N’-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4н-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід, який має протитуберкульозну активність відносно м. bovis

Реферат: Винахід розкриває N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід, який містить морфолінометильний замісник за С 5-положенням ядра 1,2,4-триазолу, фрагмент оцтової кислоти, зв'язаний з ядром 1,2,4-триазолу атомом сульфуру, та залишок гідразиду ізонікотинової кислоти, який має протитуберкульозну активність відносно М. bovis. UA 116076 C2 (12) UA 116076 C2 UA 116076 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Винахід належить до фармації, медицини та ветеринарії і може бути використаний у створенні нових біологічно активних сполук у ряді похідних 1,2,4-триазолу та для підвищення ефективності бактеріологічної діагностики туберкульозу тварин, селекції вакцинних штамів для конструювання препаратів специфічної профілактики хвороби. Проблема побічної дії ксенобіотиків та протидії їх токсичним проявам залишається вкрай важливою. Проблема лікування хворих на туберкульоз має значну наукову та соціальну значимість в умовах глобальної епідемії цього захворювання в світі, в тому числі і в Україні (Tuberculosis. Clinical diagnosis and management of tuberculosis, and measures for its prevention and control, March 2011). Резистентний туберкульоз є серйозною проблемою охорони здоров'я населення у багатьох країнах, що розвиваються (WHO policy on collaborative TB/HIV activities: guidelines for national programmes and other stakeholders. Geneva, WHO, 2012). Лікування такого туберкульозу займає більше часу та потребує більш дорогих ліків. Multidrug resistant tuberculosis (MDR-TB)  це туберкульоз, на який не діють два найбільш ефективні лікарські засоби: рифампіцин та ізоніазид (Guidelines for Clinical and Operational Management of Drug-Resistant Tuberculosis, 2013). Частота персистенції М. bovis таких штамів в організмі великої рогатої худоби неблагополучних щодо туберкульозу господарств досить висока (у межах 30 %), щоб суттєво визначити тенденцію епізоотичного процесу. Питання біологічних властивостей мікобактерій, зокрема бичачого виду, дотепер потребують вивчення, оскільки з'являються все нові й нові повідомлення авторів про особливості деяких з них. Так, в 2004 році повідомлено про M. bovis швидкорослого штаму, а в наступному – про втрату здатності швидко розмножуватися за пасажів через штучне живильне середовище. Також відмічено, що цей, згаданий вище штам M. bovis, на такому середовищі конверсує в некислотостійкі паличкоподібні та ниткоподібні форми з паралельною зміною характеру росту культури: наліт, димка (В.Зажарський, П.Давиденко та співавт., 2015). Прототипом речовин, похідної 1,2,4-триазолу, що заявляються, є Ізоніазид (гідразид ізонікотинової кислоти), що виявляє протитуберкульозну активність (М.Д. Машковський. Лікарські засоби, 1988), формули: . Найближчий аналог хоча і виявляє протитуберкульозну активність, однак володіє низкою недоліків, зокрема: високою токсичною дією та виникненням ряду побічних ефектів. В основу винаходу поставлено задачу створення нової біологічно активної сполуки в ряді 1,2,4-триазолу, яка має протитуберкульозну дію. Суттєві ознаки прототипу і винаходу, що збігаються, є такі: - в структурі прототипу і винаходу присутні групи С-N; - наявність в структурах ароматичних фрагментів; - наявність в структурах карбоксильних груп. Задачею винаходу є вивчення та дослідження впливу різних концентрації N'-(2-((4-аміно-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду та рН середовища на культивування патогенних штамів М. bovis за температур 37 °C. Поставлена задача вирішується тим, що створено нову похідну 1,2,4-триазолу, що проявляє протитуберкульозну дію: N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід, який містить морфолінометильний замісник за С 5 положенням ядра 1,2,4-триазолу, фрагмент оцтової кислоти, зв'язаний з ядром 1,2,4-триазолу атомом сульфуру, та залишок гідразиду ізонікотинової кислоти: 1 UA 116076 C2 5 . Сполуку, що заявляється, отримують шляхом взаємодії ізопропіл 2-((4-аміно-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетатату із гідразидом ізонікотинової кислоти в середовищі і-пропанолу з наступним виділенням у вигляді гідроброміду. Приклад До розчину ізопропіл-2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетатату (3,15 г) у 30 мл і-пропанолу додають 0,01 моля гідразиду ізонікотинової кислоти. Розчин кип'ятять на водяному нагрівнику 8 год., випаровують досуха та виділяють у вигляді гідроброміду. Для аналізу сполуку перекристалізовують із і-пропанолу. 10 15 20 25 30 35 40 45 Кристалічна речовина білого кольору з Тпл. 157-159 °C, добре розчинна у воді, мало розчинна у метанолі, н-пропанолі, н-бутанолі та в неполярних розчинниках. Вихід N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду складає 81 %. Вирахувано, %: С - 38,05, Н - 4,47, N-23,67, S-6,77. Знайдено, %: С - 38,10, Н - 4,48, N-23,77, S-6,79. -1 В ІЧ-спектрі сполуки, що заявляється, наявні смуги поглинання –C–S–групи при 699 см , -1 -1 вільної аміногрупи при 3441 см та смуги поглинання ароматичних кето-груп при 1681 см та -1 1699 см . Протитуберкульозна активність Протитуберкульозну активність вивчали, проводячи культивування патогенних штамів М. bovis за температури 37 °C на середовищі із рН 6,5 та 7,1, що додатково містить N'-(2-((4-аміно5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід у масових концентраціях 0,1; 0,5; 1 %. Культивування та накопичення біомаси досліджуваних штамів M. bovis проводили на яєчному живильному середовищі, яке за складом було ідентичним стандартному, виготовленому ДП "Ветеринарна медицина" (м. Харків, Україна). До середовища додавали N'(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід у концентрації 0,1 %; 0,5 %; 1 %. Дослідження проводили зі встановленням двох рівнів рН: 6,5 та 7,1. Відмірювання необхідної кількості препарату проводили згідно з ГОСТ 27025-86. Розчини препарату готували згідно методик, описаних у ГОСТ 4212-76 та ГОСТ 451787. У виділених та накопичених мікобактерій вивчали строки появи первинного росту, його інтенсивність і характер субкультури. Аналіз та оцінку колоній проводили за кількістю, величиною, формою, поверхнею, консистенцією, пігментоутворенням, прозорістю, блиском та емульгованістю у фізіологічному розчині (Манченко В.М., Троценко З.Р., Павленко М.С. та ін., 1994; О.А. Ткаченко, М.В. Білан, В.В. Зажарський, Л.О. Ковальова, 2010). Гравіметричні вимірювання виконували на лабораторних електронних аналітичних вагах моделі ESJ-200-4 (США). Вплив N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду на M. bovis На початку досліду виявляли вплив концентрації препарату та рН середовища на інтенсивність росту культури за температур 37 °C. Для цього відбирали M. bovis 100 пасажу, який культивували за температури 37 °C на середовищі з N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромідом у зазначених концентраціях у термостаті протягом трьох місяців на середовищі з рН 6,5 (в кількості десять пробірок із кожною концентрацією препарату) та рН 7,1 (в кількості десять пробірок із кожною 2 UA 116076 C2 5 10 15 концентрацією препарату). В якості контролю використовували M. bovis 100 пасажу без додавання до середовища N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)-ізонікотиногідразиду гідроброміду. Після закінчення цих термінів так само, як і після культивування за температури 37 °C, проводили облік й характеризували ріст колоній мікобактерій (культур) (В.М. Манченко, З.Р. Троценко, М.С. Павленко та ін., 1994; О.А. Ткаченко, М.В. Білан, В.В. Зажарський, Л.О. Ковальова, 2010). У підсумку були одержані дані впливу концентрацій N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду на культивування M. bovis за температур 37 °C на середовищі з різним рН на інтенсивність росту культури. У таблиці 1 систематизовано дані про культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 7,1, що додатково містить N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід у трьох концентраціях. До 7 доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis в контрольній групі на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C не відмічався. Результати, наведені в табл. 1, засвідчили відсутність росту культури M. bovis 100 пасажу за усіх (0,1, 0,5 та 1 %) концентрацій N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду впродовж усього періоду спостереження (90 діб), що свідчить про туберкулостатичну дію препарату. 20 Таблиця 1 Характеристика культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, культивованих на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C Контроль Шорсткий наліт Контроль 7-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 14-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Шорсткий наліт та поодинокі білі колонії Ріст відсутній за лінією посіву ріст. дрібні Без змін білуватого Без змін Без змін 60-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Контроль Суцільний Гладенькі, колонії кольору Ріст відсутній 30-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Контроль Суцільний Гладенькі, колонії кольору Ріст відсутній ріст. дрібні Ріст відсутній білуватого Контроль Суцільний ріст Ріст відсутній Ріст відсутній 90-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 3 UA 116076 C2 5 У таблиці 2 систематизовано дані щодо культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 6,5, яке додатково містило препарат N'-(2-((4-аміно-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду у трьох концентраціях. До 7-ї доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C не відмічався. Таблиця 2 Характеристика культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, культивованих на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C Контроль 7-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі колонії за лінією Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній посіву 14-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Суцільний ріст. Колонії Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній дрібні, білі, гладенькі 30-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній Контроль 60-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Суцільний ріст. Колонії Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній дрібні, білі, гладенькі 90-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Суцільний ріст. Колонії Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній дрібні, білі, гладенькі 10 15 20 За результатами досліду видно, що дія N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду за різних концентрацій на середовищі з рН 6,5 не відрізняється від рН 7,1. За всіма дослідними (0,1, 0,5 та 1,0 %) концентраціями N'(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)-ізонікотиногідразиду гідроброміду нами відмічена відсутність росту патогенного штаму M. bovis 100 пасажу протягом всього періоду спостереження (90 діб). Таким чином, можна зробити висновок, що 0,1, 0,5 та 1,0 % концентрації N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду активно впливають на культуральні властивості патогенного штаму M. bovis, культивованих на середовищі з рН 6,5 за температури 37 С, стримуючи ріст і розвиток, володіючи туберкулостатичною дією. Вплив ізоніазиду (гідразид ізонікотинової кислоти) на M. bovis Використовувався класичний туберкулостатичний препарат ізоніазид за різних концентрацій, рН середовища та температури 37 °C. Ізоніазид, згідно класифікації протитуберкульозних препаратів міжнародної спілки боротьби із туберкульозом, відноситься до 4 UA 116076 C2 5 10 I групи - препарати високої ефективності. В якості контролю використовували M. bovis 100 пасажу без додавання до середовища препарату ізоніазид. Для цього відбирали M. bovis 100 пасажу, який культивували за температури 37 °C на середовищі з препаратом ізоніазид у зазначених концентраціях у термостаті протягом трьох місяців на середовищі з рН 6,5 та рН 7,1 (в кількості десять пробірок із кожною концентрацією препарату). У виділених мікобактерій вивчали строки появи первинного росту, його інтенсивність і характер субкультури. У таблиці 3 систематизовано дані про культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 7,1, що додатково містить препарат ізоніазид у трьох концентраціях. До 7-ї доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C не відмічався. Таблиця 3 Характеристика культуральних властивостей 100 пасажу M. bovis, культивованих на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C 7-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Слизовий наліт Слизовий наліт Слизовий наліт Ріст відсутній жовтуватого кольору 14-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі гладенькі Без змін Без змін Ріст відсутній колонії 30-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Численні колонії білого Поодинокі колонії Дрібні колонії білого Ріст відсутній кольору білуватого кольору кольору 60-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Суцільний ріст. Дещо збільшилася Гладенькі, дрібні Дрібні колонії білого кількість поодиноких Ріст відсутній колонії білуватого кольору дрібних колоній кольору 90-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Дещо збільшилася Суцільний ріст Суцільний ріст кількість поодиноких Ріст відсутній дрібних колоній 15 20 25 Характеризуючи отримані дані, що наведені в таблиці 3, нами визначена відсутність росту культури M. bovis 100 пасажу за 1 % концентрації препарату ізоніазид. На сьому добу досліду за 0,1 % концентрації виявлений слизовий наліт жовтуватого кольору, на 30-у добу з'являються поодинокі дрібні білуватого кольору, на 60-добу їх кількість збільшується і на 90-у добу визначаємо суцільний ріст, як і в контролі. За використання 0,5 % концентрації препарату ізоніазид на 7-у добу виявлений слизовий наліт, на 14 добу досліду з'являються поодинокі гладенькі колонії, на 30 та 60 добу – дрібні колонії білого кольору. На 90 добу збільшилася кількість поодиноких дрібних колоній. Аналізуючи 1 % концентрацію препарату ізоніазид нами визначено відсутність росту патогенного штаму M. bovis 100 пасажу протягом усього періоду досліду (90 діб), що свідчить про туберкулостатичну дію препарату. 5 UA 116076 C2 5 10 15 Культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, накопиченого та культивованого на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C з препаратом ізоніазид у трьох концентраціях представлений в таблиці 4. До 14 доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C не відмічався. Аналізуючи результати досліду, що наведено в табл.4, нами визначені відмінності дії 1 % концентрації препарату ізоніазид на середовищі з рН 6,5, ніж за рН 7,1. Якщо на середовищі з рН 7,1 ріст культури M. bovis 100 пасажу протягом 90 діб культивування не спостерігався, то на середовищі з рН 6,5 з 30 доби з'являються поодинокі дрібні колонії, кількість яких на 90 добу збільшувалась. 0,1 % концентрація препарату ізоніазид незначно впливає на ріст M. bovis – вже на 7 добу виявлені поодинокі колонії білуватого кольору, кількість яких поступово збільшується з терміном спостереження. За 0,5 % концентрації препарату ізоніазид ріст колоній відмічається на 14 добу – колонії дрібні, гладенькі, білого кольору, кількість яких має тенденцію до збільшення протягом терміну спостереження. Таблиця 4 Характеристика культуральних властивостей 100 пасажу M. bovis, культивованих на середовищі з рН 6,5 з препаратом ізоніазид за температури 37 °C Контроль Слизовий наліт Контроль Поодинокі колонії білуватого кольору Контроль 7-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі колонії Шорсткий наліт Ріст відсутній білуватого кольору 14-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі гладенькі Без змін Ріст відсутній колонії 30-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % 1% Численні колонії білого Поодинокі колонії Дрібні колонії кольору білуватого кольору кольору білого Поодинокі дрібні колонії за лінією посіву 60-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Ріст білуватих, Ріст білуватих, Суцільний ріст. Колонії поодиноких гладеньких поодиноких гладеньких дрібні, білі, гладенькі колоній колоній 90-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Збільшилася кількість Збільшилася кількість Суцільний ріст. Колонії поодиноких дрібних поодиноких дрібних дрібні, білі, гладенькі колоній колоній 20 25 1% Без змін 1% Збільшилася кількість поодиноких дрібних колоній Отже, проведені дослідження засвідчили, що препарат ізоніазид за 1 % концентрації пригнічує ріст і розвиток патогенного штаму M. bovis, культивованого на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C, що свідчить про туберкулостатичну його дію. Низька концентрація (0,1 та 0,5 %) препарату ізоніазид на середовищі з рН 6,5 та 7,1 за температури 37 °C ріст патогенного штаму M. bovis 100-го пасажу не стримує. Таким чином, N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід перевищує туберкулостатичну дію препарату порівняння ізонізиду, та володіє протитуберкульозною активністю відносно М. bovis. 6 UA 116076 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 N'-(2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід: , який має протитуберкульозну активність відносно M. bovis. Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7