N’-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4н-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразид, який проявляє туберкулостатичну дію

Реферат: N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразид формули: , який проявляє туберкулостатичну дію. UA 119204 U (12) UA 119204 U UA 119204 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до фармації, медицини та ветеринарії і може бути використана у створенні нових біологічно активних сполук у ряді похідних 1,2,4-триазолу та для підвищення ефективності бактеріологічної діагностики туберкульозу тварин, селекції вакцинних штамів для конструювання препаратів специфічної профілактики хвороби. Добре відомим є той факт, що у всьому світі з кожним роком різко погіршується епідемічна ситуація з туберкульозу. Дана проблема досить гостро поставлена в Україні, де нажаль, досить активно поширюється це захворювання. Незважаючи на величезний досвід у боротьбі та профілактиці цього захворювання, туберкульоз і на сьогодні продовжує бути однією з найважливіших медико-ветеринарно-соціальних проблем. Все більше актуальним стає питання своєчасного виявлення хвороби та ефективної боротьби з її збудником. Прототипом речовин, похідної 1,2,4-триазолу, що заявляються, є Ізоніазид (гідразид ізонікотинової кислоти), що виявляє протитуберкульозну активність [М.Д. Машковський. Лікарські засоби, 1988], формули: Найближчий аналог хоча і виявляє протитуберкульозну активність, однак має низку недоліків, зокрема: високу токсичну дію та виникнення ряду побічних ефектів. В основу корисної моделі поставлено задачу створення нової біологічно активної сполуки в ряді 1,2,4-триазолу, яка має протитуберкульозну дію. Спільні суттєві ознаки прототипу та корисної моделі, що заявляється, є такі: - в структурі прототипу і корисної моделі присутні групи С-N; - наявність в структурах ароматичних фрагментів; - наявність в структурах карбоксильних груп. Задачею корисної моделі є вивчення та дослідження впливу різних концентрації N'-(2-((4метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду та рН середовища на культивування патогенних штамів М. bovis за температур 37 °C. Поставлена задача вирішується тим, що створено нову похідну 1,2,4-триазолу, що проявляє протитуберкульозну дію: N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду, який містить морфолінометильний замісник за С5 положенням, метильний радикал за N4 атомом та фрагмент оцтової кислоти, зв'язаний з ядром 1,2,4-триазолу атомом сульфуру: Сполуку, що заявляється, отримують шляхом взаємодії ізопропіл 2-((4-метил-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетатату із гідразидом ізонікотинової кислоти в середовищі і-пропанолу. Приклад До розчину ізопропіл 2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетатату (3,14 г) у 50 мл і-пропанолу додають 0,01 моль гідразиду ізонікотинової кислоти. Розчин кип'ятять на водяному нагрівнику 8 год. та випаровують досуха. Для аналізу сполуку перекристалізовують із і-пропанолу. о Кристалічна речовина жовтого кольору з Тпл. 111-113 С , мало розчинна у воді, н-пропанолі, н-бутанолі. Вихід N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду складає 84 %. Вирахувано: С 49,09 %, Н 5,41 %, N 25,05 %, S 8,19 %. Знайдено: С 49,19 %, Н 5,42 %, N 25,09 %, S 8,21 %. -1 В ІЧ-спектрі сполуки, що заявляється, наявні смуги поглинання –C–S–групи при 685 см , 1 UA 119204 U -1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -1 симетричні при 1409 см та асиметричні при 1602 см смуги поглинання СOO -групи. Протитуберкульозна активність Протитуберкульозну активність вивчали, проводячи культивування патогенних штамів М. bovis за температури 37 °C на середовищі із рН 6,5 та 7,1, що додатково містить N'-(2-((4-метил5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду у масових концентраціях 0,1; 0,5; 1 %. Культивування та накопичення біомаси досліджуваних штамів M. bovis проводили на яєчному живильному середовищі, яке за складом було ідентичним стандартному, виготовленому ДП "Ветеринарна медицина" (м. Харків, Україна). До середовища додавали N'(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду у концентрації 0,1 %; 0,5 %; 1 %. Дослідження проводили зі встановленням двох рівнів рН: 6,5 та 7,1. Відмірювання необхідної кількості препарату проводили згідно з ГОСТ 27025-86. Розчини препарату готували, згідно з методиками, описаними у ГОСТ 4212-76 та ГОСТ 4517-87. У виділених та накопичених мікобактерій вивчали строки появи первинного росту, його інтенсивність і характер субкультури. Аналіз та оцінку колоній проводили за кількістю, величиною, формою, поверхнею, консистенцією, пігментоутворенням, прозорістю, блиском та емульгованістю у фізіологічному розчині [В. М. Манченко, З. Р. Троценко, М. С. Павленко та ін., 1994; О. А. Ткаченко, М. В. Білан, В. В. Зажарський, Л. О. Ковальова, 2010]. Гравіметричні вимірювання виконували на лабораторних електронних аналітичних вагах моделі ESJ-200-4 (США). Вплив N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду на M. bovis На початку досліду виявляли вплив концентрації препарату та рН середовища на інтенсивність росту культури за температур 37 °C. Для цього відбирали M. bovis 100 пасажу, який культивували за температури 37 °C на середовищі з N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразидом у зазначених концентраціях у термостаті протягом трьох місяців на середовищі з рН 6,5 (в кількості десять пробірок із кожною концентрацією препарату) та рН 7,1 (в кількості десять пробірок із кожною концентрацією препарату). Як контроль використовували M.bovis 100 пасажу без додавання до середовища N'(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду. Після закінчення цих термінів так само, як і після культивування за температури 37 °C, проводили облік й характеризували ріст колоній мікобактерій (культур) [В.М. Манченко, З.Р. Троценко, М.С. Павленко та ін., 1994; О.А. Ткаченко, М.В. Білан, В.В. Зажарський, Л.О. Ковальова, 2010]. У підсумку були одержані дані впливу концентрацій N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду на культивування M. bovis за температур 37 °C на середовищі з різним рН на інтенсивність росту культури. У таблиці 1 систематизовано дані про культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 7,1, що додатково містить N'-(2-((4-метил-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразид у трьох концентраціях. До 7 доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis в контрольній групі на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C не відмічався. Результати, наведені в табл. 1, засвідчили, що за 0,1 % концентрації препарату відзначається поступовий ріст колоній, починаючи з 30-го до 60-го дня досліду - вздовж лінії посіву шорсткий наліт, на 90-у добу з'являються поодинокі гладкі (S-форми), дрібні колонії білого кольору. Нами встановлена відсутність росту культури M. bovis 100 пасажу за 0,5 та 1 % концентрацій N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду впродовж усього періоду спостереження (90 діб), що свідчить про туберкулостатичну дію препарату. 50 2 UA 119204 U Таблиця 1 Характеристика культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, культивованих на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C Контроль Шорсткий наліт Контроль Шорсткий наліт та поодинокі білі колонії за лінією посіву Контроль Суцільний ріст. Гладенькі, дрібні колонії білуватого кольору Контроль Суцільний ріст. Гладенькі, дрібні колонії білуватого кольору Контроль Суцільний ріст 5 7-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 14-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 30-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду 0,1 % 0,5 % 1% Вздовж лінії посіву шорсткий наліт Без змін Без змін 60-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду 0,1 % 0,5 % 1% Вздовж лінії посіву шорсткий наліт Ріст відсутній Ріст відсутній 90-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду 0,1 % 0,5 % 1% Дрібні колонії білого Ріст відсутній Ріст відсутній кольору У таблиці 2 систематизовано дані щодо культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 6,5, яке додатково містило N'-(2-((4-метил-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразид у трьох концентраціях. До 7-ї доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C не відмічався. 3 UA 119204 U Таблиця 2 Характеристика культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, культивованих на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C Контроль Поодинокі колонії за лінією посіву Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі 5 10 15 20 7-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 14-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 30-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 60-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 90-а доба досліду Концентрація N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній За результатами досліду видно, що дія препарату за різних концентрацій на середовищі з рН 6,5 не відрізняється від рН 7,1. За всіма дослідними (0,1, 0,5 та 1,0 %) концентрацій N'-(2-((4метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду нами відмічена відсутність росту патогенного штаму M. bovis 100 пасажу протягом всього періоду спостереження (90 діб). Таким чином, можна зробити висновок, що 0,1, 0,5 та 1,0 % концентрації N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду активно впливають на культуральні властивості патогенного штаму M. bovis, культивованих на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C, стримуючи ріст і розвиток, володіючи туберкулостатичною дією. Вплив ізоніазиду (гідразид ізонікотинової кислоти) на M. Bovis Використовувався класичний туберкулостатичний препарат ізоніазид за різних концентрацій, рН середовища та температури 37 °C. Ізоніазид, згідно з класифікацією протитуберкульозних препаратів міжнародної спілки боротьби із туберкульозом, належить до I групи - препарати високої ефективності. Як контроль використовували M. bovis 100 пасажу без додавання до середовища препарату ізоніазид. Для цього відбирали M. bovis 100 пасажу, який культивували за температури 37 °C на середовищі з препаратом ізоніазид у зазначених концентраціях у термостаті протягом трьох місяців на середовищі з рН 6,5 та рН 7,1 (в кількості десять пробірок із кожною концентрацією препарату). У виділених мікобактерій вивчали строки появи первинного росту, його інтенсивність і характер субкультури. 4 UA 119204 U 5 У таблиці 3 систематизовано дані про культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 7,1, що додатково містить препарат ізоніазид у трьох концентраціях. До 7-ї доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C не відмічався. Таблиця 3 Характеристика культуральних властивостей 100 пасажу M. bovis, культивованих на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C 7-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Слизовий наліт Слизовий наліт Слизовий наліт жовтуватого кольору 14-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Поодинокі гладенькі Без змін Без змін колонії 30-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Численні колонії білого Поодинокі колонії Дрібні колонії білого кольору білуватого кольору кольору 60-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Суцільний ріст. Дещо збільшилася Дрібні колонії білого Гладенькі, дрібні колонії кількість поодиноких кольору білуватого кольору дрібних колоній 90-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Дещо збільшилася Суцільний ріст Суцільний ріст кількість поодиноких дрібних колоній 10 15 20 25 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній Характеризуючи отримані дані, що наведені в таблиці 3 нами визначена відсутність росту культури M. bovis 100 пасажу за 1 % концентрації препарату ізоніазид. На сьому добу досліду за 0,1 % концентрації виявлений слизовий наліт жовтуватого кольору, на 30-у добу з'являються поодинокі дрібні білуватого кольору, на 60-добу їх кількість збільшується і на 90-у добу визначаємо суцільний ріст, як і в контролі. За використання 0,5 % концентрації препарату ізоніазид на 7-у добу виявлений слизовий наліт, на 14 добу досліду з'являються поодинокі гладенькі колонії, на 30 та 60 добу - дрібні колонії білого кольору. На 90 добу збільшилася кількість поодиноких дрібних колоній. Аналізуючи 1 % концентрацію препарату ізоніазид, нами визначено відсутність росту патогенного штаму M. bovis 100 пасажу протягом усього періоду досліду (90 діб), що свідчить про туберкулостатичну дію препарату. Культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, накопиченого та культивованого на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C з препаратом ізоніазид у трьох концентраціях представлений в таблиці 4. До 14 доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C не відмічався. Аналізуючи результати досліду, що наведено в табл. 4, нами визначені відмінності дії 1 % концентрації препарату ізоніазид на середовищі з рН 6,5, ніж за рН 7,1. Якщо на середовищі з рН 7,1 ріст культури M. bovis 100 пасажу протягом 90 діб культивування не спостерігався, то на середовищі з рН 6,5 з 30 доби з'являються поодинокі дрібні колонії, кількість яких на 90 добу 5 UA 119204 U 5 збільшувалась. 0,1 % концентрація препарату ізоніазид незначно впливає на ріст M. bovis - вже на 7 добу виявлені поодинокі колонії білуватого кольору, кількість яких поступово збільшується з терміном спостереження. За 0,5 % концентрації препарату ізоніазид ріст колоній відмічається на 14 добу - колонії дрібні, гладенькі, білого кольору, кількість яких має тенденцію до збільшення протягом терміну спостереження. Таблиця 4 Характеристика культуральних властивостей 100 пасажу M. bovis, культивованих на середовищі з рН 6,5 з препаратом ізоніазид за температури 37 °C Контроль Слизовий наліт Контроль Поодинокі колонії білуватого кольору Контроль Численні колонії білого кольору 7-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі колонії Шорсткий наліт Ріст відсутній білуватого кольору 14-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі гладенькі Без змін Ріст відсутній колонії 30-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі колонії білуватого кольору Дрібні колонії білого кольору Поодинокі дрібні колонії за лінією посіву 60-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Ріст білуватих, Ріст білуватих, Суцільний ріст. Колонії поодиноких гладеньких поодиноких гладеньких Без змін дрібні, білі, гладенькі колоній колоній 90-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Збільшилася кількість Збільшилася кількість Збільшилася кількість Суцільний ріст. Колонії поодиноких дрібних поодиноких дрібних поодиноких дрібних дрібні, білі, гладенькі колоній колоній колоній 10 Отже, проведені дослідження засвідчили, що препарат ізоніазид за 1 % концентрації пригнічує ріст і розвиток патогенного штаму M. bovis, культивованого на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C, що свідчить про туберкулостатичну його дію. Низька концентрація (0,1 та 0,5 %) препарату ізоніазид на середовищі з рН 6,5 та 7,1 за температури 37 °C ріст патогенного штаму M. bovis 100-го пасажу не стримує. 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 N'-(2-((4-метил-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразид формули: , який проявляє туберкулостатичну дію. 6 UA 119204 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7