) і/або складених білків, які описуються тут. У деяких варіантах здійснення тут описується вектор для експресії ZFP, який включає полінуклеотид, який кодує один або більше ZFP, які тут описуються, функціонально зв'язаний із промотором. В одному варіанті здійснення одним або більше ZFP є ZFN. ZFP і складені білки, які включають ці ZFP, можуть зв'язувати і/або розщеплювати один або більше генів MDH (наприклад, ген mMDH) в кодуючій області гена або в некодуючій послідовності у гені або поряд із ним, такій як, наприклад, лідерна послідовність, трейлерна послідовність або інтрон, або промоторна послідовність, або в нетранскрибованій області, або 5', або 3' від кодуючої області. У деяких варіантах здійснення ZFP або ZFN зв'язуються із кодуючою послідовністю або регуляторною послідовністю гена MDH і/або розщеплюють її. В іншому аспекті тут описуються композиції, які включають один або більше білків, складених білків і/або полінуклеотидів, які тут описуються. Клітини рослин можуть містити один унікальний ген MDH-мішень або множину паралогічних генів MDH-мішеней. Таким чином, композиції, які тут описуються, можуть включати один або більше ZFP-вмісних білків (і полінуклеотидів, які їх кодують), мішеню яких є один або більше генів MDH у клітині рослини. Мішенями ZFP можуть бути будь-які паралогічні або гомологічні гени і вибрані конкретні паралогічні або гомологічні гени в клітині рослини або комбінація деяких паралогічних і деяких гомологічних генів. В іншому аспекті тут забезпечується спосіб зміни експресії одного або більше генів MDH (наприклад, ендогенного гена mMDH) у клітині рослини, при цьому спосіб включає експресію одного або більше білків, які містять ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, білків із цинковими пальцями) у клітині за умови, щоб експресія MDH змінювалася. У деяких варіантах здійснення способи включають використання пари нуклеаз із доменами "цинкові пальці" (білків і/або полінуклеотидів, кодуючих ці білки) для створення невеликої вставки і/або делеції ("вставки або делеції"), яка порушує експресію MDH. В інших варіантах здійснення способи включають використання пари нуклеаз із доменами "цинкові пальці" для збільшення експресії MDH, наприклад, за допомогою спрямованої вставки трансгена або елемента, який збільшує експресію. В інших варіантах здійснення способи зміни експресії MDH включають використання одного або більше факторів транскрипції із доменами "цинкові пальці" (складених білків, які включають білки із MDH-зв'язувальними цинковими пальцями і функціональний домен, який є регулюючим транскрипцію доменом, таким як домен активації або репресії). У деяких варіантах здійснення змінена експресія/функція MDH приводить до збільшення фотосинтезу в клітинах рослин. У деяких варіантах здійснення змінена експресія/функція MDH приводить до модифікацій у циклі лимонної кислоти в клітинах рослин. У деяких варіантах здійснення змінена експресія/функція MDH приводить до вищих рівнів малату у клітині рослини. В інших варіантах здійснення змінена експресія/функція MDH приводить до зниження рівнів OAA у клітині. В одному варіанті здійснення змінена експресія/функція MDH у клітинах рослин має як наслідок рослини із підвищеною врожайністю. У деяких варіантах здійснення збільшення врожайності приводить до більшої сирої маси отриманого плоду і загальної сирої маси всіх плодів, зібраних із першого гроно мутантних рослин. В іншому аспекті тут забезпечуються нуклеїнові кислоти і антитіла, і способи їх застосування для виявлення і/або вимірювання зміненої експресії генів MDH і їх модифікацій. В іншому аспекті тут описується спосіб модифікації одного або більше генів MDH у клітині. У деяких варіантах здійснення спосіб включає: (a) введення в клітину рослини однієї або більше нуклеаз у формі білка і/або одного або більше експресійних векторів, кодуючих одну або більше нуклеаз (наприклад, ZFN), які зв'язуються із сайтом-мішеню в одному або більше генів MDH, в умовах, щоб нуклеази (наприклад, ZFN) експресувалися і один або більше генів MDH розщеплювалися, у силу чого здійснюється модифікація одного або більше генів MDH. У деяких варіантах здійснення принаймні один сайт-мішень знаходиться в гені mMDH. В інших варіантах 4 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення розщеплюється більше ніж один ген MDH. Більше того, у будь-якому із описуваних тут способах розщеплення одного або більше генів може привести до делеції, додавання і/або заміни нуклеотидів у розщепленій ділянці, наприклад, так, що активність MDH змінюється (наприклад, збільшується або зменшується). Проте, в іншому аспекті тут описується спосіб введення екзогенної послідовності (трансгена) у геном клітини рослини за умови, щоб активність MDH у клітині рослини змінювалася, при цьому спосіб включає стадії: (a) приведення клітини в контакт із екзогенною послідовністю (вектором-донором); і (b) експресії однієї або більше нуклеаз (наприклад, нуклеаз із доменами "цинкові пальці"), які описуються тут, у клітині, причому одна або більше нуклеаз розщеплює хромосомну ДНК; так, що розщеплення хромосомної ДНК на стадії (b) стимулює включення вектора-донора в геном у результаті гомологічної рекомбінації. У деяких варіантах здійснення екзогенна послідовність вбудовується в ген MDH. В інших варіантах здійснення екзогенна послідовність вбудовується близько від гена MDH. Активність MDH може збільшуватися або зменшуватися. У будь-якому із описуваних тут способів одна або більше нуклеаз можуть являти собою об'єднання розщеплюючого домен ендонуклеази рестрикції типу IIs із сконструйованим зв'язувальним доменом "цинкові пальці". В інших варіантах здійснення нуклеаза включає хомінг-нуклеазу, наприклад, хомінг-нуклеазу із модифікованим ДНК-зв'язувальним доменом. У будь-якому із описуваних тут способів екзогенна послідовність може кодувати білковий продукт. Проте, у подальшому аспекті також забезпечується клітина рослини, отримана відповідно до будь-якого із способів, які тут описуються. В іншому аспекті тут забезпечується рослина, яка включає клітину рослини, яка тут описується. В іншому аспекті тут забезпечується насіння рослини, яке включає клітину рослини, яка отримана як описується тут. В іншому аспекті тут забезпечується плід, отриманий від рослини, яка включає клітину рослини, отриману як описується тут. У будь-якій із композицій (клітин або рослин) або способів, які тут описуються, клітина рослини може включати клітину однодольної або дводольної рослини. У деяких варіантах здійснення клітиною рослини є така культурна рослина, наприклад, помідор (або інша плодова культура), картопля, кукурудза, соя, люцерна і т. д. Короткий опис креслень Фіг. 1 являє собою схему, на якій зображені різні структурні елементи гена мітохондріальної MDH (mMDH) із Solanum lyocpersicum (v. M82). На Фіг. 2, панелі A і B, зображені геномна організація і послідовність гена мітохондріальної малатдегідрогенази (mMDH) помідора. На Фіг. 2A продемонстровані сайти-мішені для ZFN (короткі вказуючі ліворуч і праворуч стрілки над екзонами) у екзонах 1, 3, 4 і 6. Позначений на Фіг. 2А номер зв'язувальної послідовності ZFN відповідає номеру ZFN, який описується в таблиці 1; 107830L у таблиці 1 описаний на Фіг. 2A як 830L, 107830R у таблиці 1 описаний на Фіг. 2A як 830R, 107832L у таблиці 1 описаний на Фіг. 2A як 832L, 107832R у таблиці 1 описаний на Фіг. 2A як 832R, 107833L у таблиці 1 описаний на Фіг. 2A як 833L, 107833R у таблиці 1 описаний на Фіг. 2A як 833R, 107835L у таблиці 1 описаний на Фіг. 2A як 835L, 107835R у таблиці 1 описаний на Фіг. 2A як 835R. На Фіг. 2B (SEQ ID NO: 2) представлена послідовність локусу mMDH; екзони підкреслені, і сайти-мішені ZFN позначені жирним шрифтом. Фіг. 3 являє собою схему, на якій представлена карта плазміди pKG7479. Фіг. 4 являє собою схему, на якій представлена карта плазміди pKG7480. Фіг. 5 являє собою схему, на якій представлена карта плазміди pKG7481. Фіг. 6 являє собою схему, на якій представлена карта плазміди pKG7482. На Фіг. 7 зображений аналіз послідовностей невеликих вставок або делецій ("вставок або делецій"), індукованих у гені mMDH помідора в результаті активності ZFN у протопластах. ZFN були транзиторно експресовані в протопластах клітин помідора, і вставки або делеції детектували, використовуючи аналіз HRM. Сайти-мішені в mMDH для кожної ZFN представлені разом із підкресленими сайтами зв'язування. Ампліфіковані продукти, які містять делеції (представлені як -) або вставки (жирний шрифт), представлені під кожною послідовністюмішеню. Фіг. 8, панелі A і B, являє собою графіки, на яких представлена активність mMDH у рослинах F2. Фіг. 8A являє собою графік, на якому представлене визначення активності mMDH у рослинах F2, які походять від лінії 107832_9-6 (із делецією -3 п. о.). "126 9-6 WT" позначає результати біохімічного аналізу рослини F2, у якому відсутня мутація у вигляді вставки або делеції, "115 9-6 M" позначає рослини F2, гомозиготні по мутації у вигляді вставки або делеції, і "132 9-6 H" позначає рослину F2, гетерозиготну по мутації у вигляді вставки або делеції. Фіг. 8В 5 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 являє собою графік, на якому представлене визначення активності mMDH у рослинах F2, які походять від лінії 107832_10-2 (із делецією -2 п. о.). WT48 позначає рослини F2, у яких відсутня мутація у вигляді вставки або делеції, "M60" позначає рослини F2, гомозиготні по мутації у вигляді вставки або делеції, і "H32" позначає рослину F2, гетерозиготну по мутації у вигляді вставки або делеції. Фіг. 9 являє собою діаграму, на якій представлений врожай плодів помідора лінії 107832 9-6. Середня маса помідора (г) представлена по осі Y для 3 класів рослин F2, які виділяються по мутації у вигляді делеції -3 п. о. у локусі mMDH. "WT" означає рослини F2, у яких відсутня делеція, "Het" означає рослини F2, гетерозиготні по делеції, і "Homo" означає рослини F2, гомозиготні по делеції. Фіг. 10 являє собою суміщення послідовностей ферментів mMDH сої (SEQ ID NO: 125), кукурудзи (SEQ ID NO: 126) і помідора (SEQ ID NO: 1). Фіг. 11 являє собою суміщення послідовностей мутацій mMDH, які виникають у геномі помідора. Фіг. 12 являє собою схему, на якій представлена біохімічна реакція, каталізована ферментом mMDH. Фіг. 13 являє собою таблицю, у якій представлені специфічні активності mMDH помідора дикого типу і двох мутантних ферментів mMDH помідора, які визначали, спектрофотометрично, стежачи за окислюванням НАДН. Мутація "mMDH del3" зберігає приблизно 23 % активності ферменту дикого типу, а активність ферменту із мутацією "mMDH del3 NADH BS1" є значно зменшеною на рівні приблизно 1,5 % від активності ферменту дикого типу. Докладний опис даного винаходу Даний опис стосується способів і композицій для зміненої експресії одного або більше генів малатдегідрогенази (MDH) у клітині рослини або рослині, наприклад, спрямованої геномної модифікації гена MDH, такого як ген мітохондріальної малатдегідрогенази (mMDH), у клітині рослини (наприклад, кукурудзи, помідора, сої і т. д.). Зокрема, експресію MDH змінюють за допомогою використання складених білків, які включають ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, білок із цинковими пальцями) і функціональний домен (наприклад, регулюючий транскрипцію домен і/або нуклеазу). У деяких варіантах здійснення спрямована модифікація досягається при розщепленні гена MDH, використовуючи одну або більше нуклеаз (наприклад, ZFN) для створення модифікацій (наприклад, мутацій) у локусі MDH. Розщеплення є спрямованим завдяки використанню складених білків, які включають ДНК-зв'язувальний домен, такий як ДНКзв'язувальних домен мегануклеази, ДНК-зв'язувальний домен "лейцинова блискавка", ДНКзв'язувальний домен TAL, білок із цинковими пальцями (ZFP), Crispr/Cas систему або химерні комбінації вищезгаданих доменів. У деяких варіантах здійснення модифікація включає мутацію (заміни, делеції і/або вставки) гена MDH за умови, щоб була змінена одна або більше амінокислот у першій і/або другій НАДН-зв'язувальній ділянці ендогенного гена MDH, наприклад, одна або більше амінокислот у положеннях 104-136 і/або 171-220, пронумерованих відносно SEQ ID NO: 1 (послідовності MDH помідора дикого типу), SEQ ID NO: 125 (послідовності MDH кукурудзи дикого типу) і/або SEQ ID NO: 126 (послідовності MDH сої дикого типу) і суміщених із нею. У деяких варіантах здійснення нуклеази(а) включають одну або більше ZFN. ZFN типово включають розщеплюючий домен (або півдомену для розщеплення) і зв'язувальний домен "цинкові пальці", який зв'язується із сайтом-мішеню в ендогенному гені MDH. ZFN можуть бути введені у вигляді білків, у вигляді полінуклеотидів, кодуючих ці білки, і/або у вигляді комбінацій поліпептидів і кодуючих поліпептиди полінуклеотидів. Нуклеази із доменами "цинкові пальці" типово функціонують у вигляді димерних білків після димеризації половин доменів для розщеплення і можуть утворювати гомодимери і/або гетеродимери. Були описані облігатні гетеродимерні ZFN, у випадку яких мономери ZFN, які зв'язуються із "лівим" і "правим" доменами розпізнавання, можуть поєднуватися із утворенням активної нуклеази. Див., наприклад, публікацію заявки на патент США № 2008/0131962. Таким чином, якщо є відповідні сайти-мішені, "лівий" мономер міг би утворювати активну ZFN із будь-яким "правим" мономером. Це значно збільшує кількість придатних для нуклеаз сайтів на основі випробуваних "лівих" і "правих" доменів, які можуть використовуватися в різних комбінаціях. Наприклад, рекомбінування зв'язувальних центрів 4 гомодимерних ZFN дасть додатково 12 гетеродимерних ZFN. Що ще більш важливо, воно уможливлює системний підхід до розробки трансгенів так, щоб кожна нова введена екзогенна послідовність (трансген) ставала фланкованою унікальним сайтом для ZFN, який може використовуватися для зворотного вирізання гена або для спрямування додаткових генів поряд із ним. Крім того, цей спосіб може спростити стратегії установки в один локус, яка обумовлена ZFN-залежними дволанцюговими розривами. 6 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зв'язувальний домен "цинкові пальці" може бути канонічним (C 2H2) цинковим пальцем або неканонічним (наприклад, C3H) цинковим пальцем. Крім того, зв'язувальний домен "цинкові пальці" може включати один або більше цинкових пальців (наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або більше цинкових пальців), і можна сконструювати такий домен, який зв'язується із будь-якою послідовністю в будь-якому гені MDH. Розпізнавальні спіральні ділянки, які приводяться як приклад білків із MDH-зв'язувальними цинковими пальцями для застосування для зв'язування із геном MDH, продемонстровані в таблиці 1A, а сайти-мішені у гені MDH, які наводяться як приклад, продемонстровані в таблиці 1B. Присутність такого складеного білка (або білків, і/або полінуклеотидів, кодуючих ці складені білки) у клітині приводить до зв'язування складеного білка(ів) із своїм сайтом(ами) зв'язування і розщеплення в гені(ах) MDH. Загальні відомості Для здійснення на практиці способів, а також готування і застосування композицій, які тут описуються, використовуються, крім особливо обговорених способів, традиційні методи в молекулярній біології, біохімії, дослідженні структури хроматину, обчислювальній хімії, методи культивування клітин, рекомбінантних ДНК і в зв'язаних областях, які знаходяться в межах компетентності в даній галузі техніки. Ці методи повною мірою пояснені в літературі. Див., наприклад, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 і третє видання, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley. Sons, New York, 1987 і періодичні оновлення; випуски METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; і METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999. Визначення Терміни "нуклеїнова кислота", "полінуклеотид" і "олігонуклеотид" використовуються взаємозамінно і стосуються полімеру дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів, у лінійній або замкнутій у коло конформації, і в або одноланцюговій, або дволанцюговій формі. Стосовно цілей даного опису, ці терміни не повинні розглядатися як обмеження по довжині полімеру. Ці терміни можуть охоплювати відомі аналоги природних нуклеотидів, а також нуклеотиди із підданими модифікаціям основами, цукровими і/або фосфатними складовими (наприклад, фосфоротіоатними зв'язками). Як правило, аналог конкретного нуклеотиду має таку ж специфічність спарювання основ; тобто аналог A буде піддаватися спарюванню із основою T. Терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" використовуються взаємозамінно і стосуються полімеру амінокислотних залишків. Термін також застосовується відносно полімерів амінокислот, у яких одна або більше амінокислот є хімічними аналогами або модифікованими похідними відповідних амінокислот, які зустрічаються в природі. "Зв'язування" стосується специфічного відносно послідовності, нековалентній взаємодії між макромолекулами (наприклад, між білком і нуклеїновою кислотою). Не потрібно, щоб усі компоненти взаємодії-зв'язування були специфічними відносно послідовності (наприклад, контакти із фосфатними залишками в кістяку ДНК) за умови, що взаємодія в цілому є специфічною відносно послідовності. Такі взаємодії, як правило, характеризуються константою -6 -1 дисоціації (Kd), яка становить 10 M або менше. "Спорідненість" стосується сили зв'язування: при цьому збільшена спорідненість зв'язування корелює із меншою Kd. "Зв'язувальний білок" є білком, який здатний до зв'язування із іншою молекулою. Зв'язувальний білок може зв'язуватися, наприклад, із молекулою ДНК (ДНК-зв'язувальний білок), молекулою РНК (РНК-зв'язувальний білок) і/або молекулою білка (білок-зв'язувальний білок). У випадку білок-зв'язувального білка він може зв'язуватися із самим собою (із утворенням гомодимерів, гомотримерів і т.д.), і/або він може зв'язуватися із однією або більше молекулами відмінного білка або білків. Зв'язувальний білок може мати більше ніж один тип активності зв'язування. Наприклад, білки із цинковими пальцями мають ДНК-зв'язувальну, РНКзв'язувальну і білок-зв'язувальну активність. "ДНК-зв'язувальний білок із цинковими пальцями" (або зв'язувальний домен) є білком, або доменом у більшому білку, який зв'язується із ДНК специфічним чином відносно послідовності завдяки одному або більше цинковим пальцям, які є ділянками амінокислотної послідовності усередині зв'язувального домену, структура яких стабілізована завдяки координації іона цинку. Термін "ДНК-зв'язувальний білок із цинковими пальцями" часто скорочено називають білком із цинковими пальцями або ZFP. Можна сконструювати зв'язувальні домени "цинкові пальці", які зв'язуються із заданою нуклеотидною послідовністю. Необмежуючими прикладами способів конструювання білків із 7 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цинковими пальцями є розробка і відбір. Сконструйований білок із цинковими пальцями являє собою білок, який не зустрічається в природі, розробка/склад якого випливають в основному із критеріїв раціональності. Критерії раціональності для розробки включають застосування правил заміщень і комп'ютерних алгоритмів для обробки інформації в базі даних, яка зберігає інформацію про існуючі розробки ZFP і дані про зв'язування. Див., наприклад, патенти США №№ 6140081, 6453242 і 6534261; див. також WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 і WO 03/016496. "Відібраний" білок із цинковими пальцями являє собою білок, який не зустрічається в природі, отримання якого є в основному результатом емпіричного процесу, такого як фаговий дисплей, пастка взаємодії (двогібридна система) або відбір гібридів. Див., наприклад, патент США № 5789538, патент США № 5925523, патент США № 6007988, патент США № 6013453, патент США № 6200759, WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197 і WO 02/099084. Термін "послідовність" стосується нуклеотидної послідовності будь-якої довжини, яка може являти собою ДНК або РНК; може бути лінійною, замкнутою в коло або розгалуженою і може бути або одноланцюговою, або дволанцюговою. Термін "послідовність-донор" стосується нуклеотидної послідовності, яка вбудовується в геном. Послідовність-донор може бути будь-якої довжини, наприклад, довжиною між 2 і 10000 нуклеотидів (або будь-яким цілим числом між ними або більше значень цього діапазону), переважно довжиною між 100 і 1000 нуклеотидів (або будь-яким цілим числом між ними), більш переважно довжиною між приблизно 200 і 500 нуклеотидів. "Гомологічна, неідентична послідовність" стосується першої послідовності, яка має деякий ступінь ідентичності послідовності із другою послідовністю, але чия послідовність не ідентична такій другій послідовності. Наприклад, полінуклеотид, який включає послідовність дикого типу мутантного гена, гомологічний і неідентичний послідовності мутантного гена. У деяких варіантах здійснення ступінь гомології між двома послідовностями є достатнім для допуску гомологічної рекомбінації між ними, використовуючи нормальні клітинні механізми. Дві гомологічні, неідентичні послідовності можуть бути будь-якої довжини, і ступінь їх негомології може бути настільки малий, як один нуклеотид (наприклад, для виправлення геномної точкової мутації за допомогою спрямованої гомологічної рекомбінації), або настільки велика, як 10 або більше тисяч основ (наприклад, для вбудовування гена в заданий ектопічний сайт у хромосомі). Не потрібно, щоб два полінуклеотиди, які включають гомологічні, неідентичні послідовності, були однакової довжини. Наприклад, може використовуватися екзогенний полінуклеотид (тобто полінуклеотид-донор) довжиною між 20 і 10000 нуклеотидів або пар нуклеотидів. Методи визначення ідентичності нуклеотидних і амінокислотних послідовностей відомі в даній галузі техніки. Типово такі методи включають визначення нуклеотидної послідовності мРНК для гена і/або визначення амінокислотної послідовності, кодованої ним, і порівняння цих послідовностей із другою нуклеотидною або амінокислотною послідовністю. Таким чином можуть бути також визначені і порівняні геномні послідовності. Загалом, ідентичність стосується точної відповідності нуклеотида нуклеотиду або амінокислоти амінокислоті у двох послідовностях полінуклеотидів або поліпептидів, відповідно. Дві або більше послідовності (полінуклеотидних або амінокислотних) можна порівняти за допомогою визначення відсотка їх ідентичності. Відсоток ідентичності двох послідовностей, або нуклеотидних, або амінокислотних послідовностей, є кількістю точних відповідностей між двома суміщеними послідовностями, розділеним на довжину коротшої послідовності і помноженим на 100. Апроксоване суміщення нуклеотидних послідовностей забезпечується за рахунок алгоритму пошуку локальної гомології Smith і Waterman, у Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981). Цей алгоритм може застосовуватися до амінокислотних послідовностей, використовуючи таблицю замін, розроблену Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3: 353358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., США, і упорядковану Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6): 6745-6763 (1986). Впровадження цього алгоритму, яке приводиться як приклад для визначення відсотка ідентичності послідовності забезпечене Genetics Computer Group (Madison, WI) у прикладній програмі "BestFit". Програми, які придатні для розрахунку відсотка ідентичності або схожості між послідовностями, як правило, відомі в даній галузі техніки, наприклад, іншою програмою для суміщення є BLAST, яка використовується із параметрами за замовчуванням. Наприклад, BLASTN і BLASTP можуть використовуватися, використовуючи наступні параметри за замовчуванням: генетичний код = стандартний; фільтр = немає; ланцюг = обидва ланцюги; поріг = 60; очікуване значення = 10; таблиця = BLOSUM62; опис = 50 послідовностей; сортування за допомогою = HIGH SCORE; бази даних = ненадлишкові, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB + трансляції із кодуючих послідовностей, GenBank + 8 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 білок Swiss+Spupdate+PIR. Деталі цих програм можна знайти в Інтернеті. Що стосується описуваних тут послідовностей, діапазоном бажаних ступенів ідентичності послідовностей є приблизно 80-100 % і будь-яке ціле число між ними. Типово відсотки ідентичностей між послідовностями складають принаймні 70-75 %, переважно 80-82 %, більш переважно 85-90 %, навіть більш переважно 92 %, ще більш переважно 95 % і найбільше переважно 98 %. Альтернативно, ступінь схожості послідовностей полінуклеотидів можна визначити за допомогою гібридизації полінуклеотидів в умовах, які допускають утворення стабільних дуплексів між гомологічними районами, із наступним розщепленням специфічної відносно одноланцюгової послідовності нуклеазою(ами), і визначення розміру розщеплених фрагментів. Дві послідовності нуклеїнових кислот або поліпептидів є в значній мірі гомологічними один одному, коли послідовності демонструють складову принаймні приблизно 70-75 %, переважно 80-82 %, більш переважно 85-90 %, навіть більш переважно 92 %, ще більш переважно 95 % і найпереважніше 98 % ідентичність послідовностей по усій визначеній довжині молекул, визначену із використанням вищезгаданих способів. Використовуваний тут термін "значною мірою гомологічні" також стосується послідовностей, які демонструють повну ідентичність із заданою послідовністю ДНК або поліпептиду. Послідовності ДНК, які значною мірою гомологічні, можна ідентифікувати в експерименті із використанням гібридизації за Саузерном, наприклад, у жорстких умовах, визначених для цієї конкретної системи. Визначення придатних умов гібридизації відомо кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям. Див., наприклад, Sambrook et al., вище; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press. Селективну гібридизацію двох фрагментів нуклеїнових кислот можна визначити, як описано нижче. Ступінь ідентичності послідовностей двох молекул нуклеїнових кислот впливає на ефективність і міцність гібридизаційних подій між такими молекулами. Почасти ідентична послідовність нуклеїнової кислоти буде принаймні частково інгібувати гібридизацію повністю ідентичної послідовності із молекулою-мішеню. Інгібування гібридизації повністю ідентичної послідовності можна оцінити, використовуючи аналізи гібридизації, які добре відомі в даній галузі техніки (наприклад, Саузерн (ДНК)-блот, Нозерн (РНК)-блот, гібридизація в розчині або т. п., див. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Такі аналізи можуть проводитися, використовуючи варіюючі ступені селективності, наприклад, використовуючи умови, які змінюються від низької жорсткості до високої жорсткості. Якщо використовуються умови низької жорсткості, відсутність неспецифічного зв'язування можна визначити, використовуючи одиний зонд без навіть часткового ступеня ідентичності послідовності (наприклад, зонд із складовою менше ніж приблизно 30 % ідентичністю послідовності із молекулою-мішеню) так, що під час відсутності подій неспецифічного зв'язування, додатковий зонд не буде гібридизуватися із мішеню. Використовуючи систему виявлення на основі гібридизації, вибирають зонд у вигляді нуклеїнової кислоти, який комплементарний контрольній послідовності нуклеїнової кислоти, і потім відповідно до вибору придатних умов зонд і контрольна послідовність селективно гібридизуються, або зв'язуються, один із одним із утворенням дуплексної молекули. Молекула нуклеїнової кислоти, яка здатна селективно гібридизуватися із контрольною послідовністю у помірковано жорстких умовах гібридизації, типово гібридизується в умовах, які дозволяють знайти послідовність нуклеїнової кислоти-мішень довжиною принаймні приблизно 10-14 нуклеотидів, ідентичну на принаймні приблизно 70 % послідовності вибраного зонда у вигляді нуклеїнової кислоти. Жорсткі умови гібридизації типово дозволяють виявити послідовності нуклеїнових кислот-мішеней довжиною принаймні приблизно 10-14 нуклеотидів, ідентичні на більше ніж приблизно 90-95 % послідовності вибраного зонда у вигляді нуклеїнової кислоти. Умови гібридизації, які застосовуються для гібридизації зонд/контрольна послідовність, причому зонд і контрольна послідовність мають визначений ступінь ідентичності послідовностей, можна визначити, як це відомо в даній галузі техніки (див., наприклад, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press). Умови гібридизації добре відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям. Жорсткість гібридизації стосується ступеня, у якому умови гібридизації не сприяють утворенню гібридів, які містять невідповідні нуклеотиди, при цьому більша жорсткість корелює із меншим допуском невідповідних гібридів. Фактори, які впливають на жорсткість гібридизації, добре відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям і включають, але без обмеження, температуру, pН, іонну силу і концентрацію органічних розчинників, таких як, наприклад, формамід і диметилсульфоксид. Як це відомо кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям, жорсткість 9 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 гібридизації збільшується при вищих температурах, меншій іонній силі і нижчих концентраціях розчинника. Що стосується умов жорсткості для гібридизації, у даній галузі техніки добре відомо, що численні еквівалентні умови можуть використовуватися для встановлення конкретної жорсткості, варіюючи, наприклад, наступні фактори: довжину і природу послідовностей зондів, склад основ різних послідовностей, концентрації солей і інших компонентів розчину для гібридизації, присутність або відсутність блокуючих агентів, у розчинах для гібридизації (наприклад, декстрану сульфату і поліетиленгліколю), температуру реакції гібридизації і параметри часу, а також варіюючи умови відмивання. Вибір конкретної множини умов гібридизації здійснюють, за стандартними методами у даній галузі техніки (див., наприклад, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). "Рекомбінація" стосується процесу обміну генетичною інформацією між двома полінуклеотидами. Стосовно цілей цього опису, "гомологічна рекомбінація (HR)" стосується спеціалізованої форми такого обміну, яка має місце, наприклад, під час репарації дволанцюгових розривів у клітинах. Необхідна гомологія нуклеотидних послідовностей для цього процесу, у якому використовується молекула "донора", яка служить матрицею для репарації молекули "мішені" (тобто молекули, у якій існує дволанцюговий розрив), і який відомий під різними назвами: "конверсія гена, яка не є кросинговером" або "генна конверсія, довжина ділянки якої є короткою", оскільки він приводить до перенесення генетичної інформації від донора до мішені. Без бажання обмежитися якою-небудь конкретною теорією, таке перенесення може включати корекцію невідповідності в гетеродуплексній ДНК, яка утвориться між мішеню із розривом і донором, і/або "синтез-залежний відпал ланцюгів", при якому донор використовується для ресинтезу генетичної інформації, яка буде ставати частиною мішені, і/або зв'язані процеси. Така спеціалізована HR часто приводить до зміни послідовності молекули мішені так, що частина або вся послідовність полінуклеотиду-донора включається в полінуклеотид-мішень. "Розщеплення" стосується розриву ковалентного кістяка молекули ДНК. Розщеплення можна ініціювати за допомогою множини способів, які включають, але без обмеження, ферментативний або хімічний гідроліз фосфодіефірного зв'язку. Можливий як одноланцюговий розрив, так і дволанцюговий розрив, і дволанцюговий розрив може відбуватися в результаті двох окремих подій одноланцюгового розриву. Розщеплення ДНК може приводити до створення або тупих кінців, або липких кінців. У деяких варіантах здійснення складені поліпептиди використовуються для спрямованого розщеплення дволанцюгової ДНК. "Розщеплюючий домен" включає одну або більше поліпептидних послідовностей, які мають каталітичну активність для розщеплення ДНК. Розщеплюючий домен може міститися в одному поліпептидному ланцюзі, або активність розщеплення може бути результатом асоціації двох (або більше) поліпептидів. "Півдомену для розщеплення" являє собою послідовність поліпептиду, яка, разом із другим поліпептидом (або ідентичним, або відмінним), утворить комплекс, який має активність розщеплення (переважно активність розщеплення дволанцюгової ДНК). "Сконструйованих півдомену для розщеплення" являє собою половину домену для розщеплення, яка була модифікована, щоб утворювати облігатні гетеродимери із іншою половиною домену для розщеплення (наприклад, іншим сконструйованим півдоменом для розщеплення). Див. також публікації заявок на патенти США №№ 2005/0064474, 20070218528 і 2008/0131962, включені сюди за допомогою посилання в їх повному обсязі. "Хроматин" є нуклеопротеїновою структурою, яка включає геном клітини. Хроматин клітини включає нуклеїнову кислоту, в основному ДНК, і білок, включаючи гістони і хромосомні білки, які не є гістонами. Велика частина хроматину еукаріотичних клітин існує у формі нуклеосом, причому "ядро" нуклеосоми включає приблизно 150 пар основ ДНК, зв'язаних із октамером, який включає два будь-яких із гістонів H2A, H2B, H3 і H4; і лінкерна ДНК (перемінної довжини залежно від організму) простягається між "ядрами" нуклеосом. Із лінкерною ДНК, як правило, зв'язана молекула гістону H1. Стосовно цілей даного опису, термін "хроматин", який мається на увазі, охоплює всі типи клітинного нуклеопротеїну, як прокаріотичного, так еукаріотичного. Хроматин клітини включає як хромосомний, так і епісомний хроматин. "Хромосома" являє собою хроматиновий комплекс, який включає весь геном клітини або його частину. Геном клітини часто характеризується своїм каріотипом, який являє собою сукупність усіх хромосом, які складають геном клітини. Геном клітини може включати одну або більше хромосом. 10 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Епісома" являє собою реплікуючу нуклеїнову кислоту, нуклеопротеїновий комплекс або іншу структуру, яка включає нуклеїнову кислоту, яка не є частиною хромосомного набору каріотипу клітини. Приклади епісом включають плазміди і деякі вірусні геноми. "Доступна ділянка" є місцем у хроматині клітини, у якому сайт-мішень, який є присутнім у нуклеїновій кислоті, може зв'язуватися екзогенною молекулою, яка розпізнає сайт-мішень. Без бажання обмежитися якою-небудь конкретною теорією, вважають, що доступною ділянкою є ділянка, яка не упакована в нуклеосомальну структуру. Відмінну структуру доступної ділянки можна часто знайти за її чутливістю до хімічних і ферментативних зондів, наприклад, нуклеаз. "Сайт-мішень" або "послідовність-мішень" є послідовністю нуклеїнової кислоти, яка визначає частину нуклеїнової кислоти, із якою буде зв'язуватися зв'язувальна молекула, у тому випадку, якщо існують достатні умови для зв'язування. Наприклад, послідовність 5'-GAATTC-3' є сайтоммішеню для ендонуклеази рестрикції EcoRI. "Екзогенною молекулою" є молекула, яка звичайно не є присутною у клітині, але може бути введена в клітину за допомогою одного або більше генетичних, біохімічних або інших способів. "Звичайна присутність у клітині" визначається відносно конкретної стадії розвитку клітини і умов навколишнього середовища для клітини. Таким чином, наприклад, молекула, яка є присутньою у клітинах тільки під час ранніх стадій розвитку квітки, є екзогенною молекулою відносно клітин квітки, яка повністю сформувалася. Так само молекула, індукована тепловим шоком, є екзогенною молекулою відносно клітини, яка непіддана тепловому шоку. Екзогенна молекула може включати, наприклад, послідовність, яка кодує будь-який поліпептид або його фрагмент, функціонуючий варіант дисфункціонуючої ендогенної молекули або дисфункціонуючий варіант нормально функціонуючої ендогенної молекули. Крім того, екзогенна молекула може включати кодуючу послідовність від іншого виду, яка є ортологом ендогенного гена в клітині-хазяїні. Екзогенною молекулою може бути, серед іншого, невелика молекула, наприклад, яка створюється за допомогою процесу комбінаторної хімії, або макромолекула, така як білок, нуклеїнова кислота, вуглевод, ліпід, глікопротеїн, ліпопротеїн, полісахарид, будь-яке модифіковане похідне вищезгаданих молекул, або будь-який комплекс, який включає одну або більше вищезгаданих молекул. Нуклеїнові кислоти включають ДНК і РНК, можуть бути одноабо дволанцюговими; можуть бути лінійними, розгалуженими або замкнутими в коло; і можуть бути будь-якої довжини. Нуклеїнові кислоти включають ті, які здатні утворювати дуплекси, а також такі, які утворюють триплекси нуклеїнові кислоти. Див., наприклад, патенти США №№ 5176996 і 5422251. Білки включають, але без обмеження, ДНК-зв'язувальні білки, фактори транскрипції, фактори реконструкції хроматину, білки, полімерази, метилази, деметилази, ацетилази, деацетилази, кінази, фосфатази, інтегрази, рекомбінази, лігази, топоізомерази, гірази і хелікази, які зв'язуються із метильованою ДНК. Таким чином, термін включає "трансгени" або "гени, які становлять інтерес", які є екзогенними послідовностями, введеними в клітину рослини, наприклад, у ген MDH у клітині рослини. Екзогенна молекула може бути молекулою того ж типу, що і ендогенна молекула, наприклад, екзогенним білком або нуклеїновою кислотою. Наприклад, екзогенна нуклеїнова кислота може включати геном інфекційного вірусу, плазміду або епісому, введений(у) у клітину, або хромосому, яка звичайно не є присутньою у клітині. Способи введення екзогенних молекул у клітини відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям і включають, але без обмеження, трансформацію протопластів, трансформацію із використанням карборунду (наприклад, WHISKERS), трансформацію із використанням Agrobacterium, ліпідопосередковане перенесення (тобто ліпосоми, які включають нейтральні і катіонні ліпіди), електропорацію, пряму ін'єкцію, злиття клітин, бомбардування частинками (наприклад, використовуючи "генну гармату"), копреципітацію фосфатом кальцію, перенесення із використанням DEAE-декстрану і перенесення із використанням вірусних векторів. Навпаки, "ендогенною" молекулою є молекула, яка звичайно є присутньою у конкретній клітині на конкретній стадії розвитку у конкретних умовах навколишнього середовища. Наприклад, ендогенна нуклеїнова кислота може включати хромосому, геном мітохондрії, хлоропласта або іншої органели, або епісомну нуклеїнову кислоту, яка зустрічається в природі. Додаткові ендогенні молекули можуть включати білки, наприклад, фактори транскрипції і ферменти. Термін "продукт екзогенної нуклеїнової кислоти", який тут використовується, включає продукти і у вигляді полінуклеотидів, і у вигляді поліпептидів, наприклад, продукти транскрипції (полінуклеотиди, такі як РНК) і продукти трансляції (поліпептиди). "Складеною" молекулою є молекула, у якій дві або більше молекули субодиниць зв'язані, переважно ковалентно. Молекули субодиниць можуть бути молекулами однакового хімічного типу або можуть бути молекулами різних хімічних типів. Приклади першого типу складеної 11 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 молекули включають, але без обмеження, складені білки (наприклад, об'єднання ДНКзв'язувального домену ZFP із розщеплюючим доменом) і складені нуклеїнові кислоти (наприклад, нуклеїнова кислота, яка кодує складений білок, описаний вище). Приклади другого типу складеної молекули включають, але без обмеження, об'єднання утворюючої триплекс нуклеїнової кислоти із поліпептидом і об'єднання утворюючої зв'язки в малій борозенці молекули із нуклеїновою кислотою. Експресія складеного білка в клітині може бути наслідком доставки складеного білка в клітину або в результаті доставки полінуклеотиду, який кодує складений білок, у клітину, у якій полінуклеотид транскрибується, і транскрипт транслюється, із породженням складеного білка. Транс-сплайсинг, розщеплення поліпептиду і лігування поліпептидів можуть бути також залучені в експресію білка в клітині. Способи доставки в клітини полінуклеотидів і поліпептидів представлені в цьому описі в іншому місці. Стосовно цілей даного опису, ген включає ділянку ДНК, яка кодує продукт гена (див. нижче), а також усі ділянки ДНК, які регулюють утворення продукту гена, незалежно від того, чи знаходяться регуляторні послідовності поряд із кодуючими і/або транскрибованими послідовностями або ні. Відповідно, ген включає, але без обов'язкового обмеження ними, промоторні послідовності, термінатори, які регулюють трансляцію послідовності, такі як ділянки зв'язування рибосоми і ділянки внутрішньої посадки рибосоми, енхансери, сайленсери, інсулятори, пограничні елементи, початки реплікації, сайти приєднання до матриксу і локусконтролюючі елементи. "Експресія гена" стосується перетворення інформації, яка міститься в гені, у продукт гена. Продуктом гена може бути безпосередній продукт транскрипції гена (наприклад, мРНК, тРНК, рРНК, антисмислова РНК, рибозим, структурна РНК або будь-який інший тип РНК) або білок, продукований у результаті трансляції із мРНК. Продукти гена також включають РНК, які модифіковані в результаті таких процесів, як кепіровані, поліаденілювання, метилювання і коректування, і білки, модифіковані, наприклад, у результаті метилювання, ацетилування, фосфорилування, убіквітинування, АДФ-рибозилування, міристилування і глікозилування. "Модуляція" експресії гена стосується зміни активності гена. Модуляція експресії може включати, але без обмеження, активацію гена і репресію гена. Клітини "рослин" включають, але без обмеження, клітини однодольних або дводольних рослин. Необмежуючі приклади однодольних рослин включають хлібні злаки, такі як кукурудза, рис, ячмінь, овес, пшениця, сорго, жито, цукрова тростина, ананас, цибуля, бананове дерево і кокосову пальму. Необмежуючі приклади дводольних рослин включають тютюн, помідор, соняшник, бавовник, цукровий буряк, картоплю, салат-латук, диню, сою, канолу (рапс) і люцерну. Клітини рослин можуть походити із будь-якої частини рослини і/або із будь-якої стадії розвитку рослини. "Ділянкою, яка становить інтерес" є будь-яка ділянка хроматину клітини, така як, наприклад, ген або некодуюча послідовність у гені або поряд із ним, у якому бажане зв'язування екзогенної молекули. Зв'язування може бути із метою спрямованого розщеплення ДНК і/або спрямованої рекомбінації. Ділянка, яка становить інтерес, може бути присутньою у хромосомі, епісомі, геномі органели (наприклад, мітохондрії, хлоропласта) або геномі інфекційного вірусу, наприклад. Ділянка, яка становить інтерес, може знаходитися в кодуючій області гена, у транскрибованих некодуючих областях, таких як, наприклад, лідерні послідовності, трейлерні послідовності або інтрони, або в нетранскрибованих областях, або 5', або 3' від кодуючої області. Ділянка, яка становить інтерес, може бути настільки малою, як одна пара нуклеотидів, або складати аж до 2000 пар нуклеотидів у довжину, або будь-яке ціле число пар нуклеотидів. Терміни "функціональний зв'язок" і "функціонально зв'язаний" використовуються взаємозамінно, що стосується безпосереднього сусідства двох або більше компонентів (таких як елементи послідовності), при якому компоненти розташовані так, що обидва компоненти функціонують нормально, і надається можливість опосередковування принаймні одним із компонентів функції, яку виявляє принаймні один із інших компонентів. Як ілюстрація регулююча транскрипцію послідовність, така як промотор, функціонально зв'язана із кодуючою послідовністю, якщо регулююча транскрипцію послідовність контролює рівень транскрипції із кодуючої послідовності у відповідь на присутність або відсутність одного або більше регулюючих транскрипцію факторів. Регулююча транскрипцію послідовність, як правило, функціонально зв'язана в цис-положенні із кодуючою послідовністю, але не потрібно, щоб вона знаходилася поруч із кодуючою послідовністю. Наприклад, енхансер являє собою регулюючу транскрипцію послідовність, яка функціонально зв'язана із кодуючою послідовністю, навіть якщо вони не є дотичними. 12 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Що стосується складених поліпептидів, термін "функціонально зв'язаний" може стосуватися того факту, що кожний із компонентів виконує ту ж функцію при перебуванні в зв'язку із іншим компонентом, як було б, якщо він не був зв'язаний подібним чином. Наприклад, що стосується складеного поліпептиду, у якому ДНК-зв'язувальний домен ZFP об'єднаний із розщеплюючим доменом, який ДНК-зв'язувальний домен ZFP і розщеплюючий домен знаходяться у функціональному зв'язку, якщо, у випадку складеного поліпептиду, частина у вигляді ДНКзв'язувального домену ZFP здатна до зв'язування із своїм сайтом-мішеню і/або із своїм сайтом зв'язування, у той час як розщеплюючий домен здатний розщеплювати ДНК поблизу сайтумішені. "Функціональним фрагментом" білка, поліпептиду або нуклеїнової кислоти є білок, поліпептид або нуклеїнова кислота, послідовність якого(ї) не ідентична повнорозмірному білку, поліпептиду або нуклеїновій кислоті, при цьому у нього зберігається та ж функція, що у повнорозмірного білка, поліпептиду або нуклеїнової кислоти. Функціональний фрагмент може мати великий, менший або ту ж кількістю залишків, що і (чим) відповідна природна молекула, і/або може містити одну або більше амінокислотних або нуклеотидних замін. Способи визначення функції нуклеїнової кислоти (наприклад, функції кодування, здатності до гібридизації з іншою нуклеїновою кислотою) широко відомі в даній галузі техніки. Так само способи визначення функції білків широко відомі. Наприклад, функцію зв'язування із ДНК поліпептиду можна визначити, наприклад, за допомогою зв'язування на фільтрах, зсув електрофоретичної рухливості або аналізів із використанням імунопреципітації. Розщеплення ДНК можна досліджувати за допомогою гель-електрофорезу. Див. Ausubel et al., вище. Здатність білка до взаємодії із іншим білком можна визначити, наприклад, за допомогою коімунопреципітації, аналізів із використанням двогібридної системи або комплементації, як генетичної, так і біохімічної. Див., наприклад, Fields et al. (1989) Nature 340: 245-246; патент США № 5585245 і PCT WO 98/44350. ДНК-зв'язувальні домени В описуваних тут способах може використовуватися будь-який ДНК-зв'язувальний домен. У деяких варіантах здійснення ДНК-зв'язувальний домен включає білок із цинковими пальцями. Зв'язувальний домен "цинкові пальці" включає один або більше цинкових пальців. Miller et al. (1985) EMBO J. 4: 1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Feb.: 56-65; патент США № 6453242. Зв'язувальні домени "цинкові пальці", які описуються тут, як правило, включають 2, 3, 4, 5, 6 або навіть більше цинкових пальців. Типово довжина одного домену "цинковий палець" складає приблизно 30 амінокислот. Структурні дослідження показали, що кожен домен (мотив) "цинковий палець" містить два бетаскладчасті шари (які містяться у бета-вигині, який містить два інваріантні залишки цистеїну) і альфа-спіраль (яка містить два інваріантні залишки гістидину), які утримуються в особливій конформації завдяки координації атома цинку двома цистеїнами і двома гістидинами. Цинкові пальці включають як канонічні C2H2 цинкові пальці (тобто ті, у яких іон цинку координується двома залишками цистеїну і двома залишками гістидину), так і неканонічні цинкові пальці, такі як, наприклад, C 3H цинкові пальці (ті, у яких іон цинку координується трьома залишками цистеїну і одним залишком гістидину) і C 4 цинкові пальці (ті, у яких іон цинку координується чотирма залишками цистеїну). Див. також WO 02/057293, а також публікацію заявки на патент США № 20080182332 стосовно неканонічних ZFP для застосування в рослинах. Сконструйований зв'язувальний домен "цинкові пальці" може мати нову специфічність зв'язування порівняно із білком із цинковими пальцями, які зустрічаються в природі. Методи конструювання включають, але без обмеження, розробку на основі критеріїв раціональності і різні типи відбору. Розробка на основі критеріїв раціональності включає, наприклад, використання баз даних, які включають послідовності нуклеотидів у триплетах (або квадруплетах) і амінокислотні послідовності окремих цинкових пальців, у яких послідовність нуклеотидів у триплетах або квадруплетах зв'язана із однієї або більше амінокислотними послідовностями цинкових пальців, які зв'язуються із конкретною послідовністю у вигляді триплета або квадруплета. Методи відбору, які наводяться як приклад, які включають фаговий дисплей і двогібридні системи, описані в патентах США №№ 5789538, 5925523, 6007988, 6013453, 6410248, 6140466, 6200759 і 6242568, а також WO 98/37186, WO 98/53057, WO 00/27878, WO 01/88197 і GB 2338237. Збільшення специфічності зв'язування для зв'язувальних доменів "цинкові пальці" було описано, наприклад, у WO 02/077227. 13 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Оскільки окремий цинковий палець зв'язується із послідовністю трьох нуклеотидів (тобто триплетом) (або чотиринуклеотидною послідовністю, яка може перекриватися, по одному нуклеотиду, із чотиринуклеотидним сайтом зв'язування для сусіднього цинкового пальця), довжина послідовності, із якою зв'язувальний домен "цинковий палець" відповідно до розробки зв'язується (наприклад, послідовності-мішені), буде визначати кількість цинкових пальців у конструйованому зв'язувальному домені "цинковий палець". Наприклад, у випадку ZFP, у яких мотиви "цинкові пальці" не зв'язуються із перекриваючими підсайтами, шестинуклеотидна послідовність-мішень зв'язується зв'язувальним доменом, який включає два пальці; девятинуклеотидна послідовність-мішень зв'язується зв'язувальним доменом, який включає три пальці, і т. д. Як тут відзначається, не потрібно, щоб сайти зв'язування для окремих цинкових пальців (тобто підсайти) у сайті-мішені були дотичними, але вони можуть бути розділені одним або декількома нуклеотидами, залежно від довжини і природи амінокислотних послідовностей між цинковими пальцями (тобто лінкерів між пальцями) у зв'язувальному домені, який включає множину пальців. У зв'язувальному домені, який включає множину пальців, сусідні цинкові пальці можуть бути розділені амінокислотними послідовностями-лінкерами довжиною приблизно 5 амінокислот (так званими "канонічними" лінкерами між пальцями) або, альтернативно, одним або більше неканонічними лінкерами. Див., наприклад, патенти США №№ 6453242 і 6534261. У випадку сконструйованих зв'язувальних доменів "цинкові пальці", які включають більше трьох пальців, вставка довших ("неканонічних") лінкерів між деякими із цинкових пальців може бути бажаною в деяких випадках, оскільки вона може збільшити спорідненість і/або специфічність зв'язування зв'язувальним доменом. Див., наприклад, патент США № 6479626 і WO 01/53480. Відповідно, зв'язувальні домени, які включають множину цинкових пальців, можна також характеризувати відносно присутності і локалізації неканонічних лінкерів між пальцями. Наприклад, зв'язувальний домен із шістьма цинковими пальцями, який включає три пальці (з'єднаних за допомогою двох канонічних лінкерів між пальцями), довгий лінкер і три додаткових пальці (з'єднаних за допомогою двох канонічних лінкерів між пальцями), називають конфігурацією 2×3. Аналогічно, зв'язувальний домен, який включає два пальці (із канонічним лінкером між ними), довгий лінкер і два додаткових пальці (з'єднаних за допомогою канонічного лінкера), називають конфігурацією 2×2. Білок, який включає три одиниці, які включають два пальці (у кожній із яких два пальці з'єднані за допомогою канонічного лінкера), і в якому кожна одиниця, яка включає два пальці, з'єднана із сусідньою одиницею, яка включає два пальці, за допомогою довгого лінкера, називають конфігурацією 3×2. Присутність довгого або неканонічного лінкера між двома сусідніми цинковими пальцями у зв'язувальному домені, який включає множину цинкових пальців, дозволяє двом пальцям зв'язуватися із підсайтами, які не є безпосередньо дотичними у послідовності-мішені. Відповідно, можуть існувати проміжки із одного або більше нуклеотидів між підсайтами в сайтімішені; тобто сайт-мішень може містити один або більше нуклеотидів, із якими не контактує цинковий палець. Наприклад, зв'язувальний домен "цинкові пальці" 2×2 може зв'язуватися із двома шестинуклеотидними послідовностями, розділеними одним нуклеотидом, тобто він зв'язується із 13-нуклеотидним сайтом-мішеню. Див. також Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1432-1436; Moore et al. (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1437-1441 і WO 01/53480. Як обговорювалося раніше, підсайтом-мішеню є три- або чотиринуклеотидна послідовність, яка зв'язується одним цинковим пальцем. У деяких цілях, одиницю, яка включає два пальці, називають "зв'язувальним модулем". Зв'язувальний модуль можна отримати, наприклад, за допомогою відбору двох сусідніх пальців у рамках білка із множиною пальців (як правило, трьох пальців), які зв'язуються із конкретною шестинуклеотидною послідовністю-мішеню. Альтернативно, модулі можна сконструювати за допомогою збирання окремих цинкових пальців. Див. також WO 98/53057 і WO 01/53480. Альтернативно, ДНК-зв'язувальний домен може походити із нуклеази. Наприклад, відомі розпізнавальні послідовності хомінг-нуклеаз і мегануклеаз, таких як I-SceІ, I-CeuІ, PI-PspІ, PISceІ, I-SceIV, I-CsmІ, I-PanІ, I-SceII, I-PpoІ, I-SceIII, I-CreІ, I-TevІ, I-TevII і I-TevIII. Див. також патент США № 5420032; патент США № 6833252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 33793388; Dujon et al. (1989) Gene 82: 115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12: 224-228; Gimble et al. (1996) J Mol. Biol. 263: 163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280: 345-353 і каталог New England Biolabs. Крім того, можна створити специфічність зв'язування із ДНК хомінг-нуклеаз і мегануклеаз так, щоб вони зв'язувалися із неприродними сайтами-мішенями. Див., наприклад, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10: 895905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441: 656 14 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7: 49-66; публікацію заявки на патент США № 20070117128. Як іншу альтернативу, ДНК-зв'язувальний домен може походити із білка "лейцинова блискавка". Лейцинові блискавки є класом білків, які залучені в білок-білкові взаємодії в множині регуляторних білків еукаріотичних клітин, які є важливими факторами транскрипції, зв'язаними із експресією генів. Лейцинова блискавка стосується загального структурного мотиву, спільно використовуваного цими факторами транскрипції, серед декількох царств, включаючи тварин, рослини, дріжджі і т. д. Лейцинова блискавка утворена двома поліпептидами (гомодимер або гетеродимер), які зв'язуються із специфічними послідовностями ДНК таким чином, що залишки лейцину рівномірно розподіляються по α-спіралі так, що залишки лейцину двох поліпептидів виявляються на одній і тій же поверхні спіралі. Специфічність зв'язування із ДНК лейцинових блискавок може використовуватися в ДНК-зв'язувальних доменах, які описуються тут. У деяких варіантах здійснення ДНК-зв'язувальним доменом є сконструйований домен ефектора TAL, який походить із патогена рослин Xanthomonas (див. Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29(2): 143-8; Boch et al, (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1126/science.117881) і Moscou and Bogdanove, (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1126/science.l178817); і публікації заявок на патенти США №№ 20110239315, 20110145940 і 20110301073, які включені сюди за допомогою посилання в їх повному обсязі). Нуклеазна система CRISPR (короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами)/Cas (яка зв'язується із CRISPR) є недавно розробленою нуклеазною системою на основі бактеріальної системи, яка може використовуватися для геномної інженерії. Вона заснована на частині адаптивної імунної відповіді багатьох бактерій і Archea. Коли вірус або плазміда впроваджується в бактерію, сегменти ДНК окупанта перетворюються в CRISPR РНК (crRNA) у результаті "імунної" реакції. Ця CRISPR РНК потім зв'язується, завдяки ділянці часткової комплементарності, із іншим типом РНК, яка називається трансактивуючою CRISPR РНК, для спрямування нуклеази Cas9 на ділянку, гомологічну CRISPR РНК, у ДНК-мішені, яка називається "протоспейсером". Cas9 розщеплює ДНК із утворенням тупих кінців у дволанцюговому розриві в сайтах, заданих 20-нуклеотидною спрямовуючою послідовністю, яка міститься в транскрипті CRISPR РНК. Для сайт-специфічного розпізнавання ДНК і розщеплення Cas9 потрібно як CRISPR РНК, так і трансактивуюча CRISPR РНК. Тепер розроблена така система, що CRISPR РНК і трансактивуюча CRISPR РНК можуть бути об'єднані в одну молекулу ("єдину спрямовуючу РНК"), і можна сконструювати еквівалентну CRISPR РНК частину єдиної спрямовуючої РНК, яка направляє нуклеазу Cas9 для впливу на будь-яку бажану послідовність (див. Jinek et al. (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471, і David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Таким чином, можна розробити систему CRISPR/Cas для створення дволанцюгового розриву (DSB) у бажаній мішені в геномі, і на репарацію DSB можна впливати за допомогою використання інгібіторів репарації для виклику збільшення схильної до помилок репарації. Розщеплюючі домени Як відзначено вище, ДНК-зв'язувальний домен може бути асоційований із розщеплюючим (нуклеазним) доменом. Наприклад, може бути модифікована специфічність зв'язування із ДНК хомінг-ендонуклеаз при збереженні їх нуклеазної активності. Крім того, білки із цинковими пальцями можуть бути також об'єднані із розщеплюючим доменом із утворенням нуклеази із доменами "цинкові пальці" (ZFN). Розщепляючу домен частину складених білків, які описуються тут, можна отримати із будь-якої ендонуклеази або екзонуклеази. Ендонуклеази, які приводяться як приклад, із яких може бути отриманий розщеплюючий домен, включають, але без обмеження, ендонуклеази рестрикції і хомінг-ендонуклеази. Див., наприклад, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; і Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 33793388. Відомі додаткові ферменти, які розщеплюють ДНК (наприклад, нуклеаза S1; нуклеаза квасолі золотавої; ДНКаза I підшлункової залози; нуклеаза мікрококів; дріжджова HO ендонуклеаза; див. також Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Необмежуючі приклади хомінг-ендонуклеаз і мегануклеаз включають I-SceІ, I-CeuІ, PI-PspІ, PISce, I-SceIV, I-CsmІ, I-PanІ, I-SceII, I-PpoІ, I-SceIII, I-CreІ, I-TevІ, I-TevII і I-TevIII. Див. також патент США № 5420032, патент США № 6833252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82: 115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12: 224-228; Gimble et al. (1996) J Mol. Biol. 263: 163-180; Argast et al. (1998) J Mol. Biol. 280: 345-353 і каталог New England Biolabs. Один або більше цих ферментів (або їх функціональних фрагментів) можуть використовуватися як джерело розщеплюючих доменів і половин доменів для розщеплення. 15 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ендонуклеази рестрикції (рестрикційні ферменти) присутні у багатьох видів і здатні до специфічного відносно послідовності зв'язування із ДНК (у рестрикційному сайті) і розщеплення ДНК у або поблизу сайту(і) зв'язування. Деякі рестрикційні ферменти (наприклад, типу IIS) розщеплюють ДНК у сайтах, віддалених від сайту розпізнавання, і мають роздільні зв'язувальний і розщеплюючий домени. Наприклад, фермент типу IIS FokІ каталізує дволанцюговий розрив ДНК на відстані 9 нуклеотидів від його сайту розпізнавання на одному ланцюзі і на відстані 13 нуклеотидів від його сайту розпізнавання на іншому ланцюзі. Див., наприклад, патенти США №№ 5356802, 5436150 і 5487994; а також Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 31978-31982. Таким чином, в одному варіанті здійснення складені білки включають розщеплюючий домен (або півдомену для розщеплення) із принаймні одного рестрикційного ферменту типу IIS і один або більше зв'язувальних доменів "цинкові пальці", які можуть бути або можуть не бути сконструйованими. Рестрикційним ферментом типу IIS, який наводиться як приклад, розщеплюючий домен якого є віддільним від зв'язувального домену, є FokІ. Цей конкретний фермент є активним у вигляді димера. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-10575. Відповідно, застосовно до цілей даного опису, частина ферменту FokІ, яка використовується в описуваних складених білках, вважається половиною домену для розщеплення. Таким чином, для спрямованого дволанцюгового розриву і/або спрямованого заміщення клітинних послідовностей, використовуючи об'єднання цинковий палець-FokІ, два складені білки, кожний із яких включає півдомену для розщеплення FokІ, можуть використовуватися для відтворення каталітично активного розщеплюючого домену. Альтернативно, може також використовуватися одна молекула поліпептиду, яка містить зв'язувальний домен "цинкові пальці" і дві половини домену для розщеплення FokІ. Параметри для спрямованого розщеплення і спрямованої зміни послідовностей, використовуючи об'єднання цинковий палець-FokІ, надані в цьому описі в іншому місці. Розщеплюючий домен або півдомену для розщеплення може бути будь-якою частиною білка, у якій зберігається активність розщеплення або в якій зберігається здатність до мультимеризації (наприклад, димеризації) із утворенням функціонального розщеплюючого домену. Рестрикційні ферменти типу IIS, які приводяться як приклади, описані в публікації міжнародної заявки WO 2007/014275, яка включена за допомогою посилання в її повному обсязі. Для збільшення специфічності розщеплення розщеплюючі домени можна також модифікувати. У деяких варіантах здійснення використовуються варіанти півдомену для розщеплення, ці варіанти мінімізують або запобігають гомодимеризації половин доменів для розщеплення. Необмежуючі приклади таких модифікованих половин доменів для розщеплення описані детально в WO 2007/014275, яка включена сюди за допомогою посилання в її повному обсязі. Див. також розділ "Приклади". У деяких варіантах здійснення розщеплюючий домен включає сконструйовану половину домену для розщеплення (яка також називається мутантами домену, який піддається димеризації), яка мінімізує або запобігає гомодимеризації, ці мутанти відомі кваліфікованими в даній галузі техніки фахівцям і описані, наприклад, у публікаціях заявок на патенти США №№ 20050064474; 20060188987; 20070305346 і 20080131962, опис кожної із яких включено сюди за допомогою посилання в її повному обсязі. Усі із амінокислотних залишків у положеннях 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 і 538 FokІ є мішенями для надавання впливу на димеризацію половин доменів для розщеплення FokІ. Додаткові сконструйовані половини доменів для розщеплення FokІ, які утворюють облігатні гетеродимери, можуть також використовуватися в ZFN, які тут описуються. Сконструйовані половини доменів для розщеплення FokІ, які приводяться як приклади, які утворюють облігатні гетеродимери, включають пари, у яких перша половина домену для розщеплення включає мутації в амінокислотних залишках у положеннях 490 і 538 FokІ, а друга половина домену для розщеплення включає мутації в амінокислотних залишках 486 і 499. Таким чином, в одному варіанті здійснення мутація в положенні 490 приводить до заміни Glu (E) на Lys (K); мутація в положенні 538 приводить до заміни Iso (I) на Lys (K); мутація в положенні 486 приводить до заміни Gln (Q) на Glu (E); і мутація в положенні 499 приводить до заміни Iso (I) на Lys (K). Зокрема, сконструйовані половини доменів для розщеплення, які описуються тут, були приготовлені за допомогою виклику мутацій у положеннях 490 (E→K) і 538 (I→K) в одній половині домену для розщеплення із створенням сконструйованого півдомену для 16 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розщеплення, названого "E490K:I538K", і за допомогою виклику мутацій у положеннях 486 (Q→E) і 499 (I→L) в іншій половині домену для розщеплення із створенням сконструйованого півдомену для розщеплення, названого "Q486E:I499L". Сконструйовані половини доменів для розщеплення, які описуються тут, є мутантами облігатних гетеродимерів, у які аберантне розщеплення мінімізоване або виключене. Див., наприклад, публікацію заявки на патент США № 2008/0131962, опис якої включено за допомогою посилання в її повному обсязі для всіх цілей. У деяких варіантах здійснення сконструйована половина домену для розщеплення включає мутації в положеннях 486, 499 і 496 (пронумерованих відносно FokІ дикого типу), наприклад, мутації, які приводять до заміни залишку дикого типу Gln (Q) у положенні 486 на залишок Glu (E), залишку дикого типу Iso (I) у положенні 499 на залишок Leu (L) і залишку дикого типу Asn (N) у положенні 496 на залишок Asp (D) або Glu (E) (що також називається доменами "ELD" і "ELE", відповідно). В інших варіантах здійснення сконструйована половина домену для розщеплення включає мутації у положеннях 490, 538 і 537 (пронумерованих відносно FokІ дикого типу), наприклад, мутації, які приводять до заміни залишку дикого типу Glu (E) у положенні 490 на залишок Lys (K), залишку дикого типу Iso (I) у положенні 538 на залишок Lys (K) і залишку дикого типу His (H) у положенні 537 на залишок Lys (K) або залишок Arg (R) (яка також називається доменами "KKK" і "KKR", відповідно). В інших варіантах здійснення сконструйована половина домену для розщеплення включає мутації в положеннях 490 і 537 (пронумерованих відносно FokІ дикого типу), наприклад, мутації, які приводять до заміни залишку дикого типу Glu (E) у положенні 490 на залишок Lys (K) і залишку дикого типу His (H) у положенні 537 на залишок Lys (K) або залишок Arg (R) (яка також називається доменами "KIK" і "KIR", відповідно). (Див. публікацію заявки на патент США № 20110201055). В інших варіантах здійснення сконструйована половина домену для розщеплення включає "Sharkey"-мутації і/або мутації "Sharkey" (див. Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400(1): 96-107). Сконструйовані половини доменів для розщеплення, які описуються тут, можна приготувати, використовуючи будь-який придатний спосіб, наприклад, сайт-спрямований мутагенез половин доменів для розщеплення дикого типу (FokІ), як описано в публікаціях заявок на патенти США №№ 20050064474; 20080131962 і 20110201055. Альтернативно, нуклеази можуть піддаватися збиранню in vivo на сайті-мішені нуклеїнової кислоти, використовуючи так звану технологію "розділених ферментів" (див., наприклад, публікацію заявки на патент США № 20090068164). Компоненти таких розділених ферментів можуть експресуватися або із окремих експресійних конструкцій, або можуть бути з'єднані в одну відкриту рамку зчитування, у якій окремі компоненти розділені, наприклад, пептидом 2A, який саморозщеплюється, або послідовністю IRES. Компонентами можуть бути окремі зв'язувальні домени "цинкові пальці" або домени у вигляді зв'язувального нуклеїнову кислоту домену мегануклеази. Нуклеази можна піддати скринінгу на предмет активності перед використанням, наприклад, у хромосомній системі на основі дріжджів, описаної в WO 2009/042163 і 20090068164. Конструкції для експресії нуклеаз можна легко розробити, використовуючи відомі в даній галузі техніки способи. Див., наприклад, публікації заявок на патенти США №№ 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231 і публікацію міжнародної заявки WO 07/014275. Експресія нуклеази може знаходитися під контролем конститутивного промотору або індукованого промотору, наприклад, промотору галактокінази, який активується (піддається дерепресії) у присутності рафінози і/або галактози і піддається репресії у присутності глюкози. Складені білки Способи розробки і конструювання складених білків (і кодуючих їх полінуклеотидів) відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям. Наприклад, способи розробки і конструювання складених білків, які включають ДНК-зв'язувальні домени (наприклад, домени "цинкові пальці") і регуляторні або розщеплюючі домени (або половини доменів для розщеплення), і полінуклеотидів, які кодують такі складені білки, описані в патентах США №№ 6453242 і 6534261 і публікаціях заявок на патенти США №№ 2007/0134796; 2005/0064474; 20080182332; 20090205083; 20100199389; 20110167521, 20110239315, 20110145940 і 20110301073, які включені сюди за допомогою посилання в їх повному обсязі. У деяких варіантах здійснення конструюють полінуклеотиди, які кодують складені білки. Ці полінуклеотиди можна вмонтувати у вектор, і вектор можна ввести в клітину (див. нижче заради додаткового опису, який стосується векторів і способів введення полінуклеотидів у клітини). У деяких варіантах здійснення способів, які описуються тут, нуклеаза із доменами "цинкові пальці" включає складений білок, який включає зв'язувальний домен "цинкові пальці" і півдомену для розщеплення із рестрикційного ферменту FokІ, і два такі складені білки 17 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресують у клітині. Експресія двох складених білків у клітині може бути результатом доставки двох білків у клітину; доставки одного білка і однієї нуклеїнової кислоти, яка кодує один із білків, у клітину; доставки двох нуклеїнових кислот, кожна із яких кодує один із білків, у клітину; або доставки однієї нуклеїнової кислоти, яка кодує обидва білки, у клітину. У додаткових варіантах здійснення складений білок включає один поліпептидний ланцюг, який включає дві половини домену для розщеплення і зв'язувальний домен "цинкові пальці". У цьому випадку один складений білок експресується у клітині і, як вважають, без бажання обмежитися якою-небудь теорією, розщеплює ДНК у результаті утворення внутрішньомолекулярного димера половин домену для розщеплення. У деяких варіантах здійснення компоненти складених білків (наприклад, об'єднань ZFP-FokІ) розташовані так, що домен "цинкові пальці" знаходиться найближче до N-кінця складеного білка, а півдомену для розщеплення знаходиться найближче до С-кінця. Це служить відображенням відносної орієнтації розщеплюючого домену у доменах, які зустрічаються в природі, які димеризуються і розщеплюються, таких як ті, які походять із фермента FokІ, у якому ДНК-зв'язувальний домен знаходиться найближче до N-кінця, а півдомену для розщеплення знаходиться найближче до С-кінця. У цих варіантах здійснення димеризація половин домену для розщеплення із утворенням функціональної нуклеази здійснюється при зв'язуванні складених білків із сайтами на протилежних ланцюгах ДНК, при цьому 5' кінці сайтів зв'язування є проксимальними по відношенню один до одного. У додаткових варіантах здійснення компоненти складених білків (наприклад, об'єднань ZFPFokІ) розташовані так, що півдомену для розщеплення знаходиться найближче до N-кінця складеного білка, а домен "цинкові пальці" знаходиться найближче до С-кінця. У цих варіантах здійснення димеризація половин домену для розщеплення із утворенням функціональної нуклеази здійснюється при зв'язуванні складених білків із сайтами на протилежних ланцюгах ДНК, при цьому 3' кінці сайтів зв'язування є проксимальними по відношенню один до одного. Проте, у додаткових варіантах здійснення перший складений білок містить півдомену для розщеплення, який знаходиться найближче до N-кінця складеного білка, і домен "цинкові пальці", який знаходиться найближче до С-кінця, а другий складений білок організований так, що домен "цинкові пальці" знаходиться найближче до N-кінця складеного білка, а півдомену для розщеплення знаходиться найближче до С-кінця. У цих варіантах здійснення обидва складених білки зв'язуються із одним і тим же ланцюгом ДНК, при цьому сайт зв'язування для першого складеного білка, який містить домен "цинкові пальці" найближче до С-кінця, знаходиться із 5' сторони від сайту зв'язування для другого складеного білка, який містить домен "цинкові пальці" найближче до N-кінця. У деяких варіантах здійснення описуваних складених білків амінокислотну послідовність між доменом "цинкові пальці" і розщеплюючим доменом (або половиною домену для розщеплення) називають "ZC лінкером". ZC лінкер варто відрізняти від лінкерів між пальцями, які обговорювалися вище. Див., наприклад, публікації заявок на патенти США №№ 20050064474 і 20030232410 і публікацію міжнародної заявки на патент WO05/084190 заради деталей отримання ZC лінкерів, які оптимізують розщеплення. У одному варіанті здійснення даним винаходом забезпечується нуклеаза (наприклад, ZFN), яка включає білок із цинковими пальцями, який має одну або більше розпізнавальних спіральних амінокислотних послідовностей, представлених у таблиці 1A (наприклад, білок із цинковими пальцями, який складається із компонентних доменів "цинкові пальці" із розпізнавальними спіральними ділянками, представленими в одному ряді таблиці 1A). В іншому варіанті здійснення тут забезпечується вектор для експресії ZFP, який включає нуклеотидну послідовність, яка кодує ZFP, який містить один або більше розпізнавальних спіральних ділянок, представлених у таблиці 1A, наприклад, ZFP, який містить розпізнавальні спіральні ділянки, упорядковані і представлені в одному ряді таблиці 1A. В іншому варіанті здійснення тут забезпечується ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, ZFP), який зв'язується із сайтом-мішеню, представленим у таблиці 1B, або полінуклеотид, який кодує ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, ZFP), який зв'язується із сайтом-мішеню, представленим у таблиці 1B. Сайти-мішені Описувані способи і композиції включають складені білки, які включають ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, ZFP) і регуляторний домен або розщеплюючий (наприклад, нуклеазний) домен (або півдомену для розщеплення), у яких ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, домен "цинкові пальці"), при зв'язуванні із послідовністю в хроматині клітини в одному або більше генів MDH, спрямовує активність регулюючого транскрипцію домену або розщеплюючого домену (або півдомену для розщеплення) навколо послідовності і тому модулює транскрипцію або індукує розщеплення поблизу послідовності-мішені. 18 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як викладено в цьому описі в іншому місці, можна сконструювати ДНК-зв'язувальний домен, такий як домен "цинкові пальці", який зв'язується фактично із будь-якою бажаною послідовністю. Відповідно, після ідентифікації ділянки, яка становить інтерес, яка містить послідовність, у (для) якої бажані регуляція гена, розщеплення або рекомбінація, можна сконструювати один або більше зв'язувальних доменів "цинкові пальці", які зв'язуються із однією або більше послідовностями в ділянці, яка становить інтерес. У деяких варіантах здійснення ZFP, описувані тут, зв'язуються із сайтом-мішеню, продемонстрованим у таблиці 1B. Вибір сайту-мішені в геномній ділянці, яка становить інтерес, у хроматині клітини будь-якого гена MDH для зв'язування ДНК-зв'язувального домену (наприклад, сайту-мішені) може бути здійснений, наприклад, згідно із способами, описаними в патенті США № 6453242 і/або публікаціях заявок на патенти США №№ 20110239315, 20110145940 і 20110301073, у яких також описані способи розробки ZFP, які зв'язуються із вибраною послідовністю. Кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям буде зрозуміло, що проста візуальна перевірка нуклеотидної послідовності може також використовуватися для відбору сайту-мішені. Відповідно, будь-який спосіб відбору сайту-мішені може використовуватися в заявлених способах. Сайти-мішені, як правило, складаються із множини розташованих поруч підсайтів-мішеней. Підсайт-мішень стосується послідовності (звичайно або триплету нуклеотидів, або квадруплету нуклеотидів, який може перекриватися по одному нуклеотиду із розташованим поряд квадруплетом), яка зв'язується окремим цинковим пальцем. Див., наприклад, WO 02/077227. Якщо ланцюг, із яким білок із цинковими пальцями в основному контактує, із так званим ланцюгом-мішеню, "основним ланцюгом розпізнавання" або "основним ланцюгом для здійснення контактів", деякі білки із цинковими пальцями зв'язуються із триосновним триплетом у ланцюзі-мішені і четвертою основою, яка не є мішеню ланцюга. У випадку білків із цинковими пальцями довжина сайту-мішені, як правило, складає принаймні 9 нуклеотидів, і, відповідно, він зв'язується зв'язувальним доменом "цинкові пальці", який включає принаймні три цинкові пальці. Однак також можливе зв'язування, наприклад, зв'язувального домену, який включає 4 пальці, із 12-нуклеотидним сайтом-мішеню, зв'язувального домену, який включає 5 пальців, із 15-нуклеотидним сайтом-мішеню або зв'язувального домену, який включає 6 пальців, із 18нуклеотидним сайтом-мішеню. Як це і очевидно, також можливе зв'язування більших зв'язувальних доменів (наприклад, які включають 7, 8, 9 пальців або більше) із довшими сайтами-мішенямі. Не потрібно, щоб сайт-мішень був множиною трьох нуклеотидів. Наприклад, у тих випадках, коли відбуваються взаємодії із перехрещуванням ланцюгів (див., наприклад, патент США № 6453242 і WO 02/077227), один або більше окремих цинкових пальців зв'язувального домену, який включає множину пальців, може зв'язуватися із підсайтами у вигляді квадруплетів, які перекриваються. У результаті, білок із трьома пальцями може зв'язуватися із 10-нуклеотидною послідовністю, у якій десятий нуклеотид є частиною квадруплета, який зв'язується кінцевим пальцем, білок із чотирма пальцями може зв'язуватися із 13-нуклеотидною послідовністю, у якій тринадцятий нуклеотид є частиною квадруплета, який зв'язується кінцевим пальцем, і т. д. Довжина і природа амінокислотних послідовностей-лінкерів між окремими цинковими пальцями в зв'язувальному домені, який включає множину пальців, також впливає на зв'язування із послідовністю-мішеню. Наприклад, присутність так званого "неканонічного" лінкера, "довгого лінкера" або "структурованого лінкера" між сусідніми цинковими пальцями в зв'язувальному домені, який включає множину пальців, може дозволити цим пальцям зв'язуватися із підсайтами, які не є безпосередньо прилеглими. Необмежуючі приклади таких лінкерів описані, наприклад, у патенті США № 6479626 і WO 01/53480. Відповідно, один або більше підсайтів, у сайті-мішені для зв'язувального домену "цинкові пальці", можуть бути відділені один від одного 1, 2, 3, 4, 5 або більше нуклеотидами. Для надання усього тільки одного приклада, зв'язувальний домен, який включає чотири пальці, може зв'язуватися із 13нуклеотидним сайтом-мішеню, який включає, один за одним, два розташованих поруч 3нуклеотидних підсайти, проміжний нуклеотид і два розташованих поруч підсайти у вигляді триплетів. Див. також публікацію заявки на патент США № 20090305419 заради складів і способів з'єднання штучних нуклеаз, які зв'язуються із сайтами-мішенями, розділеними різною кількістю нуклеотидів. Відстань між послідовностями (наприклад, сайтами-мішенями) стосується кількості нуклеотидів або пар нуклеотидів, які знаходяться між двома послідовностями, яку визначають від країв послідовностей, найближчих один до одного. У деяких варіантах здійснення створюють ZFP із функцією фактора транскрипції, наприклад, за допомогою конструювання складених білків, які включають ZFP і регулюючий транскрипцію домен (наприклад, домен для активації або репресії). Необмежуючі приклади придатних 19 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 регулюючих транскрипцію доменів, які можна об'єднати із ДНК-зв'язувальними доменами для модуляції експресії гена, описані, наприклад, у патентах США №№ 6534261, 6824978, 6933113 і 8399218 і публікації заявки на патент № 20080182332. Для функціонування фактора транскрипції, просте зв'язування і достатня близькість до промотору - це усе, що звичайно потрібно. Точне розташування відносно промотору, орієнтація і, у визначених межах, відстань не мають великого значення. Ця особливість робить можливою значну гнучкість при виборі сайтів-мішеней для конструювання штучних факторів транскрипції. Тому, сайтом-мішеню, який розпізнається ZFP, може бути будь-який придатний сайт у гені-мішені, який робить можливою активацію або пригнічення експресії гена за допомогою ZFP, необов'язково зв'язаного із регуляторним доменом. Переважні сайти-мішені включають ділянки, які примикають до, які знаходяться 3' або 5' від сайту(у) початку транскрипції. Крім того, сайтами-мішенями можуть бути сайти-мішені, які розташовані в енхансерних районах, сайтах-репресорах, місцях припинення роботи РНК-полімерази і специфічних регуляторних сайтах (наприклад, сайтах для SP-1, чутливих до гіпоксії елементах, елементах, які розпізнаються ядерними рецепторами, сайтах зв'язування р53), сайтах в кодуючій області кДНК або в кодуючій маркер експресованій послідовності (EST) області. В інших варіантах здійснення створюють нуклеази, наприклад ZFN і/або TALEN. Експресія нуклеази, яка включає складений білок, який включає ДНК-зв'язувальний домен і розщеплюючий домен (або двох складених білків, кожний із який включає зв'язувальний домен "цинкові пальці" і півдомену для розщеплення), у клітині викликає розщеплення поблизу послідовності-мішені. У деяких варіантах здійснення розщеплення залежить від зв'язування двох складених молекул домен "цинкові пальці"/півдомену для розщеплення з окремими сайтами-мішенями. Два сайти-мішені можуть знаходитися на протилежних ланцюгах ДНК, або, альтернативно, обидва сайти-мішені можуть знаходитися на одному і тому ж ланцюзі ДНК. Регуляція експресії генів Ряд аналізів може використовуватися для визначення того, чи модулює ДНК-зв'язувальний білок, такий як ZFP, експресію гена. Активність конкретного білка можна оцінити, використовуючи множину in vitro і in vivo аналізів, за допомогою визначення, наприклад, рівнів білка або мРНК, рівнів продуктів, ферментативної активності, активації або репресії транскрипції гена-репортера, використовуючи, наприклад, імуноаналізи (наприклад, ELISA і імуногістохімічні аналізи із використанням антитіл), гібридизаційні аналізи (наприклад, захист від РНКази, Нозерн-блотинг, in situ гібридизацію, дослідження із використанням ранжированого ряду олігонуклеотидів), колориметричні аналізи, аналізи ампліфікації, аналізи ферментативної активності, фенотипічні дослідження і т. п. Активність ДНК-зв'язувальних білків типово спочатку перевіряють in vitro, використовуючи аналізи ELISA, а потім використовуючи дріжджову експресійну систему. Наприклад, ZFP часто спочатку перевіряють, використовуючи систему для транзиторної експресії із використанням гена-репортера, а потім перевіряють регуляцію ендогенного гена-мішені в клітинах або у цілих рослинах як in vivo, так і ex vivo. ДНК-зв'язувальний білок можна рекомбінантно експресувати у клітині, рекомбінантно експресувати у клітинах, трансплантованих у рослину, або рекомбінантно експресувати у трансгеній рослині, а також ввести у вигляді білка в рослину або клітину, використовуючи засоби для доставки, описані нижче. Клітини можуть бути імобілізованими, знаходитися у розчині, бути підданими введенню в рослину або бути такими, що зустрічаються в природі, в трансгенній або нетрансгенній рослині. Модуляцію експресії гена перевіряють, використовуючи один із in vitro або in vivo аналізів, описаних тут. Зразки або проби обробляють ДНК-зв'язувальним білком (наприклад, ZFP) і порівнюють із контрольними зразками без досліджуваної сполуки для дослідження ступеня модуляції. Для регуляції експресії ендогенного гена ДНК-зв'язувальний білок типово характеризується Kd, яка складає 200 нМ або менше, більш переважно 100 нМ або менше, більш переважно 50 нМ, найпереважніше 25 нМ або менше. Ефекти зв'язувальних білків можна визначити, досліджуючи будь-який із параметрів, описаних вище. Експресія будь-якого придатного гена, фенотипічна або фізіологічна зміна може використовуватися для оцінки впливу ДНК-зв'язувального білка (наприклад, ZFP). При визначенні функціональних наслідків, використовуючи вихідні клітини або рослини, можна також визначити ряд ефектів, таких як ріст рослин, зміни транскрипції і відомих, і не охарактеризованих генетичних маркерів (наприклад, за допомогою Нозерн-блотів або досліджень із використанням ранжированого ряду олігонуклеотидів), зміни клітинного метаболізму, такі як зміни росту клітин або pН, і зміни внутрішньоклітинних вторинних месенджерів, таких як cGMP. 20 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважні дослідження регуляції експресії ендогенного гена можуть виконуватися in vitro. В одному переважному форматі in vitro дослідження регуляцію за допомогою ZFP експресії ендогенного гена в культивованих клітинах визначають, досліджуючи продукцію білка із використанням аналізу ELISA. Досліджуваний зразок порівнюють із контрольними клітинами, підданими обробці порожнім вектором або неспорідненим ZFP, мішеню якого є інший ген. В іншому варіанті здійснення регуляцію експресії ендогенного гена визначають in vitro за допомогою вимірювання рівня експресії мРНК із гена-мішені. Рівень експресії гена вимірюють, використовуючи ампліфікацію, наприклад, із використанням ПЛР (такої як ПЛР у режимі реального часу), LCR або гібридизаційні дослідження, наприклад, Нозерн-гібридизацію, захист від РНКази, дот-блотинг. В одному варіанті здійснення використовують захист від РНКази. Рівень білка або мРНК визначають, використовуючи прямо або непрямо мічені агенти для виявлення, наприклад, флуоресцентно або радіоактивно мічені нуклеїнові кислоти, радіоактивно або ферментативно мічені антитіла і т. п., як описано тут. Альтернативно, система із використанням гена-репортера може бути розроблена, використовуючи промотор гена-мішені, функціонально зв'язаний із геном-репортером, таким як люцифераза, зелений флуоресцентний білок, CAT або β-gal. Конструкцію репортера типово спільно трансфікують у культивовані клітини. Після обробки переважним ДНК-зв'язувальним білком (наприклад, ZFP) величину транскрипції із гена-репортера, трансляції або його активності вимірюють відповідно до стандартних методів, відомих кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям. Трансгенні і нетрансгенні рослини також використовуються як переважний варіант здійснення для дослідження регуляції експресії ендогенного гена in vivo. Трансгенні рослини можуть стійко експресувати переважний ДНК-зв'язувальний білок (наприклад, ZFP). Альтернативно, можуть використовуватися рослини, які транзиторно експресують переважний ZFP, або в які ZFP був введений у носії для доставки. Регуляцію експресії ендогенного гена перевіряють, використовуючи будь-який із описаних тут аналізів. Способи спрямованого розщеплення Описувані способи і композиції можуть використовуватися для розщеплення ДНК у ділянці, яка становить інтерес, у хроматині клітини (наприклад, у бажаному або заданому сайті в геномі, наприклад, у гені MDH або поблизу нього). Для такого спрямованого розщеплення ДНК конструюють ДНК-зв'язувальний домен, такий як зв'язувальних домен "цинкові пальці", який зв'язується із сайтом-мішеню в заданому сайті розщеплення або поблизу нього, і складений білок, який включає сконструйований ДНК-зв'язувальний домен і розщеплюючий домен, вводять у клітину і/або експресують із полінуклеотиду в клітині. Після зв'язування частини "цинкові пальці" складеного білка із сайтом-мішеню ДНК розщеплюється поблизу сайту-мішені розщеплюючим доменом. Альтернативно, два складених білки, кожний із яких включає зв'язувальний домен "цинкові пальці" і півдомену для розщеплення, експресують у клітини, і вони зв'язуються із сайтамимішенями, які розміщені поряд таким чином, що відтворюється функціональний розщеплюючий домен, і ДНК розщеплюється поблизу сайтів-мішеней. В одному варіанті здійснення розщеплення відбувається між сайтами-мішенями двох зв'язувальних доменів "цинкові пальці". Один або обидва зв'язувальних домени "цинкові пальці" можуть бути сконструйованими. Для спрямованого розщеплення, використовуючи складений поліпептид зв'язувальний домен "цинкові пальці"-розщеплюючий домен, сайт зв'язування може охоплювати сайт розщеплення, або ближній край сайту зв'язування може знаходитися на відстані 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25, 50 або більше нуклеотидів (або будь-якого цілого значення між 1 і 50 нуклеотидами) від сайту розщеплення. Точне місце розташування сайту зв'язування, стосовно сайту розщеплення, буде залежати від конкретного розщеплюючого домену і довжини ZC лінкера. У випадку способів, у яких використовуються два складених білки, кожний із яких включає зв'язувальний домен "цинкові пальці" і півдомену для розщеплення, сайти зв'язування, як правило, знаходяться по обох сторонах сайту розщеплення. Таким чином, ближній край першого сайту зв'язування може знаходитися на відстані 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 або більше нуклеотидів (або будь-якого цілого значення між 1 і 50 нуклеотидами) із однієї сторони сайту розщеплення, а ближній край другого сайту зв'язування може знаходитися на відстані 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 або більше нуклеотидів (або будь-якого цілого значення між 1 і 50 нуклеотидами) із іншої сторони сайту розщеплення. Способи картування сайтів розщеплення in vitro і in vivo відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям. Таким чином, в описуваних тут способах може використовуватися сконструйований домен "цинкові пальці", об'єднаний із розщеплюючим доменом. У цих випадках конструюють зв'язувальний домен, який зв'язується із послідовністю-мішеню, у сайті або поблизу сайту, у 21 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 якому бажане розщеплення. Складений білок, або кодуючий його полінуклеотид, вводять у клітину рослини. Після введення у клітину, або експресії в ній, складений білок зв'язується із послідовністю-мішеню і здійснює розщеплення в послідовності-мішені або поблизу неї. Точний сайт розщеплення залежить від природи розщеплюючого домену і/або присутності і/або природи послідовностей-лінкерів між зв'язувальним і розщеплюючим доменами. У тих випадках, коли використовуються два складених білки, кожний із яких включає півдомену для розщеплення, відстань між ближніми краями сайтів зв'язування може складати 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25 або більше нуклеотидів (або будь-яке ціле значення між 1 і 50 нуклеотидами). Оптимальні рівні розщеплення можуть також залежати і від відстані між сайтами зв'язування двох складених білків (див., наприклад, Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 3361-3369; Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21: 289-297), і від довжини ZC лінкера в кожному складеному білку. Див. також патент США № 7888121, публікацію заявки на патент США № 20050064474 і публікації міжнародних заявок на патенти WO05/084190, WO05/014791 і WO03/080809. У деяких варіантах здійснення розщеплюючий домен включає дві половини домену для розщеплення, обидві із яких є частиною одного поліпептиду, який включає зв'язувальний домен, першу половину домену для розщеплення і другу половину домену для розщеплення. Половини домену для розщеплення можуть мати однакову амінокислотну послідовність або різні амінокислотні послідовності за умови, що вони функціонують із розщепленням ДНК. Половини домену для розщеплення можуть бути також забезпечені в окремих молекулах. Наприклад, два складених білки можуть вводитися в клітину, причому кожен поліпептид включає зв'язувальний домен і півдомену для розщеплення. Половини домену для розщеплення можуть мати однакову амінокислотну послідовність або різні амінокислотні послідовності за умови, що вони функціонують із розщепленням ДНК. Крім того, зв'язувальні домени зв'язуються із послідовностями-мішенями, які типово розташовані таким чином, що, після зв'язування складених поліпептидів, дві половини домену для розщеплення представлені в просторовій орієнтації одна відносно одної, що уможливлює відтворення розщеплюючого домену (наприклад, у результаті димеризації половин домену), таким чином, дві половини домену розташовуються одна відносно одної з утворенням функціонального розщеплюючого домену, який приводить до розщеплення хроматину клітини у ділянці, яка становить інтерес. Як правило, розщеплення відтвореним розщеплюючим доменом відбувається в сайті, який розташований між двома послідовностями-мішенями. Можна сконструювати один або обидва білки, які зв'язуються із своїм сайтом-мішеню. Два складені білки можуть зв'язуватися в ділянці, яка становить інтерес, у тому самому напрямку або в протилежних напрямках, і сайти їх зв'язування (тобто сайти-мішені) можуть бути розділені будь-якою кількістю нуклеотидів, наприклад, від 0 до 200 нуклеотидів або будь-яким цілим числом між ними. У деяких варіантах здійснення сайти зв'язування для двох складених білків, кожний із яких включає зв'язувальний домен "цинкові пальці" і півдомену для розщеплення, можуть знаходитися на відстані 5-18 нуклеотидів, наприклад, на відстані 5-8 нуклеотидів, або на відстані 15-18 нуклеотидів, або на відстані 6 нуклеотидів, або на відстані 16 нуклеотидів, яку вимірюють від краю кожного сайту зв'язування, найближчого до іншого сайту зв'язування, і розщеплення відбувається між сайтами зв'язування. Сайт, у якому розщеплюється ДНК, як правило, знаходиться між сайтами зв'язування для двох складених білків. Дволанцюговий розрив ДНК часто є результатом двох одноланцюгових розривів або "ніків", зсунутих на 1, 2, 3, 4, 5, 6 або більше нуклеотидів (наприклад, розщеплення дволанцюгової ДНК природної FokІ є результатом одноланцюгових розривів, зсунутих на 4 нуклеотиди). Таким чином, розщеплення не відбувається обов'язково в точно протилежних сайтах у кожному ланцюзі ДНК. Крім того, структура складених білків і відстань між сайтамимішенями може впливати на те, чи відбувається розщеплення біля однієї пари нуклеотидів або чи відбувається розщеплення в декількох сайтах. Однак, у випадку багатьох застосувань, включаючи спрямовану рекомбінацію або спрямований мутагенез (див. нижче), розщеплення в заданому діапазоні нуклеотидів, як правило, є достатнім, і розщеплення між конкретними парами нуклеотидів не потрібне. Як відзначалося вище, описувані тут складені білки(ок) можна ввести у вигляді поліпептидів і/або полінуклеотидів. Наприклад, два полінуклеотиди, кожний із яких включає послідовності, які кодують один із вищезгаданих поліпептидів, можна ввести в клітину, і, коли поліпептиди експресуються і кожний із них зв'язується із своєю послідовністю-мішеню, відбувається розщеплення в послідовності-мішені або поблизу неї. Альтернативно, один полінуклеотид, який включає послідовності, які кодують обидва складених білки, вводять у клітину. Полінуклеотиди можуть являти собою ДНК, РНК або будь-які модифіковані форми або аналоги ДНК і/або РНК. 22 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для збільшення специфічності розщеплення додаткові композиції можуть також використовуватися в описуваних тут способах. Наприклад, взяті окремо половини доменів для розщеплення можуть демонструвати обмежену активність дволанцюгового розщеплення. У способах, у яких два складених білки, кожний із яких містить домен, який включає три цинкових пальці, і півдомену для розщеплення, вводять у клітину, кожний із білків визначає сайт-мішень, який складає приблизно 9 нуклеотидів. Хоча сукупна послідовність-мішень із 18 нуклеотидів, ймовірно, є унікальною в геномах ссавців і рослин, будь-який конкретний 9-нуклеотидний сайтмішень зустрічається, у середньому, приблизно 23000 разів у геномі людини. Таким чином, може мати місце неспецифічне розщеплення внаслідок сайт-специфічного зв'язування однієї половини домену. Відповідно, в описуваних тут способах передбачається використання домінантно-негативного мутанта половини домену для розщеплення, наприклад, FokІ (або кодуючої його нуклеїнової кислоти), який експресується в клітині разом із двома складеними білками. Домінантно-негативний мутант здатний до димеризації, але нездатний до розщеплення, і також блокує активність розщеплення половини домену, з яким він димеризується. При забезпеченні домінантно-негативного мутанта в надлишковій молярній кількості відносно складених білків тільки ділянки, у яких зв'язуються обидва складені білки, будуть характеризуватися досить високою локальною концентрацією функціонального розщеплюючого півдомену, щоб відбувалася димеризація і розщеплення. У сайтах, у яких зв'язується тільки один із двох складених білків, його половини домену для розщеплення утворюють димер із половиною домену домінантно-негативного мутанта, і небажане, неспецифічне розщеплення не відбувається. Експресійні вектори Нуклеїнову кислоту, яка кодує один або більше складених білків (наприклад, ZFN), описуваних тут, можна клонувати у вектор для трансформації прокаріотичних або еукаріотичних клітин для реплікації і/або експресії. Вектори можуть бути прокаріотичними векторами (наприклад, пдазмідами, або "човниковими" векторами, векторами комах) або еукаріотичними векторами. Нуклеїнову кислоту, яка кодує складений білок, можна також клонувати у експресійний вектор для введення в клітину. Для експресії складених білків (наприклад, ZFN) послідовності, які кодують складені білки, типово субклонують у експресійний вектор, який містить промотор, що керує транскрипцією. Придатні прокаріотичні і еукаріотичні промотори добре відомі в даній галузі техніки і описані, rd наприклад, у Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3 ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); і Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., вище). Бактеріальні експресійні системи для експресії білків застосовні, наприклад, у E. coli, Bacillus sp. і Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983)). Набори для таких експресійних систем є в продажу. Еукаріотичні експресійні системи для клітин ссавців, дріжджів і клітин комах добре відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям і також є в продажу. Промотор, який використовується для керування експресією кодуючої складений білок нуклеїнової кислоти, залежить від конкретного застосування. Наприклад, сильний конститутивний промотор, підібраний залежно від клітини-хазяїна, типово використовується для експресії і очищення складених білків. Навпаки, коли складений білок вводять in vivo для регуляції гена рослини (див. наведений нижче розділ "Доставка нуклеїнових кислот у клітини рослин"), або конститутивний, регульований (наприклад, під час розвитку, згідно із типом тканини або клітин або під дією навколишнього середовища), або індукований промотор використовується залежно від конкретного застосування складеного білка. Необмежуючі приклади промоторів рослин включають промоторні послідовності, які походять із гена убіквітину-3 (ubi-3) A. thaliana (Callis et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493); манопінсинтази (Δmas) A. tumifaciens (Petolino et al., патент США № 6730824); і/або вірусу мозаїки прожилок листків маніоки (CsVMV) (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31: 1129-1139). Див. також розділ "Приклади". Крім промотору, експресійний вектор типово містить транскрипційну одиницю або експресійну касету, яка містить усі додаткові елементи, необхідні для експресії нуклеїнової кислоти в клітинах-хазяїнах, або прокаріотичних, або еукаріотичних. Таким чином, типова експресійна касета містить промотор (який включає ділянки зв'язування рибосоми), функціонально зв'язаний, наприклад, із послідовністю нуклеїнової кислоти, яка кодує складений білок, і сигнали, необхідні, наприклад, для ефективного поліаденілювання транскрипта, термінації транскрипції або термінації трансляції. Додаткові елементи касети можуть включати, наприклад, енхансери, гетерологічні сигнали сплайсингу, послідовність 2A із вірусу Thosea asigna (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70: 8124-8127), і/або сигнал ядерної локалізації (NLS). 23 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Конкретний експресійний вектор, який використовується для перенесення генетичної інформації в клітину, вибирають, приймаючи до уваги передбачуване використання складених білків, наприклад, експресію у рослинах, тварин, бактеріях, грибах, найпростіших і т. д. (див. експресійні вектори, описані нижче). Стандартні вектора для експресії в бактеріях і клітинах тварин відомі в даній галузі техніки і описані докладно, наприклад, у публікації заявки на патент США № 20050064474A1 і публікаціях міжнародних заявок на патенти WO05/084190, WO05/014791 і WO03/080809. Стандартні методи трансфекції можуть використовуватися для отримання ліній бактеріальних клітин, клітин рослин, ссавців, дріжджів або комах, які експресують великі кількості білка, який можна потім очистити, використовуючи стандартні методи (див., наприклад, Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). Трансформацію еукаріотичних і прокаріотичних клітин виконують згідно із стандартними методами (див., наприклад, Morrison, J. Bact. 132: 349351 (1977); Clark-Curtiss. Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et al., eds., 1983)). Будь-яка із добре відомих процедур для введення чужорідних нуклеотидних послідовностей у такі клітини-хазяїни може використовуватися. Вони включають використання трансфекції із використанням кальцію фосфату, полібрену, злиття протопластів, електропорації, ультразвукових методів (наприклад, сонопорації), ліипосом, мікроін'єкції, "голої" ДНК, плазмідних векторів, вірусних векторів, трансформації із використанням Agrobacterium, трансформації із використанням карборунду (наприклад, WHISKERS), як епісомної, так і інтегративної, і будь-якого із інших добре відомих способів для введення клонованої геномної ДНК, кДНК, синтетичної ДНК або іншого чужорідного генетичного матеріалу в клітину-хазяїна (див., наприклад, Sambrook et al., вище). Лише необхідно, щоб конкретна використовувана процедура генетичної інженерії була здатна до успішного введення принаймні одного гена в клітину-хазяїна, здатну експресувати переважний білок. Доставка нуклеїнових кислот у клітини рослин Як відзначалося вище, ДНК-конструкції можна ввести в бажану клітину рослини (наприклад, у її геном) за допомогою множини традиційних методів. Для оглядів таких методів див., наприклад, Weissbach. Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463; і Grierson. Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9. Див. також публікації заявок на патенти США №№ 20090205083; 20100199389; 20110167521 і 20110189775, які включені сюди за допомогою посилання в їх повному обсязі. Наприклад, ДНК-конструкцію можна ввести безпосередньо у геномну ДНК клітини рослини, використовуючи такі методи, як електропорація і мікроін'єкція в протопласти клітин рослини, або ДНК-конструкції можна ввести безпосередньо в тканину рослини, використовуючи методи балістичної трансфекції, такі як бомбардування частинками ДНК (див., наприклад, Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73). Альтернативно, ДНК-конструкцію можна ввести в клітину рослини за допомогою трансформації із використанням наночастинок (див., наприклад, публікацію заявки на патент США № 20090104700, яка включена сюди за допомогою посилання в її повному обсязі). Альтернативно, ДНК-конструкції можна об'єднати із придатними пограничними районами Т-ДНК/фланкуючими її районами і ввести у вектор звичайного хазяїна Agrobacterium tumefaciens. Методи трансформації із використанням Agrobacterium tumefaciens, зокрема нейтралізація онкогенів і розробка і застосування бінарних векторів, повністю описані в науковій літературі. Див., наприклад, Horsch et al. (1984) Science 233: 496-498, і Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803. Крім того, перенесення генів можна досягнути, використовуючи не стосовні до Agrobacterium бактерії або віруси, такі як Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, картопляний вірус X, вірус мозаїки цвітної капусти і вірус мозаїки прожилок листків маніоки, і/або вірус мозаїки тютюну. Див., наприклад, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1): 1-4. Зв'язані із вірулентністю функції хазяїна Agrobacterium tumefaciens будуть пропонувати вставку T-ланцюга, який містить конструкцію і розташований поряд маркер, у ДНК клітинихазяїна при інфікуванні клітини бактеріями, використовуючи бінарний Т-ДНК-вектор (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12: 8711-8721) або процедури співкультивування (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231). Як правило, система для трансформації із використанням Agrobacterium використовується для створення дводольних рослин (Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16: 357-384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118: 627-641). Система для трансформації із використанням Agrobacterium може також використовуватися для трансформації, а також перенесення, ДНК в однодольні рослини і клітини рослин. Див. патент США № 5591616; Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3: 3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al. 24 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (1984) Nature 311: 763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325: 1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 31-40; і Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95: 426-434. Альтернативні методи перенесення генів і трансформації включають, але без обмеження, трансформацію протопластів через поглинання "голої ДНК", опосередковане кальцієм, поліетиленгліколем (ПЕГ) або електропорацією (див. Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3: 27172722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; і Shimamoto (1989) Nature 338: 274-276), і електропорацію тканин рослин (D'Hаlluіn et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505). Додаткові методи трансформації клітин тм рослин включають мікроін'єкцію, опосередковану карборундом (наприклад, WHISKERS поглинання ДНК (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9: 415-418), і бомбардування мікрочастинками (див. Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309; і Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603-618). Описувані способи і композиції можуть використовуватися для вставки екзогенних послідовностей у ген MDH. Вони застосовні, оскільки експресія введеного трансгена в геном рослини залежить критично від сайту інтеграції. Відповідно, гени, які кодують, наприклад, стійкість до гербіциду, стійкість до комах, поживні речовини, антибіотики або терапевтичні молекули, можуть бути вставлені за допомогою спрямованої рекомбінації у ділянках геному рослин, які придатні для їх експресії. Трансформовані клітини рослин, які отримують за допомогою будь-якого із вищезгаданих методів трансформації, можна піддати культивуванню для регенерації цілої рослини, яка має змінений генотип і, відповідно, бажаний фенотип. Такі методи регенерації основані на обробці визначеними фітогормонами у середовищі для росту культури тканин, типово спираючи на маркер стійкості до біоциду і/або гербіциду, який був введений разом із бажаними нуклеотидними послідовностями. Регенерація рослин із культивованих протопластів описана в Evans et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; і Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Регенерації можна також досягти, виходячи із калусу, експлантів, органів, пилку, зав'язей або частин рослини. Такі методи регенерації описані в загальному в Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486. Нуклеїнові кислоти, які вводяться в клітину рослини, можуть використовуватися для надавання бажаних особливостей, по суті, будь-якій рослині. Широкий ряд рослин і систем клітин рослин можна створити заради бажаних фізіологічних і агрономічних характеристик, описуваних тут, використовуючи НК-конструкції даного опису і різні вищезгадані методи трансформації. У переважних варіантах здійснення, які є мішенями для інженерії рослини або клітини рослин включають, але без обмеження, однодольні і дводольні рослини, такі як культури, зокрема зернові культури (наприклад, пшениця, кукурудза, рис, просо, ячмінь), плодові культури (наприклад, помідор, яблуня, грушеве дерево, полуниця, апельсинове дерево), фуражні культури (наприклад, люцерна), коренеплоди (наприклад, морква, картопля, цукровий буряк, ямс), листкові овочі (наприклад, салат-латук, шпинат); квіткові рослини (наприклад, петунія, троянда, хризантема), хвойні дерева і сосни (наприклад, сосна, ялина); рослини, які використовують у фіторемедіації (наприклад, рослини, які накопичують важкі метали); олійні культури (наприклад, соняшник, насіння рапсу) і рослини, які використовують для експериментальних цілей (наприклад, Arabidopsis). Таким чином, описувані способи і композиції мають застосування в межах широкого ряду рослин, які включають, але без обмеження, види із родів Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Erigeron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Phaseolus, Pisum, Pyras, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna і Zea. Введення нуклеїнових кислот, які вводяться в клітину рослини, може використовуватися для надавання бажаних особливостей, по суті, будь-якій рослині. У деяких варіантах здійснення зміна експресії/функції MDH у клітинах рослин приводить до рослин, які характеризуються збільшеною величиною врожаю плодів, які мають збільшену біомасу рослини (або плода рослини), більший вміст м'якоті плода, концентроване зав'язування плода, що є рослинами більшого розміру, що має збільшену сиру масу, збільшену суху масу, збільшений твердий вміст, вищу загальну масу при зборі врожаю, збільшену інтенсивність і/або однорідність кольору культури, змінені хімічні характеристики (наприклад, які стосуються олій, жирних кислот, вуглеводів, білків) і т. д. Кваліфікований у даній галузі техніки фахівець визнає, що екзогенну послідовність можна тимчасово включити в клітину рослини. Для включення екзогенної полінуклеотидної послідовності може використовуватися клітинний апарат клітини рослини, у яку введена 25 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність. Експресію екзогенної полінуклеотидної послідовності, яка включає ZFN, яка тимчасово включена в клітину рослини, можна досліджувати за допомогою аналізу геномної ДНК послідовності-мішені для ідентифікації і визначення вставок або делецій, інверсій або вставок. Ці типи реаранжування є наслідком розщеплення сайту-мішені у послідовності геномної ДНК і наступної репарації ДНК. Крім того, експресію екзогенної полінуклеотидної послідовності можна досліджувати, використовуючи способи, які дозволяють перевірити експресію гена-маркера, відомі фахівцям із середнім рівнем компетентності у даній галузі техніки. Про транзиторну експресію генів-маркерів повідомлялося при використанні ряду рослин, тканин і систем доставки ДНК. Системи аналізів транзиторної експресії включають, але без обмеження, пряму доставку гена за допомогою електропорації або бомбардування частинками тканин у будь-якому аналізі транзиторної експресії в рослині, використовуючи будьякий вид рослин, який становить інтерес. Такі системи для транзиторної експресії будуть включати, але без обмеження, електропорацію в протопласти клітин із ряду джерел тканин або бомбардування частинками конкретних тканин, які становлять інтерес. Даний опис охоплює використання будь-якої транзиторної експресійної системи для оцінки сайт-специфічної ендонуклеази (наприклад, ZFN) і для введення мутацій у ген MDH-мішень. Приклади тканин рослин, передбачених для перевірки при транзиторних експресіях за допомогою відповідної системи доставки, будуть включати, але без обмеження, основні тканини листка, калус, сім'ядолі, корені, ендосперм, зав'язі, тканину квітки, пилок і епідермальну тканину. Кваліфікований у даній галузі техніки фахівець визнає, що екзогенну полінуклеотидну послідовність можна міцно включити в трансгені рослини. Після підтвердження того, що екзогенна полінуклеотидна послідовність є функціонуючою, її можна ввести в інші рослини за допомогою статевого схрещування. Може використовуватися будь-який із ряду стандартних методів селекції, залежно від схрещуваного виду. Трансформовану клітину, калус, тканину рослини або рослину можна ідентифікувати й ізолювати за допомогою відбору або скринінгу створеного рослинного матеріалу відносно ознак, кодованих генами-маркерами, які є присутніми у ДНК, що трансформується. Наприклад, можна виконати відбір за допомогою вирощування створеного рослинного матеріалу на середовищах, які містять інгібіторні кількості антибіотика або гербіциду, до якого генна конструкція, що трансформується, надає стійкості. Крім того, трансформовані рослини і клітини рослин можна також ідентифікувати за допомогою скринінгу на предмет активностей будь-яких генів візуальних маркерів (наприклад, генів β-глюкуронідази, люциферази, B або C1), які можуть бути присутніми у рекомбінантних НК-конструкціях. Методології такого відбору і скринінгу добре відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям. Фізичні і біохімічні методи також можуть використовуватися для ідентифікації трансформованих рослин або клітин рослин, які містять міцно вставлені генні конструкції, або клітини рослини, які містить змінену геномну ДНК гена-мішені, яка є наслідком транзиторної експресії сайт-специфічної ендонуклеази (наприклад, ZFN). Ці способи включають, але без обмеження: 1) аналіз за Саузерном або ампліфікацію із використанням ПЛР для виявлення і визначення структури вставки рекомбінантної ДНК; 2) Нозерн-блот, захист від РНКази S1, подовження праймера або ампліфікацію за допомогою ПЛР із використанням зворотної транскриптази для виявлення і дослідження РНК-транскриптів із генних конструкцій; 3) ферментативні аналізи для виявлення ферментативної або рибозимної активності, коли такі продукти генів кодуються генною конструкцією; 4) гель-електрофорез білків, методи Вестернблотинга, імунопреципітацію або імуноферментний твердофазний аналіз (ELISA), коли продуктами генних конструкцій є білки. Додаткові методи, такі як in situ гібридизація, забарвлювання із використанням ферментів і імунозабарвлювання, також можуть використовуватися для виявлення присутності або експресії рекомбінантної конструкції у конкретних органах і тканинах рослин. Способи проведення всіх цих аналізів добре відомі кваліфікованим фахівцям у даній галузі техніки. Ефекти маніпуляції генами, використовуючи описувані тут способи, можна спостерігати із використанням, наприклад, Нозерн-блотів РНК (наприклад, мРНК), виділеної із тканин, які становлять інтерес. Типово, якщо мРНК є присутньою або кількість мРНК збільшилася, можна припустити, що відповідний трансген експресується. Інші способи вимірювання активності гена і/або кодованого поліпептиду можуть використовуватися. Різні типи ферментативних аналізів можуть використовуватися залежно від використовуваного субстрату і способу виявлення збільшення або зменшення продукту реакції або побічного продукту. Крім того, рівні експресованого поліпептиду можна вимірити імунохімічно, тобто за допомогою ELISA, RIA, EIA і інших аналізів на основі антитіл, добре відомих кваліфікованим фахівцям в даній галузі техніки, наприклад, за допомогою електрофоретичних способів виявлення (із використанням або 26 UA 115875 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забарвлювання, або Вестерн-блотинга). Як одного необмежуючого приклада, виявлення білків AAD-1 і PAT, використовуючи аналіз ELISA, описано в публікації заявки на патент США № 20090093366, яка у такий спосіб включена за допомогою посилання в її повному обсязі. Трансген можна вибірково експресувати у деяких тканинах рослини або на деяких стадіях розвитку, або трансген можна експресувати, по суті, у всіх тканинах рослини, по суті, протягом усього життєвого циклу. Однак також застосовний будь-який комбінаторний спосіб експресії. Даним описом також охоплюються насіння трансгенних рослин, описаних вище, причому насіння містить трансген або генну конструкцію. Даним описом, крім того, охоплюється потомство, клони, лінії клітин або клітини трансгенних рослин, описаних вище, причому зазначене потомство, клони, лінія клітин або клітина містять трансген або генну конструкцію. Складені білки (наприклад, ZFN) і експресійні вектори, які кодують складені білки, можуть вводитися безпосередньо в рослину для регуляції генів, спрямованого розщеплення і/або рекомбінації. У деяких варіантах здійснення рослина містить множину паралогічних генів MDHмішеней. Таким чином, один або більше різних складених білків або експресійних векторів, які кодують складені білки, можуть вводитися в рослини, щоб впливати на один або більше із цих паралогічних генів у рослині. Введення ефективних кількостей здійснюють за допомогою будь-якого із способів, звичайно використовуваних для приведення складених білків у максимальний контакт із клітиною рослини, яка піддається обробці. ZFP уводять будь-яким придатним способом, переважно із використанням прийнятних носіїв. Придатні способи введення таких модуляторів є в розпорядженні і добре відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям, і, хоча більше ніж один спосіб може використовуватися для введення конкретної композиції, конкретний спосіб може часто забезпечити негайну і ефективнішу реакцію, ніж інший спосіб. Носії можуть також використовуватися і визначаються почасти конкретною композицією, що вводиться, а також конкретним способом, який використовується для введення композиції. Відповідно, існує широкий ряд придатних препаратів носіїв, які є у розпорядженні. Приклади Приклад 1: Характеристика гена-мішені мітохондріальної малатдегідрогенази (mMDH) із помідора (Solanum lycopersicum) Ген малатдегідрогенази (MDH) звичайно є присутнім у вигляді множини паралогічних копій в організмі. Незважаючи на присутність схожих паралогічних послідовностей генів малатдегідрогенази в організмі, одна послідовність гена мітохондріальної малатдегідрогенази (mMDH) була ідентифікована і виділена із Solarium lycopersicum. На початку послідовність гена мітохондріальної малатдегідрогенази (mMDH) була ідентифікована, виходячи із декількох баз даних, які стосуються послідовностей полінуклеотидів, за допомогою порівняння частин послідовностей відомих генів малатдегідрогенази, які були описані в літературі, із множиною різних полінуклеотидних послідовностей, які містяться в базах даних, що стосуються послідовностей полінуклеотидів. Після численних порівнянь суміщень послідовностей були ідентифіковані повні послідовності двох різних генів малатдегідрогенази: послідовність mMDH (описана нижче) і послідовність глікосомальної MDH (gMDH) (ідентифікаційний номер: AY725476). Спроби скринувати бази даних, які стосуються послідовностей, привели до ідентифікації локусу mMDH у вигляді ідентифікаційного номера: Solyc07g062650 (SEQ ID NO: 1) у базі даних, які стосуються геномних послідовностей помідора, доступної в Інтернеті в Solgenomics (див. також Bombarely et al. (2011) Nuc Acids Res. (Database issue): D1149-55). Послідовність гена mMDH, ідентифіковану за допомогою віртуального скринінгу, використовували для підтвердження послідовності гена mMDH із двох різних генотипів помідора, M82 і Moneymaker. Праймери для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) були розроблені на основі ідентифікованої за допомогою віртуального скринінгу послідовності гена mMDH. Фрагмент, ампліфікований за допомогою ПЛР, розміром приблизно 6 т. п. о. був виділений із кожного генотипу помідора, клонований і секвенований. Неочікувано, оскільки незначні розходження звичайно очікуються, секвеновані гени mMDH із генотипів помідора не продемонстрували розходження із локусом mMDH, який був спочатку ідентифікований і виділений у результаті віртуального скринінгу. Виділені нові послідовності гена mMDH були використані для подальшої розробки реагенту "цинкові пальці". Приклад 2: Отримання білків із цинковими пальцями, призначених для зв'язування із геном мітохондріальної малатдегідрогенази (mMDH) Білки із цинковими пальцями, спрямовані проти послідовностей ДНК, які кодують різні функціональні домени, в кодуючій області гена mMDH S. lycopersicum v. M82 mMDH, (див. Фіг. 1) були розроблені, як описувалося раніше. Див., наприклад, Urnov et al. (2005) Nature 435: 646 27 UA 115875 C2 5 651. Послідовність-мішень і розпізнавальні спіральні ділянки, які приводяться як приклад, продемонстровані в таблиці 1A (конструкції розпізнавальних спіральних ділянок) і таблиці 1B (сайти-мішені). У таблиці 1B нуклеотиди в сайті-мішені, з якими контактують розпізнавальні спіральні ділянки ZFP, позначені із використанням великих літер; неконтактуючі нуклеотиди позначені із використанням малих літер. Таблиця 1A Конструкції, які зв'язуються із mMDH помідора цинкових пальців ZFN Номер/ Субоди Палець 1 (F1) ниця RSDDLSE 107830R/ (SEQ ID 28492 NO:11) QSSDLSR 107830L/ (SEQ ID 28491 NO:17) RSDTLSV 107832R/ (SEQ ID 28536 NO:23) RSDNLAR 107832L/ (SEQ ID 28535 NO:29) DRSNLSR 107833R/ (SEQ ID 28550 NO:32) QSGNLAR 107833L/ (SEQ ID 28549 NO:40) DRSDLSR 107835R/ (SEQ ID 28564 NO:46) DRSNLSR 107835L/ (SEQ ID 28563 NO:32) Палець 2 (F2) Палець 3 (F3) TNSNRKR (SEQ ID NO:12) TSGNLTR (SEQ ID NO:18) DNSTRIK (SEQ ID NO:24) QRGNRNT (SEQ ID NO:30) LRQNLIM (SEQ ID NO:35) SEQ ID NO:41 NRYDLHK QAGNLKK (SEQ ID NO:47) LKQHLTR (SEQ ID NO:52) RSDHLST (SEQ ID NO:13) RSDYLSK (SEQ ID NO:19) RSDHLSE (SEQ ID NO:25) DSSDRKK (SEQ ID NO:31) RSDALSE (SEQ ID NO:36) DRSNLSR (SEQ ID NO:32) QSGSLTR (SEQ ID NO:48) QSSDLSR (SEQ ID NO:17) Палець 4 (F4) Палець 5 (F5) Палець 6 (F6) TNSNRIT (SEQ ID NO:14) TSSVRTT (SEQ ID NO:20) TSGSLTR (SEQ ID NO:26) DRSNLSR (SEQ ID NO:32) RSSTRKT (SEQ ID NO:37) LRFARDA (SEQ ID NO:43) RSDNLRE (SEQ ID NO:49) QSGNLAR (SEQ ID NO:40) RREDLIT (SEQ ID NO:15) TSGNLTR (SEQ ID NO:18) RSDALSR (SEQ ID NO:27) LRHHLTR (SEQ ID NO:33) DRSALSR (SEQ ID NO:38) RSDNLAR (SEQ ID NO:29) DSSDRKK (SEQ ID NO:31) RSDHLSQ (SEQ ID NO:55) TSSNLSR (SEQ ID NO:16) QRSHLSD (SEQ ID NO:22) TSGNLTR (SEQ ID NO:18) -RSDALAR (SEQ ID NO:39) RSDHLTQ (SEQ ID NO:45) -QNAHRIT (SEQ ID NO:56) Таблиця 1B Послідовності-мішені для білків із цинковими пальцями Номер цинкового пальця 107830R 107830L 107832R 107832L 107833R 107833L 107835R 107835L Послідовність-мішень agcatcctatgtatctcgccgtgGATTCGCATCGGGATCCG (SEQ ID NO:3) cggatcccgatgcgaatccacggCGAGATACATAGGATGCT (SEQ ID NO:4)* ctctttggagttaccatgcttGATGTGGTTAGGGCCAAG (SEQ ID NO:5) cttggccctaaccacatcaagcatGGTAACTCCAAAGAG (SEQ ID NO:6)* ttcagaggtcaatctcccagtagttgGTGGTCATGCTGgCATAAC (SEQ ID NO:7) gttatgccagcatgaccaccaactacTGGGAGATTGACcTCTGAA (SEQ ID NO:8)* gtcaccgagcttcccttcttcgcaTCCAAGGTAaTAAGCC (SEQ ID NO:9) ggcttattaccttggatgcgaAGAAGGGAAGCTcGGTGAC (SEQ ID NO:10)* * означає послідовності зв'язування, комплементарні SEQ ID NO: 2, або із зворотною орієнтацією відносно неї. 10 Конструкції цинкових пальців, які зв'язуються із mMDH, були включені у вектори, які кодують білок, який має принаймні один палець із структурою CCHC. Див. публікацію заявки на патент США № 2008/0182332. Зокрема, останній палець у кожному білку мав кістяк CCHC для 28