Фрагмент днк, який кодує білок родини tgf-b

1 Фрагмент ДНК, который кодирует белок семейства TGF - р ^ содержащий следующую аминокислотную последовательность Met-Asn-Ser-Met-Asp-Pro-Glu-Ser-Thr^ т а ш е ф у н к . ционально активные производные указанного белка 2 Фрагмент ДНК по п 1, отличающийся тем, что содержит следующую нуклеотидную последовательность AGA T CT OC C GGC A A T ACC AG A C C A T CC, с ч и т ь | в а н И Я для белка, начинающейся на первом нуклеотиде 3 Фрагмент ДНК по п 1 или 2, отличающийся тем, что представляет собой фрагмент ДНК, выделенный из позвоночных животных 4 Фрагмент ДНК по п 3, отличающийся тем, что позвоночное животное представляет собой млекопитающее 5 Фрагмент ДНК по п 4, отличающийся тем, что млекопитающее выбирают из группы, которая включает человека, свинью, корову и грызуна 6 Фрагмент ДНК по п 5, отличающийся тем, что грызуна выбирают из группы, которая включает крысу и мышь 7 Фрагмент ДНК по п 1, отличающийся тем, что характеризуется следующей нуклеотидной после довательностью д х ш з х с е сскжвссса дкхаоетеа. СОЛССССЙА ЙСАЭОЭЗЮЗ CECSGCCCG састотетсс ССЙЙШЗГОС дклчссеш ж о з и ш з . сссссылаз стожк-ют СОХЙОЖС •исегнлш НЙЙЯЕСМ; озйохазоз ссстедссйб дахсмаж а г а т а х озссссссд ш о с с с с х азазгаада апгазстег ждзжост 60 12о 180 240 етсссишга СЕСДЖАЙЄС СТСБСМОЙ сяозжгмз TTGGBGGCJS ЙССТЗСССАЙ ШХШСйСС «СТПйТВЗ ЯСШШЗСЬ. Ж К К Э т » . ШГССОЖС •ЕСйОЗМШї. 300 гашгаалн тиетавта жшжкж ОУКЭЗЙЗШЗ сгожазэз сазмзлоэз гжкотээзз МСЗЖЖССЕ шгсшззс смдазш; ОЭЗОЗЗЗЗЩ GCGSXGGDS noxcsficrc иялшха аэзссссвс сэзжахаи tessecxoa' икгазшаг асстссопз ааазссзш гсогаастаз апзззйетк; шсаоист озщесісет сазийсятг дазасдазз ахвссилв алэяалп ашзлвзз гдазздкэс эхссгазгас сгссягахс ишхпсеа ссохаэзз: азхязэкс аззгййаэзс ссклтсстз егептазэх ОЗССЗЖЙЛ юэээссю талтаагж; дшчааэх 420 ссолсгазс СДОЭЮЗМЙ йз^пзгата ТЄЙОВ^ШС ГКЗУЗХДІЕ; СООЇЙЙДНЗЗ В40 . ашхясгс агвеозсм юзйахзкг: Амэиссиа *азгапхтвз ЗЄО 4BO 540 600 660 720 780 900 эео иго сстзетэхс ахйдкжк СЙЭЕСЖЕССХ ОЙЗЭЖКЗ АЙСИХЗШЗ; дхсаааіе юно сгсдсокхс дсгазлоштесххастазІГТСЙОЮХ ЙІСЙЕОЕССС -ЕСЖЖПНЙ Н « 1200 ЙЙОЗШЗІОГ 120? иагсткжа ОЗЙСАІШЗ: ТОЭЗДСЕЙСТ GSTCJUCK; з я с с г о к г г laacTCCGu GSSCKTOIQ: даэгакхат •кэазокххд 8 Фрагмент ДНК, который кодирует белок семейства TGF - р _ содержащий следующую аминокислотную последовательность Leu-Leu-LyB-Ala-AsQ-Thr-Ala-Ala-Gly-Tbr, a ТЗКЖЄ функ-ционально активные производные указанного белка 9 Фрагмент ДНК по п 8, отличающийся тем, что содержит следующую нуклеотидную последовательность CTTCTCA&QGCCAACACaGCTCCUGGCACC, c р а М К О Й считывания для белка, начинающейся на первом нуклеотиде 10 Фрагмент ДНК по п 8 или 9, отличающийся тем, что представляет собой фрагмент ДНК, выделенный из позвоночных животных 11 Фрагмент ДНК по п 10, отличающийся тем, что позвоночное животное представляет собой млекопитающее 12 Фрагмент ДНК по п 11, отличающийся тем, что млекопитающее выбирают из группы, которая включает человека, свинью, корову и грызуна 13 Фрагмент ДНК по п 12, отличающийся тем, что грызуна выбирают из группы, которая включает крысу и мышь 14 Фрагмент ДНК по п 8, отличающийся тем, что характеризуется следующей нуклеотидной после О Ю О 00 48105 дователыностью сишюзсг «ижгата СЙСЙИЖСД оіетстетс гашжссс ЮОЗЗСЕВСС озикргалн ахаосйста ЩЖШОТСА зотэззвза. 1 ССЙЯЭЙСИ алеется, оаоээээггс о-шжкад стсеяиш; ШЛШЇЖ; азшкнші csmoicaaG саетшхм: амэсатзс сжааястк •гсаааэзад ОССЙСВЗССС GGCGCCCCCT жжэожас стзогазг такс ш 120 IBQ г«о 265 15 Рекомбинантная молекула ДНК, содержащая фрагмент нуклеиновой кислоты по любому из пунктов 1-7 16 Рекомбинантная молекула ДНК, содержащая фрагмент нуклеиновой кислоты по любому из пунктов 8-14 17 Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантую молекулу ДНК по п 15 18 Клетка-хозяин по п 17, отличающаяся тем, что представляет собой бактерию, грибок, клетку растения или животного 19 Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантую молекулу ДНК по п 16 20 Клетка-хозяин по п 19, отличающаяся тем, что представляет собой бактерию, грибок, клетку растения или животного 21 Способ получения белка семейства TGF - р ^ предусматривающий культивирование клеткихозяина по п 17 22 Способ получения белка семейства TGF - р ^ предусматривающий культивирование клеткихозяина по п 19 23 Белок семейства T G F ~ Р по п 1, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность 10 2D 30 40 50 CSSKALHVNF KDMGWDDHII APIJ2YEAPHC SSLCEFBLRS HLEPTHHAVI 60 70 80 98 100 QTLMHSHBPE STPPSCCVFT RbSPISXLFX OSftMUWYKQ YEDMWESCG CR 10 20 30 40 50 IQPEGYAHMF CIGQCPLHIU GHPGIAASFH Т&УЪНЬЬИШ TAA8TTGGGS 60 ?0 80 CCVPTASRFL SLLYYDRDSN rVXTDIPDMV VSACGCS 25 Фармацевтическая композиция, состоящая из активного вещества и фармацевтически приемлемого носителя, отличающаяся тем, что активное вещество представлено белком семейства T G F - p поп 23 26 Фармацевтическая композиция по п 25, отличающаяся тем, что предназначена для лечения костных, хрящевых или зубных дефектов 27 Фармацевтическая композиция по п 25, отличающаяся тем, что предназначена для процессов восстановления тканей и заживления ран 28 Фармацевтическая композиция, состоящая из активного вещества и фармацевтически приемлемого носителя, отличающаяся тем, что активное вещество представлено белком семейства T G F - p поп 24 29 Фармацевтическая композиция по п 28, отличающаяся тем, что предназначена для лечения костных, хрящевых или зубных дефектов 30 Фармацевтическая композиция по п 28, отличающаяся тем, что предназначена для процессов восстановления тканей и заживления ран 31 Антитело или фрагмент антитела, которые способны специфически связываться с белком семейства TGF ~ Р по п 23 32 Антитело или фрагмент антитела по п 31, где упомянутое антитело является моноклональным 33 Антитело или фрагмент антитела, которые способны специфически связываться с белком 24 Белок семейства T G F ~ P по п 8, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность семейства TGF ~ Р по п 24 34 Антитело или фрагмент антитела по п 33, где упомянутое антитело является моноклональным 35 Молекула кДНК, кодирующая белок по п 23 36 Молекула кДНК, кодирующая белок по п 24 Настоящее изобретение относится к новому росту/факторам дифференцировки кодирующих последовательностей ДНК семейства TGF -р В частности, это изобретение относится к новым кодирующим последовательностям ДНК семейства TGF -р подобных белкам, выделению указанных последовательностей ДНК, плазмидам экспрессии, содержащим указанную ДНК, микроорганизмам, преобразованным указанной плазмидой экспрессии, образованию указанного белка культивированием указанного трансформанта и к формацевтическим составам, содержащим указанный белок Семейство TGF -р факторов роста, содержащих BMP, TGF и белки связанные Ингибином ( Roberta and Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 419472) является в частности уместным в широком диапазоне медицинских лечений и применений Эти факторы используются в процессах, связанных с заживлением ран и восстановлением тканей Кроме того, несколько членов семейства TGF -р являются тканеиндукционными, особенно остеоиндукционными, и следовательно играют решающую роль в индуцировании хрящей и развитии костей Возней (Wozney) в работе Progress in Growth Factor Research 1 (1989), 267-280 and Vale et al , Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 211-248 описывают различные факторы роста, такие как связывающиеся с BMP /костные морфогенетические белки/ и группой Ингибина Члены этих групп разделяют значительное структурное подобие Предшественник белка состоит из аминотерминальной сигнальной последовательности, пропептидной и карбоксиконцевой последовательности примерно из 110 аминокислот, которая впоследствии расщепляется от предшественника и представляет собой зрелый белок Кроме того, их члены определяются посредством гомологии последовательностей аминокислот Зрелый белок содержит самые консервативные последовательности, в особенности семь остатков цистина, ко 48105 торые сохраняются между членами семейства Белки подобные семейству TGF -р являются многофункциональными, гормонально активными факторами роста Они также разделяют связанные биологические активности, такие как хемотактическое притяжение клеток, способствуя дифференцировке клеток и их тканеиндуцирующей способности, такой как хряще- и костно- индуцирующей способности В патенте США №5 013 649 описываются последовательности ДНК кодирующие остео-индукционные белки, под названием белки ВМР-2 /костный морфогенетический белок/ и в патентных заявках США под серийными номерами 179 101 и 179 197 описываются белки BMP ВМР-1 и ВМР-3 Кроме того, многие типы клеток способны синтезировать белки подобные семейству TGF -р и фактически все клетки обладают рецепторами TGF -р Вместе взятые эти белки показывают различия в их структуре, приводящие к значительному изменению в их детальной биологической функции Кроме того, они обнаруживаются в широком многообразии различных тканей и этапов развития Следовательно, они могут обладать различиями в отношении их функции в подробности, например необходимая клеточная физиологическая окружающая среда, их продолжительность жизни, их цели, их потребность в дополнительных факторах и их устойчивость к деградации Таким образом, хотя многочисленные белки, проявляющие ткане-индукционный, особенно остеоиндукционный потенциал, описаны, их естественная роль в организме и, что более важнее, их медицинское соответствие должны быть еще подробно разъяснены В значительной степени подозревается появление еще неизвестных членов семейства TGF-p соответствующих остеогенезу или дифференцировке/индукции других тканей Однако, основная проблема в выделении этих новых белков подобных TGF -р состоит в том, что их функция еще не может быть достаточно точно описана для разработки различительного биоанализа С другой стороны, предполагаемая гомология нуклеотидной последовательности до известных членов семейства была бы слишком низкой, чтобы позволить проверку классическими методами гибридизации нуклеиновой кислоты Тем не менее, дальнейшее выделение и определение характеристик новых белков подобных TGF -р, является крайне необходимым для удерживания всего набора белков индукции и дифференцировки удовлетворяющего все необходимые медицинские требования Эти факторы могут находить полезные медицинские применения в излечивании дефектов и излечениях дегенеративных нарушений костных и/или других тканей подобных, например, почке или печени Таким образом, технической проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, посуществу является предложение кодирования последовательностей ДНК для новых членов семейства белка TGF -р имеющего митогенный и/или дифференцированно-индуцированный, например, остео-индуцированный потенциал Решение вышеуказанной технической проблемы достигается предоставлением примеров осуществления изобретения, охарактеризованных в пунктах формулы изобретения от 1 до 17 Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидными из описания предпочтительных вариантов осуществления изобретения и чертежей Теперь будут кратко описаны листинги последовательности и чертежи Последовательность Ю №1 показывает нукдеотидную последовательность МР-52, то есть, эмбрио выведенную последовательность соответствующую зрелому пептиду и большинство кодирования последовательности для пропептида МР-52, Некоторая часть пропептидной последовательности на 5'-конце МР-52 до сих пор не была охарактеризована Последовательность Ю №2 показывает до сих пор охарактеризованную последовательность нуклеотидную МР-121 последовательность выведенную из печени Последовательность Ю №3 показывает аминокислотную последовательность МР-52, выведенную из последовательности Ю №1 Фигура 1 показывает выравнивание аминокислотных последовательностей МР-52 и МР-121 с некоторыми связанными белками 1а показывает выравнивание МР-52 с некоторыми членами семейства белка BMP начиная с первого из семи консервированных цистеинов, 16 показывает выравнивание МР-121 с некоторыми членами семейства белка Ингибина • указывает, что аминокислота является одинаковой во всех сравниваемых белках, + указывает, что аминокислота является одинаковой по крайней мере в одном из белков, сравниваемых с МР-52 /Фиг 1а/ или МР-121 /Фиг 16/ Фигура 2 показывает нуклеотидные последовательности олигонуклеотидного праймера, использованные в настоящем изобретении и выравнивание этих последовательностей с известными членами семейства TGF -р М означает А или С, S означает С или G, R означает А или G , и К означает G или Т 2а описывает последовательность праймера 01, 26 показывает последовательность праймера OID Настоящее изобретение относится к новым белкам подобным семейству TGF -р и предлагает последовательности ДНК, содержащиеся в соответствующих генах Такие последовательности включают нуклеотидные последовательности, содержащие последовательность ATGAACTCCATGGACCCCGAGTCCACA И CTTCTCAAGGCCAACACAGCTGCAGGCACC и в частности последовательности, как иллюстрированные в Последовательности ID №№1 и 2, аллельные производные указанных последовательностей и последовательностей ДНК, дегенерированных в результате генетического кода для указанных последовательностей Они также включают последовательности ДНК гибридизирующиеся при строгих условиях с вышеупомянутыми последовательностями ДНК и содержащих следующие аминокислотные последовательности 48105 Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr ОГ Leu Leu Lys Ala Asn Thr Ala Ala Gly Thr, Хотя указанные аллельные, дегенеративные и гибрид изирующие последовательности могут иметь структурные дивергенции вследствие естественно происходящих мутаций, таких как небольшие делеции или замены, они обычно будут все еще проявлять по-существу те же самые полезные свойства, позволяя их использовать в основном в тех же самых медицинских применениях В соответствии с настоящим изобретением, термин "гибридизация означает обычные условия гибридизации, предпочтительно условия с концентрацией соли 6 х SSC при температуре 62° до 66°С за которым следует промывание в течение часа 0,6 х SSC, 0,1 % SDS при температуре от 62 до 66°С Термин "гибридизация" предпочтительно относится к строгим условиям гибридизации с концентрацией соли 4 х SSC при температуре 62 66°С сопровождающейся промывкой в течение одного часа с применением 0,1 х SSC, 0,1 % SDS при температуре 62 - 66°С Важные биологические активности кодированных белков содержат митогенный и остеоиндукционный потенциал и могут определяться в анализах согласно работам Робертса и др , PNAS 78 /1981/, 5339-5343, Сейедина и др , PNAS 82/1985/, 2267-2271 или Сампата и Редди, PNAS 78 /1981/, 7599-7603 Предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются последовательности ДНК, определенные выше и получаемые от позвоночных, предпочтительно млекопитающих, таких как свинья, или корова и от грызунов, таких как крыса или мышь, и в частности от приматов, таких как люди В особенности предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются последовательности ДНК, называемые МР52 и МР-121, которые показаны в Последовательностях Ю №1 и №2 Соответствующие транскрипты МР-52 были получены из эмбриогенной ткани и кода для белка показывающего значительную аминокислотную гомологию по отношению к зрелой части белков подобных BMP/см фиг 1а/ Белковые последовательности ВМР2 /=ВМР2А/ и ВМР4 /=ВМР2В/ описываются в работе Возней и др , в журнале Science Vol 242, 1528-1534 (1988) Соответствующие последовательности ВМР5, ВМР6 и ВМР7 описываются в работе Селесте и др , Celeste et al , Proc Natl Acad Sci USA Vol 87, 9843-9847(1990) Некоторые типичные гомологии последовательностей, которые являются специфическими только для известных последовательностей BMP, были также обнаружены в пропептидной части МР-52, тогда как другие части предшественника МР-52 показывают заметные различия относительно предшественников BMP мРНК МР-121 была обнаружена в ткани печени, и ее соответствующая аминокислотная последовательность показывает гомологию относительно аминокислотных последовательностей цепей белка ингибина /см фиг 16/ Последовательности кДНК кодирующие белки подобные семейству TGF -р еще не 8 были выделены из ткали печени, вероятно вследствие низкой численности специфических транскриптов TGF -р в этой ткани Однако, в эмбриогенной ткани, кодирование последовательностей белков подобных известному семейству TGF -[3 может быть обнаружено в относительном избытке Недавно изобретатели обнаружили также наличие скопления белков подобных семейству TGF -р в печени Высокий уровень фона клонов связанных с известными факторами этой группы представляет основное затруднение в установлении новых последовательностей связанных с семейством TGF -р из этих и вероятно других тканей В настоящем изобретении клонирование осуществлялось в соответствии с методом, описанным ниже Раз была клонирована последовательность ДНК, подготовка клеток хозяина способных к продуцированию белков подобных семейству TGF -р и продуцирование указанных белков может быть легко завершено с применением известных способов рекомбинантнои ДНК содержащей построение кодирования плазмидов экспрессии указанного белка и преобразование клетки хозяина с указанной плазмидой экспрессии, культивирование трансформанта в соответствующей культурной среде, и восстановление продукта имеющего активность подобную семейству TGF -р Таким образом, настоящее изобретение относится также к рекомбинантным молекулам содержащим вышеописанные последовательности ДНК, дополнительно связанные с последовательностью управления экспрессией Такие векторы могут быть полезными в продуцировании белков подобных семейству TGF -р в устойчивых или переходных преобразованных клетках Несколько систем, имеющих отношение к животным, растениям, грибкам и бактериям, могут применяться для трансформации и последующего процесса культивации Предпочтительно векторы экспрессии, которые могут быть использованы в изобретении, содержат последовательности необходимые для репликации в клетке хозяина и являются автономно воспроизводимыми Предпочтительным также является использование векторов, содержащих избираемые гены маркера, которые могут быть легко отобранными для преобразованных клеток Необходимая операция хорошо известна специалистам в данной области Другой целью настоящего изобретения является создание клетки хозяина, преобразованной плазмидой экспрессии настоящего изобретения и способной продуцировать белок семейства TGF Р К примерам соответствующих клеток хозяина относятся различные эукариотические и прокариотические клетки, такие ник Е коли, клетки насекомых, клетки растений, клетки млекопитающих и грибки, такие как дрожжи Еще одной целью настоящего изобретения является создание белка семейства TGF -р кодированного вышеописанными последовательностями ДНК и отображающего биологические особенности такие как тканеиндуцированные, в частности остео-индуцированные и/или митогенные способности возможно относящиеся к терапевтическому лечению Вышеупомянутые особен 48105 ности белка могут изменяться в зависимости от образования гомодимеров или гетеродимеров Такие структуры могут оказаться полезными также в клинических применениях В Последовательности Ю №3 показана аминокислотная последовательность особенно предпочтительного белка семейства TGF -р /МР-52/ Другим аспектом настоящего изобретения является создание процесса для продуцирования белков подобных семейству TGF -р Такой процесс содержит культивирование клетки хозяина преобразованной с последовательностью ДНК настоящего изобретения в соответствующей культурной среде и очистку продуцированного белка подобного семейству TGF -р Таким образом, этот процесс позволит продуцирование достаточного количества требуемого белка для использования в медицинских обработках или в применениях с использованием методов культуры клеток требующих факторы роста для их действия Клетка хозяина получается из бактерий таких как Басиллус или Эшеричиа коли, из грибков таких как дрожжи, из растений, таких как табак, картофель или Арабидопсис, и из животных, в частности линий клеток позвоночных таких как Mo-, COS- или линии клеток СНО Еще одним аспектом настоящего изобретения является создание особенно чувствительного процесса для выделения последовательностей ДНК соответствующих низкой численности мРНКт в тканях, представляющих интерес Процесс настоящего изобретения содержит комбинацию четырех различных этапов Во-первых, мРНК должна быть внделена и использована в реакции амплификации с применением олигонуклеотидных праймеров Последовательность олигонуклеотидных праймеров содержит дегенерированные последовательности ДНК, выведенные из аминокислотной последовательности белков связанных с рассматриваемым геном Этот этап может приводить к амплификации уже известных членов рассматриваемого семейства генов, и эти нежелательные последовательности поэтому должны быть устранены Эта цель достигается применением эндонуклеаз рестрикции, которые известны для гидролизата уже анализированных членов семейства генов После обработки амплифицированной популяции ДНК указанными эндонуклеазами рестрикции, остающиеся требуемые последовательности ДНК выделяются электрофорезом геля и реамплифицируются в третьем этапе реакцией амплификации, и в четвертом этапе они клонируются в соответствующие векторы для секвенирования Для повышения чувствительности и эффективности, этапы два и три выполняются неоднократно, по крайней мере два раза в одном примере осуществления этого процесса В предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения, вышеописанный процесс выделения используется для выделения последовательностей ДНК из ткани печени В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения вышеописанного процесса, один праймер использованный для эксперимента PCR является гомологичным хвостовой части пол и А 10 мРНК, тогда как второй праймер содержит последовательность специфическую для генов Способы, применяемые в осуществлении различных этапов этого процесса ^акже как реакции амплификации или методы секвенирования/ известны специалисту в этой области и описаны, например, в работе Самбрук и др , 1989г "Молекулярное клонировакие лабораторное руководство", (Sambrook et al , 1989, "Molecular Cloning A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press ) Еще одной целью настоящего изобретения является создание фармацевтических составов, содержащих терапевтически эффективное количество белка семейства TGF -р настоящего изобретения Дополнительно, такой состав содержит фармацевтически приемлемый носитель Такой терапевтический состав может использоваться при заживлении ран и восстановлении тканей, а также и при заживлении костей, хрящей или дефектов зубов, и возможно с другими связанными белками или факторами роста Таким образом, терапевтический состав настоящего изобретения может содержать, но не ограничиваться, МР-52 кодированный белок совместно с МР-121 кодированным белком, и дополнительно с другими известными биологически активными веществами такими как ECF /эпидермальный фактор роста/ или PDGF /фактор роста выведенный из пластин/ Другим возможным клиническим применением белка подобного семейству TGF-p, является использование супрессора иммунологической реакции, который предотвращал бы отторжение трансплантатов органов Фармацевтический состав, содержащий белки настоящего изобретения может также использоваться профилактически, или может применяться в косметической пластиковой хирургии Кроме того, применение состава не ограничивается использованием для людей, но может включать животных, в частности, также домашних животных Наконец, другой целью настоящего изобретения является тело или фрагмент антитела, который способный специфически связываться с белками настоящего изобретения Общеизвестны способы выращивания такого специфического антитела Предпочтительно такое антитело является моноклональным антителом Такие антитела или фрагменты антител могут быть полезными для диагностических методов Следующие примеры подробно иллюстрируют описанное изобретение, но не должны быть истолкованными как ограличивающие изобретение Пример 1 Выделение МР-121 1 1 Общее количество РНК было выделено из ткани печени у человека /мужчина в возрасте 40 лет/ способом, описанным в работе Чиргвина и др, Биохимия 18 /1979/, 5294-5299, Поли А+ РНК была отделена от общего количества РНК олиго /дТ/ хроматографией в соответствии с инструкциями изготовителя (Stratagene Poly ( А ) Quick columns) 1 2 Для реакции обратной транскрипции, поли А+ РНК /1 - 2,5мкг/ выведенная из ткани печени, нагревалась в течение 5 минут до 65°С и быстро 11 48105 охлаждалась на льду Реагенты обратной транскрипции, содержащие 27 единиц защиты РНК /Фармация/, 2,5мкг олиго дЛ7і21 /Фармация/ 5 х буфер /250мМ Трис/HCL рН 8,5, 50мМ MgCL2 , 50мМ дитиотреитола /DTT/, 5мМ каждого дезоксинуклеозид-5'-трифосфата, бООмМ KCL /к 20 единиц обратной транскриптазы вируса птичего миелобластоза /AMV, Бохрингер Маннгейм/ на мкг + поли /А / РНК были добавлены Реакционная смесь /25мкл/ была инкубирована в течение 2 часов при температуре 42°С Пул кДНК печени хранился при температуре - 20°С 1 3 Деоксинуклеотидные праймеры OD и OID /фиг 2/ предназначенные дли праймирования реакции амплификации были генерированы на автоматическом синтезаторе ДНК /Биосерч/ Очистка была сделана денатурацией электрофореза в полиакриламидном геле и выделением основной полосы из геля изотахофорезом Олигонуклеотиды были разработаны выравниванием последовательностей нуклеиновых кислот некоторых известных членов семейства TGF -р и выбором участков самой высокой консервации /сохранения/ Для облегчения клонировавши, оба олигонуклеотида содержали места ограничения EcoRI и OD дополнительно содержал место ограничения Nco на своем 5' -конце 1 4 В реакции цепи полимеразы, пул кДНК выведенный из печени был использован в качестве кодирующей нити ДНК в 50мкл реакционной смеси Амплификация была выполнена в I x PCR буфере /16,6мМ /NH4/2SO4, 67мМ Трис/HCL рН 8,8, 2мМ MgCI2, 6,7мкМ ЭДТК ЮмМ р - меркаптоэтанол, 170мкг/мл BSA /альбумин бычьей сыворотки /Гибко /, 200мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата /Фармация/, 30 пикомоль каждого олигонуклеотида /OD и OID/ и 1,5 единиц Так полимеразы /АмплиТак, Перкин Элмер Цетус/ Реакция PCR содержала кДНК соответствующей ЗОнг поли /А+/ РНК в качестве исходного материала Реакционная смесь была перекрыта парафином и было выполнено 40 циклов PCR /цикл 1 80 с 93°С/40 с 52°С/40 с 72°С, циклы 2-9 60 с 93°С/40 с 52°С/40 с 72°С, циклы 10-29 60 с 93°С/40 с 52°С/60 с 72°С, циклы 30-31, 60 с 93°С/40 с 52°С/90 с 72°С, цикл 40 60 с 93°С/40 с 52°С/420 с 72°С/ Шесть реакционных смесей PCR были сгруппированы, очищены последующими экстракциями с равными объемами фенола, фенол/хлороформа /1 1/ в объемном отношении /и хлороформа/ изоамилового спирта /24 1 в объемном отношении/ и концентрированы осаждением этанола 1 5 Одной половины полученного пула PCR было достаточно для переваривания ферментами рестрикции Spr 1 /Фармация/ и AlwN 1 /Биолабс/ Вторая половина была переварена в серии реакций ферментами рестрикции Ava I /BRL/ Вторая половина была переварена в серии реакций ферментами рестрикции Ava I /BRL/, AlwN I /Биолабс/ и Tfi /Биолабс/ Переваривания эндонуклеазы рестрикции были выполнены в ЮОмкл при температуре 37°С /за исключением Tfi при температуре 65°С/ с применением 8 единиц каждого фермента в реакции от 2 до 12 часов в буферном веществе, рекомендуемом изготовителем 12 1 6 Каждая проба ДНК была фракционирована электрофорезом с применением 4% геля агарозы /3% агароза FMC Nusieve, Biozum и 1% агароза, BRL/ в трис буфере бората /83мМ Трисоснование, 89мМ борная кислота, 2мМ этилендиаминтетрауксусная кислота, рН 8/ После окраски этидиумбромидом нерасщепленные продукты амплификации /примерно 200 комплементарных пар гетероциклических оснований ДНК, маркер размера был введен параллельно/ были отделены от геля и выделены экстрагированием фенола равный объем фенолов был добавлен в отделенную агарозу, которая была измельчена на небольшие части, заморожена в течение 10 минут, встряхнута и центрифугирована Водная фаза была собрана, промежуточная фаза реэкстрагирована тем же самым объемом ТЕ-буфера, центрифугирована и обе водные фазы были комбинированы ДНК была дальше очищена дважды фенол/хлороформом и один раз экстрагированием хлороформом/ изоамиловым спиртом 1 7 После осаждения этанола, одна четвертая или одна пятая выделенной ДНК была реамплифицирована с применением тех же самых условий, которые были использованы для первичной амплификации, за исключением уменьшения количества циклов до 13 /цикл 1 80 с 93°С/40 с 52°С/40 с 72°С, циклы 2-12 60 с 93°С/40 с 52°С/60 с 72°С, цикл 13 60 с 93°С/40 с 52°С/420 с 72°С/ Продукты реамплификации были очищены, фрагментированы теми же самыми ферментами, которые описаны выше и нерасщепленные продукты были выделены из гелей агарозы как упомянуто выше для продуктов амплификации Реамплификация сопровождалась рестрикцией и выделение геля было повторено еще раз 1 8 После последнего выделения из геля продукты амплификации были переварены 4 единицами EcoR 1 /Фармация/ в течение 2 часов при температуре 37°С с применением буфера, рекомендуемого изготовителем Одна четвертая смеси рестрикции была лигирована до вектора рБлюскриптаІІ 5К+ /Стратаген/, который был переварен таким же образом EcoR I После лигирования, 24 клона из каждой комбинации фермента были дальше анализированы секвенированием Проба, ограниченная AlwN 1 и Sph І не содержала новых последовательностей только последовательности ВМР6 и ингибин рА 19 идентичных новых последовательностей, которые были названы МР-121, были обнаружены Awa I, AlwN I и Tfi ограниченных проб Одна последовательность отличалась от этой главным образом установленной последовательности двумя нуклеотидными обменами Реакция лигирования и трансформации в Е coh HBIOI были выполнены так, как описано в работе Самбрука и др , Молекулярное клонирование лабораторное руководство /1989/ (Sambrook et al (1989) Molecular cloning A laboratory manual Трансформанты были выбраны на основании устойчивости к ампициллину и ДНКт плазмиды были выделены в соответствии со стандартными протоколами /Самбрук и др , /1989// Анализ был проведен секвенированием двунитевой плазмиды "секвенированием окончания цепи дидеокси рибо нуклеотида" 13 48105 с набором секвенирования "Секвеназа Версия 2 0" /Биохимическая Корпорация Соединенных Штатов/ "Sequence Version 2 0" (United States Biochemical Corporation) Клон был завершен до З'-конца к-ДНК способом, подробно описанным в работе Фрохмана /Амплификации, опубликована корпорацией Перкин-Элмер, выпуск 5 /1990/, стр 11-15/ мРНК той же самой печени была использована для выделения первого фрагмента МР-121 и была обратно транскрибирована с применением праймера, состоящего из олиго дТ /16 остатков/ связанного с праймером адаптера / A G A A T T C G C A T G C C A T G G T C G A C G A A G C / T / 1 6 / А м п л и ф и к а ц и я была выполнена с применением праймера адаптера /AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG/ И внутреннего праймера /GGCTACGCCATGAACTTCTGCATA/ тельности МР-121 последова Продукты амплификации были реамплифицированы с применением гнездового внутреннего праймера Продукты реамплификации были клонированы после рестрикции с Sph 1 в таким же образом ограниченном векторе рТ7/ТЗ 1119 /Фармация/ и последовательность была установлена с применением набора секвенирования "Секвеназа Версия 2 0" /Биохимическая Корпорация Соединенных Штатов/ Клоны характеризовались их перекрыванием последовательности до 3конца известной последовательности МР-121 Пример 2 Выделение МР-52 Дополнительная последовательность кДНК, МР-52, была выделена в соответствии с вышеописанным способом /Пример 1/ с применением РНК из эмбриона у человека /8-9 недель возраст/ Реакция PCR содержала кДНК соответствующей 20 новым родам поли /А+/ РНК в качестве исходного материала Этап раамплификации повторили дважды для обеих комбинаций ферментов После лигирования, 24 клона из каждой комбинации фермента были дополнительно исследованы секвенированием Проба, ограниченная AlwN и Sph 1 дала новую последовательность, которая была названа МР-52 Другие клоны содержали главным образом последовательность ВМР6 и одну последовательность ВМР7 Проба, ограниченная Ava I, AlwN 1 и Tfi, не содержала новых последовательностей, но состояла главным образом из ВМР7 и нескольких последовательностей ингибина рА Клон был завершен до 3'- конца в соответствии с вышеописанным способом /Пример 1/ Тот же самый эмбрион мРНК, который был использован для выделения первого фрагмента МР-52, был обратно транскрибирован как в Примере 1 Амплификация была выполнена с применением праймера адаптера /AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG/ И в н у т р е н н е г о п р а й м е р а / C T T G A G T A C G A G G C T T T C C A C T G / последовательности МР-52 Продукты амплификации были реамплифицированы с применением гнездового праймера адаптера /ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG/ И гнездового внутреннего праймера /GGAGCCCACGAATGATGCAGTCA/ последовательности МР-52 Продукты реамплификации были клонированы после рестрикции с применением Nco 1 в подобным же образом ограниченном векторе /pUC 19 /Фармация №27-4951-01/ с изменен 14 ным местом многократного клонирования содержащего место рестрикции уникального Nco 1/ и установлена последовательность Клоны характеризовались своей последовательностью перекрывания до 3'- конца известной последовательности МР-52 Некоторые из этих клонов содержат последние 143 пары азотистых оснований 3'- конца последовательности, показанной в Последовательности Ю №1 и 0,56 т п н не транслированных участков /последовательность не показана/ Один из них был использован в качестве пробы для поиска геномной библиотеки человека /Стратаген №946203/ простым способом, подробно описанным в работе Аусубеля и др/Текущие протоколы в Молекулярной Биологии, опубликованные Greene publishing Associates and Wiley-lnterscience (1989) Из 8 x 105 Я, бактериофагов один бактериофаг 1X21 Л I, который, как было подтверждено, содержал вставку примерно 20 т п н , был выделен и отложен с применением DSM /№7387/ Этот клон содержит в дополнение к последовательности, выделенной из мРНК описанными способами амплификации, информацию последовательности, дополнительной к 5'- концу Для секвенирования фрагмент Хинд III примерно 7,5 т п н был субклонирован в таким же образом ограниченном векторе /Блюскрипт 5К, Стратаген №212206/ Эта плазмида, названная SKL52 /НЗ/ МР12, была также отложена с применением DSM /№7353/ Информация о последовательности, выведенной из этого клона, показана в Последовательности Ю № 1 На нуклеотиде №1050, определенная кДНК и соответствующая геномная последовательность отличаются на одну пару азотистых оснований /кДНК G, геномная ДНК А/ Мы допускаем, что геномная последовательность должна был правильной, поскольку это было подтверждено также секвенированием амплифицированной геномной ДНК из эмбриональной ткани, которая была использована для приготовления мРНК Геномная ДНК содержит интрон примерно 2 т п н между парами азотистых оснований 332 и 333 Последовательности Ю № 1 Последовательность интрона не показана Правильное место соединения экзон/экзона было подтверждено секвенированием продукта амплификации, выведенного из кДНК, которая содержит этот участок Информация об этом секвенировании была получена при помощи слегка измененного способа, подробно описанного в работе Фрохмана /Амплификации, опубликованные корпорацией Перкин-Элмер, выпуск 5 /1990/, стр 11-15/ Тот же самый зародыш РНК, который был использован для выделения З'-конца МР-52, был обратно транскрибирован с применением внутреннего праймера последовательности МР52, ориентированной в направлении 5' / A C A G C A G G T G G G T G G T G T G G A C T / Х в о с т о в а я ч а с т ь п о л и А была прибавлена к 5'-кокцу первой нити кДНК с применением концевой трансферазы Двухстадийная амплификация была выполнена сначала применением праймера, состоящего из олиготимидина и праймера адаптера /AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC/T16// И затем праймера адаптера /AGAATTGGCATGCCATGGTCGACG/ И внутреннего 15 праймера сти 48105 /CCAGCAGCCATCCTTCTCC/ МР-52 последовательно Продукты амплификация были реам плифицированы с применением того же самого праймера адаптера и гнездового внутреннего праймера /TCCAGGGCACTAATGTCAAACACG/ тельности МР-52 Продукты последова ре-амплификации были снова последовательно реамплифицированы с применением гнездового праймера адаптера /ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG/ И гнездового внутреннего праймера /ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG/ последовательности МР-52 Конечные продукты реамплифииации были клонированы тупым концом в векторе /Блюскрипт SK, Стратаген №212206/ ограниченном EcoRV Клоны характеризовались их перекрыванием последовательности до ДНК X 21 Л Плазмида SKL 52 /НЗ/ МР12 была отложена под номером 7353 на DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorgamsmen und Zellkulturen), Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, on 10 12 1992 Бактериофаг X 21 Л был отложен под номером 7387 на DSM 13 1 1993 Последовательность Ю № 1 Тип последовательности Нуклеотидная Длина последовательности 1207 комплементарных пар оснований Нить двойная Топология Линейная DNA Молекулярный тип ДНК - Первоначальный источник Организм человека Непосредственный экспериментальный источник Ткань эмбрионаСвойства Кодирование последовательности человеческого белка подобного семейству TGF-p /МР-52/ 60 гастзяах ажакшж: мкггсссаз ляззяогагаяхмаавсакдагоет 120 Д Т П ' У Г ' 3 7 с а п ж й с о й д з с с & з з к д с б ж £ с с & & « з ш з й м и сссгаялес ітсиазива гевакзззй GGBCECCGBS m x c & x a s гесссавнж йссогаш: ССДОХСССЙ тсгсмтд сшяшаа сваоадваг гсзезашл; апшоет эосаддш оюгшае СЙШЖЗШ ш ш м з ОИВЭХЙЙ. шззжжсс шзтшиЕ ДЗШЙЗЗЭЖ азшжхзж ажіхізіаз-ісюайсса шзтазт отшзот ілссолаа ОЙЄСККЇЗЗсталезеззсазкожке еккетхш ййааахйт созгагаэ: смахяшз HXCCCGGBG зэззэзаза: 20 4 ЗОО 16 ї ш з а н ж і АЙОЯШССЯ а ж к г а з е CSSXSTSG СЗЭЗЕПЛССТ газигаг GCGcrcceiG а э о э э л ш ЙСОЗКГЛОЇ стэзаэлс т ю з о а с т озиссзстг газйкжт йАСййасаз охвалотз ССВЗЗУЗСКЗ оаззссвзаз аюзеззсае GGCCSKGPC а с а л а з х т з з о л т а а CXSCGCSSX c x s e a s a o : j o a a w e o : ОЕИЇГДЙВЇ аіштлзззс а а а а к а я я а з з ж о з ткнтвше ЙСВЇЇЇЙЙЗХ 54D боо 660 720 7ІО шзэзхссд а а ж а о с ссзгакязе зжаазгпт йзэлзсгтз 900 ахгеахаа (ГЕЙСХЙЗ; зсдвспсйй озйскгаззс ЇССРСЮЗЗІ еээалета; сшювпэ, сйссснита Gcicaorox ЬВДЭВЗЙЮТ кгмюааій кгшмзоп м»аксгаі а э з л т а ж тезжойсв озяснісх ИУЗПОХЙТ тазкяаха калссккл кхгазиж: мсаажїї: тажтіа сюгпхгюг аянпзжшз Э60 іого юзо то ізоо Последовательность ID № 2 Тип последовательности Нукдеотидный Длина последовательности 265 комплементарных пар оснований Нить единичная Топология Линейная Молекулярный тип откДНКдомРНК Первоначальный источник Организм Человека Непосредственный экспериментальный источник Ткань печени Свойства Человеческий белок подобный семейству TGF -р /МР-121/ аяажлэзл1 ЕЯМПКЗЕ ССЯШРИСЙ сйсвэзетя стсмжпс . GgacCTCTG стазззтас яюггатаа. a m m r c ; ЮГЗЖІЕРСА шзкэкза. сшнюшз асквскгас СЖЗОЩЯЭЕ 24D Последовательность Ю № 3 Тип последовательности аминокислота Длина последовательности 401 аминокислота Первоначальный источник Организм Человека Непосредственный экспериментальный источник Свойства Человеческий балок подобный семейству TGF -р (МР-52) 17 10 № 52 ОШЯШШ 20 48105 18 S O ЗО 49 ЙЕШ2ШС ШШЕЯРШЗ 10 вда г СКШШТЛР srrxsmsm ЙКЯЯШГК 20 ЗО 4G S O шізх ISSGSHfflS СЭЭЗСЕЗНт QiSGSSISES ЗЖШЕОйШ ШР 5 ШКНШЭТВЕ ШЮЩСНП ИЙЗШШТС ИКЯЕИЛ® штопш: С^НСШПЙ GKPGSBSSEB тнт»зшж СШР~