Н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4н-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлорид, який виявляє протитуберкульозну дію

Реферат: Н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлорид, який виявляє протитуберкульозну дію. UA 119920 U (12) UA 119920 U UA 119920 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до фармації, медицини та ветеринарії і може бути використана у створенні нових біологічно активних сполук у ряді похідних 1,2,4-триазолу та для підвищення ефективності бактеріологічної діагностики туберкульозу тварин, селекції вакцинних штамів для конструювання препаратів специфічної профілактики хвороби. Cучасний стан виробництва протитуберкульозних препаратів в Україні далеко не ідеальний, тому необхідно розширювати виробництво вітчизняних протитуберкульозних препаратів. З огляду на вищевикладене, можна сказати, що головною задачею пошуку нових протитуберкульозних препаратів є створення високоактивних і малотоксичних препаратів, позбавлених побічних ефектів. Також дуже важливо, щоб резистентність до них мікобактерій туберкульозу розвивалася якомога повільніше. Антибіотики і фторхінолони, що застосовуються для лікування туберкульозу, характеризуються широким спектром дії, синтетичні препарати діють тільки на мікобактерії туберкульозу. В основу сучасних класифікацій покладена клінічна ефективність і стерплюваність протитуберкульозних препаратів. Питання біологічних властивостей мікобактерій, зокрема бичачого виду, дотепер потребують вивчення. Найближчим аналогом речовин, похідної 1,2,4-триазолу, що заявляються, є Ізоніазид (гідразид ізонікотинової кислоти), що виявляє протитуберкульозну активність [М.Д. Машковський. Лікарські засоби, 1988], формули: . Найближчий аналог хоча і виявляє протитуберкульозну активність, однак має низку недоліків, зокрема: високу токсичну дію та виникнення ряду побічних ефектів. В основу корисної моделі поставлено задачу створення нової біологічно активної сполуки в ряді 1,2,4-триазолу, яка має протитуберкульозну дію. Спільні суттєві ознаки найближчого аналога та корисної моделі, що заявляється, є такі: - в структурі найближчого аналога і корисної моделі присутні групи С-N; - наявність в структурах ароматичних фрагментів; - наявність в структурах карбоксильних груп. Задачею корисної моделі є вивчення та дослідження впливу різних концентрації н-пропіл 2((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду та рН середовища на культивування патогенних штамів М. bovis за температур 37 °C. Поставлена задача вирішується тим, що створено нову похідну 1,2,4-триазолу, що проявляє протитуберкульозну дію: н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлорид, який містить морфолінометильний замісник за С5 положенням, аміногрупу за N4 атомом та фрагмент оцтової кислоти, зв'язаний з ядром 1,2,4-триазолу атомом сульфуру у вигляді гідрохлориду: Сполуку, що заявляється, отримують шляхом взаємодії 4-аміно-5-(морфолінометил)-4H1,2,4-триазол-3-тіолу із н-пропіл 2-хлорацетатом в середовищі і-пропанолу в присутності еквіваленту калій гідроксиду та виділяють у формі гідрохлориду. Приклад До розчину 0,01 моль КОН у 3 мл води та 30 мл і-пропанолу додають 0,01 моль 4-аміно-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-тіолу та 0,01 моль н-пропіл 2-хлорацетату, кип'ятять до нейтрального середовища протягом 3 год., фільтрують, розчинник випаровують. Сполуку виділяють у формі гідрохлориду. 1 UA 119920 U º 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Кристалічна речовина жовтого кольору з Тпл. 173-175 С, розчинна у воді, і-пропанолі, малорозчинна у н-бутанолі. Вихід н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду складає 83 %. Вирахувано: С 40,96 %, Н 6,30 %, N 19,90 %, S 9,11 %. Знайдено: С 41,05 %, Н 6,31 %, N 19,93 %, S 9,09 %. -1 В ІЧ-спектрах наявні смуги поглинання, C-S-групи при 699 см , смуги поглинання -1 -1 ароматичного радикалу при 1455 см , а також смуги при 1720см , що можуть вказувати на наявність СО-груп. Крім цього ІЧ- спектр характеризується смугою поглинання С-О-С-груп при -1 1231 см . Протитуберкульозна активність Протитуберкульозну активність вивчали, проводячи культивування патогенних штамів М. bovis за температури 37 °C на середовищі із рН 6,5 та 7,1, що додатково містить н-пропіл 2-((4аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду у масових концентраціях 0,1; 0,5; 1 %. Культивування та накопичення біомаси досліджуваних штамів M. bovis проводили на яєчному живильному середовищі, яке за складом було ідентичним стандартному, виготовленому ДП "Ветеринарна медицина" (м. Харків, Україна). До середовища додавали нпропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлорид у концентрації 0,1 %; 0,5 %; 1 %. Дослідження проводили зі встановленням двох рівнів рН: 6,5 та 7,1. Відмірювання необхідної кількості препарату проводили згідно з ГОСТ 27025-86. Розчини нпропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду готували згідно з методиками, описаними у ГОСТ 4212-76 та ГОСТ 4517-87. У виділених та накопичених мікобактерій вивчали строки появи первинного росту, його інтенсивність і характер субкультури. Аналіз та оцінку колоній проводили за кількістю, величиною, формою, поверхнею, консистенцією, пігментоутворенням, прозорістю, блиском та емульгованістю у фізіологічному розчині (В.М. Манченко, З.Р. Троценко, М.С. Павленко та ін., 1994; О.А. Ткаченко, М.В. Білан, В.В. Зажарський, Л.О. Ковальова, 2010). Гравіметричні вимірювання виконували на лабораторних електронних аналітичних вагах моделі ESJ-200-4 (США). Вплив н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду на M. Bovis. На початку досліду виявляли вплив концентрації препарату та рН середовища на інтенсивність росту культури за температур 37 °C. Для цього відбирали M. bovis 100 пасажу, який культивували за температури 37 С на середовищі з н-пропіл 2-((4-аміно-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду у зазначених концентраціях у термостаті протягом трьох місяців на середовищі з рН 6,5 (в кількості десять пробірок із кожною концентрацією препарату) та рН 7,1 (в кількості десять пробірок із кожною концентрацією препарату). Як контроль використовували M.bovis 100 пасажу без додавання до середовища нпропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду. Після закінчення цих термінів так само, як і після культивування за температури 37 °C, проводили облік й характеризували ріст колоній мікобактерій (культур) (В.М. Манченко, З.Р. Троценко, М.С. Павленко та ін., 1994; О.А. Ткаченко, М.В. Білан, В.В. Зажарський, Л.О. Ковальова, 2010). У підсумку були одержані дані впливу концентрацій н-пропіл 2-((4-аміно-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду на культивування M. bovis за температур 37 °C на середовищі з різним рН на інтенсивність росту культури. У таблиці 1 систематизовано дані про культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 7,1, що додатково містить н-пропіл 2-((4-аміно-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлорид у трьох концентраціях. До 7 доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis в контрольній групі на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C не відмічався. Результати, наведені в табл. 1, засвідчили відсутність росту культури M. bovis 100 пасажу за усіх (0,1, 0,5 та 1 %) концентрацій н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетату гідрохлориду впродовж усього періоду спостереження (90 діб), що свідчить про туберкулостатичну дію препарату. 2 UA 119920 U Таблиця 1 Характеристика культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, культивованих на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C Контроль Шорсткий наліт Контроль Шорсткий наліт та поодинокі білі колонії за лінією посіву Контроль Суцільний ріст. Гладенькі, дрібні колонії білуватого кольору Контроль Суцільний ріст. Гладенькі, дрібні колонії білуватого кольору Контроль Суцільний ріст 5 7-а доба досліду Концентрація н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 14-а доба досліду Концентрація н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 30-а доба досліду Концентрація н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду 0,1 % 0,5 % 1% Без змін Без змін Без змін 60-а доба досліду Концентрація н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 90-а доба досліду Концентрація н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній У таблиці 2 систематизовано дані щодо культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 6,5, яке додатково містило н-пропіл 2-((4-аміно-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлорид у трьох концентраціях. До 7-ї доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C не відмічався. 3 UA 119920 U Таблиця 2 Характеристика культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, культивованих на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C Контроль Поодинокі колонії за лінією посіву Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі 5 10 15 20 7-а доба досліду Концентрація н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 14-а доба досліду Концентрація н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 30-а доба досліду Концентрація н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 60-а доба досліду Концентрація н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 90-а доба досліду Концентрація н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній За результатами досліду видно, що дія препарату за різних концентрацій на середовищі з рН 6,5 не відрізняється від рН 7,1. За всіма дослідними (0,1, 0,5 та 1,0 %) концентрацій н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду нами відмічена відсутність росту патогенного штаму M. bovis 100 пасажу протягом всього періоду спостереження (90 діб). Таким чином, можна зробити висновок, що 0,1, 0,5 та 1,0 % концентрації н-пропіл 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлориду активно впливають на культуральні властивості патогенного штаму M. bovis, культивованих на середовищі з рН 6,5 за температури 37 ºС, стримуючи ріст і розвиток, маючи туберкулостатичну дію. Вплив ізоніазиду (гідразид ізонікотинової кислоти) на M. Bovis Використовувався класичний туберкулостатичний препарат ізоніазид за різних концентрацій, рН середовища та температури 37 °C. Ізоніазид, згідно з класифікацією протитуберкульозних препаратів міжнародної спілки боротьби із туберкульозом, належить до I групи - препарати високої ефективності. Як контроль використовували M. bovis 100 пасажу без додавання до середовища препарату ізоніазид. Для цього відбирали M. bovis 100 пасажу, який культивували за температури 37 °C на середовищі з препаратом ізоніазид у зазначених концентраціях у термостаті протягом трьох місяців на середовищі з рН 6,5 та рН 7,1 (в кількості десять пробірок із кожною концентрацією препарату). У виділених мікобактерій вивчали строки появи первинного росту, його інтенсивність і характер субкультури. 4 UA 119920 U 5 У таблиці 3 систематизовано дані про культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 7,1, що додатково містить препарат ізоніазид у трьох концентраціях. До 7-ї доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C не відмічався. Таблиця 3 Характеристика культуральних властивостей 100 пасажу M. bovis, культивованих на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C 7-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % Слизовий наліт Слизовий наліт Слизовий наліт жовтуватого кольору 14-а доба досліду Контроль Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % Поодинокі гладенькі Без змін Без змін колонії 30-а доба досліду Контроль Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % Численні колонії білого Поодинокі колонії Дрібні колонії білого кольору білуватого кольору кольору 60-а доба досліду Контроль Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % Суцільний ріст. Дещо збільшилася Дрібні колонії білого Гладенькі, дрібні колонії кількість поодиноких кольору білуватого кольору дрібних колоній 90-а доба досліду Контроль Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % Суцільний ріст Суцільний ріст Дещо збільшилася кількість поодиноких дрібних колоній Контроль 10 15 20 25 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній Характеризуючи отримані дані, що наведені в таблиці 3, нами визначена відсутність росту культури M. bovis 100 пасажу за 1 % концентрації препарату ізоніазид. На сьому добу досліду за 0,1 % концентрації виявлений слизовий наліт жовтуватого кольору, на 30-у добу з'являються поодинокі дрібні білуватого кольору, на 60-добу їх кількість збільшується і на 90-у добу визначаємо суцільний ріст, як і в контролі. За використання 0,5 % концентрації препарату ізоніазид на 7-у добу виявлений слизовий наліт, на 14 добу досліду з'являються поодинокі гладенькі колонії, на 30 та 60 добу - дрібні колонії білого кольору. На 90 добу збільшилася кількість поодиноких дрібних колоній. Аналізуючи 1 % концентрацію препарату ізоніазид, нами визначено відсутність росту патогенного штаму M. bovis 100 пасажу протягом усього періоду досліду (90 діб), що свідчить про туберкулостатичну дію препарату. Культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, накопиченого та культивованого на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C з препаратом ізоніазид у трьох концентраціях представлений в таблиці 4. До 14 доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C не відмічався. Аналізуючи результати досліду, що наведено в табл.4, нами визначені відмінності дії 1 % концентрації препарату ізоніазид на середовищі з рН 6,5, ніж за рН 7,1. Якщо на середовищі з рН 7,1 ріст культури M. bovis 100 пасажу протягом 90 діб культивування не спостерігався, то на 5 UA 119920 U 5 середовищі з рН 6,5 з 30 доби з'являються поодинокі дрібні колонії, кількість яких на 90 добу збільшувалась. 0,1 % концентрація препарату ізоніазид незначно впливає на ріст M. bovis - вже на 7 добу виявлені поодинокі колонії білуватого кольору, кількість яких поступово збільшується з терміном спостереження. За 0,5 % концентрації препарату ізоніазид ріст колоній відмічається на 14 добу - колонії дрібні, гладенькі, білого кольору, кількість яких має тенденцію до збільшення протягом терміну спостереження. Таблиця 4 Характеристика культуральних властивостей 100 пасажу M. bovis, культивованих на середовищі з рН 6,5 з препаратом ізоніазид за температури 37 °C Контроль Слизовий наліт Контроль Поодинокі колонії білуватого кольору Контроль Численні колонії білого кольору 7-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі колонії Шорсткий наліт Ріст відсутній білуватого кольору 14-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі гладенькі Ріст відсутній Без змін колонії 30-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі дрібні колонії Поодинокі колонії Дрібні колонії білого за лінією посіву білуватого кольору кольору 60-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % 1% Суцільний ріст. Колонії Ріст білуватих, Ріст білуватих, дрібні, білі, гладенькі поодиноких гладеньких поодиноких гладеньких Без змін колоній колоній 90-а доба досліду Контроль Концентрація препарату ізоніазид 0,1 % 0,5 % 1% Суцільний ріст. Колонії Збільшилася кількість Збільшилася кількість Збільшилася кількість дрібні, білі, гладенькі поодиноких дрібних поодиноких дрібних поодиноких дрібних колоній колоній колоній Контроль 10 15 Отже, проведені дослідження засвідчили, що препарат ізоніазид за 1 % концентрації пригнічує ріст і розвиток патогенного штаму M. bovis, культивованого на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C, що свідчить про туберкулостатичну його дію. Низька концентрація (0,1 та 0,5 %) препарату ізоніазид на середовищі з рН 6,5 та 7,1 за температури 37 °C ріст патогенного штаму M. bovis 100-го пасажу не стримує. 6 UA 119920 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Н-пропіл формули: 2-((4-аміно-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетату гідрохлорид , який виявляє протитуберкульозну дію. Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7