Спосіб одержання рекомбінантного с-пептиду проінсуліну людини

Реферат: Винахід належить до способу одержання рекомбінантного с-пептиду людини, що включає культивування штаму-продуцента Escherichia coli, руйнування бактеріальних клітин дезінтеграцією, відділення "тілець включення", що містять гібридний білок, їхнє розчинення в буфері, що містить сечовину і дитіотреїтол, ренатурацію й очищення ренатурованого гібридного білка, його розщеплення трипсином і карбоксипептидазою В, обробку якими здійснюють одночасно, при цьому продукти трипсинолізу розділяють хроматографією на SP-сефарозі, врівноваженій 0,03-0,1 М амоній-ацетатним буфером рН 3,6, що містить 3М сечовини, елююючи лінійним градієнтом хлористого калію від 0 до 0, 5 М в стартовому буфері, з наступним очищенням і одержанням цільового продукту. UA 99481 C2 (12) UA 99481 C2 UA 99481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки, до якої належить винахід. Винахід стосується біотехнології, зокрема генної і білкової інженерії, і може бути використаний для одержання рекомбінантного с-пептиду (зв'язувального пептиду проінсуліну) людини. Попередній рівень техніки Розрізняють декілька форм с-пептиду довжиною від 31 до 3 5 амінокислотних залишків. Форми розрізняються вмістом залишків аргініну і лізину на С- і N-кінцях поліпептиду. Ці амінокислоти не входять до складу молекули зрілого інсуліну людини і, на думку деяких дослідників, повинні належати до с-пептиду. Однак у кровоносне русло секретується тільки зрілий с-пептид довжиною 31 амінокислотний залишок, що не містить основних амінокислот. Послідовність цієї форми с-пептиду приведена нижче. Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Попередник с-пептиду синтезується в острівцях Лангерганса спеціалізованими клітинами підшлункової залози в складі препрогормону (препроінсуліну). Утворення с-пептиду відбувається там же в результаті посттрансляційних модифікацій. На першому етапі від препроінсуліну відщеплюється сигнальна послідовність - N-кінцевий фрагмент, що містить 23 амінокислотних залишки. З проінсуліну (86 амінокислотних залишків), що утворився у комплексі Гольджі, за участю специфічних пептидаз, відбувається утворення зрілого с-пептиду (31 амінокислотний залишок). Згодом він секретується в кровоносне русло в еквімолярному співвідношенні з інсуліном. с-Пептид проінсуліну людини був описаний у 60-х роках XX століття. Первісні дослідження не знайшли існування у нього специфічної біологічної функції. Довгий час вважалося, що він необхідний тільки для утворення правильної конформації білкової молекули інсуліну. На початку 90-х років XX століття [Johansson et al., 1992] з'явилося багато відомостей про застосування с-пептиду для профілактики і лікування ускладнень, пов'язаних з діабетом. сПептид з успіхом застосовувався для поліпшення стану пацієнтів, що страждають від ретинопатії, ангіопатії і нефропатії - основних факторів інвалідизації і смертності при діабеті [Ido, Science, 1997, 277, 563-566; Forst, 1998, Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 106, 270-276 й ін.]. Однак у даний час великомасштабні дослідження і застосування в клініках утруднені через недостачу с-пептиду на ринку, його високу вартість і низьку якість. Так, наприклад, відомий постачальник реактивів - корпорація Sigma-Aldrich - пропонує с-пептид, що має чистоту 85% за ціною 371,5 євро за 250 мкг препарату [Каталог Sigma 2006-2007, с. 706]. Інша корпорація Phoenix Pharmaceuticals, Inc. - пропонує 200 мкг препарату за ціною 75,00 доларів. При цьому компанія не вказує ніяких даних щодо якості пептиду, що продається. В організмі здорової людини с-пептид секретується в еквімолярному співвідношенні з інсуліном. Точна кількість, необхідна пацієнтам, що страждають діабетом, у даний час не визначена. Якщо припустити, що хворим необхідно еквімолярне введення препаратів інсуліну і с-пептиду, то при добовій дозі інсуліну 3 мг буде потрібне введення приблизно 1,5 мг с-пептиду. Таким чином, при застосуванні с-пептиду, що є на ринку, вартість терапії одного пацієнта протягом місяця буде становити більше 15000 доларів. При цьому його якість не задовольняє вимогам, що виставляються до фармакологічних препаратів. На відміну від інсуліну амінокислотна послідовність с-пептиду сильно відрізняється у різних видів ссавців, що унеможливлює одержання його з тваринної сировини. Існуючі способи одержання с-пептиду, можна поділити на три категорії: 1) Одержання с-пептиду хімічним синтезом. Цим способом одержана більшість препарату, представленого на ринку в даний час [Sigma-Aldrich, Phoenix Pharmaceuticals, Inc. і ін.]. 2) Одержання с-пептиду біосинтетичними методами в складі злитих білків [Huang, Acta Biochim. Biophys. Sin. 2006, 38: 586-592; Jonasson, Journal of Biotechnology 76 (2000) 215-226]. Для одержання с-пептиду цим способом створюється химерний білок, в якому за лідерним фрагментом йдуть декілька послідовностей с-пептиду, розділених амінокислотами, що забезпечують гідроліз специфічними протеазами. На першому етапі відбувається культивування мікроорганізмів у ферментерах, потім у них індукується синтез рекомбінантного поліпептиду; клітини руйнуються, і рекомбінантний білок очищається й обробляється специфічними протеазами, які приводять до одержання с-пептиду. На заключному етапі відбувається очищення с-пептиду від домішок. Даний спосіб може забезпечити великі обсяги виробництва, але вимагає створення штамів-продуцентів, відпрацьовування умов культивування мікроорганізмів, способів очищення рекомбінантного білка, а також створення і валідації методів контролю якості. 1 UA 99481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3) Одержання с-пептиду біосинтетичними методами разом з інсуліном. Цей спосіб виробництва полягає у введенні деяких модифікацій у технологію одержання рекомбінантного інсуліну з метою оптимізації одержання с-пептиду, що утворюється на певних етапах виробництва, в основі якого лежить одержання проінсуліну, що не піддається модифікаціям. Даний спосіб має ряд переваг. Для одержання с-пептиду цим способом не потрібне створення нових штамів-продуцентів, відпрацьовування технології очищення і згортання білка, створення нових інструментальних методів контролю виробничого процесу. Крім того, сировиною для одержання с-пептиду, у даному випадку, є відходи, що утворюються при виробництві рекомбінантного інсуліну. Найбільш близьким за технічною сутністю до заявленого винаходу, є спосіб одержання с-пептиду, запропонований J. Nilsson з співавторами (1). Спосіб полягає в культивуванні штаму-продуцента Е. соlі, продукуючого проінсулін, що містить два синтетичних IgG зв'язувальних домени стафілококового білка А. Автори спромоглися досягти високої продуктивності штаму-продуцента за рахунок використання ними розробленого багатого живильного середовища. Вихід проінсуліну становив 3 г/л живильного середовища. Схема виділення полягала в руйнуванні бактеріальних клітин, одержанні «тілець включення», що містять проінсулін, розчиненні «тілець включення», окисного сульфітолізу проінсуліну, його ренатурації, очищенню ренатурованого білка афінною хроматографією на IgG-сефарозі, розщепленні проінсуліну протеолітичними ферментами (трипсином і карбоксипептидазою В) і заключному очищенню інсуліну і с-пептиду високоефективною рідинною хроматографією з оберненою фазою. Недоліками даного способу є: А) використання багатого живильного середовища для вирощування мікроорганізму, тривалий час вирощування (близько 34 годин), висока собівартість цільового продукту, обумовлена використанням для очищення афінного сорбенту, який дорого коштує у виробництві і недовговічний у промисловому використанні. Недоліком також можна вважати використання в технології одержання інсуліну і с-пептиду детергенту Tween 20. Відомо, що використання детергентів при виділенні білків приводить до їх сорбції на білок і присутності детергенту в кінцевому продукті. Також очищення с-пептиду тільки методом хроматографії з оберненою фазою приводять до низького виходу на даній стадії, яка становить разом 44%. Б) Виділення й очищення проінсуліну як проміжного продукту ускладнює процес і знижує вихід цільових продуктів. Даний винахід усуває наявні недоліки способів одержання с-пептиду. Суть винаходу У даному винаході описується спосіб одержання рекомбінантного с-пептиду, що повністю сумісний з існуючою технологією одержання рекомбінантного інсуліну людини, розкритий у патенті Російської Федерації RU2144957, дата публікації 27 січня 2000 р. Суть винаходу полягає в способі одержання рекомбінантного с-пептиду людини, що містить культивування штаму-продуцента Escherichia coli, руйнування бактеріальних клітин дезінтеграцією, відділення «тілець включення», що містять гібридний білок, їх розчинення в буфері, який містить сечовину і дитіотреїтол, ренатурацію й очищення ренатурованого гібридного білка, його розщеплення трипсином і карбоксипептидазою В з наступним очищенням і одержанням цільового продукту. Як штам-продуцента використовують штам Escherichia coli JM109/pPINS07, очищення ренатурованого гібридного білка здійснюють шляхом осадження домішаних сполук підкисленням до рН 4,0-6,0 з наступною хроматографією надосадової рідини на КМ-сефарозі, розщеплення гібридного білка трипсином і карбоксипептидазою В здійснюють одночасно, при цьому продукти трипсинолізу розділяють хроматографією на SP-сефарозі, урівноваженою 0,03-0,1 М амоній-ацетатним буфером, рН 5,0-6,0, що містить 3 М сечовини, з елюцією лінійним градієнтом хлористого калію від 0 до 0,5 М в стартовому буфері. Білковий матеріал, що не сорбується за даних умов і який містить с-пептид, збирають і потім проводять очищення с-пептиду на аніонообмінних сорбентах і методами обернено-фазової високоефективної хроматографії. Основна відмінність даного способу одержання с-пептиду полягає в тому, що для його виробництва не потрібно витрат на культивування мікроорганізму, виділення й очищення гібридного білка, а також на ферментну обробку, тому що за вибраних умов гідролізу гібридного білка с-пептид не руйнується і зберігає свою структуру. До числа безпосередніх витрат на виробництво с-пептиду належать витрати, пов'язані з двома стадіями хроматографічного очищення і ліофілізацією. Причому за рахунок застосування аніонообмінної хроматографії низького тиску вдається суттєво продовжити ресурс сорбентів, застосовуваних для високоефективної хроматографії, і підвищити вихід с-пептиду на стадії очищення. 2 UA 99481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Найкращий варіант здійснення даного винаходу Для одержання рекомбінантного с-пептиду людини використовують рекомбінантний штам бактерії Escherichia coli JM109/рРINS07-продуцент гібридного поліпептиду, що містить проінсулін людини. Штам депонований у Центральній колекції мікроорганізмів Російського акціонерного товариства «БІОПРЕПАРАТ» ЦКМК «Б» під № ЦКМ В-66ІН. Вирощування посівної й основної культури рекомбінантного штаму проводять на живильному середовищі, що містить в г/л: гідролізат казеїну солянокислий - 20, екстракт пекарських дріжджів - 14, двозаміщений фосфат калію триводний - 6, однозаміщений фосфат калію - 3, сульфат магнію - 0,5, натрій хлористий - 5, глюкозу - 10, ампіциліну натрієву сіль 0,05, воду очищену - інше. Посівний матеріал використовують для засівання ферментера загальною ємністю 200-1500 л. Для індукції синтезу гібридного білка в середині логарифмічної фази росту вносять 1-ізопропіл-Р-В-1-тіогалактопіранозид. У процесі вирощування концентрацію розчиненого кисню підтримують на рівні 40±15%, кількість глюкози, що вводиться, регулюють за рівнем розчиненого кисню і рН. Після закінчення вирощування культуру концентрують на сепараторі і руйнують на гомогенізаторі Гауліна в 0,1 М Трис-буфері, що містить 1,5 М сечовини і 1 мМ ЕДТА. «Тільця включення» відокремлюють центрифугуванням. Виділення гібридного білка з гранул проводять за наступною схемою. «Тільця включення» розчиняють у буфері, що містить 0,1 М Трис, 8 М сечовину, після чого додають 5-10 мм дитіотреїтолу. Гібридний білок ренатурують шляхом інкубації в 5-10-кратному об'ємі 0,1 М гліцин-NaOH буфера, рН 9-11 при t = 10-14°С. Кислотне осадження проводять доведенням рН до 4,0-6,0 розчином НСl. Осад, що утворився, відокремлюють мікрофільтрацією. Очищення гібридного білка проводять хроматографією на КМ-сефарозі, урівноваженою 0,05 трис-НСІ буфером, рН 7,0-7,5. Білок елююють буфером, що врівноважує, який містить 0,25 М NaCl і 1,5 М сечовини. Ферментативне розщеплення гібридного білка трипсином і карбоксипептидазою В проводять при співвідношенні карбоксипептидаза:гібридний білок - 0,3:1000. Співвідношення трипсин:карбоксипептидази В становить 0,75:1. Реакцію починають при температурі 8,5-9,5°С, потім реакційну суміш поступово нагрівають до 17-20°С. Після завершення процесу реакцію зупиняють підкисленням трифтороцтовою кислотою до рН 3,3. Продукти трипсинолізу хроматографують на SP-сефарозі, урівноваженій 0,03 М амонійацетатним буфером, рН 3,6, що містить 3 М сечовину. На цій стадії інсулін сорбується на носій, а с-пептид елююється у фракціях проскакування. Фракції проскакування розводять у співвідношенні вода:матеріал - 3:1 і доводять рН до величини 4,0-6,0. Потім цей матеріал піддається хроматографії на аніонообмінному сорбенті. Елюція здійснюється в трис-ацетатному буфері рН 5,0 підвищенням градієнту хлористого калію до 0,5 М. Фракції, що містять чистий матеріал, піддають очищенню на стандартному устаткуванні для препаративної обернено-фазової хроматографії. Чистий матеріал піддається ліофільному сушінню і зберігається в такому вигляді до використання. Приклад одержання с-пептиду на дослідно-промисловому устаткуванні 1. Вирощування біомаси продуцента, що містить гібридний білок Робочу культуру клітин рекомбінантного штаму Escherichia coli JМ109/рРINS07-продуцента гібридного поліпептиду (білка), що містить проінсулін людини, зберігають у водно-гліцериновому розчині в скляних або полімерних ампулах при температурі мінус 40°С. На всіх стадіях розмноження мікробних культур використовують живильне середовище наступного складу (г/л): 50 3 UA 99481 C2 5 10 Дослідно-промислова лінія для вирощування біомаси продуцента складається з качалкиінкубатора на 12 качалкових колб і ферментерів ємністю 15, 150 і 1500 л. Посівні культури готують у кількості 1/10 від об'єму живильного середовища, що засівається. На першому етапі розмноження 2 колби з живильним середовищем засівають вмістом однієї ампули з робочою культурою й інкубують в качалці при 37°С протягом 18 годин. Вирощеною культурою засівають 10-12 колб, що містять по 100 мл живильного середовища, і вирощують до оптичної щільності (ОЩ) 4-6 од. (довжина хвилі - 540 нм, довжина оптичного шляху - 10 мм). Ланцюг ферментерів, виготовлений за індивідуальним замовленням, має погоджені геометричні, фізичні і мас-обмінні характеристики. Керування процесами підготовки живильних середовищ і проведення культивування здійснюється за програмами, закладеним у комп'ютери. Основні умови вирощування посівних культур 15 20 25 30 Для всіх посівних культур проводять структурно-морфологічний аналіз, при якому оцінюється не тільки «чистота» культур, але і морфологічна структура клітин мікроорганізму. За результатами аналізу приймається рішення про можливість подальшого використання посівного матеріалу. Вирощування основної культури продуцента проводять у ферментері загальною ємністю 1500 л. Склад живильного і середовища основні умови культивування такі ж, як і для посівних культур, однак для індукування біосинтезу гібридного білка на певній стадії розвитку культури в неї вноситься індуктор 1-ізопропіл-р-0-1-тіогалактопіранозид. Максимальне накопичення гібридного білка відбувається в тому випадку, коли індукцію гібридного білка провокують в середині логарифмічної фази росту. Для вибраних нами умов вирощування це відповідає нагромадженню біомаси 7-10 од. ОЩ. Після додання індуктора вирощування продовжують до утворення внутрішньоклітинних включень гібридного білка «тілець включення» у 90-95% клітин. Експрес-контроль процесу накопичення «тілець включення» (ТВ) здійснюють за допомогою фазово-контрастної мікроскопії препаратів «роздавлена крапля». Основні параметри процесу приведені в таблиці. 4 UA 99481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Після утворення ТВ у 90-95% клітин подальше культивування може привести до часткового лізису клітин і втрати накопиченого гібридного білка. Відповідно до результатів ретроспективного аналізу в культурах накопичується до 3 г/л гібридного білка. 2. Виділення «тілець включення» Ріст культури у ферментері зупиняють шляхом різкого скорочення інтенсивності перемішування, включаючи аерацію, і охолодження до 10-14°С. Охолоджену культуру концентрують на сепараторі у 8-10 разів. Одержують 100-125 л суспензії, у яку вводять концентрат буфера (на 50 л води очищеної - 15 кг сечовини, 1,4 кг натрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти і 0,9 кг Трис-буфера). Забуферену суспензію двічі пропускають через гомогенізатор Гауліна при тиску 700-800 атм. Температура суспензії не повинна бути вище 15-20°С, що досягається охолодженням живильника і приймача гомогенізатора. Гомогенат клітин пропускають через проточну центрифугу (g = 18000). Основна маса «тілець включення» (не менше 90%) осаджується в роторі центрифуги, а розчинні білки і залишки клітинних стінок скидаються з центрифуги в збірник для інактивації. Вологий осад «тілець включення», 8-10 кг, вивантажують з ротора центрифуги, фасують у поліетиленову тару, заморожують і зберігають у морозильнику при температурі мінус 40°С. Термін збереження - до 6 місяців. Втрати гібридного білка при виділенні «тілець включення» не перевищують 15%. 3. Виділення гібридного білка У реактор об'ємом 250 л заливають 100 л буферного розчину, що містить 8М сечовини, завантажують 10-12 кг пасти «тілець включення» і включають перемішувальний пристрій. Після розчинення «тілець включення» додають у реактор 0,150 кг дитіотреїтолу і продовжують перемішувати протягом 10-12 годин. У реактор із сорочкою об'ємом 1200 л заливають 900 л гліцин-NaOH буфера, рН 9-11 і охолоджують його до температури 10-14°С, подаючи в сорочку охолоджену воду. Після того як буфер остудиться, починають насосом подавати в реактор розчин гібридного білка з відновленими дисульфідними зв'язками. Протягом 20-24 годин інкубують розчин гібридного білка, перемішуючи і підтримуючи температуру в реакторі 10-14°С. Після того як 75-80% гібридного білка (ГБ) ренатурує з утворенням правильно замкнутих S-S зв'язків (контроль методом ОФ ВЕРХ), проводять підкислення реакційного середовища в реакторі до рН 4,0-5,5 розчином соляної кислоти. Зупиняють перемішування і через 4-5 годин відокремлюють осад, що сформувався, на мікрофільтраційній установці. Правильно згорнутий гібридний білок сорбують з фільтрату на іонообмінну колонку об'ємом 20 л, заповнену КМсефарозою, попередньо урівноваженою 0,05 Мтрис-НСІ буфером, рН 7,0-7,5. Сорбований білок елююють з колонки, пропускаючи через неї врівноважувальний буфер, з доданням 0,25 М NaCl і 1,5 М сечовини. Фракції, що містять гібридний білок з чистотою не менше 95% (ОФ ВЕРХ), об'єднують і використовують для подальшої роботи. 4. Ферментативний гідроліз гібридного білка 5 UA 99481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Розщеплення ГБ трипсином і карбоксипептидазою В проводять у реакторі з нержавіючої сталі, забезпеченому перемішувальним пристроєм, і сорочкою. Розчин ГБ у кількості 100-150 л (вміст білка 1-1,2 кг) вносять у реактор, включають перемішувальний пристрій, і подають у сорочку охолоджену воду з температурою 8-9°С. Через 30-40 хв після того як розчин ГБ остудиться до температури 10-12°С, вимірюють показник рН розчину ГБ і за допомогою 1 М розчину трис-(оксиметил)амінометану доводять його значення до рН 7,0-7,5. Потім у реактор вносять розчин карбоксипептидази В і трипсину з розрахунку, що масове співвідношення внесеної в реактор карбоксипептидази В і гібридного білка дорівнює 0,3:1000, а масове співвідношення трипсину і карбоксипептидази В становить 0,75:1. Через 1000-1200 хв реакцію розщеплення ГБ трипсином зупиняють, підкисляючи вміст реактора трифтороцтовою кислотою до рН 3,3. Одержаний розчин наносять на хроматографічну колонку об'ємом 20 л. заповнену SPсефарозою, попередньо урівноваженою 0,03 М амоній-ацетатним буфером, рН 3,6 з добавкою 3 М сечовини і збирають фракції, що містять с-пептид. На даній стадії на SP-сефарозу сорбується інсулін, а с-пептид не взаємодіє із сорбентом і виходить у фракціях проскакування. Фракції, що містять с-пептид, об'єднують, розводять водою в об’ємному співвідношенні матеріал:вода 3:1 і після підведення рН до 4-6 наносять на колонку. Потім колонку промивають 20 мМ трис-ацетатним буфером, рН 5,0 до досягнення базової лінії контрольного проточного денситометру. Сорбований с-пептид елююють лінійним градієнтом хлористого калію від 0 до 0,5 М в тому ж буфері. Об'єднують фракції, що містять с-пептид з чистотою не менше 90% (контроль здійснюється методом аналітичної обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії - ОФ ВЕРХ), і передають на стадію препаративної ОФ ВЕРХ. Потім доводять рН розчину до значення 6,3-6,5 10% розчином аміаку. Середній вихід на даній стадії очищення перевищує 85%. 5. Очищення с-пептиду методом препаративної обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії (ОФ ВЕРХ) Очищення с-пептиду методом ОФ ВЕРХ проводять на стандартному устаткуванні Kiloprep 250 фірми Waters, CШA або аналогічному устаткуванні інших фірм. Установка містить у своєму складі наступні елементи: - блок керування, - двоголовний мембранний насос високого тиску, - насос високого тиску для накачування проби на розділення, - ультрафіолетовий детектор з перемінною довжиною хвилі, - препаративна колонка з пристроєм для радіального стиску, - пневморегульовані клапани потоку на виході, - комп'ютер для керування й обробки даних. Підготовку хроматографічної установки до роботи проводять відповідно до інструкції фірмивиробника для окремих блоків і установки в цілому. Для проведення робіт установлюють картридж, заповнений силікагелем із щепленою фазою С18 фірми «Videk», США, у колонку і створюють у сорочці колонки тиск згідно з прикладеним до картриджа паспортом. Підключають колонку гнучкими армованими шлангами до хроматографу. Промивають колонку послідовно розчином 0,1% ТФО в кількості 2-3 об'єму колонки, потім 1-2 об'ємами ацетонітрилу (В) і 1-2 об'ємами води. Підготовлена в такий спосіб колонка використовується на стадії очищення. У підготовлену колонку за допомогою насоса для подачі проби з ємності подають розчин спептиду з попередньої стадії в кількості 35-40 г білка. Включають програмуючий пристрій і ведуть розділення за наступною програмою: 50 Реєстрацію процесу розділення ведуть при 220 нм на проточному спектрофотометрі при чутливості приладу 2,0. Збір фракцій білка ведуть за допомогою колектора хроматографа або 6 UA 99481 C2 5 10 15 20 вручну. Зібрані фракції основного піка с-пептиду аналізуються на вміст домішок методом аналітичної обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії. Вихід с-пептиду на даній стадії перевищує 80%. Таким чином, сумарний вихід за двома стадіями хроматографічного очищення становить більш 70%, що більш ніж у 1,5 рази перевищує одержаний Nilsson et al. 6. Фінішне очищення і ліофілізація с-пептиду Фракції, що містять не менше 95% с-пептиду, поєднують у скляному реакторі, забезпеченому сорочкою, датчиками температури і рН. Потім доводять рН розчину до значення 6,3-6,5 10% розчином аміаку. Матеріал піддається стерилізучій фільтрації і в стерильних умовах розливається по флаконах. Потім здійснюється ліофільне висушування препарату й закупорювання флаконів у стерильних умовах. Таким чином, застосування даного способу дозволяє з високим виходом одержувати с-пептид проінсуліну людини з чистотою не менш 95% з відходів, що утворюються в процесі одержання рекомбінантного інсуліну людини. Список літератури 1. Nilson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. Integrated production of human insulin and its C-peptide. 1996, Journal of biotechnology, v. 48, p. 241-250. 2. Патент РФ RU2144957, 27. 01. 2000. 3. Johansson et al., 1992. 4. Ido, Science, 1997, 277, 563-566. 5. Forst, 1998, Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 106, 270-276. 6. Huang, Acta Biochim. Biophys. Sin. 2006, 38: 586-592. 7. Jonasson, Journal of Biotechnology 76 (2000) 215-226. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 30 35 1. Спосіб одержання рекомбінантного с-пептиду людини, що включає культивування штамупродуцента Escherichia coli, руйнування бактеріальних клітин дезінтеграцією, відділення "тілець включення", що містять гібридний білок, їхнє розчинення в буфері, що містить сечовину і дитіотреїтол, ренатурацію й очищення ренатурованого гібридного білка, його розщеплення трипсином і карбоксипептидазою В, обробку якими здійснюють одночасно, при цьому продукти трипсинолізу розділяють хроматографією на SP-сефарозі, врівноваженій 0,03-0,1 М амонійацетатним буфером рН 3,6, що містить 3М сечовини, елююючи лінійним градієнтом хлористого калію від 0 до 0, 5 М в стартовому буфері, з наступним очищенням і одержанням цільового продукту. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що штамом-продуцентом є Е. соlі JM109/pPINS07, ренатурацію й очищення ренатурованого гібридного білка проводять шляхом осадження домішкових сполук підкисленням до рН 4,0-6,0 з наступною хроматографією на КМ-сефарозі. Комп’ютерна верстка M. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7