Спосіб виробництва a-абета (варіанти)

1. Спосіб продукування -АБета у клітинній культурі великомасштабного виробництва, що включає кроки: забезпечення клітинної культури, що включає: клітини ссавців, які містять ген, що кодує -АБета, ген якого експресується за умов клітинної культури; і середовище, що містить глутамін і має характеристику середовища, вибрану із групи, що складається із нижченаведених характеристик: і) сукупна кількість амінокислот на одиницю об’єму більша ніж приблизно 70 мМ; іі) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості аспарагіну становить менше ніж приблизно 2; ііі) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості амінокислот в цілому становить менше ніж приблизно 0,2; iv) молярне співвідношення сукупної кількості неорганічних іонів до сукупної кількості амінокислот в цілому становить приблизно від 0,4 до 1; або v) об’єднана сукупна кількість глутаміну й аспарагіну на одини 2 (19) 1 3 89644 4 куватися до щільності життєздатних клітин в ме19. Спосіб за п. 18, у якому другий крок змін вклюжах діапазону приблизно 20-80 % від максимальчає зміну принаймні однієї умови культивування, ної можливої щільності життєздатних клітин, якщо вибраної із групи, що складається із: (і) темперавказана культура підтримувалась при першому тури, (іі) рН, (ііі) осмоляльності, (iv) рівня хімічних наборі умов культивування; індуктантів та їх комбінації. зміну принаймні однієї з умов культивування таким 20. Спосіб за п. 18, у якому вказаний третій набір чином, щоб застосувати другий набір умов культиумов включає третій температурний діапазон, що вування; становить приблизно 27-37 градусів Цельсія. підтримання вказаної культури упродовж другого 21. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший проміпроміжку часу при другому наборі умов і упродовж жок часу становить від 1 до 7 днів. 22. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший промідругого проміжку часу таким чином, щоб -АБета жок часу становить приблизно 4 дні. накопичився в клітинній культурі. 23. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший промі3. Спосіб за п. 1, в якому вказана умова клітинної жок часу й вказаний другий проміжок часу сумарно культури у вказаній зміні на принаймні одному становлять принаймні 5 днів. кроці умов культивування вибирається із групи, що 24. Спосіб за п. 1, у якому в кроці підтримання вкаскладається із: (і) температури, (іі) рН, (ііі) осмолязаної культури упродовж другого проміжку часу льності, (iv) рівня хімічних індуктантів та їх комбірівень лактату зменшується слідом за рівнем лакнації. тату у культурі, досягаючи максимального рівня. 4. Спосіб за п. 1, у якому початкова концентрація 25. Спосіб за п. 1, у якому в кроці підтримання вкаглутаміну вказаного середовища становить менше заної культури упродовж другого проміжку часу ніж або дорівнює 10 мМ. рівень амонію зменшується слідом за рівнем амо5. Спосіб за п. 1, у якому початкова концентрація нію в культурі, досягаючи максимального рівня. глутаміну вказаного середовища становить менше 26. Спосіб за п. 1, у якому вказана сумарна кільніж або дорівнює 4 мМ. кість вказаного виробленого -АБета є принаймні 6. Спосіб за п. 1, у якому сумарна сукупна кількість глутаміну на одиницю об’єму вказаного середовиу 1,5 рази вищою, ніж кількість -АБета, вироблеща становить менше ніж або дорівнює 10 мМ. ного за інакших ідентичних умов в інакшому іден7. Спосіб за п. 1, у якому сумарна сукупна кількість тичному середовищі, що не має вказаних характеглутаміну на одиницю об’єму вказаного середовиристик середовища. ща становить менше ніж або дорівнює 4 мМ. 27. Спосіб за п. 1, у якому вказана сумарна кіль8. Спосіб за п. 1, у якому глутамін забезпечується кість вказаного виробленого -АБета є принаймні тільки в початковому середовищі на початку кліу 2 рази вищою, ніж кількість -АБета, виробленотинної культури. го за інакших ідентичних умов в інакшому ідентич9. Спосіб за п. 1, у якому початкова щільність вканому середовищі, що не має вказаних характерис5 заних клітин ссавців становить принаймні 2x10 тик середовища. клітин/мл. 28. Спосіб за п. 1, у якому вказана клітинна куль10. Спосіб за п. 1, у якому початкова щільність тура у подальшому постачається додатковими 6 вказаних клітин ссавців становить принаймні 2x10 компонентами. клітин/мл. 29. Спосіб за п. 28, у якому вказані додаткові ком11. Спосіб за п. 1, у якому крок забезпечення поненти постачаються в множинних інтервалах. включає забезпечення принаймні приблизно 1000 30. Спосіб за п. 28, у якому вказані додаткові комл культури. поненти вибираються із групи, що складається з 12. Спосіб за п. 1, у якому крок забезпечення гормонів і/або інших факторів росту, певних іонів включає забезпечення принаймні приблизно 10000 (таких як натрію, хлориду, кальцію, магнію і фосл культури. фату), буферів, вітамінів, нуклеозидів або нуклео13. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший набір тидів, мікроелементів (неорганічних сполук, що умов включає перший температурний діапазон, що зазвичай присутні у дуже низьких кінцевих конценстановить приблизно 30-42 градуси Цельсія. траціях), амінокислот, ліпідів або глюкози чи інших 14. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший набір джерел енергії. умов включає перший температурний діапазон, що 31. Спосіб продукування -АБета у клітинній кульстановить приблизно 37 градусів Цельсія. турі великомасштабного виробництва, що включає 15. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір кроки: умов включає другий температурний діапазон, що забезпечення клітинної культури, що включає: становить приблизно 25-41 градус Цельсія. клітини ссавців, які містять ген, що кодує -АБета, 16. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір ген якого експресується за умов клітинної культуумов включає другий температурний діапазон, що ри; і становить приблизно 29-35 градусів Цельсія. визначене середовище, що містить глутамін і має 17. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір принаймні дві характеристики середовища, які умов включає другий температурний діапазон, що вибираються із групи, що складається із нижченастановить приблизно 31 градус Цельсія. ведених характеристик: і) початкова концентрація 18. Спосіб за п. 1, що додатково включає другий амінокислот більша ніж приблизно 70 мМ; іі) молякрок змін слідом за першою вказаною зміною прирне співвідношення глутаміну до аспарагіну станонаймні однієї з умов культивування, що включає вить менше ніж приблизно 2; ііі) молярне співвідзміну принаймні однієї з умов культивування таким ношення глутаміну до загальної кількості чином, щоб застосувати третій набір умов до кульамінокислот становить менше ніж приблизно 0,2; тури. iv) молярне співвідношення кількості неорганічних 5 89644 6 іонів до загальної кількості амінокислот становить неорганічних іонів до початкової загальної кількосприблизно від 0,4 до 1; та v) об’єднана концентраті амінокислот становить приблизно від 0,4 до 1; v) ція глутаміну й аспарагіну становить більше ніж об’єднана початкова концентрація глутаміну й поприблизно 16 мМ; чаткова концентрація аспарагіну становить більше підтримання вказаної культури в початковій фазі ніж приблизно 16 мМ, та їх комбінацій. росту при першому наборі умов культивування 34. Спосіб за будь-яким із пп. 1, 2 або 31-33, у упродовж першого проміжку часу, достатнього для якому: надання можливості вказаним клітинам репродурівні лактату є нижчими, ніж ті рівні, що спостерікуватися в межах діапазону приблизно 20-80 % від гаються за інакших ідентичних умов в інакшому максимальної можливої щільності життєздатних ідентичному середовищі, що не має вказаної хараклітин, якщо вказана культура підтримувалась при ктеристики середовища; першому наборі умов культивування; рівні амонію є нижчими, ніж ті рівні, що спостерізміну принаймні однієї з умов культивування таким гаються за інакших ідентичних умов в інакшому чином, щоб застосувати другий набір умов культиідентичному середовищі, що не має вказаної харавування; ктеристики середовища; і підтримання вказаної культури упродовж другого загальна кількість виробленого -АБета є принайпроміжку часу при другому наборі умов і упродовж мні настільки ж високою, як та, що спостерігається другого проміжку часу таким чином, щоб -АБета за інакших ідентичних умов в інакшому ідентичнонакопичився в клітинній культурі. му середовищі, що не має вказаної характеристики середовища. 32. Спосіб продукування -АБета у клітинній куль35. Спосіб за п. 1, у якому вказана культура не турі великомасштабного виробництва, що включає постачається додатковими компонентами протякроки: гом продукування вказаного -АБета. забезпечення клітинної культури, що включає: 36. Спосіб за п. 1, у якому гліцилглутамін заміняклітини ссавців, які містять ген, що кодує -АБета, ється на глутамін у вказаній культурі. ген якого експресується за умов клітинної культу37. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільри; і кість гістидину, ізолейцину, лейцину, метіоніну, визначене середовище, що містить глутамін, яке фенілаланіну, триптофану, тирозину і проліну на характеризується нижченаведеними особливостяодиницю об’єму у вказаному середовищі станоми: і) початкова концентрація амінокислот більша вить більше ніж приблизно 25 мМ. ніж приблизно 70 мМ; іі) молярне співвідношення 38. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільглутаміну до аспарагіну становить менше ніж прикість гістидину, ізолейцину, лейцину, метіоніну, близно 2; ііі) молярне співвідношення глутаміну до фенілаланіну, триптофану, тирозину і проліну на загальної кількості амінокислот становить менше одиницю об’єму у вказаному середовищі станоніж приблизно 0,2; iv) молярне співвідношення вить більше ніж приблизно 35 мМ. кількості неорганічних іонів до загальної кількості 39. Спосіб за п. 1, у якому вказане середовище амінокислот становить приблизно від 0,4 до 1; або має характеристику середовища, вибрану із групи, v) об’єднана концентрація глутаміну й аспарагіну що складається із нижченаведених характеристик: становить більше ніж приблизно 16 мМ; (і) сукупна загальна кількість гістидину на одиницю підтримання вказаної культури в початковій фазі об’єму становить більше ніж приблизно 1,7 мМ; росту при першому наборі умов культивування (іі) сукупна загальна кількість ізолейцину на одиупродовж першого проміжку часу, достатнього для ницю об’єму становить більше ніж приблизно 3,5 надання можливості вказаним клітинам репродумМ; куватися в межах діапазону приблизно 20-80 % від (ііі) сукупна загальна кількість лейцину на одиницю максимальної можливої щільності життєздатних об’єму становить більше ніж приблизно 5,5 мМ; клітин, якщо вказана культура підтримувалась при (iv) сукупна загальна кількість метіоніну на одинипершому наборі умов культивування; цю об’єму становить більше ніж приблизно 2,0 мМ; зміну принаймні однієї з умов культивування таким (v) сукупна загальна кількість фенілаланіну на чином, щоб застосувати другий набір умов культиодиницю об’єму становить більше ніж приблизно вування; 2,5 мМ; підтримання вказаної культури упродовж другого (vi) сукупна загальна кількість проліну на одиницю проміжку часу при другому наборі умов і упродовж об’єму становить більше ніж приблизно 2,5 мМ; другого проміжку часу таким чином, щоб -АБета (vii) сукупна загальна кількість триптофану на одинакопичився в клітинній культурі. ницю об’єму становить більше ніж приблизно 1,0 33. Спосіб за п. 1, у якому вказане середовище мМ; і включає середовище, що містить глутамін і має (viii) сукупна загальна кількість тирозину на одинихарактеристики середовища, які вибираються із цю об’єму становить більше ніж приблизно 2,0 мМ. групи, що складається із нижченаведених харак40. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільтеристик: кість серину на одиницю об’єму у вказаному сереі) початкова концентрація амінокислот більша ніж довищі становить більше ніж приблизно 10 мМ. приблизно 70 мМ; іі) молярне співвідношення по41. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільчаткової кількості глутаміну до початкової кількості кість аспарагіну на одиницю об’єму у вказаному аспарагіну становить менше ніж приблизно 2; ііі) середовищі становить більше ніж приблизно 8 мМ. молярне співвідношення початкової кількості глу42. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільтаміну до початкової загальної кількості амінокискість аспарагіну на одиницю об’єму у вказаному лот становить менше ніж приблизно 0,2; iv) молярне співвідношення початкової кількості 7 89644 8 середовищі становить більше ніж приблизно 12 середовищі становить більше ніж приблизно 25 мМ. мг/л. 43. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кіль47. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість фосфору на одиницю об’єму у вказаному кість піридоксину й піридоксалю на одиницю середовищі становить більше ніж приблизно 5 мМ. об’єму у вказаному середовищі становить більше 44. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільніж приблизно 35 мг/л. кість глутамату на одиницю об’єму у вказаному 48. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільсередовищі становить менше ніж приблизно 1 мМ. кість рибофлавіну на одиницю об’єму у вказаному 45. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільсередовищі становить більше ніж приблизно 2,0 кість кальцію пантотенату на одиницю об’єму у мг/л. вказаному середовищі становить більше ніж приб49. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільлизно 20 мг/л. кість тіаміну гідрохлориду на одиницю об’єму у 46. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільвказаному середовищі становить більше ніж прибкість нікотинаміду на одиницю об’єму у вказаному лизно 35 мг/л. Ця заявка заявляє пріоритет попередньої Патентної заявки США №60/604936, яка була подана 27 серпня 2004 року, зміст якої включено шляхом посилання у повному обсязі. Білки й поліпептиди набувають все більшого й більшого значення у якості терапевтичних засобів. У більшості випадків, терапевтичні білки й поліпептиди отримують в клітинній культурі, із клітин, які були створені й/або відібрані з метою продукування незвично високих рівнів певного білка або поліпептиду, що розглядається. Контроль і оптимізація умов клітинної культури є критично важливими для успішного комерційного виробництва білків і поліпептидів. Багато білків і поліпептидів, отриманих у клітинній культурі, продукуються в серійному або підживлювальному процесі, при якому клітини культивують упродовж певного періоду часу, а потім культуру завершують, й отриманий білок або поліпептид виділяють. На остаточну кількість і якість виробленого білка або поліпептиду можуть істотно впливати умови клітинної культури. Наприклад, традиційні процеси серійної й підживлювальної культури часто призводять до продукування відходів метаболізму, які негативно впливають на ріст, життєздатність клітин і виробництво або стабільність білка чи поліпептиду, що розглядається. У той час як було докладено зусиль для поліпшення виробництва білків і поліпептидів у процесах серійної й підживлювальної культури, залишається потреба в додаткових удосконаленнях. Крім того, значне зусилля було зроблене для розробки визначених середовищ (тобто, середовищ, зібраних із відомих індивідуальних компонентів, що не містять сироватки або інших побічних продуктів тваринного походження) для використання при культивуванні клітин, особливо клітин ссавців. Особливості росту клітини можуть бути зовсім різними у визначених середовищах на відміну від середовищ, отриманих із сироватки. Існує певна потреба в розробці удосконалених систем для продукування білків й поліпептидів за допомогою клітинної культури у визначених середовищах. Даний винахід пропонує удосконалену систему для великомасштабного виробництва білків і/або поліпептидів у клітинній культурі. Наприклад, даний винахід пропонує комерційні масштабні (наприклад, 500л або більше) способи культивування, які використовують середовище, що характеризу ється однією або кількома нижчезазначеними особливостями: і) сукупна кількість амінокислот на одиницю об'єму більша ніж приблизно 70мМ; іі) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості аспарагіну становить менше ніж приблизно 2; ііі) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості амінокислот в цілому становить менше ніж приблизно 0,2; iv) молярне співвідношення сукупної кількості неорганічних іонів до сукупної кількості амінокислот в цілому становить приблизно від 0,4 до 1; або ν) об'єднана сукупна кількість глутаміну й аспарагіну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 16мМ. Звичайний спеціаліст у даній галузі зрозуміє, що термін "сукупний", який використовується вище, стосується сумарної кількості певного компоненту або компонентів, доданих упродовж клітинної культури, включаючи компоненти, що додаються на початку культури й компоненти, що додаються згодом. У певних варіантах втілення винаходу, яким надається перевага, бажано мінімізувати "підживлення" культури протягом довгого часу, таким чином, бажано максимально збільшити кількості, присутні спочатку. Звичайно, протягом культури компоненти середовища метаболізуються і, таким чином, культури з тими ж самими сукупними кількостями даних компонентів матимуть різні абсолютні рівні, якщо ці компоненти додаються в різний час (наприклад, всі присутні спочатку у порівнянні з деякими, що додаються шляхом підживлення). Відповідно до даного винаходу, використання такого середовища надає можливість отримувати високі рівні продукування білка й зменшує накопичення певних небажаних факторів, таких як амоній і/або лактат. Звичайний спеціаліст у даній галузі зрозуміє, що композиції середовищ відповідно до даного винаходу охоплюють визначені й невизначені середовища. У певних варіантах втілення даного винаходу, яким надається перевага, культуральне середовище - це визначене середовище, в якому склад середовища відомий й контролюється. У певних варіантах втілення даного винаходу, яким надається перевага, до способів культивування належать зміна культивування від першого набору умов культивування до другого набору умов культивування у такий спосіб, щоб досягнути метаболічного зсуву для клітин. У деяких варіан 9 89644 10 тах втілення ця зміна виконується, коли культура Фігура 10 показує рівні амонію клітинних кульдосягла приблизно 20-80% її максимальної щільтур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах ності клітин. У деяких варіантах втілення зміна підживлюваної культури з низьким рівнем глутамівключає зміну температури (або температурного ну. діапазону), при якій підтримується культура. АльФігура 11 показує рівні лактату клітинних культернативно або додатково, даний винахід пропотур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах нує способи, пристосовані таким чином, щоб після підживлюваної культури з низьким рівнем глутамідосягнення піку, рівні лактату і/або амонію в кульну. турі зменшувалися з часом. В інших варіантах втіФігура 12 показує титр анти-GDF-8 у контролення зміна включає зсув рН, осмолярності або льних умовах й умовах підживлюваної культури з рівня хімічних індуктантів, таких як алканові кислонизьким рівнем глутаміну. ти або їх солі. Фігура 13 показує відповідь на дози заліза кліДо клітинних культур відповідно до даного витин анти-GDF-8 у Середовищі 1 і Середовищі 2. находу можуть довільно додаватись поживні речоФігура 14 показує щільність клітин культур з вини й/або інші компоненти середовища, включапідживленням глутаматом і глутаміном. ючи гормони й/або інші фактори росту, певні іони Фігура 15 показує життєздатність клітин куль(такі як натрію, хлориду, кальцію, магнію і фосфатур з підживленням глутаматом і глутаміном. ту), буфери, вітаміни, нуклеозиди або нуклеотиди, Фігура 16 показує титр анти-Льюїс Υ у культумікроелементи (неорганічні сполуки, що зазвичай рах з підживленням глутаматом і глутаміном. присутні у дуже низьких кінцевих концентраціях), Фігура 17 показує рівні лактату у культурах з амінокислоти, ліпіди або глюкозу чи інше джерело підживленням глутаматом і глутаміном. енергії. У певних варіантах втілення даного винаФігура 18 показує рівні амонію у культурах з ходу може бути вигідним доповнювати середовипідживленням глутаматом і глутаміном. ща хімічними індуктантами, такими як гексаметиФігура 19 показує осмолярність культур з пілен-біс(ацетамід) ("НМВА") і натрію бутират дживленням глутаматом і глутаміном. ("NaB"). Ці довільні добавки можуть додаватись на Фігура 20 показує щільність клітин анти-Льюїс початку культивування або можуть додаватись в Y. Кожен графік - це середнє із двох колб для більш пізній період з метою поповнення вичерпаструшування, вирощених з використанням тих саних поживних речовин або з іншої причини. Зазвимих умов. чай, відповідно до даного винаходу бажано обираФігура 21 показує життєздатність клітин антити початковий склад середовища таким чином, Льюїс Y. Кожен графік - це середнє із двох колб щоб мінімізувати підживлення. для струшування, вирощених з використанням тих Відповідно до даного винаходу може проводисамих умов. тися моніторинг різних умов культивування, вклюФігура 22 показує середній титр культури античаючи рН, щільність клітин, життєздатність клітин, Льюїс Y. Кожен графік - це середнє із двох колб рівні лактату, рівні амонію, осмолярність або титр для струшування, вирощених з використанням тих поліпептиду чи білка, що експресується. самих умов. Фігура 1 показує порівняння Середовища 1 1 і Фігура 23 показує рівні амонію клітин антиСередовища 2 у колбах для струшування з викоЛьюїс Y. Кожен графік - це середнє із двох колб ристанням клітин анти-GDF-8. для струшування, вирощених з використанням тих Фігура 2 показує ріст й життєздатність клітин самих умов. анти-GDF-8 у Середовищі 1. Фігура 24 показує лопастний пристрій, що виФігура 3 показує ріст клітин клітинних культур користовується у серійно-підживлюваних культуанти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах кульрах. тивування без підживлення глутаміном. Фігура 25 показує ріст клітин анти-GDF-8 за ріФігура 4 показує життєздатність клітин клітинзних експериментальних умов. них культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й Фігура 26 показує життєздатність клітин антиумовах культивування без підживлення глутаміGDF-8 за різних експериментальних умов. ном. Фігура 27 показує титр анти-GDF-8 за різних Фігура 5 показує рівні амонію клітинних кульекспериментальних умов. тур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах Фігура 28 показує рівні лактату культур антикультивування без підживлення глутаміном. GDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 6 показує рівні лактату клітинних кульФігура 29 показує рівні амонію культур антитур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах GDF-8 за різних експериментальних умов. культивування без підживлення глутаміном. Фігура 30 показує ріст клітин анти-GDF-8 за ріФігура 7 показує титр анти-GDF-8 у контрользних експериментальних умов. них умовах й умовах культивування без підживФігура 31 показує титр анти-GDF-8 за різних лення глутаміном. експериментальних умов. Фігура 8 показує щільність клітин клітинних куФігура 32 показує рівні лактату культур антильтур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах GDF-8 за різних експериментальних умов. підживлюваної культури з низьким рівнем глутаміФігура 33 показує рівні амонію культур антину. GDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 9 показує життєздатність клітин клітинФігура 34 показує ріст клітин анти-GDF-8 у моних культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й дифікованому Середовищі 9, що містить різні рівні умовах підживлюваної культури з низьким рівнем глутаміну й аспарагіну. глутаміну. 11 89644 12 Фігура 35 показує життєздатність клітин антиФігура 57 показує ріст клітин анти-GDF-8 у СеGDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що місредовищах 1, 3 і 9. тить різні рівні глутаміну й аспарагіну. Фігура 58 показує титр анти-GDF-8 у СередоФігура 36 показує рівні лактату культур антивищах 1, 3 і 9. GDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що місФігура 59 показує екстрапольовані титри антитить різні рівні глутаміну й аспарагіну. GDF-8 для різних рівнів глутаміну окремо й сумарФігура 37 показує рівні амонію культур антиного об'єднаного глутаміну й аспарагіну. GDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що місФігура 60 показує ріст клітин анти-АБета за рітить різні рівні глутаміну й аспарагіну. зних умов середовищ, що випробовуються. Фігура 38 показує рівні глутаміну культур антиФігура 61 показує життєздатність клітин антиGDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що місАБета за різних умов середовищ, що випробовутить різні рівні глутаміну й аспарагіну. ються. Фігура 39 показує титр анти-GDF-8 у модифіФігура 62 показує рівні лактату культур антикованому Середовищі 9, що містить різні рівні глуАБета за різних умов середовищ, що випробовутаміну й аспарагіну. ються. Фігура 40 показує осмолярність культур антиФігура 63 показує рівні амонію культур антиGDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що місАБета за різних умов середовищ, що випробовутить різні рівні глутаміну й аспарагіну. ються. Фігура 41 показує ріст клітин анти-GDF-8 у сеФігура 64 показує титр анти-АБета за різних редовищах, що містять різні рівні аспарагіну й цисумов середовищ, що випробовуються. теїну. Фігура 65 показує осмолярність культур антиФігура 42 показує рівні лактату культур антиАБета за різних умов середовищ, що випробовуGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспаються. рагіну й цистеїну. Фігура 66 показує ріст клітин, що експресують Фігура 43 показує рівні амонію культур антиTNFR-Ig за різних експериментальних умов. GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспаФігура 67 показує життєздатність клітин, що рагіну й цистеїну. експресують TNFR-Ig за різних експериментальних Фігура 44 показує рівні глутаміну культур антиумов. GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспаФігура 68 показує залишкову глюкозу в культурагіну й цистеїну. рах клітин, що експресують TNFR-Ig за різних ексФігура 45 показує рівні глутамату культур анпериментальних умов. ти-GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні Фігура 69 показує рівні глутаміну в культурах аспарагіну й цистеїну. клітин, що експресують TNFR-Ig за різних експеФігура 46 показує титр анти-GDF-8 у середориментальних умов. вищах, що містять різні рівні аспарагіну й цистеїну. Фігура 70 показує концентрацію лактату в куФігура 47 показує осмолярність культур антильтурах клітин, що експресують TNFR-Ig за різних GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспаекспериментальних умов. рагіну й цистеїну. Фігура 71 показує рівні амонію в культурах кліФігура 48 показує ріст клітин анти-GDF-8 у сетин, що експресують TNFR-Ig за різних експериредовищах, що містять різні рівні амінокислот і ментальних умов. вітамінів. Фігура 72 показує відносний титр TNFR-Ig за Фігура 49 показує рівні лактату культур антирізних експериментальних умов. GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аміноФігура 73 показує щільності клітин анти-GDF-8, кислот і вітамінів. вирощених в 6000л і 1л біореакторах. Фігура 50 показує рівні амонію культур антиФігура 74 показує титри анти-GDF-8 клітин, GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аміновирощених в 6000л і 1л біореакторах. кислот і вітамінів. Фігура 75 показує рівні лактату клітин антиФігура 51 показує рівні глутаміну культур антиGDF-8, вирощених в 6000л і 1л біореакторах. GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аміноФігура 76 показує рівні амонію клітин антикислот і вітамінів. GDF-8, вирощених в 6000л і 1л біореакторах. Фігура 52 показує титр анти-GDF-8 у середоВизначення вищах, що містять різні рівні амінокислот і вітамі"Близько", "Приблизно": вжиті авторами термінів. ни "близько" і "приблизно", що застосовуються до Фігура 53 показує ріст клітин анти-GDF-8 у сеоднієї або кількох певних умов клітинної культури, редовищах, що містять різні рівні вітамінів, мікроестосуються діапазону значень, які є подібними до лементів Ε і заліза. зазначеного еталонного значення для тієї умови Фігура 54 показує рівні лактату культур антиабо умов культури. У певних варіантах втілення GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні вітатермін "близько" стосується діапазону значень, які мінів, мікроелементів Ε і заліза. перебувають у межах 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, Фігура 55 показує рівні амонію культур анти13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 відсотка або GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні вітаменше зазначеного еталонного значення для тієї мінів, мікроелементів Ε і заліза. умови або умов культури. Фігура 56 показує титр анти-GDF-8 у середо"Амінокислота": вжитий авторами термін "амівищах, що містять різні рівні вітамінів, мікроеленокислота" стосується будь-якої із двадцяти приментів Ε і заліза. родних амінокислот, які зазвичай використовуються в утворенні поліпептидів, або аналогів чи 13 89644 14 похідних цих амінокислот. Амінокислоти відповідно "Щільність клітин": вжитий авторами термін до даного винаходу забезпечуються в середовищі "щільність клітини" стосується кількості клітин, до клітинних культур. Амінокислоти, що забезпеприсутніх у даному об'ємі середовища. чуються в середовищі, можуть пропонуватися у "Життєздатність клітин": вжитий авторами тевигляді солі або у формі гідрату. рмін "життєздатність клітини" стосується здатності "Антитіло": вжитий авторами термін "антитіло" клітин у культурі виживати при даному наборі умов стосується молекули імуноглобуліну або імунолокультивування або експериментальних змін. Вжигічно активної частини молекули імуноглобуліну, тий авторами термін також стосується тієї частини такої як фрагменти Fab або F(ab')2, що містить клітин, які є живими в певний час по відношенню одну або кілька антиген-зв'язуючих ділянок, які до загальної кількості клітин, живих й мертвих, у специфічно зв'язуються (імунореагують) з антигекультурі на той момент часу. ном. Вжиті авторами терміни "моноклональні ан"Культура", "клітинна культура" і "культура клітитіла" і "склад моноклонального антитіла" стосутин ссавців": ці вжиті авторами терміни стосуються ються клонової популяції молекул антитіл, які популяції клітин ссавців, яка суспендована в серемістять тільки один вид антиген-зв'язуючої діляндовищі (див. визначення "середовища" нижче) за ки, що має здатність імунореагувати зі специфічумов, що підходять для виживання й/або росту ною антигенною детермінантою, тоді як терміни клітинної популяції. Як буде очевидно для звичай"поліклональні антитіла" і "склад поліклонального них спеціалістів в даній галузі, ці вжиті авторами антитіла" стосуються популяції молекул антитіл, терміни можуть стосуватися комбінації, що містить які містять різні види антиген-зв'язуючих ділянок, популяцію клітин ссавців й середовище, у якому ця що мають здатність до взаємодії з певним антигепопуляція суспендована. ном. Визначення моноклональних антитіл включає "Підживлювана культура": вжитий авторами клонові молекули, отримані за допомогою традитермін "підживлювана культура" стосується спосоційних технологій, й молекули певної послідовносбу культивування клітин, при якому до культури ті, отримані шляхом маніпуляції або мутації певних додаються додаткові компоненти в певний час залишків, наприклад, гуманізовані антитіла. після початку процесу культивування. До компоне"Серійна культура": вжитий авторами термін нтів, що додаються, як правило, належать харчові "серійна культура" стосується способу культивудобавки для клітин, які були вичерпані протягом вання клітин, при якому всі компоненти, які будуть процесу культивування. Підживлювана культура в остаточному підсумку використовуватися при зазвичай в деякий момент припиняється, а клітини культивуванні клітин, включаючи середовище і/або компоненти в середовищі збираються й, до(див. визначення "середовища" нижче), а також вільно, очищуються. самі клітини, надаються на початку процесу куль"Фрагмент": вжитий авторами термін "фрагтивування. Як правило, в деякий момент серійна мент" стосується поліпептидів і визначається як культура припиняється, а клітини і/або компоненти будь-яка дискретна частина даного поліпептиду, в середовищі збираються й, довільно, очищуютьщо є унікальною або характерною для цього поліся. пептиду. Вжитий авторами термін також стосуєть"Біореактор": вжитий авторами термін "біореася будь-якої дискретної частини даного поліпептиктор" стосується будь-якого контейнера, що викоду, що зберігає принаймні частку активності ристовується для росту культури клітин ссавців. повнорозмірного поліпептиду. Бажано, щоб частка Біореактор може бути будь-якого розміру, що призбереженої активності становила принаймні 10% датний для культивування клітин ссавців. Як праактивності повнорозмірного поліпептиду. Більш вило, біореактор буде мати об'єм, що становить бажано, щоб частка збереженої активності станопринаймні 1 літр і може бути об'ємом 10, 100, 250, вила принаймні 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12,0000 літрів 80% або 90% активності повнорозмірного поліпепабо більше, або будь-якого проміжного об'єму в тиду. Ще більш бажано, щоб частка збереженої цих межах. Внутрішні умови біореактора, включаактивності становила принаймні 95%, 96%, 97%, ючи, крім інших, рН і температуру, як правило, 98% або 99% активності повнорозмірного поліпепконтролюють упродовж періоду культивування. тиду. Найбільш бажано, щоб частка збереженої Біореактор може складатися з будь-якого матеріаактивності становила 100% активності повнорозлу, що є прийнятним для утримування культур мірного поліпептиду. Вжитий авторами термін таклітин ссавців, суспендованих в середовищах за кож стосується будь-якої частини даного поліпепумов культивування відповідно до даного винахотиду, що включає принаймні елемент ду, включаючи скло, пластмасу або метал. Вжитий встановленої послідовності, виявлений у повнороавторами термін "виробничий біореактор" стосузмірному поліпептиді. Бажано, щоб елемент посється кінцевого біореактору, що використовується лідовності охоплював принаймні 4-5, більш бажано у виробництві поліпептиду або білка, що розглядапринаймні приблизно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ється. Об'єм біореактора для великомасштабного 50 або більше амінокислот повнорозмірного полівиробництва клітинної культури, як правило, стапептиду. новить принаймні 500 літрів і може бути 1000, "Ген": вжитий авторами термін "ген" стосуєть2500, 5000, 8000, 10000, 12,0000 літрів або більше, ся будь-якої нуклеотидної послідовності, ДНК або або будь-якого проміжного об'єму в цих межах. РНК, принаймні деяка частина якої кодує дискретЗвичайний спеціаліст в даній галузі буде знати й ний кінцевий продукт, як правило, крім іншого, позможе обрати прийнятні біореактори для викорисліпептид, що функціонує в деякому аспекті клітинтання в практичному втіленні даного винаходу. ного метаболізму або розвитку. Вважається, що термін стосується не тільки кодуючої послідовнос 15 89644 16 ті, що кодує поліпептид або інший дискретний кінсіб, що рН й концентрації солей є оптимальними цевий продукт, але може також охоплювати діляндля виживання та проліферації клітин. Середовики до і після кодуючої послідовності, які модулюще може також належати до "визначених середоють основний рівень експресії (див. визначення вищ" - середовищ без сироватки, що не містять "генетичного контрольного елемента" нижче), а жодних білків, гідролізатів або компонентів невітакож проміжні послідовності ("інтрони") між індидомого складу. Визначені середовища не містять відуальними кодуючими сегментами ("екзонами"). компонентів тваринного походження, і всі компо"Генетичний контрольний елемент": вжитий ненти мають відому хімічну структуру. авторами термін "генетичний контрольний еле"Відходи метаболізму": вжитий авторами термент" стосується будь-якого елементу послідовномін "відходи метаболізму" стосується сполук, що сті, що модулює експресію гена, з яким він операпродукуються клітинною культурою внаслідок нотивно зв'язаний. Генетичні контрольні елементи рмальних або патологічних метаболічних процесів, можуть функціонувати шляхом збільшення або які є до певної міри шкідливими для клітинної кузменшення рівнів експресії й можуть бути розтальтури, особливо по відношенню до експресії або шовані до, у межах або після кодуючої послідовактивності бажаного рекомбінантного поліпептиду ності. Генетичні контрольні елементи можуть діяти або білка. Наприклад, відходи метаболізму можуть на будь-якій стадії генної експресії, регулюючи, бути шкідливими для росту або життєздатності наприклад, ініціацію, елонгацію або термінацію клітинної культури, можуть зменшувати кількість транскрипції, сплайсинг іРНК, редагування ІРНК, продукованого рекомбінантного поліпептиду або стабільність іРНК, локалізацію іРНК в межах клітибілка, можуть змінювати згортання, стабільність, ни, ініціацію, елонгацію або термінацію трансляції глікозилювання або іншу посттрансляційнумодиабо будь-яку іншу стадію генної експресії. Генетифікацію експресованого поліпептиду або білка, чи чні контрольні елементи можуть функціонувати можуть бути шкідливими для клітин і/або експресії індивідуально або в комбінації один з одним. чи активності рекомбінантного поліпептиду або "Гібридома": вжитий авторами термін "гібрибілка у будь-який інший спосіб. До прикладів віддома" стосується клітини, створеної шляхом злитходів метаболізму належать лактат, що вироблятя умертвленої клітини, отриманої з імунологічного ється внаслідок метаболізму глюкози, і амоній, що джерела, й клітини, що продукує антитіла. Отривиробляється внаслідок метаболізму глутаміну. мана гібридома представляє собою умертвлену Одна мета даного винаходу полягає в сповільненклітину, що продукує антитіла. Окремі клітини, що ні виробництва, зниженні або навіть усуненні відвикористовуються для створення гібридоми моходів метаболізму в культурах клітин ссавців. жуть проходити з будь-якого ссавцевого джерела, "Осмолярність" i "осмоляльність": "осмоляльвключаючи, крім іншого, щура, свиню, кролика, ність" - міра осмотичного тиску розчинених часток вівцю, свиню, козу і людину. Термін також охоплює у водному розчині. Частки включають іони й неіотріомні клітинні лінії, які отримують, коли потомстнізовані молекули. Осмоляльність виражається як во гетерогібридних мієломних злиттів, що є продуконцентрація осмотично активних часток (тобто, ктом злиття між людськими клітинами й мишачої осмолі), розчинених в 1кг розчину (1мОсм/кг Н2О мієломної клітинної лінії, у подальшому зливаєтьпри 38°С відповідає осмотичному тиску, рівному ся із плазмацитом. Крім того, вважається, що тер19мм рт.ст). "Осмолярність", на відміну від цього, мін включає будь-яку умертвлену гібридну клітинстосується кількості часток, розчинених в 1 літрі ну лінію, що продукує антитіла, таку як, наприклад, розчину. Вжите авторами скорочення "мОсм" квадроми (див., наприклад, Milstein et al., Nature, означає "міліосмолі/кг розчину". 537:3053 (1983)). "Перфузійна культура": вжитий авторами тер"Інтегрована щільність життєздатних клітин": мін "перфузійна культура" стосується способу кувжитий авторами термін "інтегрована щільність льтивування клітин, при якому до культури додатжиттєздатних клітин" стосується середньої щількові компоненти додаються безперервно або ності життєздатних клітин протягом культивування, напівбезперервно після початку процесу культивупомноженої на час перебігу культивування. Припування. Додані компоненти, як правило, включають скаючи, що кількість продукованого поліпептиду поживні добавки для клітин, які були вичерпані й/або білка пропорційна кількості життєздатних протягом процесу культивування. Частина клітин клітин, присутніх упродовж культивування, інтегі/або компонентів у середовищі, як правило, збирована щільність життєздатних клітини є корисним рається на безперервній або напівбезперервній інструментом для оцінки кількості поліпептиду основі й, довільно, очищується. й/або білка, виробленого протягом культивування. "Поліпептид": вжитий авторами термін "полі"Середовище", "клітинне культуральне серепептид" стосується послідовного ланцюга амінокидовище", "культуральне середовище": ці вжиті слот, з'єднаних за допомогою пептидних зв'язків. авторами терміни стосуються розчину, що містить Вжитий термін стосується амінокислотного ланцюпоживні речовини, які живлять зростаючі клітини га будь-якої довжини, але звичайний спеціаліст в ссавців. Як правило, ці розчини забезпечують неданій галузі розумітиме, що термін не обмежуєтьзамінимі й замінимі амінокислоти, вітаміни, джереся довгими ланцюгами й може стосуватися мінімала енергії, ліпіди та мікроелементи, необхідні клільного ланцюга, що включає дві амінокислоти, тині для мінімального росту й/або виживання. з'єднані разом за допомогою пептидного зв'язку. Розчин може також містити компоненти, які збіль"Білок": вжитий авторами термін "білок" стосушують ріст і/або виживання вище мінімального ється одного або кількох поліпептидів, які функціорівня, включаючи фактори росту й гормони. В опнують як дискретна одиниця. Якщо окремий політимальному варіанті розчини готують у такий спопептид є дискретною функціонуючою одиницею й 17 89644 18 не потребує постійної фізичної асоціації з іншими Будь-який поліпептид, що може експресуваполіпептидами для утворення дискретної функціотись в клітині-хазяїні, може бути вироблений віднуючої одиниці, вжиті авторами терміни "поліпепповідно до даного винаходу. Поліпептид може тид" і "білок" використовуються почергово. Якщо експресуватись із гена, що є ендогенним для клідискретна функціональна одиниця складається з тини-хазяїна, або із гена, що введений в клітинубільш ніж одного поліпептиду, які фізично асоціюхазяїна шляхом генної інженерії. Поліпептид може ються один з одним, вжитий авторами термін "бібути пептидом, що зустрічається в природі, або лок" стосується кількох поліпептидів, які фізично може, альтернативно, мати послідовність, що була з'єднані й функціонують разом як дискретна одистворена або відібрана рукою людини. Створений ниця. генною інженерією поліпептид може бути зібраний "Рекомбінантно експресований поліпептид" і із інших поліпептидних сегментів, які окремо зу"рекомбінантний поліпептид": ці вжиті авторами стрічаються в природі, або може включати один терміни стосуються поліпептиду, експресованого із або кілька сегментів, які не зустрічаються в прироссавцевої клітини-хазяїна, що була генетично ді. створена для експресії цього поліпептиду. РекомПоліпептиди, які можуть, за бажанням, бути бінантно експресований поліпептид може бути експресовані відповідно до даного винаходу, часто ідентичним або подібним до поліпептидів, які забудуть відбиратися на підставі потрібної біологічзвичай експресуються в ссавцевій клітині-хазяїні. ної або хімічної активності. Наприклад, даний виРекомбінантно експресований поліпептид може нахід може використовуватися для експресії будьтакож бути стороннім для клітини-хазяїна, тобто якого фармацевтично або комерційно доцільного гетерологічним до пептидів, що зазвичай експреферменту, рецептора, антитіла, гормону, регулясуються в ссавцевій клітині-хазяїні. Альтернативторного фактора, антигену, зв'язуючого агента і но, рекомбінантно експресований поліпептид може т.п. бути химерним, оскільки частини поліпептиду місАнтитіла тять амінокислотні послідовності, які є ідентичниЗ огляду на велику кількість антитіл, що викоми або подібними до поліпептидів, що зазвичай ристовуються у даний час або досліджуються у експресуються в ссавцевій клітині-хазяїні, у той якості фармацевтичних або інших комерційних час як інші частини є сторонніми для клітинизасобів, виробництво антитіл представляє особхазяїна. ливий інтерес відповідно до даного винаходу. Ан"Посів": вжитий авторами термін "посів" стосутитіла - це білки, які мають здатність специфічно ється процесу переносу клітинної культури в біозв'язувати певний антиген. Відповідно до даного реактор або інший контейнер. Клітини можуть повинаходу може використовуватися будь-яке антипередньо розмножуватись в іншому біореакторі тіло, що може бути ексцресоване в клітині-хазяїні. або контейнері. Альтернативно, клітини можуть В оптимальному варіанті втілення, антитіло, що бути заморожені й розморожені безпосередньо експресується, є моноклональним антитілом. перед їх переносом в біореактор або контейнер. В іншому оптимальному варіанті втілення, моТермін стосується будь-якої кількості клітин, вклюноклональне антитіло є химерним антитілом. Хичаючи одну клітину. мерне антитіло містить амінокислотні фрагменти, "Титр": вжитий авторами термін "титр" стосуякі отримані з більш ніж одного організму. Молекується загальної кількості рекомбінантно експресоли химерного антитіла можуть включати, наприваного поліпептиду або білка, продукованого кульклад, антиген-зв'язуючий домен із антитіла миші, турою клітин ссавців, розділеної на дану кількість щура або інших видів, з людськими константними об'єму середовища. Титр, як правило, виражаєтьділянками. Описані різноманітні тактики для ствося в одиницях міліграмів поліпептиду або білка на рення химерних антитіл. Див. наприклад, Morrison мілілітр середовища. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Даний винахід пропонує удосконалені системи Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., для виробництва білків і/або поліпептидів клітинПатент США №4816567; Boss et al., Патент США ною культурою. Зокрема, винахід пропонує систе№4816397; Tanaguchi et al., Публікація Європейсьми, які мінімізують продукування одного або кілького Патенту ЕР 171496; Публікація Європейського кох продуктів метаболізму, шкідливих для росту, Патенту 0173494, Патент Великобританії GB життєздатності клітин і/бо виробництва або якості 2177096В. білка. В оптимальному варіанті втілення даного В іншому оптимальному варіанті втілення, мовинаходу, клітинна культура є серійною або піджиноклональне антитіло є людським антитілом, влювальною культурою. Інші певні варіанти втіотриманим, наприклад, за допомогою рибосомлення винаходу, яким надається перевага, докладисплейних або фаг-дисплейних бібліотек (див., дно обговорюються нижче. Звичайні спеціалісти в наприклад, Winter et al., Патент США №6291159 і даній галузі зрозуміють, однак, що різні модифікаKawasaki, Патент США №5658754), або викорисції до цих переважних варіантів втілення охоплютання ксенотрансплантатних видів, у яких нативні ються обсягом представленої нижче формули вигени антитіла інактивовані й функціонально замінаходу. Формула винаходу та її рівноцінні нені людськими генами антитіла, при цьому заливаріанти, що визначають обсяг даного винаходу, шаючи неушкодженими інші компоненти нативної не є й не повинні обмежуватись певними переважімунної системи (див., наприклад, Kucherlapati et ними варіантами втілення або цим описом певних al., Патент США №6657103). переважних варіантів втілення. В іншому оптимальному варіанті втілення, моПоліпептиди ноклональне антитіло є гуманізованим антитілом. Гуманізоване антитіло є химерним антитілом, в 19 89644 20 якому значна більшість амінокислотних залишків Для того, щоб спрямовуватися на Ley й ефекотримана з людських антитіл, у такий спосіб звотивно націлюватися на пухлину, в ідеалі потрібне дячи до мінімуму будь-яку потенційну імунну реакантитіло з винятковою специфічністю до антигену. цію при переносі у людський суб'єкт. В гуманізоваТаким чином, бажано, щоб антитіла анти-Льюїс Υ них антитілах амінокислотні залишки в ділянках, відповідно до даного винаходу не реагували перещо визначають комплементарність, замінені, прихресно зі структурами типу 1 (тобто, лакто-серіями наймні частково, залишками із не людських видів, груп крові (Lea і Leb)) і, бажано, не зв'язували інші які обумовлюють бажану антиген-специфічність антигенні детермінанти типу 2 (тобто, неолактоабо афінність. Такі змінені молекули імуноглобуліструктуру), таку як структури Lex й Н-типу 2. Прикну можуть бути створені за допомогою будь-якого ладом оптимального антитіла анти-Льюїс Υ є з декількох способів, відомих в даній галузі (напристворене hu3S193 (див. Патенти США №№ клад, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 6310185; 6518415; 5874060, зміст яких включений 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, авторами у повному обсязі). Гуманізоване антиті4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth Enzymol, 92, 3-16 ло hu3S193 (Attia, M.A., et al. 1787-1800) було (1982)), і бажано вироблені відповідно до полоотримане шляхом пересадки CDR від 3S193, яке є жень РСТ Публікації WO92/06193 або ЕР 0239400, мишачим моноклональным антитілом, що утворюзміст кожної з яких включений авторами шляхом ється проти клітини аденокарциноми з винятковою посилання). Гуманізовані антитіла можуть виробспецифічністю до Ley (Kitamura, К., 12957-12961). лятись комерційно, наприклад, Scotgen Limited, 2 Hu3S193 не тільки зберігає специфічність 3S193 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Великобритадо Ley, але й також набуває здатності опосереднія. Для ознайомлення з додатковою літературою, ковувати комплемент-залежну цитотоксичність див. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); (далі зазначається як CDC) і антитіло-залежну Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); і клітинну цитотоксичність (далі зазначається як Pкesta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), зміст ADCC) (Attia, M.A., et al. 1787-1800). Це антитіло кожного з них включений авторами шляхом посиспрямовується на ксенотрансплантати, що екслання. пресують Ley, у голих мишах, як демонструється в В іншому оптимальному варіанті втілення, модослідженнях біорозподілу з hu3S193, міченим ноклональні, химерні або гуманізовані антитіла, 1251, 111Іn або 18F, а також іншими радіоактивописані вище, можуть містити амінокислотні залиними мітками, що потребують хелатуючого агента, шки, які у природі не зустрічаються в жодному антипу 111In, 99mTc, або 90Y (Clark, et al. 4804титілі в жодних видах. Ці сторонні залишки можуть 4811). використовуватися, наприклад, для надання нової В іншому варіанті втілення антитіло є одним з або модифікованої специфічності, афінності або людських антитіл анти-GDF-8, названих Муо29, ефекторної функції моноклональному, химерному Муо28 та Муо22, і антитілами та антигенабо гуманізованому антитілу. В іншому оптимальзв'язуючими фрагментами, отриманими з них. Ці ному варіанті втілення, описані вище антитіла моантитіла здатні зв'язувати зрілий GDF-8 з високою жуть бути кон'югованими із препаратами для сисафінністю, інгібувати активність GDF-8 in vitro та in темної фармакотерапії, такими як токсини, vivo, як продемонстровано, наприклад, шляхом низькомолекулярні цитотоксичні препарати, моінгібування зв'язування ActRIIB і випробувань генадифікатори біологічної відповіді та радіонукліди репортера, і можуть інгібувати активність GDF-8, (див. наприклад, Kunz et al., Кон'югати носійпов'язану з негативним регулюванням скелетнопохідне каліхеаміцину (Calicheamicin derivativeм'язової маси й кісткової щільності. Див., наприcarrier conjugates). US20040082764 Α1). клад, Veldman, et al., Патент США №20040142382. В одному варіанті втілення антитіло є антитіРецептори Інший клас поліпептидів, які продемонструвалом, що специфічно зв'язується із фрагментом Α ли свою ефективність у якості фармацевтичних амілоїдного білка-попередника або з іншими комй/або комерційних засобів, включає рецептори. понентами амілоїдної бляшки, і є корисним в боРецептори - це, як правило, трансмембранні глікоротьбі з накопиченням амілоїдних бляшок у мозку, протеїни, які функціонують шляхом розпізнання що характерне для хвороби Альцгеймера. (див., позаклітинного сигнального ліганду. Рецептори, як наприклад, Патентна заявка США 60/636684). правило, містять протеїнкіназний домен на додаВ іншому варіанті втілення антитіла відповідно ток до домену, який розпізнає ліганд, що ініціює до даного винаходу спрямовані проти антигенів сигнальний шлях, фосфорилюючи цільові внутріповерхні клітини, що експресуються на цільових шньоклітинні молекули після зв'язування ліганду, клітинах і/або тканинах при проліферативних защо призводить до змін, пов'язаних з розвитком або хворюваннях, таких як рак. В одному варіанті втіметаболізмом, усередині клітини. В одному варіалення антитіло є антитілом анти-Льюїс Υ lgG1. нті втілення рецептори, що розглядаються, модиЛьюїс Υ - це вуглеводневий антиген зі структурою фікуються таким чином, щоб вилучити у них транFuca12Gal14[Fuca13] GlcNac13R (Abe et смембранний й/або внутрішньоклітинний домен(и), al. (1983) J. Biol. Chem., 258 11793-11797). Антиген замість якого може довільно бути прикріплений IgЛьюїс Υ експресується на поверхні від 60% до 90% домен. В оптимальному варіанті втілення рецеплюдських епітеліальних пухлин (включаючи пухтори, що виробляються відповідно до даного вилини молочної залози, товстої кишки, легені та находу, є рецепторними тирозинкіназами (RTK). передміхурової залози), принаймні 40% яких надеРодина RTK включає рецептори, які є критичними кспресують цей антиген, і має обмежену експресію для різних функцій численних типів клітин (див., в нормальних тканинах. наприклад, Yarden and Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 21 89644 22 57:433-478, 1988; Ullrich and Schlessinger, Cell тим поліпептидом ActRIIB, що містить позаклітин61:243-254, 1990, зміст яких включений авторами ний домен рецептора ActRIIB і частину Fc антитіла шляхом посилання). До прикладів RTK, належать, (див., наприклад, Wolfman, et al., Злитий поліпепкрім інших, члени родини рецепторів фактора ростид ActRIIB та його використання (ActRIIB fusion ту фібробластів (FGF - fibroblast growth factor), polypeptides and uses therefor), US2004/0223966 члени родини рецепторів епідермального фактора Α1). Β іншому варіанті втілення фактором росту росту (EGF - epidermal growth factor), рецептор може бути модифікований пропептид GDF-8 (см., тромбоцитарного фактора росту (PDGF - platelet наприклад, Wolfman, et al., Модифіковані та стабіderived growth factor), тирозинкіназа з імуноглобулізовані пропептиди GDF та їх використання лін- і EGF-гомологічними доменами-1 (ТІЕ-1) і ре(Modifed and stabilized GDF propeptides and uses цептори ТІЕ-2 (Sato et al., Nature 376(6535):70-74 thereof), US2003/0104406 A1). Альтернативно, бі(1995), зміст якого включений авторами шляхом лок, що розглядається, міг би бути білком, що міспосилання) і c-Met рецептор, деякі з яких, як притить домен фолістатину (див., наприклад, Hill, et пускається, стимулють ангіогенез, прямо або неal., GASP1: білок, що містить домен фолістатину прямо (Mustonen and Alitalo, J. Cell Biol. 129:895(GASP1: a follistatin domain containing protein). US 898, 1995). До інших прикладів RTK належать ем2003/0162714 A1, Hill, et al., GASP1: білок, що місбріональна печінкова кіназа 1 (FLK-1 - fetal liver тить домен фолістатину (GASP1: a follistatin kinase 1) (іноді зазначається як рецептор, що місdomain containing protein), US 2005/0106154 А1, тить кіназний домен-вставку (KDR - kinase insert Hill, et al., Білки, що містять домен фолістатину domain-containing receptor) (Terman et al., (Follistatin domain containing proteins). US Oncogene 6:1677-83, 1991) або рецептор судинно2003/0180306 А1). го ендотеліального клітинного фактора росту 2 До прикладів факторів росту ссавців й інших (VEGFR-2 - vascular endothelial cell growth factor сигнальних молекул належать, крім інших, цитокіreceptor 2)), fms-подібна тирозинкіназа 1 (Fit-1 ни; епідермальний фактор росту (EGF); тромбоциfms-like tyrosine kinase-1) (DeVries et al. Science тарний фактор росту (PDGF); фактори росту фіб255;989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519робластів (FGF), такі як aFGF і bFGF; 524, 1990), іноді зазначається як рецептор судинтрансформуючі фактори росту (TGF), такі TGFного ендотеліального клітинного фактора росту 1 альфа й TGF-бета, включаючи TGF-бета 1, TGF(VEGFR-1 - vascular endothelial cell growth factor бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4 або TGF-бета 5; receptor 1), нейропілін-1, ендоглін, ендозиалін і інсуліноподібний фактор росту-І і -II (IGF-I і IGF-II); Ax1, але не обмежуються ними. Звичайні спеціалідec(1-3)-IGF-I (IGF-I мозку), білки, що зв'язуютьсти в даній галузі знатимуть інші рецептори, які інсуліноподібні фактори росту; CD білки, такі як можуть оптимально бути експресовані відповідно CD-3, CD-4, CD-8 і CD-19; еритропоетин; остеоіндо даного винаходу. дуктивні фактори; імунотоксини; кістковий морфоУ варіанті втілення, якому надається особлива генетичний білок (BMP - bone morphogenetic перевага, відповідно до даного винаходу експреprotein); інтерферон, такий як інтерферон-альфа, суються інгібітори фактору некрозу пухлини, у фобета, і -гама; колонієстимулюючі фактори (CSF рмі альфа й бета рецепторів фактора некрозу пуcolony stimulating factors), наприклад, М- CSF, GMхлини (TNFR-1; EP417 563, опублікований 20 CSF і G-CSF; інтерлейкіни (TL), наприклад, від IL-1 березня 1991 року; і TNFR-2, ЕР 417 014 опублікодо IL-10; фактор некрозу пухлини (TNF) альфа й ваний 20 березня 1991 року) (для огляду, див. бета; А-ланцюг інсуліну; В-ланцюг інсуліну; проінNaismith and Sprang, J Inflamm. 47(1-2):1-7 (1995сулін; фолікулостимулюючий гормон; кальцитонін; 96), зміст якого включений авторами шляхом полютеїнізуючий гормон; глюкагон; коагулюючі факсилання). Відповідно до одного варіанту втілення тори, такі як фактор VIIIC, фактор IX, тканинний інгібітор фактору некрозу пухлини містить розчинфактор і фактор фон Віллебранда; антикоагулююний рецептор TNF і, бажано, TNFR-Ig. В одному чі фактори, такі як Білок С; передсердний натрійуваріанті втілення оптимальними інгібіторами TNF ретичний фактор; легеневий сурфактант; активавідповідно до даного винаходу є розчинні форми тор плазміногена, такий як урокіназа або людський TNFRI і TNFRII, а також розчинні TNF-зв'язуючі сечовий або тканинний активатор плазміногена (tбілки, в іншому варіанті втілення злиття TNFR-Ig є PA); бомбезин; тромбін, гемопоетичний фактор TNFR:Fc, термін, що використовується авторами, росту; енкефаліназа; RANTES (regulated on стосується "etanercept", що є димером двох молеactivation normallу T-cell expressed and secreted кул позаклітинної частини р75 TNF-.альфа. рецепрегульований при активації звичайно Т-клітин, тора, кожна молекула складається з 235експресований і секретований); людський запальамінокислотної Fc частини субодиниці 1 людського ний білок макрофагів (МІР-1-альфа); мулеріанIgG. інгібуюча речовина; Α-ланцюг релаксину; В-ланцюг Фактори росту та інші сигнальні молекули релаксину; прорелаксин; мишачий гонадотропінІнший клас поліпептидів, які показали свою асоційований пептид; нейротрофічні фактори, такі ефективність у якості фармацевтичних й/або кояк кістковий нсйротрофічний фактор (BDNF - boneмерційних засобів, включає фактори росту та інші derived neurotrophic factor), нейротрофін-3, -4, -5, сигнальні молекули. Фактори росту це, як правило, або -6 ( NT-3, NT-4, NT-5, або NT-6), або фактор глікопротеїни, які секретуються клітинами й зв'яросту нервів, такий як NGF-бета. Звичайні спеціазуються із та активують рецептори на інших клітилісти в даній галузі знатимуть інші фактори росту нах, ініціюючи зміни, пов'язані з розвитком або або сигнальні молекули, які можуть бути експресометаболізмом, в рецепторній клітині. В одному вані відповідно до даного винаходу. варіанті втілення білок, що розглядається, є злиG-білок спряжені рецептори 23 89644 24 Інший клас поліпептидів, які показали свою іншого генератора молекул вторинних мессенджеефективність у якості фармацевтичних й/або корів. Активність GPCR може також регулюватися мерційних засобів, включає фактори росту та інші шляхом фосфорилювання внутрішньо- і позаклісигнальні молекули. G-білок спряжені рецептори тинних доменів або петель. (GPCR - G-protein coupled receptor) - це білки, які Глутаматні рецептори формують групу GPCR, мають сім трансмембранних доменів. Після зв'язуякі є важливими в нейротрансмісії. Глутамат є говання ліганда із GPCR, всередині клітини трансдуловним трансміттером в ЦНС і, як вважається, кується сигнал, що призводить до зміни біологічної грає важливу роль в нейрональній пластичності, або фізіологічної властивості клітини. когнітивній функції, пам'яті, навчанні і при декільGPCR, разом з G-білками та ефекторами (внукох неврологічних захворюваннях, таких як епілептрішньоклітинними ферментами й каналами, які сія, інсульт і нейродегенеративні порушення модулюються G-білками), є компонентами моду(Watson, S. and S. Arkinstall (1994) The G-Protein льної сигнальної системи, що з'єднує стан внутріLinked Receptor Facts Book, Academic Press, San шньоклітинних вторинних мессенджерів із позакліDiego CA, pp. 130-132). Ці ефекти глутамата опотинними вхідними сигналами. Ці гени й генні середковуються двома різними класами рецептопродукти є потенційними збудниками захворюванрів під назвою іонотропні і метаботропні. Іонотропня. ні рецептори містять внутрішній катіонний канал й Певні дефекти в гені родопсину й гені рецепопосередковують швидкі збуджувальні дії глутаматора вазопресину V2, як показано, спричинює різні ту. Метаботропні рецептори є модуляторними, форми аутосомальної домінантної й аутосомальзбільшуючи мембранну збудливість нейронів шляної рецесивної пігментної дегенерації сітківки, нехом інгібування кальцієзалежної калієвої провідноцукрового ниркового діабету. Ці рецептори мають сті і шляхом інгібування та потенціювання збуджукритичне значення для центральної нервової сисвальної передачі іонотропних рецепторів. теми і для периферійних фізіологічних процесів. Метаботропні рецептори класифікуються на п'ять Суперродина білків GPCR на даний час містить підтипів, базуючись на фармакології агоніста й більш ніж 250 типів паралогів, рецепторів, які шляхах трансдукції сигналу, й широко розподіляпредставляють варіанти, отримані шляхом дупліються в тканинах головного мозку. кації гену (або інших процесів), на противагу ортоРодина вазоактивних кишкових поліпептидів логам, тим же рецепторам від різних видів. Супер(VIP - vasoactive intestinal polypeptide), є групою родина може бути розділена на п'ять родин: споріднених поліпептидів, дії яких також опосередРодина І, рецептори, типовими представниками ковуються GPCR. Ключовими членами цієї родини яких є родопсин і бета2-адренергічний рецептор, і є безпосередньо VIP, секретин і фактор, що вивіна даний час представлена більш ніж 200 унікальльняє гормон росту (GRF - growth hormone ними членами; Родина II, що нещодавно охаракreleasing factor). VIP має широкий спектр фізіологітеризована родиною рецепторів секретичної дії, включаючи розслаблення гладких м'язів, ну/кальцитоніну/паратиреоїдного гормону; Родина стимуляцію або інгібування секреції в різних ткаIII, родина метаботропного глутаматного рецептонинах, модуляцію різних видів активності імунних ру в ссавців; Родина IV, родина сАМР рецепторів, клітин та різні збуджувальні й інгібувальні види важлива при хемотаксисі і розвитку D. discoideum; активності в ЦНС. Секретин стимулює секрецію і Родина V, грибкові спряжені рецептори феромоферментів та іонів у підшлунковій залозі й кишечнів, такі як STE2. нику й також є присутнім у маленьких кількостях в GPCR включають рецептори для біогенних мозку. GRF є важливим нейроендокринним агенамінів, для ліпідних медіаторів запалення, пептидтом, що регулює синтез і вивільнення гормону роних гормонів і сенсорних сигнальних медіаторів. сту із передньої частки гіпофізу (Watson, S. and S. GPCR стає активованим при зв'язуванні рецептоArkinstall вище, pp. 278-283). ром його позаклітинного ліганду. Конформаційні Після зв'язування ліганда з GPCR, конформазміни в GPCR, які спричинені взаємодією лігандційна зміна передається до G білка, що змушує рецептор, впливають на зв'язуючу афінність Gсубодиницю обміняти зв'язану молекулу GDP на білка із внутрішньоклітинними доменами GPCR. молекулу GTP і відокремитись від -субодиниць. Це дає GTP можливість зв'язуватись з G білком із GTP-зв'язана форма -субодиниці, як правило, підвищеною афінністю. функціонує як ефектор-модулюючий залишок, Активація G білка за допомогою GTP призвопризводячи до продукування вторинних мессендить до взаємодії  субодиниці G білка з адениладжерів, таких як циклічний AMP (наприклад, шлятциклазою або іншими генераторами молекул втохом активації аденилатциклази), диацилгліцерину ринних мессенджерів. Ця взаємодія регулює або фосфатів інозиту. Для людини відомо більш активність аденилатциклази, а отже продукування ніж 20 різних типів -субодиниць, які зв'язуються з молекули вторинного мессенджеру, сАМР. сАМР меншим об'єднанням  і -субодиниць. До прикларегулює фосфорилювання й активацію інших внудів ссавцевих G білків належать Gi, Go, Gq, Gs і трішньоклітинних білків. Альтернативно, клітинні Gt. G білки докладно описані в Lodish H. et al. рівні інших молекул вторинних мессенджерів, таMolecular Cell Biology, (Scientific American Books ких як cGMP або ейкозиноїди, можуть підвищуваInc., New York, N.Y., 1995), зміст якої включений тись або знижуватись активністю GPCR.  субодиавторами шляхом посилання. ниця G білка дезактивується шляхом гідролізу GPCR є головною мішенню для дії й розробки GTP за допомогою GTPaзи, а , , і  субодиниці препаратів. Фактично, рецептори призвели до роповторно асоціюють. Після цього гегеротримерний зробки більш ніж половини відомих на даний час G білок відокремлюється від аденилатциклази або препаратів (Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14: 25 89644 26 1516), і GPCR представляють найважливішу міклітинах, належать, наприклад, промотер мавп'яшень для терапевтичного втручання, причому 30% чого вірусу, промотери вірусу герпесу простого, препаратів, що клінічно призначаються, антагоніпромотери папіломавірусу, промотери аденовірузують або агонізують GPCR (Milligan, G. and Rees, су, промотери вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), S., (1999) TIPS. 20: 118-124). Це демонструє, що промотери вірусу саркоми Рауса, промотери цивикористання рецепторів такого типу у якості тетомегаловірусу (ЦМВ), довгі термінальні повторапевтичних мішеней є добре встановленим, дорення (LTR) вірусу мишачої лейкемії Молоні та веденим фактом. інших ретровірусів, промотер тимідинкінази вірусу Взагалі, спеціалісти при практичному втіленні герпесу простого, а також інші вірусні промотери, даного винаходу будуть обирати поліпептид, що їх відомі звичайним спеціалістам в даній галузі. цікавить, і знатимуть його точну амінокислотну Індуцибельні промотери запускають експресію послідовність. Способи відповідно до даного винаоперативно зв'язаних кодуючих послідовностей в ходу успішно застосовувались у виробництві різприсутності індукуючого агенту й можуть також номанітних поліпептидів, включаючи, наприклад, використовуватися відповідно до даного винаходу. людське моноклональне антитіло, спрямоване на Наприклад, у клітинах ссавців, металотіонеїновий фактор росту й диференціювання 8 (Приклади 1, промотер індукує транскрипцію низхідних кодую3, 4, 7-14), гуманізоване антитіло анти-Льюїс Υ чих послідовностей у присутності певних іонів ме(Приклади 5 і 6), анти-АБета (Приклад 15) і димерталу. Інші індуцибельні промотери будуть визнані ний Fc-злитий білок рецептора фактора некрозу й/або відомі звичайним спеціалістам в даній галузі. пухлини (Приклад 16), що свідчить про те, що даЗазвичай, генна послідовність експресії також ний винахід буде корисним для експресії цілого включатиме 5'нетранскрибуючі і 5'нетранслюючі спектру різних поліпептидів і білків. Будь-який дапослідовності, пов'язані з ініціюванням транскрипний білок, що повинен бути експресований відпоції й трансляції, відповідно, такі як рамка ТАТА, відно до даного винаходу, матиме свої власні осокеппінг послідовність, послідовність СААТ і т.п. бливі характеристики й може впливати на Для збільшення рівнів експресії поліпептидів або щільність або життєздатність культивованих клібілків, які будуть експресуватися, можуть довільно тин, і може бути експресований на більш низьких використовуватися елементи-посилювачі. До прирівнях ніж інший поліпептид або білок, вирощений кладів елементів-посилювачів, які, як показано, при ідентичних умовах культури. Звичайний спеціфункціонують в клітинах ссавців, належить SV40 аліст в даній галузі матиме змогу відповідним чиранній генний посилювач, як описано в Dijkema et ном модифікувати кроки й композиції даного винаal., EMBO J. (1985) 4: 761 і посилювач/промотер, ходу з метою оптимізації клітинного росту й/або отриманий із довгого термінального повторення виробництва будь-якого даного поліпептиду або (LTR) вірусу саркоми Рауса (RSV - Rous Sarcoma білка, що експресується. Virus), як описано в Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Генетичні контрольні елементи Sci. USA (1982b) 79:6777 і людського цитомегалоЯк буде очевидно для звичайних спеціалістів в вірусу, як описано в Boshart et al., Cell (1985) даній галузі, генетичні контрольні елементи мо41:521. жуть використовуватися з метою регулювання Системи для зв'язування контрольних елемегенної експресії поліпептиду або білка. Такі генентів із кодуючими послідовностями відомі в даній тичні контрольні елементи повинні відбиратися на галузі (загальні методи молекулярної біології та основі їх активності у відповідній клітині-хазяїні. рекомбінантної ДНК описані в Sambrook, Fritsch, Контрольні елементи можуть бути конститутивно and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory активними або можуть бути індуцибельними за Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor певних обставин. Індуцибельні контрольні елеменLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, ти є особливо корисними у випадках, коли експрезміст якого включений авторами шляхом посилансований білок є токсичим або іншим чином шкідня). Комерційні вектори, що підходять для вставки ливо впливає на ріст і/або життєздатність клітин. У оптимальної кодуючої послідовності для експресії таких випадках, регулювання експресії поліпептив різних клітинах ссавців за різних умов росту та ду або білка через індуцибельні контрольні елеіндукції також добре відомі в даній галузі. менти може покращити життєздатність клітин, Введення кодуючих послідовностей і відповідщільність клітини і/або сумарний вихід експресоних контрольних елементів в клітини-хазяїни ваного поліпептиду або білка. В даній галузі відоСпособи, що підходять для введення в ссавма й доступна велика кількість контрольних елецеві клітини-хазяїни нуклеїнових кислоти, достатментів, корисних у практичному втіленні даного ніх для досягнення експресії поліпептидів або білвинаходу. ків, що розглядаються, відомі в даній галузі. Див., Представники конститутивних ссавцевих пронаприклад, Gething et al., Nature, 293:620-625 мотерів, які можуть використовуватися відповідно (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); до даного винаходу, включають, крім інших, проLevinson et al.; EP 117,060; and EP 117058, зміст мотер гіпоксантин фосфорибозилтрансферази кожного з яких включений авторами шляхом поси(HPTR - hypoxanthine phosphoribosyl transferase), лання. промотер аденозиндеамінази, промотер піруваткіДля клітин ссавців, оптимальні способи траннази, промотер бета-актину, а також інші конститусформації включають спосіб осадження фосфатом тивні промотери, відомі звичайним спеціалістам в кальцію Graham і van der Erb, Virology, 52:456-457 даній галузі. Додатково, до вірусних промотерів, (1978) або спосіб з ліпофектаміном (Gibco BRL) які, як показано, стимулюють конститутивну ексHawley-Nelson, Focus 15:73 (1193). Загальні аспекпресію кодуючих послідовностей в еукаріотичних ти системних трансформацій ссавцевих клітин 27 89644 28 хазяїнів були описані Axel у Патенті США продукції високих рівнів білка або поліпептиду. №4399216, виданому 16 серпня 1983 року. Для Часто, клітини створюються генетично для продуознайомлення з різними способами для трансфокції високих рівнів білка, наприклад, шляхом ввермації ссавцевих клітин, див. Keown et al., Methods дення гена, що кодує білок або поліпептид, який in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in розглядається, й/або за допомогою введення конEnzymology, 185:527-537 (1990), і Mansour et al., трольних елементів, які регулюють експресію гена Nature, 336:348-352 (1988). До характерних прик(ендогенного або введеного), що кодує поліпепладів прийнятних векторів для експресії поліпептид, який розглядається. тидів або білків у клітинах ссавців належать, крім Певні поліпептиди можуть шкідливо впливати інших, pCDNA1; pCD, див. Okayama, et al. (1985) на ріст клітини, життєздатність клітини або деякі Mol. СеІl Вiol. 5:1136-1142; pMClneo Poly-A, див. інші характеристики клітин, що в остаточному підThomas, et al. (1987) Cell 51:503-512; і вектор басумку до певної міри обмежує виробництво поліциловірусу, такий як pАС 373 або pАС 610. пептиду або білка, який розглядається. Навіть сеВ оптимальних варіантах втілення, поліпептид ред популяції клітин одного певного типу, або білок стійко трансфектується в клітинуствореного для експресії певного поліпептиду, хазяїна. Однак, звичайний спеціаліст в даній галузі існує варіабельність у межах клітинної популяції, визнає, що даний винахід може використовуватися таким чином, що певні індивідуальні клітини буу випадку транзиторно або стійко трансфектовадуть рости краще й/або продукуватимуть більше них клітин ссавців. поліпептиду, що розглядається. У певних оптимаКлітини льних варіантах втілення даного винаходу, клітинВідповідно до даного винаходу може викорисна лінія відбирається практиком еміпіричним шлятовуватися будь-яка клітина ссавця або тип клітин, хом для здорового росту за певних умов, обраних сприйнятливий до клітинної культури і до експресії для культивування клітин. У варіантах втілення, поліпептидів. До прикладів клітин ссавців, які мояким надається особлива перевага, індивідуальні жуть використовуватися відповідно до існуючого клітини, створені для експресії певного поліпептивинаходу, належать, крім інших, лінія мишачої мієду обираються для великомасштабного виробницломи BALB/c (NSO/1, ЕСАСС No: 85110503); людтва, базуючись на рості клітин, кінцевій щільності ські ретинобласти (PER.C6 (CruCell, Leiden, Нідерклітин, відсотку життєздатності клітин, титрі ексланди)); лінія CV1 нирки мавпи, трансформована пресованого поліпептиду або будь-якої їх комбіназа допомогою SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); лінія ції чи будь-яких інших умовах, що вважаються людської ембріональної нирки (клітини 293 або практиком важливими. 293, субклоновані для росту в суспензійній культуФаза клітинної культури рі, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клітиДо типових процедур для продукування поліни нирки дитинчат хом'яків (ВНK, АТСС CCL 10); пептиду, що розглядається, належать серійні кульклітини яєчника китайського хом'яка +/-DHFR тури й підживлювані культури. Процеси серійної (СНО, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. культури традиційно включають інокуляцію кульUSA, 77:4216 (1980)); клітини Сертолі миші (ТМ4, тури для великомасштабного виробництва посівMather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); клітини ною культурою з певною конкретною щільністю нирки мавпи (CV1 АТСС CCL 70); клітини нирки клітин, вирощування клітин за умов, що сприяють африканської зеленої мавпи (VERO-76, АТСС росту й життєздатності клітин, збір культури, коли CRL-1 587); клітини людського раку шийки матки клітини досягають зазначеної щільності клітин, і (HeLa, АТСС CCL 2); клітини нирки собаки (MDCK, очищення експресованого поліпептиду. Процедури АТСС CCL 34); клітини печінки щура Буффало підживлюваної культури включають додатковий (BRL 3А, АТСС CRL 1442); клітини людської легені крок або кроки підживлення серійної культури за (W138, АТСС CCL 75); клітини людської печінки допомогою поживних речовин й інших компонен(Hep G2, НВ 8065); мишача пухлина молочної затів, які споживаються упродовж росту клітин. Послози (ММТ 060562, АТСС CCL51); клітини ТРІ тійна й невирішена проблема, що стосується тра(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 диційних серійних й підживлюваних культур, (1982)); клітини MRC 5; клітини FS4; і лінія людсьполягає в утворенні відходів метаболізму, які чикої гепатоаденоми (Hep G2). У варіанті втілення, нять шкідливий вплив на ріст, життєздатність кліякому надається особлива перевага, даний винатин і виробництво експресованих поліпептидів. хід використовується для культивування та ексДва продукти-відходи метаболізму, які чинять осопресії поліпептидів і білків із клітинних ліній СНО. бливо шкідливий вплив - це лактат і амоній, що Крім цього, відповідно до даного винаходу моутворюються внаслідок метаболізму глюкози та же використовуватися будь-яка кількість комерційглутаміну, відповідно. Крім ферментативного проно й некомерційно доступних клітинних лінії гібридукування амонію внаслідок метаболізму глутамідоми, які експресують поліпептиди або білки. ну, амоній також накопичується в клітинних кульСпеціаліст, кваліфікований в даній галузі, добре турах внаслідок неметаболічного розщеплення, розумітиме, що клітинні лінії гібридоми можуть що відбувається з часом. Даний винахід пропонує мати різні вимоги щодо живлення й/або можуть поліпшений спосіб великомасштабного виробницпотребувати різних умов культивування для оптитва поліпептидів, що мінімізує шкідливі ефекти мального росту й експресії поліпептиду або білка, і амонію й лактата шляхом сповільнення і навіть матиме змогу модифікувати умови, у разі необхіднівелювання накопичення цих відходів у клітинних ності. культурах. Звичайний спеціаліст в даній галузі Як відзначено вище, у багатьох випадках клівизнає, що даний винахід може використовуватися тини будуть відбиратися або створюватися для в будь-якій системі, у якій культивуються клітини, 29 89644 30 включаючи, крім інших, серійні, підживлювані й (USA), 53:288-293 (1965), G.E. Moore et al., J. Am. перфузійні системи. У певних оптимальних варіанMedical Assn., 199:519-24 (1967), вміст кожного з тах втілення даного винаходу, клітини вирощують яких включений авторами шляхом посилання). У в серійних або підживлюваних системах. певних варіантах втіленнях даного винаходу, конСередовища центрація амінокислот в культуральних середоТрадиційні композиції середовищ, включаючи вищах бажано є більшою ніж приблизно 70мМ. Ще комерційно доступні середовища, такі як Хема F10 більш бажано, композиції середовищ відповідно (Ham's F10, Sigma), середовище MEM (Minimal до даного винаходу містять концентрації амінокиEssential Medium, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), і слот, більші ніж приблизно 70мМ у вихідних сересередовище Ігла в модифікації Дульбекко ([DMEM довищах. Показано, що у випадку, коли концент- Dulbecco's Modified Eagle's Medium], Sigma), місрації амінокислот вихідних середовищ тять в своєму складі відносно високі рівні глюкози перебувають у цьому діапазоні, щільність клітин й й глутаміну в порівнянні з іншими амінокислотами. титр збільшуються протягом періоду росту культуЦі компоненти, як вважалось, були потрібні в надри (див. Приклад 13). лишку, оскільки вони є первинними метаболічними Крім того, у певних варіантах втілення даного джерелами енергії для клітин. Однак, швидке сповинаходу, молярне співвідношення глутаміну до живання цих поживних речовин призводить до аспарагіну в культуральних середовищах є зниженакопичення лактату й амонію, як описано вище. ним у порівнянні з іншими комерційно й некомерДодатково, високі початкові рівні глюкози й глутаційно доступними середовищами. Бажано, щоб міну, й подальше накопичення лактату й амонію молярне співвідношення глутаміну до аспарагіну в зумовлюють високу осмолярність, стан, що сам по культуральних середовищах становило менше ніж собі часто є шкідливим для росту, життєздатності приблизно два. клітин й виробництва поліпептидів. Крім того, у певних варіантах втілення даного Даний винахід пропонує різні композиції серевинаходу, молярне співвідношення глутаміну до довищ, які, при використанні відповідно до інших сумарної кількості амінокислот у культуральних кроків культивування, описаних авторами, мінімісередовищах є зниженим у порівнянні з іншими зують і навіть нівелюють накопичення лактату та комерційно й некомерційно доступними середоамонію. Композиції середовищ даного винаходу, вищами. Бажано, щоб молярне співвідношення які, як показано, чинять сприятливий вплив на ріст глутаміну до сумарної кількості амінокислот у куй/або життєздатність клітин або на експресію полільтуральних середовищах становило менше ніж пептиду чи білка, включають одну або кілька з ниприблизно 0,2. жченаведених характеристик: і) сукупна кількість Цікавий і несподіваний результат зниження амінокислот на одиницю об'єму більша ніж прибмолярного співвідношення глутаміну до аспарагіну лизно 70мМ; іі) молярне співвідношення сукупної або до сумарної концентрації амінокислот у вихідкількості глутаміну до сукупної кількості аспарагіну них середовищах відповідно до даного винаходу становить менше ніж приблизно 2; ііі) молярне полягав у тому, що на додаток до відзначеного співвідношення сукупної кількості глутаміну до зменшення в накопиченні амонію, також спостерісукупної кількості амінокислот в цілому становить галося зменшення в накопиченні лактату. У певних менше ніж приблизно 0,2; iv) молярне співвідноваріантах втілення, накопичені рівні амонію й лакшення сукупної кількості неорганічних іонів до сутату не тільки нижчі ніж в контрольних культурах, купної кількості амінокислот в цілому становить але й дійсно фактично зменшуються після початприблизно від 0,4 до 1; або ν) об'єднана сукупна кового накопичення (наприклад, див. Приклади 3 і кількість глутаміну й аспарагіну на одиницю об'єму 7). становить більше ніж приблизно 16мМ. Звичайний Boraston (Патент США №5871999) описав куспеціаліст у даній галузі зрозуміє, що термін "сукультуральне середовище, у якому молярне співвідпний", який використовується вище, стосується ношення сумарної кількості неорганічних іонів до сумарної кількості певного компоненту або компосумарної кількості амінокислот становить від 1 до нентів, доданих упродовж клітинної культури, 10. Boraston показав, що при забезпеченні культувключаючи компоненти, що додаються на початку рального середовища, у якому молярне співвідкультури й компоненти, що додаються згодом. ношення сумарної кількості неорганічних іонів до Звичайний спеціаліст у даній галузі зрозуміє, що сумарної кількості амінокислот перебуває в цьому композиції середовищ відповідно до даного винадіапазоні, агрегація клітин СНО, вирощених у сеходу охоплюють визначені й невизначені середоредовищі, зменшується. В іншому оптимальному вища. варіанті втілення даного винаходу, молярне співТрадиційні композиції середовищ починаються відношення сумарної кількості неорганічних іонів з відносно низького рівня сумарної кількості амінодо сумарної кількості амінокислот у культуральнокислот у порівнянні з композиціями середовищ му середовищі зменшене навіть ще більше, до даного винаходу. Наприклад, загальний вміст аміприблизно від 0,4 до 1. Як показано в Прикладі 13, нокислот традиційного середовища для клітинної зменшення цього співвідношення від 1,75 до прикультури, відомого як DME-F12 (суміш 50:50 сереблизно 0,7 призводить до помітного збільшення довища Ігла в модифікації Дульбекко й середовищільності клітин й виробництва експресованого ща Хема F12) становить 7,29мМ, а загальний поліпептиду або білка упродовж періоду росту вміст амінокислот традиційного середовища для культури. клітинної культури, відомого як RPMI-1640, станоВ іншому оптимальному варіанті втілення давить 6,44мМ (Див. наприклад, H.J. Morton, In Vitro, ного винаходу, культуральне середовище містить 6:89-108 (1970), R.G. Ham, Proc. Nat. Assoc. Sci. об'єднану концентрацію глутаміну і аспарагіну, що 31 89644 32 становить приблизно від 16 до 36мМ. Як показано (ВЕРХ), тести на біологічну активність й афінна в Прикладі 14, Таблиці 22, у середовищ, які місхроматографія. Звичайний спеціаліст в даній галутять об'єднану сумарну концентрацію глутаміну та зі знатиме інші відповідні способи для виявлення аспарагіну в межах цього діапазону, відзначаються експресованих поліпептидів або білків. У разі, яквищі титри експресованого поліпептиду ніж у сещо полі пептид або білок, що розглядається, ексредовищ, які містять об'єднану сумарну кількість пресують різні клітини-хазяїни, можуть використоглутаміну і аспарагіну поза цим діапазоном. Звивуватися кілька або всі перелічені способи для чайний спеціаліст в даній галузі матиме змогу обвизначення, яка ізклітин експресує цей поліпептид рати точну об'єднану концентрацію глутаміну і або білок на найвищих рівнях. аспарагіну в межах цього діапазону з метою оптиЯк тільки клітину, що експресує поліпептид мізації росту й/або життєздатності клітин і збільабо білок, що розглядається, ідентифікували, клішення до максимуму виробництва експресованого тину розмножують у культурі за допомогою будьполіпептиду. якого із широкого спектру способів, добре відомих Крім того, звичайний спеціаліст в даній галузі звичайному спеціалісту в даній галузі. Клітину, яка визнає, що будь-яка із вище зазначених умов моекспресує поліпептид або білок, що розглядається, же використовуватися або окремо або в різних як правило, розмножують шляхом вирощування її комбінаціях одна з одною. Використовуючи компопри температурі й у середовищі, що є сприятлизиції середовищ, яким властива одна, кілька або вим для виживання, росту й життєздатності клітивсі вищезгадані характеристики, звичайний спеціни. Початковий об'єм культури може бути будьаліст в даній галузі матиме змогу оптимізувати ріст яким, але часто меншим ніж об'єм культури вирой/або життєздатність клітин і збільшити до максибничого біореактора, що використовується у кінмуму виробництво експресованого поліпептиду. цевому виробництві поліпептиду або білка, що Кожна із цих композицій середовищ, розкритих розглядається, і часто клітини проходять кілька в даному винаході, може, довільно, доповнювациклів у біореакторах зі збільшенням об'єму до тись у міру необхідності гормонами й/або іншими посіву у виробничий біореактор. Клітинна культура факторами росту, певними іонами (такими, як наможе збовтуватися або струшуватися з метою трій, хлорид, кальцій, магній і фосфат), буферами, збільшення насичення середовища киснем й дисвітамінами, нуклеозидами або нуклеотидами, мікперсії поживних речовин до клітин. Альтернативно роелементами (неорганічними сполуками, що заабо додатково, для збільшення й контролю насизвичай присутні у дуже низьких кінцевих концентчення культури киснем можуть використовуватися раціях), амінокислотами, ліпідами, гідролізатами спеціальні барботуючі пристрої, які є відомими в білка або глюкозою чи іншим джерелом енергії. У даній галузі. Відповідно до даного винаходу, звипевних варіантах втілення даного винаходу допочайний спеціаліст в даній галузі розумітиме, що внення середовищ хімічними індуктантами, такими може бути вигідним контролювати або регулювати як гексаметилен-біс(ацетамід) ("ГМБА") і натрію певні внутрішні умови біореактора, включаючи, бутират ("NaB") може мати сприятливий ефект. Ці крім інших, рН, температуру, насичення киснем і додаткові добавки можуть додаватися на початку т.д. культивування або можуть додаватися в більш Початкова щільність клітин у виробничому біпізній період часу з метою поповнення вичерпаних ореакторі може обиратися звичайним спеціалістом поживних речовин або з іншої причини. Звичайний в даній галузі. Відповідно до даного винаходу поспеціаліст в даній галузі знатиме будь-які бажані чаткова щільність клітин у виробничому біореактоабо необхідні добавки, які можуть бути включені в рі може становити всього одну клітину на об'єм описані композиції середовищ. культури. В оптимальних варіантах втілення даноПідготовка культури клітин ссавців го винаходу, початкові щільності клітин у виробниВ даній галузі відомі різні способи підготовки чому біореакторі можуть коливатися від приблизно 2 клітин ссавців для виробництва білків або поліпеп2х10 життєздатних клітин на мл до приблизно тидів за допомогою серійної й підживлюваної ку2х103, 2х104, 2х105, 2х106, 5х106 або 10х106 життєльтури. Як описано вище, нуклеїнова кислота, доздатних клітин на мл і вище. статня для досягнення експресії (як правило Початкові й проміжні клітинні культури можуть вектор, що містить ген, який кодує поліпептид або бути вирощені до будь-якої бажаної щільності пебілок, що розглядається, й будь-які оперативно ред посівом у наступний проміжний або кінцевий зв'язані генетичні контрольні елементи) може бути виробничий біореактор. Бажано, щоб більшість введена в лінію клітин-хазяїнів за допомогою веклітин залишалися живими до посіву, хоча не виликої кількості добре відомих способів. Як правимагається повна або майже повна життєздатність. ло, клітини підлягають скринінгу для визначення, В одному варіанті втілення даного винаходу, кліякі із клітин-хазяїнів фактично поглинули вектор і тини можуть бути вилучені із супернатанта, наприекспресують полі пептид або білок, що розглядаклад, шляхом низькооборотного центрифугування. ється. До традиційних способів виявлення певного Може також бути бажаним промити вилучені кліполіпептиду або білка, що розглядається, експретини середовищем перед посівом у наступний біосованого клітинами ссавців належать, крім інших, реактор з метою видалення будь-яких небажаних імуногістохімія, імунопреципітація, проточна цитовідходів метаболізму або компонентів середовиметрія, імунофлуоресцентна мікроскопія, SDSща. Середовище може бути тим середовищем, у PAGE, метод імуноблотингу (Western blot), метод якому попередньо вирощувались клітини, або мовиявлення за допомогою імобілізованого ферменже бути іншим середовищем чи промивним розчиту (ELISA - enzyme-linked immunosorbentassay), ном, обраним практичним виконавцем даного виметоди високоефективної рідинної хроматографії находу. 33 89644 34 Після цього клітини можуть бути розведені до Протягом початкової фази росту клітини мовідповідної щільності для посіву у виробничий біожуть вирощуватися упродовж довшого або коротреактор. В оптимальному варіанті втілення даного шого проміжку часу, залежно від потреб практика й винаходу, клітини розводять в тому ж самому сепотреб безпосередньо клітин. В одному варіанті редовищі, що буде використовуватися у виробнивтілення клітини вирощують упродовж періоду чому біореакторі. Альтернативно, клітини можуть часу, який є достатнім для досягнення щільності бути розведені в іншому середовищі або розчині, життєздатних клітин, що є встановленим відсотком залежно від потреб і бажань практичного виконаввід максимальної щільності життєздатних клітин, ця даного винаходу, або з метою пристосування якої б клітини врешті-решт досягли, якщо б їм надо конкретних потреб безпосередньо клітин, надали можливість рости без втручань. Наприклад, приклад, якщо вони повинні зберігатися упродовж клітини можуть бути вирощені упродовж періоду короткого проміжку часу до посіву у виробничий часу, достатнього для досягнення бажаної щільнобіореактор. сті життєздатних клітин, що становить 1, 5, 10, 15, Початкова фаза росту 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, Як тільки виробничий біореактор був засіяний 90, 95 або 99 відсотків від максимальної щільності в описаний вище спосіб, клітинну культуру підтрижиттєздатних клітин. мують в початковій фазі росту за умов, що сприяВ іншому варіанті втілення клітинам надають ють виживанню, росту й життєздатності клітинної можливість рости упродовж певного проміжку чакультури. Точні умови варіюють залежно від типу су. Наприклад, залежно від початкової концентраклітин, організму, з якого клітина була отримана, і ції клітинної культури, температури, при якій виприроди та характеру поліпептиду або білка, що рощуються клітини і властивого клітинам темпу експресується. росту, клітини можуть вирощуватися упродовж 0, Відповідно до даного винаходу виробничий бі1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ореактор може бути будь-якого об'єму, що підхо18, 19, 20 або більше днів. У деяких випадках, клідить для великомасштабного виробництва поліпетинам можна надати можливість рости протягом птидів або білків. В оптимальному варіанті місяця або більше. Клітини б вирощувались упровтілення об'єм виробничого біореактору становить довж 0 днів у виробничому біореакторі, якби їхній принаймні 500 літрів. В інших оптимальних варіанріст у біореакторі для посіву, при температурі потах втілення об'єм виробничого біореактору стачаткової фази росту, був достатній для того, щоб новить 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 літрів щільність життєздатних клітини у виробничому або більше, чи має будь-який проміжний об'єм в біореакторі під час його інокуляції уже була на цих межах. Звичайний спеціаліст в даній галузі рівні бажаного відсотка від максимальної щільносзнатиме й матиме змогу обрати підходящий біореті життєздатних клітин. Практичний виконавець актор для використання в практичному втіленні даного винаходу матиме змогу обрати тривалість даного винаходу. Виробничий біореактор може початкової фази росту залежно від вимог вироббути сконструйований з будь-якого матеріалу, що ництва поліпептиду або білка й потреб безпосереє сприятливим для росту й життєздатності клітин, дньо клітин. що не перешкоджає експресії або стабільності Клітинну культуру можна збовтувати або поліпептиду або білка, що експресується. струшувати протягом початкової фази культивуТемпература клітинної культури в початковій вання з метою збільшення насичення киснем й фазі росту буде обиратися на підставі насамперед дисперсії поживних речовин до клітин. Відповідно діапазону температур, при яких клітинна культура до даного винаходу звичайний спеціаліст в даній залишається життєздатною. Наприклад, протягом галузі розумітиме, що може бути вигідним контропочаткової фази росту, клітини СНО добре ростуть лювати або регулювати певні внутрішні умови біопри 37°С. Зазвичай, більшість клітин ссавців добре реактора протягом початкової фази росту, вклюростуть в межах діапазону приблизно від 25°С до чаючи, крім інших, рН, температуру, насичення 42°С. Бажано, щоб клітини ссавців добре росли в киснем і т.д. Наприклад, рН можна контролювати межах діапазону приблизно від 35°С до 40°С. Звишляхом додавання відповідної кількості кислоти чайні спеціалісти в даній галузі матимуть змогу або основи, а насичення киснем можна контролюобрати відповідну температуру або температури вати за допомогою барботуючих пристроїв, які є для вирощування клітин, залежно від потреб клівідомими в даній галузі. тин і виробничих вимог практичного виконавця. Заміна умов культивування В одному варіанті втілення даного винаходу Відповідно до тактики даного винаходу, напритемпература початкової фази росту підтримується кінці початкової фази росту може бути замінена як єдина, постійна температура. В іншому варіанті принаймні одна з умов культивування для того, втілення температура початкової фази росту підтщоб застосувати другий набір умов культивування, римується в межах діапазону температур. Наприі відбувся метаболічний зсув у культурі. Накопиклад, протягом початкової фази росту температучення інгібіторних метаболітів, особливо лактату й ра може стійко збільшуватись або зменшуватись. амонію, інгібує ріст. Метаболічний зсув, що досяАльтернативно, упродовж початкової фази росту гається шляхом, наприклад, зміни в температурі, температура може збільшуватись або зменшуварН, осмоляльності або рівня хімічного індуктанта тись дискретними кількостями в різні проміжки клітинної культури, може характеризуватися зничасу. Звичайний спеціаліст в даній галузі матиме женням співвідношення певної швидкості продукузмогу визначити доцільність застосування однієї вання лактату до певної швидкості споживання або кількох температур і стійкого чи дискретного глюкози. В одному необмежуючому варіанті втіхарактеру зміни температури. лення умови культивування замінюють шляхом 35 89644 36 заміни температури культивування. Однак, як віданій галузі буде зрозуміло, що відповідно до дадомо у даній галузі, заміна температури не є єдиного винаходу, можуть використовуватися три або ним механізмом, через який можна досягнути відбільше послідовних змін температур з метою збіповідного метаболічного зсуву. Наприклад, такий льшення життєздатності чи щільності клітин і/або метаболічний зсув може також бути досягнутий збільшення експресії рекомбінантних поліпептидів шляхом заміни інших умов культивування, вклюабо білків. Температура або температурні діапачаючи, крім інших, рН, осмоляльність і рівні натрію зони клітинної культури після кожної послідовної бутирату. Як обговорювалося вище, вибір часу зміни температури можуть бути вищими або нижзаміни культури буде визначатися практичним чими ніж температура(и) або температурний діавиконавцем даного винаходу, базуючись на вимопазон(и) перед заміною. В оптимальному варіанті гах виробництва поліпептиду або білка чи потревтілення даного винаходу, кожна послідовна тембах безпосередньо клітин. пература або температурний діапазон є нижчими При заміні температури культивування темпеніж попередня температура або температурний ратурна заміна може бути відносно поступовою. діапазон. Наприклад, здійснення зміни температури може Наступна фаза виробництва займати кілька годин або днів. Альтернативно, Відповідно до даного винаходу, як тільки умотемпературна заміна може бути відносно різкою. ви клітинної культивування були замінені як обгоНаприклад, зміна температури може завершитися ворювалося вище, клітинну культуру підтримують через менше ніж кілька годин. З огляду на відповіупродовж наступної фази виробництва при другодне виробництво й контрольне устаткування, таке му наборі умов культивування, що сприяють вижияк застосовується в якості стандартного в комерванню й життєздатності клітинної культури й підційному великомасштабному виробництві поліпепходять для експресії бажаного поліпептиду або тидів або білків, зміна температури може звершибілка на комерційно прийнятних рівнях. тися навіть упродовж менш ніж години. Як обговорювалося вище, культивування може Температура клітинної культури в наступній бути замінене шляхом заміни однієї або кількох з фазі росту буде обиратися на підставі насамперед низки умов культивування, включаючи, крім інших, діапазону температур, при яких клітинна культура температуру, рН, осмоляльність і рівні натрію бузалишається життєздатною й експресує рекомбітирату. В одному варіанті втілення замінюється нантні поліпептиди або білки на комерційно притемпература культивування. Відповідно до цього йнятних рівнях. Зазвичай, більшість клітин ссавців варіанту втілення упродовж наступної фази вирозалишаються життєздатними й експресують рекобництва, культуру підтримують при температурі мбінантні поліпептиди або білки на комерційно або температурному діапазоні, що є нижчим ніж прийнятних рівнях в межах діапазону приблизно температура або температурний діапазон початвід 25°С до 42°С. Бажано, щоб клітини ссавців кової фази росту. Наприклад, протягом наступної залишалися життєздатними й експресували рекофази виробництва, клітини СНО добре експресумбінантні поліпептиди або білки на комерційно ють рекомбінантні поліпептиди й білки в межах прийнятних рівнях в межах діапазону приблизно діапазону від 25°С до 35°С. Як обговорювалося від 25°С до 35°С. Звичайні спеціалісти в даній гавище, можуть використовуватися багаторазові лузі матимуть змогу обрати відповідну температудискретні зміни температури з метою збільшення ру, або температури для вирощування клітин, защільності або життєздатності клітин чи збільшення лежно від потреб клітин і виробничих вимог експресії рекомбінантного поліпептиду або білка. практичного виконавця. Відповідно до даного винаходу, клітини моВ одному варіанті втілення даного винаходу жуть підтримуватися в наступній фазі виробництва температура наступної фази росту підтримується до досягнення бажаної щільності клітини або титру як єдина, постійна температура. В іншому варіанті виробництва. В одному варіанті втілення клітини втілення температура наступної фази росту підтпідтримують в наступній фазі виробництва до доримується в межах діапазону температур. Наприсягнення максимального титру до рекомбінантного клад, протягом наступної фази росту температура поліпептиду або білка. В інших варіантах втілення може стійко збільшуватись або зменшуватись. культура може бути зібрана до цього часу, залежАльтернативно, упродовж наступної фази росту но від виробничих вимог практичного виконавця температура може збільшуватись або зменшуваабо потреб безпосередньо клітин. Наприклад, клітись дискретними кількостями в різні проміжки тини можуть підтримуватися упродовж періоду часу. Звичайний спеціаліст в даній галузі розумічасу, достатнього для досягнення щільності життиме, що багаторазові дискретні заміни температєздатних клітин, що становить 1, 5, 10, 15, 20, 25, тур охоплюються в даному варіанті втілення. На30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 приклад, температура може бути замінена один або 99 відсотків від максимальної щільності життєраз, клітини підтримуються при цій температурі здатних клітин. У деяких випадках, може бути баабо температурному діапазоні упродовж певного жаним надати можливість щільності життєздатних проміжку часу, після якого температура може бути клітин досягати максимуму, а потім надати можлизамінена знову - на вищу або нижчу температуру. вість щільності життєздатних клітин зменшитися Температура культури після кожної дискретної до деякого рівня перед збором урожаю культури. У заміни може бути постійною aбo може підтримуванадзвичайному прикладі, може бути бажаним натися в межах певного діапазону температур. дати можливість щільності життєздатних клітини У Прикладі 16 показані дані, що демонструють наблизитися або досягти нуля перед збором уроефективність використання двох послідовних змін жаю культури. температур, хоча для звичайних спеціалістів в 37 89644 38 В іншому варіанті втілення даного винаходу, інших, рН, температуру, насичення киснем і т.д. клітинам надають можливість рости упродовж пеНаприклад, рН можна контролювати шляхом довного проміжку часу протягом наступної фази видавання відповідної кількості кислоти або основи, робництва. Наприклад, залежно від концентрації а насичення киснем можна контролювати за допоклітинної культури на початку наступної фази росмогою барботуючих пристроїв, які є відомими в ту, температури, при якій вирощуються клітини і даній галузі. властивого клітинам темпу росту, клітини можуть Контроль умов культивування вирощуватися упродовж 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, У певних варіантах втілення даного винаходу 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше практик може виявити, що вигідно або необхідно днів. У деяких випадках, клітинам можна надати проводити періодичний моніторинг певних умов можливість рости протягом місяця або більше. вирощування клітинної культури. Моніторинг умов Практичний виконавець даного винаходу матиме культивування клітин дозволяє практикові визназмогу обрати тривалість наступної фази виробничати, чи продукує клітинна культура рекомбінантцтва залежно від вимог виробництва поліпептиду ний поліпептид або білок на субоптимальних рівабо білка й потреб безпосередньо клітин. нях або, чи збирається культура входити в У певних випадках, може бути вигідно або несубоптимальну фазу продукування. Щоб проводиобхідно постачати клітинну культуру протягом нати моніторинг певних умов культивування клітин, ступної фази виробництва поживними речовинами буде необхідно відбирати невеликі аліквоти кульабо іншими компонентами середовища, які були тури для аналізу. Звичайний спеціаліст в даній вичерпані або метаболізовані клітинами. Напригалузі розумітиме, що існує потенційна можликлад, могло б бути вигідним постачати клітинну вість, що такий відбір може бути джерелом контакультуру поживними речовинами або іншими коммінації клітинної культури, і вживатиме відповідних понентами середовища, які, як виявилось під час заходів з метою мінімізації ризику такої контамінамоніторингу клітинної культури, були вичерпані ції. (див. розділ 'Моніторинг умов культивування' нижУ якості прикладів, крім іншого, може бути виче). Альтернативно або додатково, може бути вигідно або необхідно проводити моніторинг темпегідно або необхідно підживлювати клітинну кульратури, рН, щільності клітин, життєздатності клітуру перед наступною фазою виробництва. У тин, інтегрованої щільності життєздатних клітин, якості прикладів, крім іншого, може бути вигідно рівнів лактату, рівнів амонію, осмолярності або або необхідно постачати клітинну культуру гормотитру поліпептиду або білка, що експресується. В нами й/або іншими факторами росту, певними даній галузі відомі численні способи, що дозволять іонами (такими як натрію, хлориду, кальцію, магнію звичайному спеціалісту в даній галузі визначати ці і фосфату), буферами, вітамінами, нуклеозидами умови. Наприклад, щільність клітини може виміабо нуклеотидами, мікроелементами (неорганічрюватись за допомогою гемацитометра, лічильниними сполуками, що зазвичай присутні у дуже ника Coulter або дослідження щільності клітин зьких кінцевих концентраціях), амінокислотами, (CEDEX). Щільність життєздатних клітин може буліпідами або глюкозою чи іншим джерелом енергії. ти визначена шляхом фарбування зразка культури Ці додаткові компоненти можуть всі додаватрипаном синім. Оскільки тільки мертві клітини тись до клітинної культури одночасно, або їх можпоглинають трипан синій, щільність життєздатних на постачати клітинній культурі в серії додавань. В клітин може бути визначена шляхом підрахунку одному варіанті втілення даного винаходу додатзагальної кількості клітин, поділу кількості клітин, кові компоненти постачаються клітинній культурі в які поглинули барвник на загальну кількість клітин і різні проміжки часу в пропорційних кількостях. В взяття зворотного дробу. Для визначення рівнів іншому варіанті втілення може бути бажано надати лактату, амонію або експресованого поліпептиду тільки певну кількість додаткових компонентів спочи білка може використовуватися ВЕРХ. Альтерчатку, і постачати компоненти, що залишаються, нативно, рівень експресованого поліпептиду або пізніше. У ще одному варіанті втілення даного вибілка може бути визначений за допомогою станданаходу, клітинна культура постійно підживлюється ртних методів молекулярної біології, таких як фарцими додатковими компонентами. бування coomassie гелів SDS-PAGE, метод імуноВідповідно до даного винаходу, повний об'єм, блотингу (Western blotting), тест Бредфорда, тест що додається до клітинної культури повинен, опЛоурі, тест Бюрета і УФ адсобція. Може також бути тимально, підтримуватися на мінімальному рівні. вигідно або необхідно проводити моніторинг постНаприклад, повний об'єм середовища або розчитрансляційних модифікацій експресованого поліну, що містить додаткові компоненти, які додаютьпептиду або білка, включаючи фосфорилювання й ся до клітинної культури може становити 1, 2, 3, 4, глікозилювання. 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50% Виділення експресованого поліпептиду об'ємуклітинної культури до постачання додаткоЗазвичай, як правило, буде бажано виділяти вих компонентів. й/або очищувати білки або поліпептиди, що ексКлітинну культуру можна збовтувати або пресуються відповідно до даного винаходу. В опструшувати протягом наступної фази виробництва тимальному варіанті втілення, експресований поз метою збільшення насичення киснем й дисперсії ліпептид або білок секретується у середовище, і, поживних речовин до клітин. Відповідно до даного таким чином, наприклад, шляхом центрифугуванвинаходу звичайний спеціаліст в даній галузі роня або фільтрування, можуть бути вилучені клітизумітиме, що може бути вигідним контролювати ни й інші тверді частки, як перший крок у процесі або регулювати певні внутрішні умови біореактора очищення. Цей варіант втілення особливо кориспротягом наступної фази росту, включаючи, крім ний при використанні відповідно до даного вина 39 89644 40 ходу, тому що способи й композиції, описані автояким доступним шляхом, включаючи, крім інших, рами, призводять до збільшення життєздатності парентеральний (наприклад, внутрішньовенний), клітин. Внаслідок цього, менше клітин вмирає провнутрішньошкірний, підшкірний, пероральний, натягом процесу культивування, і у середовище визальний, бронхіальний, офтальмічний, трансдервільняється менше протеолітичних ферментів, що мальний (місцевий), трансмукозальний, ректальпотенційно можуть зменшувати вихід експресований і вагінальний шляхи. Фармацевтичні ного поліпептиду або білка. композиції відповідно до винаходу, як правило, Альтернативно, експресований поліпептид або включають очищений поліпептид або білок, ексбілок зв'язується із поверхнею клітини-хояїна. У пресований із клітинної лінії ссавців, агент для цьому варіанті втілення, середовище видаляється, доставлення (тобто, катіонний полімер, пептидний а клітини-хазяїни, що експресують поліпептид або молекулярний транспортер, поверхнево-активна білок, розщеплюються як перший крок у процесі речовина, і т.д., як описано вище) у комбінації з очищення. Лізис ссавцевих клітин-хазяїнів можна фармацевтично прийнятним носієм. Вжитий автодосягти за допомогою низки засобів, добре відорами термін "фармацевтично прийнятний носій" мих звичайним спеціалістам в даній галузі, вклювключає розчинники, дисперсійні середовища, чаючи фізичне руйнування скляними кільками і дію покриття, протибактеріальні та протигрибкові зависоких рН. соби, ізотонічні агенти і засоби для затримки всмоПоліпептид або білок можуть бути виділені й ктування, і т.п., сумісні з фармацевтичним введеночищені стандартними способами, включаючи, ням. В композиції можуть також бути включені крім інших, хроматографію (наприклад, іоннообдодаткові активні сполуки. мінну, афінну, ексклюзійну і гідроксиапатитну хроФармацевтичну композицію готують у вигляді матографію), гель-фільтрацію, центрифугування лікарської форми таким чином, щоб вона була або різницю в розчинності, осадження етанолом, сумісною з наміченим шляхом введення. Розчини або за допомогою будь-яких інших наявних спосоабо суспензії, що використовуються для парентебів для очищення білків (Див., наприклад, Scopes, рального, внутрішньошкірного або підшкірного Protein Purification Principles and Practice 2nd застосування можуть включати нижченаведені Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, компоненти: стерильний розчинник, такий як вода S.J. and Hames, B.D. (eds.), Protein Expression : A для ін'єкцій, фізіологічний розчин, фіксовані олії, Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; and поліетиленгліколі, гліцерин, пропіленгліколь або Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), інші синтетичні розчинники; протибактеріальні заGuide to Protein Purification: Methods in Enzymology соби, такі як бензиловий спирт або метилпарабе(Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic ни; антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота або Press, 1997, зміст всіх з них включений авторами натрію дисульфіт; хелатуючі агенти, такі як етилешляхом посилання). Для імуноафінної хроматогндиамінтетраоцтова кислота; буфери, такі як ацерафії, зокрема, білок може бути виділений шляхом тати, цитрати або фосфати і засоби для коригузв'язування його з афінною колонкою, що містить вання тонічності, такі як натрію хлорид або антитіла, які були утворені проти цього білка й декстроза. рН може бути відкоригований за допоприкріплені до стаціонарної фази. Альтернативно, могою кислот або основ, таких як натрію гідроксид таги афінності, такі як послідовність оболонки віабо хлористоводнева кислота. Препарати для парусу грипу, полігістидин або глутатіон-Sрентерального застосування можуть бути розфатрансфераза можуть бути приєднані до білка за совані в ампули, одноразові шприци або флакони допомогою стандартних рекомбінантних способів, з кількома дозами, виготовлені зі скла або пластщоб надати можливість для легкого очищення маси. пропусканням через відповідну афінну колонку. До фармацевтичних композицій, що підходять Інгібітори протеази, такі як фенілметилсульфонілдля ін'єкційного використання, як правило, налефторид (ФМСФ), лейпептин, пепстатин або апрожать стерильні водні розчини (у випадку водорозтинін можуть додаватись на будь-яких або на всіх чинних речовин) або дисперсії й стерильні порошстадіях з метою зменшення або нівелювання деки для екстемпорального приготування градації поліпептиду або білка упродовж процесу стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсії. У очищення. Особливо бажано застосовувати інгібівипадку внутрішньовенного введення прийнятні тори протеази, коли необхідно розщепити клітини носії включають фізіологічний розчин, бактеріостадля виділення й очищення експресованого поліпетичну воду, Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ) птиду або білка. Звичайний спеціаліст в даній гаабо фосфатний буферний розчин (PBS). У всіх лузі оцінить, що точна техніка очищення буде вавипадках, композиція повинна бути стерильною і ріювати залежно від природи поліпептиду або повинна бути рідкою до того ступеня, щоб легко білка, що підлягає очистці, природи клітин, із яких вводитися шприцем. Оптимальні фармацевтичні ескспресується поліпептид або білок, і складу секомпозиції є стабільними за умов виготовлення й редовища, у якому були вирощені клітини. зберігання й повинні оберігатися від контамінації Фармацевтичні композиції мікроорганізмами, такими як бактерії та гриби. В певних оптимальних варіантах втілення виЗазвичай, відповідний носій може бути розчиннинаходу, вироблені поліпептиди або білки будуть ком або дисперсійним середовищем, що містить, мати фармакологічну активність і будуть кориснинаприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліми для приготування фармацевтичних препаратів. церин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь, і Сполуки відповідно до винаходу, що описані вище, т.п.) та їх прийнятними сумішами. Належна текуможна вводити суб'єктові або можна спочатку причість може підтримуватися, наприклад, за допомоготувати у лікарській формі для доставлення будьгою покриття, такого як лецитин, шляхом підтри 41 89644 42 мування необхідного розміру часток у випадку ням прийнятного витискувача, наприклад, газу, дисперсії й шляхом використання поверхневотакого як вуглекислий газ, або розпилювача. Даактивних речовин. Запобігання контамінації мікроний винахід, зокрема, охоплює доставлення споорганізмами можна досягнути за допомогою різних лук, використовуючи назальний спрей, інгалятор протибактеріальних й протигрибкових засобів, або інше пряме доставлення до верхніх й/або нинаприклад, парабенів, хлорбутанолу, фенолу, асжніх дихальних шляхів. Внутрішньоназальне ввекорбінової кислоти, тимерозалу, і т.п. У багатьох дення ДНК вакцин, спрямованих проти вірусів гривипадках, буде бажаним включити в композицію пу, як було показано, індукує відповіді CD8 Τ ізотонічні агенти, наприклад, цукор, багатоатомні клітин, що вказує на те, що принаймні деякі клітиспирти, такі як манітол, сорбітол або натрію хлони в дихальних шляхах можуть поглинати ДНК при рид. Пролонгованої адсорбції ін'єкційних композидоставленні цим шляхом, і агенти для доставленцій можна досягти шляхом включенням до її скланя відповідно до винаходу збільшать клітинне погду агента, що затримує всмоктування, наприклад, линання. Відповідно до певних варіантів втілення алюмінію моностеарату і желатину. винаходу композиції, що містять очищений поліпеСтерильні ін'єкційні розчини можуть готуватиптид, експресований із клітинної лінії ссавців й ся шляхом введення очищеного поліпептиду або агент для доставлення, готуються у вигляді велибілка у необхідній кількості у відповідний розчинких пористих часток для аерозольного введення. ник з одним або комбінацією перелічених вище Системне введення може також здійснюватися компонентів, у разі потреби, після чого проводитьтрансмукозальним або трансдермальним шляхом. ся фільтрована стерилізація. Зазвичай, дисперсії Для трансмукозального або трансдермального готують шляхом введення очищеного поліпептиду введення у композиції використовуються проникаабо білка, що експресується із клітинної лінії ссавючі засоби у відповідності із бар'єром, через який ців, в стерильний носій, що містить основне диснеобхідно проникнути. Такі проникаючі засоби є персійне середовище й інші необхідні компоненти загальновідомими в даній галузі, і включають, наіз перелічених вище. У випадку стерильних пороприклад, для трансмукозального введення, детершків для приготування стерильних ін'єкційних розгенти, жовчні солі і похідні фусидової кислоти. чинів до оптимальних способів приготування наТрансмукозального введення можна досягнути за лежать вакуумне висушування й сушіння допомогою назальних спреїв або супозиторіїв. Для сублімацією, що дає можливість отримати поротрансдермального введення, очищений поліпепшок активного компонента плюс будь-який додаттид або білок і агенти для доставлення готують у ковий бажаний компонент із попередньо стерильвигляді мазей, бальзамів, гелей або кремів, які є но-відфільтрованого розчину. загальновідомими в даній галузі. Пероральні композиції, зазвичай, включають Композиції можуть також бути приготовані у інертний розчинник або харчовий носій. Для пероформі супозиторіїв (наприклад, зі звичайними осрального терапевтичного введення очищений поновами для супозиторіїв, такими як какаомасло й ліпептид або білок можуть бути поєднані з допоміінші гліцериди) або утримуючих клізм для ректажними речовинами й використовуватися у вигляді льного застосування. таблеток, драже або капсул, наприклад, желатиВ одному варіанті втілення композиції готують нових капсул. Пероральні композиції можуть також з носіями, які захистять поліпептид або білок від бути приготовані з використанням рідкого носія швидкого виведення з організму, такі як лікарські для застосування у вигляді рідини для полоскання форми з контрольованим вивільненням, включаюрота. У якості складової частини композиції мочи імплантати й мікроінкапсульовані системи для жуть бути включені фармацевтично сумісні агенти доставлення. Можуть використовуватися біологічзв'язування і/або допоміжні матеріали. Таблетки, но сумісні полімери, що розкладаються мікрооргапігулки, капсули, драже й т.п. можуть містити будьнізмами, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, який з нижченаведених компонентів або сполук полігліколева кислота, колаген, поліортоестери і подібної природи: зв'язуючий засіб, такий як мікрополімолочна кислота. Способи для підготовки такристалічна целюлоза, трагакантова камідь або ких лікарських форм будуть очевидні для спеціаліжелатин; наповнювач, такий як крохмаль або лакста, кваліфікованого в даній галузі. Матеріали мотоза, дезінтегруючий агент, такий як альгінова кижуть також бути отримані комерційно від Alza слота, Примогель (Primogel) або зерновий крохCorporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Ліпосомаль; любрикант, такий як магнію стеарат або мальні суспензії (включаючи ліпосоми, спрямовані Sterotes; глідант, такий як колоїдний кремнію діокна інфіковані клітини з моноклональними антитісид; підсолоджувач, такий як сахароза або сахалами до вірусних антигенів) можуть також викоририн; або ароматизатор, такий як м'ята, метилсалістовуватися у якості фармацевтично прийнятних цилат або помаранчевий ароматизатор. У носіїв. Вони можуть бути приготовлені відповідно композиціях для перорального введення можуть до способів, відомих спеціалістам, кваліфікованим вигідно застосовуватись засоби для поліпшення у даній галузі, наприклад, як описано в Патенті стабільності усередині шлунково-кишкового тракту США №4522811. й/або збільшення всмоктування. Вигідно готувати пероральні або парентеральДля введення шляхом інгаляції композиції відні композиції у формі одиниці дозування для просповідно до винаходу, що містять очищений політоти введення й однорідності дозування. Термін пептид або білок, експресований із клітинної лінії «форма одиниці дозування», вжитий авторами, ссавців й агента для доставлення, в оптимальному стосується фізично дискретних одиниць, які відповаріанті доставляються у вигляді аерозолю з упавідають одиничним дозуванням для суб'єкта, що ковок під тиском або розпилювача, з застосуванпідлягає лікуванню; кожна одиниця, що містить 43 89644 44 попередньо визначену кількість активного поліпепрнативні методи й матеріали для втілення винахотиду або білка в кількості, з розрахунку для досягду, а також додаткові заявки будуть очевидними нення бажаного терапевтичного ефекту у комбінадо спеціаліста в даній галузі, і призначені для ції з необхідним фармацевтичним носієм. включення у межах супровідної формули винахоПоліпептид або білок, експресований відповіду. дно до даного винаходу можна вводити в різні інПриклади тервали і упродовж різних проміжків часу, як потПриклад 1: Удосконалене середовище 1 для рібно, наприклад, один раз на тиждень упродовж підживлюваного процесу анти-GDF-8 приблизно від 1 до 10 тижнів, від 2 до 8 тижнів, Традиційні підживлювані процеси для культиприблизно від 3 до 7 тижнів, приблизно 4, 5, або 6 вування клітинних ліній мають кілька недоліків, тижнів, і т.д. Кваліфікований спеціаліст оцінить, що включаючи час і зусилля, необхідні для введення певні фактори можуть впливати на дозування й підживлень і потребу в спеціальному устаткуванні вибір часу, що необхідні для ефективного лікувану великомасштабних біореакторах. Мета полягала ня суб'єкта, включаючи, крім інших, ступінь тяжкоу розробці серійних середовищ для виробництва сті хвороби або розладу, попереднє лікування, білків, що розглядаються, у великомасштабних загальний стан здоров'я й/або вік суб'єкта та інші біореакторах, що потребує мінімального підживнаявні хвороби. Зазвичай, лікування суб'єкта за лення. допомогою поліпептиду або білку, як описано авМатеріали й методи торами, може включати окреме лікування або, у Штами й середовища: клітини яєчника китайбагатьох випадках, може включати низку схем ліського хом'яка ("СНО"), були модифіковані генною кування. Крім того зрозуміло, що відповідні дози інженерією для експресії моноклонального антитіможуть залежати від сили дії поліпептиду або білла проти фактора росту й диференціювання 8 ка й можуть бути довільно пристосовані до конкре("анти-GDF-8 клітини") (див. Veldman et al., тного реципієнта, наприклад, шляхом введення Neutralizing Antibodies Against GDF-8 and Uses доз, що збільшуються, до досягнення попередньо Therefor, US20040142382 А1). Клітини анти-GDF-8 встановленої бажаної відповіді. Вважається, що використовувалися для випробування нових сепевний рівень дози для будь-якого конкретного рійних середовищ. Середовище 1 і Середовище 2 тваринного суб'єкта може залежати від різних фапорівнювали на їхні здатності підтримувати високу кторів, включаючи активність певного поліпептиду щільність й життєздатність клітин. Композиції цих або білка, що застосовується, вік, масу тіла, загасередовищ, а також Середовища 3 перелічені в льний стан здоров'я, стать і раціон харчування Таблиці 1. Середовища готують шляхом додавансуб'єкта, час введення, шлях введення, швидкість ня всіх компонентів, за винятком FeSО4·7Н2O. Пісекскреції, будь-яку комбінацію препаратів і ступінь ля цього середовища доводять до рН 7.25, фіксуекспресії або активності, що буде змодульована. ють осмолярність і після цього додають Даний винахід включає використання компоFeSО4·7Н2O. зицій відповідно до винаходу для лікування неУмови культивування: Для експериментів в свійських тварин. Відповідно, дози й способи ввеколбах, клітини анти-GDF-8 вирощували у колбах дення можуть бути відібрані відповідно до відомих струшування й пропускали три рази. Для експерипринципів ветеринарної фармакології й медицини. ментів в біореакторі клітини анти-GDF-8 вирощуКерівні принципи можна знайти, наприклад, в вали упродовж 12 днів, щодня постачали 2% за Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and об'ємом 20Х середовища для підживлення СереTherapeutics, 8th edition, Iowa State University Press; довища 4 (Таблиця 3) або 3% за об'ємом 16Х СеISBN: 0813817439; 2001. редовища 4 (Таблиця 4) після дня 5. Протягом Фармацевтичні композиції відповідно до винаперших 4 днів клітини вирощували при 37°С. На ходу можуть бути включені в контейнер, пакування день 5 температуру замінили на 31°С. або розподіляючий пристрій разом з інструкціями Аналіз зразків: Щоденні зразки відбирали із для застосування. культур і аналізували на рівні амінокислот, вітаміПредставлений вище опис є пояснювальним і нів, заліза, фосфату, глюкози й глутаміну. жодним чином не обмежує обсяг винаходу. Альте 45 89644 46 47 89644 48 49 Результати й висновки Фігура 1 показує, що темп росту клітин airraGDF-8 був подібний і в Середовищі 1, і в Середовищі 2 в експериментах у колбах. Фігура 2 показує, що в бiореакторах, Середовище 1 показало істотне збільшення кінцевої щільності й життєздатності клітин у порівнянні з Середовищем 3. Кінцевий титр також значно збільшився, від 551мг/л для платформного процесу до 976мг/л із Середовищем 1 (дані не показані). Температура була замінена із 37°С на 31°С у день 5. Через несподіваний високий ріст клітин, культури підживлювали щодня після дня 5 або за допомогою 2% за об'ємом 20Х Середовища 4 або за допомогою 3% за об'ємом 16Х Середовища 4. Таким чином, це не справжній серійний експеримент, як спочатку планувалося. Аспарагін і тіамін додавались в середовища для підживлення, починаючи з дня 10. При розробці концентрованих серійних середовищ потрібно розглянути кілька можливих проблем. По-перше, концентровані поживні речовини могли б виявитися токсичними для клітин. У середовищах, розроблених у цьому Прикладі, всі поживні речовини й компоненти, як визначено, були нижче меж токсичності (дані не показані). По-друге, концентровані серійні середовища обов'язково мають більш високу осмолярність ніж неконцентровані середовища, що як показано, чинить шкідливий вплив на ріст й життєздатність клітин. Цю проблему можна усунути шляхом зниження кількості NaCl у початкових середовищах. Крім того, концентровані серійні середовища міс 89644 50 тять недостатні рівні глюкози для підтримки росту упродовж усього періоду культивування. Таким чином, культури постачали щодня після дня 5 підживленням у вигляді глюкози. По-третє, інсулін і глутамін сприйнятливі до деградації протягом 12-денного періоду культивування. Таким чином, культура постачалась цими компонентами на додаток до глюкози. Нарешті, залізо осаджується із розчину, що містить високі концентрації фосфату при високому рН. Цю проблему можна усунути шляхом додавання заліза наприкінці процесу приготування середовища, після коригування рН до відповідного рівня. Приклад 2: Розробка концентрованого середовища для підживлення (Середовища 5) для клітин анти-GDF-8 у підживлюваному процесі. У Прикладі 1 був розроблений серійний процес для культивування клітин анти-GDF-8 з використанням Середовища 1. Через високу щільність клітин, що спостерігалася протягом процесу, було визначено, що постачання поживними речовинами на додаток до глюкози й глутаміну, все ще є вигідним. Однак, підживлення серії за допомогою 8Х середовища для підживлення Середовища 4 призвело б до надмірного розведення культури. Щоб обійти цю проблему, були розроблені більше концентровані середовища для підживлення. Матеріали й методи та результати В Таблиці 2 зазначається склад Середовища 4А-1, Середовища 4В, Мікроелементи В і Мікроелементи D, що використовуються у композиціях Таблиць 3-7. 51 89644 52 53 89644 54 20X Середовище 4. Перші концентровані середовища були розроблені як 20ХСередовище 4. Композиція середовищ для 20Х Середовища 4 надається в Таблиці 3. 55 89644 56 Примітка: Nucellin виготовляється компанією Eli Lilly (Індіанаполіс, IN, США); вихідний розчин Γ/Π=0,036мг/мл гідрокортизону, 1,08мг/мл путресцину·2НСІ. Композиція середовищ складається з 3 частин: І, II, III. Перша частина - концентрована версія 8ХСередовища 4 з індивідуальними компонентами Середовища 4В, окрім фолієвої кислоти через проблеми з розчинністю цього вітаміну. Друга частина - вихідний розчин заліза, Мікроелементи D і кислотний цистеїн, для уникнення можливого осадження заліза при додаванні в частину І. Частина III - вихідний розчин фолієвої кислоти. Частина І додається 2% за об'ємом щодня, починаючи з дня 5, а частини II й III додаються один раз у день 5 разом з частиною І. Кінцеве значення рН середовищ для підживлення було доведене до 7.0, а осмолярність становила приблизно 1064мОсм. 2% підживлення призведе до зростання глюкози на 2г/л, глутаміну на 2мМ і осмолярності на 14мОсм для культури. 2. 16X Середовище 4. Для зменшення зростання осмолярності середовища для підживлення змінили із 20Х Середовища 4 (2% за об'ємом щодня) до 16ХСередовища 4 (3% за об'ємом щодня). Композиція середовищ для 16Х Середовища 4 надається в Таблиці 4. 57 89644 58 Примітка: Nucellin виготовляється компанією Eli Lilly (Індіанаполіс, IN, США); вихідний розчин Г/П=0,036мг/мл гідрокортизону, 1,08мг/мл путресцину·2НСІ. У цьому модифікованому 16Х Середовищі 4 також усунули глюкозу з метою подальшого зменшення осмолярності і надання певної гнучкості підживлення глюкозою. Сумарна осмолярність середовищ для підживлення тепер становить 295мОсм. 3. 16Х Середовище 4. В композицію 16Х Середовища 4 були внесені зміни. В підживлення додавали вихідний розчин заліза, що призвело до добавки 0,45мкМ з кожним підживленням. Крім цього, знову додали глюкозу, щоб надавати 1,5г/л з кожним підживленням. Композиція середовищ для цього модифікованого 16Х Середовища 4 надається в Таблиці 5. 59 89644 60 Примітка: Nucellin виготовляється компанією Eli Lilly (Індіанаполіс, IN, США); вихідний розчин Γ/Π=0,036мг/мл гідрокортизону, 1,08мг/мл путресцину·2НСІ. 4. 16Х Середовище 4. У цьому випадку, середовища для підживлення (16Х Середовище 4) були зроблені в комбінованих середовищах замість 3 окремих підживлень як в останніх кількох серіях. Були проведені тести, щоб гарантувати, що фолієва кислота може бути розчинена при необхідній концентрації й, що ні залізо, ні фолієва кислота не випадуть в осад з розчину після зберігання або при 4°С, або при кімнатній температурі упродовж 6 днів. Композиція середовищ для комбінованого 16Х Середовища 4 надається в Таблиці 6.