Спосіб одержання рекомбінантного інсуліну людини

Спосіб одержання рекомбінантного інсуліну людини шляхом конструювання рекомбінантної плазмідної ДНК, яка кодує проінсулін, зв'язаний з лідерною послідовністю через аргінін, одержання і культивування штаму-продуцента гібридного білка ESCHERICHIA COLI, виділення і дезінтеграції клітин, виділення гібридного білка, його ферментативного розщеплення з наступним очищенням і одержанням цільового продукту, який відрізняється тим, що ділянка рекомбінантної плазмідної ДНК, яка кодує гібридний білок з амінокислотною послідовністю проінсуліну людини, має наступну структуру: 2 (19) 1 3 76661 4 специфічністю тваринних білків. Технологія одерколонці з сефадексом G-25 і ренатурують за дожання інсуліну людини представлена двома напомогою 2-меркаптоетанолу. Очищений ренатуропрямками: 1) технологіями одержання інсуліну ваний білок розщеплюють трипсином, а подальше людини напівсинтетичного та 2) технологіями перетворення отриманих продуктів в інсулін проодержання інсуліну людини біосинтетичного. водять з використанням карбоксипептидази В. Інсулін людини напівсинтетичний одержують із Потім його очищують катіонообмінною свинячого інсуліну за допомогою реакції хроматографією, фракції з високим вмістом транспептидації, використовуючи трипсин інсуліну об'єднують і проводять заключне очищен[Деклараційний патент України № 46667А, 2001 ня гельфільтрацією. рік; заявка № 2002135039, рішення про видачу Це рішення дозволяє відмовитися від стадії патенту Росії від 29.11.2004 року]. Технологія бромціанового гідролізу при одержанні інсуліну, одержання біосинтетичного інсуліну є найбільш тобто від використання токсичної сполуки, в певній перспективною. Вона базується на технології мірі скоротити технологічний процес та підвищити рекомбінантних ДНК. Спочатку вдалося розробити вихід гібридного білка за рахунок відмовлення від технологію одержання біосинтетичного інсуліну додаткового імуноглобулін G - зв'язуючого домена людини шляхом дисульфідного зшивання між аргініном і проінсуліном. Але його недоліками ланцюгів А і В, які клонувалися і синтетизувалися є недостатній вихід гібридного білка та утворення окремо [Goeddel D.V. et al., 1979, Proc. Natl. Acad. домішок, які важко усуваються (des.Thr30-Ins), що Sci, USA 76 : 106 –110]. В подальшому було встапризводить до зменшення виходу кінцевого проновлено, що інсулін з більш високим виходом дукту - рекомбінантного інсуліну людини. утворюється із свого біосинтетичного попередника Завданням винаходу є створення ефективного - проінсуліну [Couseus L. et al. 1987, Gene, 61: 265 способу одержання рекомбінантного інсуліну лю– 267]. Ген, який кодує біосинтез проінсуліну людини, який гарантує збільшення виходу гібридного дини, був одержаний біля 20 років тому як синтебілка та одержання кінцевого продукту високої зом кДНК на матриці мРНК, яку виділили з якості. підшлункової залози людини [Bell G.J. et al., 1979, Поставлене завдання вирішується тим, що у Nature, 282, 525 – 527], так і хімікоспособі одержання рекомбінантного інсуліну люферментативним синтезом [Williams D.C. et al., дини шляхом конструювання рекомбінантної 1982, Science, 215,687-689]. плазмідної ДНК, в якій проінсулін зв'язаний з На сьогодні вже розроблена методологія лідерною послідовністю через аргінін, одержання і експресії гена проінсуліну людини у клітинах Е. культивування штаму-продуцента гібридного білка соїі. Вона полягає у біосинтезі клітинами бактерій ESCHERICHIA COLI, виділення і дезінтеграції проінсуліну у складі гібридних білків у вигляді неклітин, виділення гібридного білка, його ферменрозчинних „тілець включення". Гібридний білок тативного розщеплення з наступним очищенням і забезпечує резистентність щодо дії одержанням цільового продукту, згідно з винахопротеолітичних ферментів клітин і ефективне дом ділянка рекомбінантної плазмідної ДНК, яка відщеплення лідерної послідовності від кодує гібридний білок з амінокислотною проінсуліну людини. В якості лідерної послідовністю проінсуліну людини, має наступну послідовності використовують глутатіон-Зструктуру: трансферазу, бичачий протимозін, імуноглобулін G-зв'язуючі домени білка А із S.aureus та інші (патент № 2144957, Росія, 1998 рік). Лідерні фрагменти відщеплюють хімічним або ферментативним шляхом. Хімічний спосіб передбачає обробку бромціаном по залишку метіоніну, а ферментативний - розщеплення по залишку аргініну - використання трипсину. Як відомо, бромціан є високотоксичною сполукою, тому його використання є головним недоліком цієї технології. Найбільш близьким до винаходу за технічною суттю та результатом, якого досягають, є спосіб одержання рекомбінантного інсуліну людини за патентом України № 24452, 1998 року. Згідно з цим патентом в якості штаму-продуцента гібридного білка використовують штам Escherichia і в якості штаму-продуцента використовують штам coli XLl-Blue, який характеризується наявністю ESCHERICHIA COLI BL21/pIK8-proins, який плазміди pInsR, котра кодує гібридний білок, в характеризується наявністю сконструйованої якому проінсулін людини - попередник інсуліну плазміди, а перед ферментативним розщеплензв'язується з природним лідерним пептидом через ням гібридного білка проводять його обробку цитзалишок аргініну і одержується на основі векторної раконовим ангідридом. плазміди рКК223-3. Клітини цього штаму культиПриклад 1 вують, вирощують в необхідній кількості біомасу, Конструювання рекомбінантної плазмідної відібрані клітини дезінтегрують, проводять окисний ДНК. Рекомбінантна плазмідна ДНК створюється сульфітоліз, очищують одержаний рекомбінантний на основі одного з представників серії зЕТ білок-8-сульфонат аніонообмінною векторів, в нашому випадку, рЕТ 28а (+). Даний хроматографією, потім знесолюють його на 5 76661 6 вектор розміром 5369 п.н. (пар іуклеотидів) містить округлі колонії білого кольору діаметром 2-3 мм за сайт ініціації реплікації (огі), ген стійкості до 12 годин інкубації при 37 С; канаміцину (Кап), юлілінкерну ділянку та репре2) фізіолого-біохімічні: клітини зростають в сорний ген (Lad). Полілінкерна ділянка міститься температурному діапазоні від 5 до 40 С, оптимум за такими регуляторними ділянками, як Т7 проморН від 6,0 до 7,5. Як джерела вуглецю, азоту і тор, сайт зв'язування з рибосомою та сайт ініціації інших необхідних компонентів використовують гранскрипції. Експресія полілінкерної ділянки даноамінокислоти, солі, вітаміни та глюкозу; го вектора знаходиться під контролем Г7 промото3) стійкість до антибіотиків: клітини виявляють ра. Ділянка рекомбінантної плазмідної ДНК згідно з стійкість до канаміцину. Концентрація канаміцину в винаходом, яка кодує 'ібридний білок, складається середовищі вища за 100 мкг/мл є критичною. з лідерного фрагменту, який містить шість Ідентифікація гібридного білка, який гістидинових іалишків і кодується ділянкою продукується штамом-продуцентом Е.соlі транскрипції, і амінокислотної послідовності BL21/pIK8proins, проводиться методом Westernпроінсуліну іюдини, зв'язаних через залишок blot з використанням моноклональних антитіл проаргініну. Кодон вищевказаного залишку аргініну ти інсуліну людини та антитіл, які розпізнають іводиться задля протеолітичного відщеплення 6xHis ділянку лідерного фрагменту. лідерного фрагменту від проінсуліну пляхом Приклад 3 трипсинолізу. Ця ділянка означена авторами як В 5 мл рідкого живильного середовища LB, яке „proins" на фізичній карті їекомбінантної плазмідної містить 10 г/л бактотриптону, 5 г/л дріжджового ДНК. кДНК проінсуліну отримують шляхом екстракту, 10 г/л натрію хлориду, 0,05 г/л полімеразної іанцюгової реакції з використанням канаміцину сульфату, при рН 7,2 інокулюють кДНК Бібліотеки клітин островків Лангерганса індивідуальну колонію клітин штаму Е.соїі BL21/ іідшлункової залози людини. рІК8 proins, продуцента гібридного білка, який В якості олігонуклеотидних затравок викоримістить проінсулін людини. Проводять інкубацію стовують праймери наступного їуклеотидного дина качалочному апараті протягом ночі при зайну. температурі 37°С. Нічну культуру вносять в колбу, яка містить 100 мл живильного середовища, і проNdel Arg довжують культивацію протягом 6 годин до оптичної густини культури (OD620), яка дорівнює 5 – GC – GATATG – CGA – Forvard одиниці, після чого її використовують для – TTTGTGAACCAACACCTGTG – 3 інокуляції ферментера. 100 мл культури вносять в HindIII Stop 10 л живильного середовища, культивування в 5 – TG – GAATTC – СТА – Revers ферментері ведуть при температурі 37°С з – GTTGCAGTAGTTCTCCAGC 3 інтенсивною аерацією. Кожні 30 хвилин контролюють оптичну густину культури і при OD620 > 3 вноРекомбінантну плазмідну ДНК, яку автори насять індуктор експресії ізопропіл- -Dзвали pIKS-proins, конструюють шляхом клонувантіогалактопіранозід до кінцевої концентрації 5 мМ і ня нуклеотидної послідовності, яка кодує продовжують культивування протягом 4 годин. проінсулін, в полілінкерну ділянку вихідного вектоОдержану біомасу концентрують центрифугуванра по липких кінцях сайтів Ndel/EcoRl за допомоням (30 хвилин, 4 000 g). Клітини з 1 л гою лігазної реакції. культуральної рідини суспендують в 40 мл 0,05 М Рекомбінантна плазміда pIKS-proins трис-НСІ буфері, 0,2 М натрію хлориду рН 7,8 і характеризується молекулярною масою 5575 п.н. і руйнують ультразвуковою дезінтеграцією (3 рази складається з наступних ділянок: огі - сайт ініціації по 1 хвилині за частоти 44 кГц). Аналіз лізату реплікації; Кап - ген стійкості до канаміцину; proins бактеріальних клітин проводять методом елек- ділянка, що кодує гібридний білок з трофорезу в 15 % ПААГу (39 : 1) в присутності амінокислотною послідовністю проінсуліну людидодецилсульфату натрію з наступним скануванни; Lad репресорний ген. Експресія ням на денситометрі. Аналіз показав, що вміст рекомбінантного білка перебуває під контролем гібридного білка складав 63 % від сумарного білка Т7-промотора. Повна генетична ідентичність клітин. Одержаний лізат бактеріальної культури послідовності проінсуліну людини була центрифугують протягом 45 хвилин при 10 000 g з підтверджена ДНК-секвенуванням. Фізична карта охолодженням (4°С). Отриманий осад (тільця рекомбінантної плазмідної ДНК представлена на включення) розчиняють в 0,1 М трис-НСІ буфері фіг. 1. рН 8,5, який містить 8М сечовини, до повного розПриклад 2 чинення. Для одержання штаму-продуцента, який Розчин тілець включення освітлюють центримістить проінсулін людини, компетентні клітини фугуванням при 10 000 g при кімнатній Е.соїі вихідного штаму BL21 трансформують температурі. Аналіз показав, що розчин містив 155 рекомбінантною плазмідною ДНК pIKSproins. мг білка, з яких 100 мг приходилися на гібридний Штам-продуцент Е.соїі BL21/pIK8proins білок (з 1 л культуральної рідини). Одержаний характеризується наступним генотипом: F-ompT розчин розводять в 2 рази і проводять очищення hsdSe (гв - пів-) gal dsm Km та має такі ознаки: від білків клітин „хазяїна" за допомогою ДЕАЕ1) культурально-морфологічні: рухливі, сефарози, використовуючи ступеневий градієнт по непатогенні, грамнегативні палички розміром натрію хлориду від 0,1 до 1 М.Фракція 0,3 - 0,6 М менше 1 мкм; на агаризованому середовищі LB, по натрію хлориду містила гібридний білок - чистояке містить50 мкг/мл канаміцина, утворюють та 98 %. Після того проводять окисний 7 76661 8 сульфітоліз, використовуючи 6М гуанідин хлорид в людини кристалізують за рН 5,8, суспензію 0,1 М трис-НСІ буфері рН 8,5 за концентрації кристалів промивають водою та ліофільне висугібридного білка 2 мг/мл та за кінцевої шують. концентрації сульфіту натрію та хлориду цистеїну Ідентичність одержаного продукту - інсуліну 0,05 М і 0,2 мМ, відповідно. людини - підтверджується наступними параметВідновлення дисульфідних зв'язків проводять рами: в 0,1 М трис-НСІ буфері рН 7,5, який містить 4 М - молекулярною масою (мас-спектрометрія), сечовини, 2-меркаптоетанолом за концентрації 0,7 - амінокислотним складом, молей/л. - збігом амінокислотної послідовності з С- та Після цього гібридний білок обробляють цитN-кінців (по 15 амінокислотах), раконовим ангідридом за його 30 кратного моляр- відповідністю часу утримування піку інсуліну ного надлишку в перерахунку на 2 залишки лізину міжнародному референт-стандарту USP при та при рН 8,2 - 8,5. Час реакції становить 2 години аналізі ВЕРХ, за кімнатної температури. - відповідністю часу утримування фрагментів Оброблений цитраконовим ангідридом інсуліну референт - стандарту USP при аналізі гібридний білок розщеплюють трипсином ВЕРХ (пептидне картування протеазою V8), (співвідношення фермент : субстрат складає - біологічною активністю. 1:1000) і карбоксипептидазою В (0,05 од. на мг Щодо амінокислотного складу одержаного білка) протягом 2 годин при температурі 37 °С. рекомбінантного інсуліну людини в порівнянні з Реакцію зупиняють оцтовою кислотою, реакційну стандарт інсуліном, то він приводиться у таблиці суміш інкубують за кімнатної температури для нижче. зняття цитраконового захисту. Проведені дослідження дозволили зробити Реакційну суміш фільтрують через фільтр з висновок, що якість одержаного продукту розміром пор 0,2 мкм для нанесення на колонку відповідає вимогам Європейської і USP фармакосистеми ВЕРХ (високоефективної рідинної пеи і характеризується наступними показниками: хроматографії). В якості нерухомої фази викоривміст основної речовини > 98 %, вміст високомостовують сорбент обернено-фазового типу, налекулярних білків - не більше 0,5 %, вміст приклад, Daisogel ODS-AP з розміром часток 15 інсулінспоріднених сполук - не більше 1 %, вміст проінсуліну - не більше 10 ppm, вміст мкм та розміром пор 100 - 150 . В якості рухомої імунореактивних поліпептидів (пептидів клітин) фази використовують 0,06 М гліцин-НСІ буфер, не більше 10 ppm, біологічна активність - не мен0,015 М амонію сульфату та пропанолу-2 з ше 27,5 МО/мг. концентрацією від 20 до 35 % за рН 2,5. Фракцію Таким чином, використання винаходу, що інсуліну людини кристалізують за рН 5,8. пропонується, дозволяє збільшити вихід Кристалічну суспензію фільтрують, кристали гібридного білка більш ніж на 30 % та одержати промивають водою, розчиняють в 0,25 % оцтовій рекомбінантний інсулін високої якості. Окрім того, кислоті та наносять на колонку системи ВЕРХ. При відмовлення від використання сефадекса G-25 такій же нерухомій фазі, як вказана вище, в якості для знесолення рекомбінантного білка-Sрухомої фази в даному випадку використовують сульфоната, катіонообмінної хроматографії для 0,05 М ацетатний буфер, котрий містить пропановиділення і очищення інсуліну та гель-фільтрації лу-2 від 10 до 25 % за рН 2,5. Фракцію інсуліну на останньому етапі очищення, як у винаході прототипі, дозволяє масштабувати виробничий процес і збільшити вихід кінцевого продукту. Амінокислота Asx Thr Ser Glx Pro Gly Ala Cys Val Ile Leu Tyr Phe His Lys Arg Теоретично 3 3 3 7 1 4 1 6 4 2 6 4 3 2 1 1 Кількість амінокислотних залишків Стандарт інсулін 3,15 3,05 2,94 7,07 1,21 4,15 1,01 5,94 3,97 2,15 5,92 3,91 3,13 2,10 1,07 0,98 Приклад № 3 3,22 2,95 2,78 7,23 1,15 4,22 1,10 5,90 4,25 1,98 6,05 3,85 3,25 2,07 1,03 1,21 9 Комп’ютерна верстка М. Клюкін 76661 Підписне 10 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601