Спосіб одержання розчинного бета-глюкану

Реферат: Винахід належить до способу одержання розчинного β-глюкану, що включає: ресуспендування частинок β-глюкану, перемішування частинок в буферному розчині при кислому pH, підвищеному тиску і підвищеній температурі, охолодження суміші з одержанням частинок розчинного β-глюкану та необов'язково сушіння одержаних частинок. Також винахід належить до композиції, що містить частинки розчинного β-глюкану. UA 101617 C2 (12) UA 101617 C2 UA 101617 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки. До якої належить винахід За даною заявкою вимагається пріоритет за патентною заявкою США №60/916,690, з назвою SOLUBLE GLUCAN PREPARATION (одержання розчинного глюкану), поданою 8 травня 2007. Даний винахід стосується частинок розчинного β-глюкану. Зокрема даний винахід стосується поліпшеного способу і композиції частинок розчинного β-глюкану. Як правило, глюкани описують, як полімери глюкози, одержані з дріжджів, бактерій, грибків і рослин таких, як овес і ячмінь. Відомо, що глюкани, які містять β(1-3)-зв'язаний глюкопіранозний скелет, мають біологічну активність, зокрема модулюють імунну систему і, як недавно було встановлено, індукують мобілізацію гемопоетичних стволових клітин і клітин-попередників (HSPC). Одержання високоякісного розчинного β-глюкану, описане в попередньому рівні техніки дуже дорого коштує. Висока вартість виробництва робить його, наприклад, харчовою добавкою, що дуже дорого коштує або інгредієнтом харчового продукту. Отже, продовжує існувати необхідність в поліпшеному розчинному β-глюкані. Короткий опис суті винаходу Частинки β-глюкану розчинні в кислому розчині при підвищеній температурі і тиску. Одержаний в результаті розчинний β-глюкан може бути підданий додатковому освітленню і очищенню при використанні, наприклад, центрифугування і/або хроматографії. Одержаний в результаті продукт навіть у випадку, коли він містить глюкани з високою молекулярною масою, може бути висушений з одержанням порошку, який надалі може бути повторно розчинений. Короткий опис фігур Фіг. 1-4 - криві RI і графіки перетворення даних зразків частинок розчинного β-глюкану. Фіг. 5 - графічне представлення даних продукування TNFα, індукованого різними βглюканами. Докладний опис винаходу Вихідний матеріал, використовуваний у даному винаході, являє собою частинки або нерозчинний β-глюкан, одержаний будь-яким способом. Розмір вихідного матеріалу β-глюкану у вигляді частинок може змінюватися в межах від суцільних частинок глюкану до субмікрону. Також у вихідному матеріалі може змінюватися вміст домішок. Однак при зростанні вмісту домішок у вихідному матеріалі кількість добувного розчинного глюкану зменшується. Одним з ® прикладів прийнятного вихідного матеріалу є WGP 3-6 від Biothera. У даному винаході може бути використана будь-яка кількість джерел β-глюкану. Прикладами таких джерел є дріжджі, ячмінь, овес, гриби й інші грибки і тому подібне. Частинки β-глюкану обробляють кислотою під тиском і при підвищеній температурі з одержанням розчинного βглюкану. Спочатку гранульовані частинки β-глюкану ресуспендують, змішують в закупорювальній реакційній посудині в буферному розчині і доводять до pH 3,6. Буферні реагенти додають таким чином, що кожний літр загального об'єму суспензії готової суміші містить близько 0,61 г ацетату натрію, 5,24 мл безводної оцтової кислоти і 430 г гранульованих частинок β-глюкану. У посудину подають азот для видалення кисню і підвищення тиску в реакційній посудині. Як правило, тиск всередині посудини доводять до 35 фунтів на квадратний дюйм і нагрівають суспензію до температури близько 135 °C протягом близько 5,5 годин. Було встановлено, що за таких умов β-глюкан розчиняється. При пониженні температури нижче 135 °C, розчинність також знижується. Потрібно зазначити, що ця температура і тиск оптимізовані тільки для описуваного варіанта втілення даного винаходу. Для інших реакційних умов і/або реагентів вони змінюються, і може бути потрібна оптимізація і регулювання температур і тиску. Перевагою даного винаходу в порівнянні з процесами розчинення β-глюкану з попереднього рівня техніки є використання підвищеного тиску і температури, що дозволяє відмовитися від застосування небезпечних хімічних сполук. Раніше використовувані небезпечні хімічні сполуки, містять, наприклад, легкозаймисті леткі органічні сполуки, такі як ефір і етанол, дуже сильні кислоти, такі як мурашина і сірчана кислота, і розчини лугів з дуже великим pH. Спосіб за даним винаходом не тільки безпечний, але і в ньому зменшена кількість різних використовуваних хімікатів і кількість виконуваних стадій, він більш економічний. Додатковою перевагою способу за даним винаходом є те, що тривалість вище вказаної обробки дозволяє контролювати молекулярну масу одержаних в результаті частинок розчинного β-глюкану. Використовуваний в описі термін "частинки розчинного β-глюкану" стосується будь-якої форми розчинних або повторно розчинних частинок. Тривалість часу обробки обернено пропорційна одержаній в результаті молекулярній масі. Іншими словами, при зростанні часу обробки, одержувана 1 UA 101617 C2 5 середня молекулярна маса частинок розчинного β-глюкану знижується. Цей принцип проілюстрований нижче. Збирають чотири зразки з партій суспензії частинок розчинного β-глюкану в різні періоди часу (60, 90, 120 і 240 хвилин) під час вище вказаного процесу. Молекулярну масу зразків визначають при використанні ексклюзійної хроматографії по відношенню до декстранових маркерів молекулярної маси. Результати наведені в Таблиці 1. Таблиця 1 Зразок за часом Mn* 60 хвилин 90 хвилин 120 хвилин 240 хвилин Mw** 5500 8500 6600 5100 352000 1180000 354000 56500 Mz*** 4250000 5430000 2730000 362000 Концентрація гексози 5,16 мг/мл 12,33 мг/мл 11,26 мг/мл ~25 мг/мл * середньочислову молекулярну масу розраховують за формулою: ; ** середню молекулярну масу розраховують за формулою: ; де Ni, є числом молекул з молекулярною масою Mi; *** z-середня молекулярна маса, основана на розмірі полімерних ланцюжків. 10 15 20 25 30 35 40 Як видно з вказаних вище даних, частинки β-глюкану починають повільно руйнуватися, досягаючи самого великого середнього розміру через близько 90 хвилин. Після 90 хвилин середній розмір починає зменшуватись. Конкретні дані за часом приведені на фіг. 1-4. Фіг. 1 включає частини А і B. На частині А приведена крива індексу рефракції (RI) зразка після 60 хвилин. На частині В дані, одержані в частині А, перетворені і нанесені на графік. Крива 10 представляє перетворені вихідні дані. Крива 12 представляє сумарний процент відносної молекулярної маси. Молекулярну масу визначають при використанні стандартних кривих, одержаних для декстрану відомого розміру (дані не показані). Дані, одержані для 90 хвилинного зразка, приведені на фіг. 2. На частині А і частині В приведені криві 14 і 16, відповідні частинам А і В фіг. 1. Дані, одержані для 120 хвилинного зразка, приведені на фіг. 3. На частині А і частині В приведені криві 18 і 20, відповідні частинам А і В фіг. 1. Дані, одержані для 240 хвилинного зразка, приведені на фіг. 4. На частині А і частині В приведені криві 22 і 24, відповідні частинам А і В фіг. 1. Для конкретних цілей можуть бути використані частинки розчинного глюкану з певним розміром. Наприклад, при місцевому нанесенні молекули з меншою молекулярною масою можуть краще проникати в шкіру. З іншого боку, молекули з більшою молекулярною масою краще прийнятні для перорального введення. Отже, можливість легко контролювати середній розмір молекул глюкану має значну перевагу в порівнянні з попереднім рівнем техніки. Точний час теплової обробки, як правило, визначають експериментальним шляхом, забираючи зразки вмісту реактора. Можуть бути проведені різні тести, такі як гель-проникаюча хроматографія (GPC). Спосіб дозволяє максимально збільшити вихід розчинних частинок, які відповідають вимогам профілів для конкретного застосування і вмісту домішок. Як тільки βглюкан розчинений, суміш охолоджують для зупинення реакції. З цього моменту частинки розчинного β-глюкану можуть бути промиті і використані, однак для фармацевтичного застосування, як правило, проводять додаткове очищення. Для додаткового очищення і/або освітлення частинок розчинного β-глюкану може бути використана будь-яка комбінація однієї або більше подальших стадій. Якщо необхідно, також можуть бути використані інші засоби, відомі з рівня техніки, що передує винаходу. Прийнятні засоби включають, наприклад, центрифугування або центрифугування в безперервному потоці, яке дозволяє видалити значну частину ліпідних домішок. У деяких прикладах включення ліпідів в частинки розчинного β-глюкану може збільшувати його ефективність проти певних інфекційних захворювань або посилювати імунну систему. 2 UA 101617 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб за даним винаходом забезпечує засоби для ефективного контролю і дозволяє змінюватися кількість ліпідів в композиції частинок розчинного β-глюкану. Як альтернатива або додатково, частинки розчинного β-глюкану можуть бути профільтровані. В одному варіанті втілення даного винаходу матеріал фільтрують через 0,2 мкм фільтр. Для очищення також може бути використана хроматографія. Частинки розчинного β-глюкану можуть бути піддані обробленню в момент проведення хроматографії. Наприклад, якщо стадія хроматографії включає хроматографію з гідрофобним впливом (HIC), додатково частинки розчинного β-глюкану можуть бути піддані обробленню до питомої провідності і рН розчином сульфату амонію і ацетату натрію. Прийнятний розчин являє собою 3,0 M сульфат амонію, 0,1 M ацетат натрію, який використовують для регулювання pH до 5,5. Іншим видом хроматографії, використовуваної на стадії хроматографії, є гель-проникаюча хроматографія (GPC). Для того щоб гарантувати, що завантаження не перевищує пропускну здатність колонки, можливо необхідне проведення множини циклів хроматографії. З цього моменту частинки розчинного β-глюкану очищені і вони готові до застосування. Як правило, зібрані частинки розчинного β-глюкану мають середню молекулярну масу >1000000 Да з високою полідисперсністю. Перевага частинок розчинного β-глюкану, як продукту, зокрема полягає у високій молекулярній масі з такими межами, як більше мільйона Дальтон (Да), продукт може бути висушений розпилювальним сушінням з одержанням порошкоподібної форми і потім повторно розчинений в розчинах з рН близько 5 або більше, зокрема від слабких кислот до сильних основ. Додатково, повторне розчинення проводять при близько кімнатній температурі (~25 °C). В залежності від кінцевої концентрації після повторного розчинення і використовуваного розчинника, необхідні час і температура для повторного розчинення можуть змінюватися. Здатність продукту до повторного розчинення робить його ідеальним для створення швидкорозчинних форм β-глюкану, прийнятних, наприклад, для швидкорозчинних порошкоподібних напоїв. А саме, частинки розчинного β-глюкану в сухій формі повторно зволожують до досягнення вмісту вологи в межах від близько 9 % до 12 % з утворенням агломератів. Через пневморозпилювачі в агломерат додають поверхнево-активну речовину, таку як лецитин. Концентрація поверхнево-активної речовини може змінюватися в залежності від використовуваної поверхнево-активної речовини, умов і розчинника, в якому в результаті буде розчинений продукт. Потім агломерати проходять через три стадії в сушарці з псевдорозрідженим шаром. На першій стадії продукт нагрівають, на другій стадії проводять оброблення продукту і на третій стадії продукт охолоджують. Одержаний в результаті продукт просівають з одержанням швидкорозчинного продукту. Інший шлях одержання швидкорозчинного продукту включає додання другого розчинного інгредієнта в сухій формі, такого як столовий цукор або сіль (NaCl). В одному прикладі 200 мг порошкоподібних частинок розчинного β-глюкану і в межах від близько 0,5 до близько 1,0 г кристалів цукрози змішують і подрібнюють в міксері протягом близько 2-3 хвилин. Суміш доводять до 500 мл водою кімнатної температури й інтенсивно струшують. Частинки розчинного β-глюкану розчинені. Ідентичний приклад здійснюють з NaCl з тим же результатом. Частинки розчинного β-глюкану, як продукту незалежно від форми, в якій він знаходиться: в розчиненій, порошкоподібній або повторно розчиненій формі, можуть мати множину застосувань. Частинки розчинного β-глюкану ідеальні для застосування як поживної добавки, інгредієнта харчового продукту, косметичного інгредієнта і фармацевтичного продукту для застосування людьми і сільськогосподарськими/компаньйонами/екзотичними тваринами. Традиційні харчові продукти, в які можуть бути додані сухі або вологі форми частинок розчинного β-глюкану, включають, наприклад, зернові і продукти із зернових, хлібобулочні вироби й суміші для випічки, напої й основи для напоїв, аналоги молочних продуктів, такі як соєве молоко, молоко і молочні продукти, продукти з рослинного білка, фрукти і фруктові соки, що пройшли технологічну обробку, м'яку карамель, супи і суміші для супів, йогурт, бутильовану воду і напої, поживні батончики і тому подібне. Якщо необхідно, для поліпшення смаку, аромату і текстури можуть бути додані різні маскуючі агенти й інші добавки. У рідкій формі частинки розчинного β-глюкану можуть бути використані для одержання харчових плівок. Тонкий шар рідкого продукту сушать при використанні будь-якого з численних засобів, відомих з попереднього рівня техніки. Для створення плівок з різними текстурами або придання їм більшої або меншої гнучкості в рідкий продукт можуть бути додані добавки. Плівки використовують як носії для фармацевтичних продуктів або харчових добавок. При цьому для поліпшення смаку, аромату і текстури плівки, можуть бути додані різні маскуючі агенти й інші добавки. 3 UA 101617 C2 5 10 15 20 Також частинки розчинного β-глюкану, як продукту більш ефективні в порівнянні з частинками β-глюкану з попереднього рівня техніки. Наприклад, продукт може бути більш ефективним проти інфекційних захворювань або раку. Підвищена ефективність може виражатися в поліпшеному засвоєнні, більшому посиленні імунної системи, зниженні дозування і тому подібне. Проведені для цієї мети in vitro дослідження показали, що частинки розчинного β-глюкану не індукують TNFα з мононуклеарних клітин периферичної крові людини (PBMC) при концентрації аж до 300 мкг/мл. Зокрема PBMC людини культивують в cRPMI середовищі, що містить 5 % інактивовану нагріванням FCS. Клітини стимулюють різними бета глюканами (всі вільні від ендотоксинів), агоністом TLR7/8 або носієм. Бета глюкани використовують в різних концентраціях. Після інкубування протягом ночі при температурі 37 °C, 5 % CO2, збирають супернатант, вільний від клітин, зберігають при температурі -20 °C до моменту проведення аналізу на цитокіни при використанні ELISA. На Фігурі 5 приведені результати трьох повторів. Як видно з графіка, суцільні частинки глюкану стимулюють продукування TNFα, в той час як продукт, що представляє розчинні частинки, не викликає цього. Оскільки TNFα є головним цитокіном, залученим до запальної реакції, передбачається, що продукт, який представляє розчинні частинки, не індукує запальну реакцію. Незважаючи на те, що даний винахід описаний з посиланням на конкретні варіанти його втілення, фахівцеві в галузі техніки, до якої належить даний винахід, потрібно розуміти, що можуть бути зроблені різні зміни у формі і деталях, не виходячи за обсяг вимог даного винаходу, який викладений нижче в наданій формулі винаходу. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 30 35 1. Спосіб одержання розчинного β-глюкану, що включає: a) ресуспендування частинок β-глюкану; b) перемішування частинок в буферному розчині при кислому pH, підвищеному тиску і підвищеній температурі; c) охолодження суміші з одержанням частинок розчинного β-глюкану; та d) необов'язково сушіння одержаних частинок. 2. Спосіб за п. 1, де перемішування частинок в буферному розчині проводять при pH 3,6. 3. Спосіб за п. 1, де перемішування частинок проводять при тиску 35 фунтів на квадратний дюйм. 4. Спосіб за п. 1, де перемішування частинок проводять при нагріванні суспензії до температури близько 135 °С протягом близько 5,5 годин. 5. Спосіб за п. 1, де частинки розчинного β-глюкану одержують із дріжджів. 6. Спосіб за п. 1, де частинки розчинного β-глюкану мають середню молекулярну масу більшу ніж близько 1000000 Да. 7. Композиція, що містить частинки розчинного β-глюкану, одержаного способом за п. 1. 4 UA 101617 C2 5 UA 101617 C2 6 UA 101617 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7