Кондуктометричний біосенсор на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргінину в рідинах біологічного походження

Реферат: Кондуктометричний біосенсор на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження складається з двох пар золотих гребінчастих електродів. На першу пару з яких нанесена робоча мембрана на основі аргініндеімінази, селективна до аргініну. На другу пару електродів нанесена референтна мембрана на основі бичачого сироваткового альбуміну. Біосенсор призначений для підключення до експериментальної установки для кондуктометричних вимірювань, яка в свою чергу під'єднана до комп'ютера. UA 115345 U (12) UA 115345 U UA 115345 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пропонована корисна модель належить до галузі медицини та харчової промисловості і може бути використана для діагностики раку і багатьох інших захворювань, пов'язаних з порушенням обміну речовин або для контролю якості та дозрівання фруктів, а саме для визначення концентрації аргініну в сироватці крові або фруктових соках, а більш конкретно до кондуктометричного біосенсора на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження. Амінокислота L-аргінін належить до найбільш лужних амінокислот і має найбільшу ізоелектричну точку 10,76 у порівнянні з іншими 20 амінокислотами, відіграє важливу роль в поділі клітин, загоюванні ран, синтезі білка, імунних реакціях і багатьох інших біологічних функціях. До того ж аргінін є фізіологічним попередником оксиду азоту (N0) [1], який відіграє роль ключового посередника в судинному гемостазі. Коли кількість аргінін-похідних речовин значно зменшується це може бути шкідливим для здоров'я і навіть, небезпечним для життя. L-аргінін є важливим біомаркером низки захворювань, пов'язаних з порушенням обміну, зокрема гіпераргінінемії, викликаної генетичним дефектом в гені ARG1 (дефіцит аргінази) [2-3]. Кількість L-аргініну в сечі є показником наявності гомозиготної цистинурії [4], гепатокарциноми, меланоми шкіри та колоректального раку, туберкульозу легенів. Зокрема встановлено, що у хворих на туберкульоз легень спостерігається зниження загального рівня амінокислот у сироватці крові. При діагностиці колоректального раку L-аргінін виконує роль додаткового маркера до аргінази сироватки крові на початковій та метастатичній стадіях раку. На даний момент в світі для аналізу концентрації L-аргініну використовують такі методи, як спектрофотометрія, флуориметрія, хроматографія, полярографія, високоефективна рідинна хроматографія та інші. Запропоновані методи є досить складними, коштовними та потребують складної попередньої підготовки проб. Наприклад, для спектрофотометричних методів реакція з нінгідрином є низькоспецифічною, а реакція на основі двоферментної системи (аргіназа/уреаза) можлива лише у випадку відсутності сечовини у аналізованих зразках. Значним недоліком інших, згаданих вище, методів є вплив інтерферуючих речовин, зокрема, лізину, проліну, цитруліну, сечовини. Відповідно для їх реалізації, необхідна додаткова обробка аналізованих проб. Окрім, традиційних методів аналізу аргініну існують і біосенсорні. Серед цих розробок вирізняються біосенсори на основі різних типів електрохімічних перетворювачів, переважна більшість з яких на основі амперметричних перетворювачів. При розробці амперометричних біосенсорів використовують в основному одноферментну систему на основі оксидази L- та Dамінокислот або ж декарбоксилази аргініну. Нажаль. дані типи біосенсорів не достатньо селективними особливо для визначення аргініну в складних багатокомпонентних зразках (кров, соки і тощо). У випадку розробки кондуктометричних та потенціометричних біосенсорів використовується двоферментна система на основі аргінази/уреази. Вагомим недоліком такої біосенсорної системи є певна втрата чутливості у зв'язку з використанням кількох ферментів, крім того, неможливість аналізу складних зразків, що містять сечовину, зокрема кров, сеча, тощо. Відомий біосенсор на основі іон-селективного електрода для визначення L-аргініну у фруктових соках, що базується на використанні лише одного ферменту аргініндеімінази [7]. Нажаль, для функціонування він потребує технологічно складного електрода порівняння і має ряд недоліків таких як світлочутливість, складність технології його подальшої мініатюризації, неможливість використання недорогої тонкоплівчастої технології виготовлення. До того ж чутливість використаних в роботі іон-селективних електродів не найкраща. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу створення такого кондуктометричного біосенсора на основі аргініндеімінази для кількісного визначення аргініну в рідинах біологічного походження, який би дозволив більш швидко та селективно визначати концентрацію аргініну та був би більш перспективним та дешевим для подальшого масового виробництва. Поставлена задача вирішується запропонованим кондуктометричним біосенсором на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження, який відповідно до корисної моделі складається з двох пар золотих гребінчастих електродів, на першу пару з яких нанесена робоча мембрана на основі аргініндеімінази, селективна до аргініну на другу пару електродів нанесена референтна мембрана на основі бичачого сироваткового альбуміну, а вказаний біосенсор призначений для підключення до експериментальної установки для кондуктометричних вимірювань, яка в свою чергу під'єднана до комп'ютера. Використання в роботі біосенсора на основі кондуктометричного перетворювача, дозволило проводити більш швидкий та селективний аналіз біозразків завдяки слабій чутливості перетворювача до змін рН та наявності амінокислот у зразку. Крім того, використовуючи при 1 UA 115345 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 створенні біосенсорів кондуктометричний перетворювач, запропонований кондуктометричний біосенсор для визначення аргініну став більш перспективним та більш дешевшим для подальшого масового виробництва, за рахунок відсутності технологічно складного електрода порівняння та використання недорогої тонкоплівчастої технології виготовлення. В основі роботи кондуктометричного біосенсора на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження лежить наступна ферментативна реакція: Аргініндеіміназа L-аргінін+Н2О→L-цитрулін+NН3 В процесі проходження ферментативної реакції аргініндеіміназа розщеплює аргінін при цьому змінюється провідність розчину в приелектродному просторі, яку і можна реєструвати за допомогою кондуктометричного перетворювача [5]. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де - на фіг. 1 показано зовнішній вигляд кондуктометричного біосенсора на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження; - на фіг. 2 показана блок-схема експериментальної установки для кондуктометричних вимірювань; - на фіг. 3 продемонстровано типові відгуки кондуктометричного біосенсора на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження на реальному прикладі проведення експерименту; - на фіг. 4 наведено калібрувальний графік залежності величини відгуків біосенсора на основі аргініндеімінази від концентрації аргініну. Кондуктометричний біосенсор на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження складається з двох золотих гребінчастих пар електродів 1 та 2 /ГЕ/ (фіг. 1). На одну пару електродів 1 /ГЕ/ нанесена робоча мембрана 3 /РМ/ на основі аргініндеімінази. На другу пару електродів 2 /ГЕ/ нанесена референтна мембрана порівняння 4 /МП/. Згаданий біосенсор підключений до експериментальної установки для кондуктометричних вимірювань (фіг.2). Експериментальна установка для кондуктометричних вимірювань містить вимірювальний прилад (портативний кондуктометр "МСР-3") 5 /ВП/, що був, розроблений та виготовлений в Інституті електродинаміки НАН України [6]. Також, кондуктометрична схема включала в себе тримач для біосенсора 6 /ТБ/ і штатив 7 /СШ/. При проведенні вимірювань на основу штативу встановлюють робочу комірку 8 /ВК/ з досліджуваним розчином 9 /ДР/, а весь сенсорний блок встановлюють на магнітний перемішуючий пристрій 10 /МП/. Портативний вимірювальний прилад "МСР-3" - 5 /ВП/ підключається до електромережі через адаптер мережі живлення 11 /БЖ/, до біосенсора сполучними дротами через контакт 12 /СД/, а до персонального комп'ютера 13 /ПК/ зі встановленим пакетом відповідного програмного забезпечення через контакт 14 /КК/. Вимірювання проводили при частоті струму 37 кГц та амплітуді 14 мВ. Після підключення біосенсора до тримача 6 /ТБ/ одержували початкову базову лінію на графіку, а далі додавали досліджувану речовину. Відгук реєстрували на екрані персонального комп'ютера 13 /ПК/. Пропонований кондуктометричний біосенсор на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження працює так. Попередньо виготовляли біоселективні мембрани. Для створення гелю для ферментної робочої мембрани 3 /РМ/ аргінінового біосенсора готували розчин з вмістом 10 % аргініндеімінази, 5 % сироваткового альбуміну бика (БСА), 10 % гліцерину у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,5. До складу гелів додавався гліцерин для стабілізації ферментів при іммобілізації та запобіганні передчасному підсиханню розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. В свою чергу, сироватковий альбумін бика в складі ферментних мембран відігравав роль стабілізуючого агента для ферментів. Референтну мембрану порівняння 4 /МП/ виготовляли таким же чином, але замість наважки ферменту до гелю додавали лише 10 % БСА. Перед нанесенням на поверхню електродів приготовлені гелі змішували з 0,4-1 % водним розчином глутарового альдегіду у співвідношенні 1:1. Таким чином, ферментна робоча мембрана 3 /РМ/, нанесена на першу робочу пару гребінчастих електродів 1 /ГЕ/ складалась з 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, та з наступних інгредієнтів, у такому їх співвідношенні (у мас %): - 8-12 аргініндеімінази, - 2-6 БСА, - 8-12 гліцерин, - 0,5 глутаровий альдегід (ГА). 2 UA 115345 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Референтну мембрану порівняння 4 /МП/, нанесена на другу робочу пару гребінчастих електродів 2 /ГЕ/ кондуктометричного біосенсора складалась з 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, та з наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): - 12-17 БСА, - 8-12 гліцерин, - 0,5 ГА. Співвідношення компонентів біоселективних мембран було отримано експериментально. Його підібрали для покращення аналітичних характеристик біосенсора, таких як селективність, чутливість, операційна стабільність. Після процесу іммобілізації біосенсори висушували 30 хв. на повітрі за кімнатної температури. Перед початком роботи, для видалення надлишку незв'язаного ферменту та інших компонентів мембран, біосенсор відмивали протягом 20 хв. у буфері, в якому і проводили подальші досліди. Кондуктометричний біосенсор на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження підключали до експериментальної установки для кондуктометричних вимірювань, що працювала у режимі кондуктометричних вимірювань при частоті струму 37 кГц та амплітуді 14 мВ. Далі кондуктометричний біосенсор на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження поміщали до робочої комірки об'ємом 2,0 мл, заповненої 10 мМ фосфатним буфером, рН 7,5, та витримували декілька хвилин для отримання стабільної базової лінії. Потім додавали певну аліквоту модельного розчину аргініну та отримували сигнал біосенсора. Сигнал від біосенсорів автоматично оброблявся персональним комп'ютером і виводився у графічному вигляді. Графічне зображення відгуків кондуктометричного біосенсора на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження на послідовне додавання декількох аліквот модельного розчину аргініну показано на фіг. 3. Час за який було отримано один біосенсорний відгук складав 15 секунд, що в 2 рази швидше ніж задекларовано, у відомому потенціометричному біосенсорі-0,5 хвилини [7]. Протокол роботи кондуктометричного біосенсора на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження в модельних розчинах. Для отримання калібрувальної кривої біосенсорного визначення аргініну у вимірювальній комірці змінювали концентрацію субстрату, додаючи певні аліквоти вихідних концентрованих розчинів аргініну. Після отримання кожного відгуку біосенсор відмивали від продукту, змінюючи робочий буфер мінімум 3 рази кожні 2 хв. Шляхом отримання відгуків біосенсора на додавання різних аліквот модельних розчинів аргініну було побудовано калібрувальну криву для визначення концентрації аргініну (Фіг.4). Визначення концентрації аргініну в рідинах біологічного походження за калібрувальною кривою. Додавали аліквоту проби до вимірювальної комірки та отримували відгуки. Далі за калібрувальною кривою вираховували концентрацію аргініну в невідомій пробі. За умов подальшої стандартизації запропонованого кондуктометричного біосенсора на основі аргініндеімінази, ціна аналізу однієї проби, за пропонованою моделлю, буде щонайменше у 4 рази дешевше, ніж у відомих біосенсорів. З прикладу роботи біосенсора та за допомогою калібрувальної кривої (Фіг.3) і типових сигналів біосенсора (Фіг.4) видно, що пропонований кондуктометричний біосенсор на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження є функціонально придатним і дозволяє набагато швидше та дешевше отримувати результати аналізу аргініну в реальних розчинах порівняно з відомими біосенсорами, також його робота не потребує наявності технологічно складного електроду порівняння. До того ж в порівнянні з роботою [7] чутливість використовуваних в корисній моделі кондуктометричних гребінчастих планарних електродів в 5 разів більша. Крім того, запропонований кондуктометричний біосенсор на основі іммобілізованої аргініндеімінази не чутливий до змін рН, амінокислот, характеризується швидшим часом відгуку (20 сек.). Джерела інформації: 1. О.Іккерт, Н.Кургалюк, С.Гордій, Вплив L-аргініну та Nco-нітро - 1-аргініну на стан енергозабезпечення мітохондрій печінки щурів із різною резистентністю до гіпоксії в разі дії стресових навантажень, Вісник Львів, ун-ту., 2002, № 28. С. 271-278 2. Н.Є. Стасюк, С.Р.Басе, Г.З.Гайда, X.С.Єпрємян, М.В.Гончар Новий ензиматичний метод визначення L-аргініну за використання аргінази і людини та уреази. Scientific Journal "ScienceRise" №6/1(11) 2015, С. 43-48 3 UA 115345 U 5 10 3. В. VynnytskaMyronovska, Y. Bobak, Y. Garbe, С Dittfeld, O. Stasyk, L. A. Kunz-Schughart Single amino acid arginine starvation efficiently sensitizes cancer cells to canavanine treatment and irradiation, Inter. Journal of Cancer. -2012. -Vol. 130, Issue 9. -P. 2164-2175. 4. S.M.Morales Cystinuria: diagnosis and therapeutic approach. An. Sist. Sanit. Navar. (2011) 34(3): 453-461. 5. C.B.Дзядевич Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування. Біополімери і клітина-2005, -21, -с. 91-106. 6. В.Г.Мельник, А.Д.Василенко, А.Е.Дудченко, В.Д.Погребняк, Исследования подавления синфазной помехи в биосенсорной кондуктометрической системе с дифференциальными датчиками. Sensor Electronics and Microsystem Technologies 2014 -Т. 11, №3,49-61 7. Verma, N., Singh, A.K. & Kaur, P. J Biosensor based on ion selective electrode for detection of L-arginine in fruit juices, Anal Chem (2015) 70: 1111-1115. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Кондуктометричний біосенсор на основі аргініндеімінази для кількісного аналізу аргініну в рідинах біологічного походження, який відрізняється тим, що складається з двох пар золотих гребінчастих електродів, на першу пару з яких нанесена робоча мембрана на основі аргініндеімінази, селективна до аргініну, на другу пару електродів нанесена референтна мембрана на основі бичачого сироваткового альбуміну, а вказаний біосенсор призначений для підключення до експериментальної установки для кондуктометричних вимірювань, яка в свою чергу під'єднана до комп'ютера. 4 UA 115345 U 5 UA 115345 U 6 UA 115345 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7