Конструйований білок з цинковими пальцями, направлений на гени рослин, залучені до біосинтезу жирних кислот

Реферат: Винахід належить до конструйованих білків з цинковими пальцями, направлених на гени рослин, залучені до біосинтезу жирних кислот. Також надані способи застосування таких білків з цинковими пальцями для модуляції експресії генів, інактивації генів і направленої модифікації генів. UA 109418 C2 (12) UA 109418 C2 UA 109418 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ По заявці заявляється пріоритет попередньої заявки США № 61/279528, поданої 22 жовтня 2010 року, опис якої, таким чином, в повному об'ємі включений в цей документ за допомогою посилання. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Опис в основному стосується галузей геномної інженерії і експресії білків в рослинах. Зокрема, даний винахід стосується конструювання ДНК-зв'язувальних доменів, наприклад, білків з цинковими пальцями, направлених на гени, залучені до синтезу жирних кислот, і способів використання таких білків з цинковими пальцями для модуляції експресії генів, інактивації генів і направленої модифікації генів для отримання рослин із зміненими профілями жирних кислот. ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Дієти з високим вмістом насичених жирів збільшують вміст ліпопротеїнів низької густини (LDL), що, в свою чергу, викликає відкладення холестерину на кровоносних судинах, попередня умова тісно корелює з атеросклерозом і ішемічною хворобою серця (Conner et al., Coronary Heart Disease: Prevention, Complications, and Treatment, J.B. Lippincott, Philadelphia, 1984 pp. 4364). На відміну від цього показано, що дієти з високим вмістом мононенасичених жирів послаблюють захворювання серця. Олеїнова кислота, єдина мононенасичена жирна кислота в більшості харчових рослинних олій, знижує LDL також ефективно, як і лінолева кислота, але не впливає на рівні ліпопротеїнів високої густини (HDL) (Mensink et al. (1989) New England J. Med., 321:436-441). Крім того, дієти з високим вмістом мононенасичених жирних кислот також корелюють зі зниженим систолічним артеріальним тиском (Williams et al. (1987) J. Am. Med. Assoc., 257:3251-3256, 1987). У світлі впливу жирних кислот на дієту і здоров'я проводилися спроби змінити профіль жирних кислот рослин, що використовуються в харчових і промислових цілях. Однак загальноприйняті способи зміни рослин для поліпшення профілю жирних кислот основані на мутагенезі (наприклад, хімічний, радіаційний і т. д.) і/або селекції і вимагають часу, трудомісткі і не направлені специфічно на вибрані гени. Див., наприклад, патент США № 5861187. Нещодавно, конструйовані ДНК-зв'язувальні домени, такі як ДНК-зв'язувальні домени мегануклеаз і білки з цинковими пальцями (ZFP), ефективно використовували для селективної модуляції експресії генів і для направленої зміни послідовностей генів у рослин (див., наприклад, патенти США №№ 7262054, 7235354, 7220719, 7001768 і 6534261; патентні публікації США №№ 2008/0182332 і з серійним номером США № 12/284888). Білки з цинковими пальцями (ZFP) являють собою білки, які зв'язуються з ДНК, РНК і/або білком специфічним для послідовності чином за допомогою стабілізованого металом домену, відомого як цинковий палець. Див., наприклад, Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes et al. (1993) Sci. Amer. 268(2):56-65; і Klug (1999) J. Mol. Biol. 293:215-218. ZFP, як правило, знаходяться в факторах транскрипції, і до цього часу в декількох тисячах відомих або передбачуваних факторах транскрипції ідентифіковано більше 10000 послідовностей цинкових пальців. ДНК-зв'язувальні домени також можна використовувати з нуклеазними доменами з отриманням сконструйованих нуклеаз. Наприклад, можна змінювати ДНК-зв'язувальний домен хомінг-ендонуклеази з отриманням нової хомінг-ендонуклеази. Подібним чином, домени цинкових пальців також комбінували з нуклеазними розщеплювальними доменами з отриманням нуклеаз з цинковими пальцями (ZFN) для специфічного задавання дволанцюжкового розриву в області генома, де бажана модифікація (наприклад, делеція, мутація, гомологічна рекомбінація або вставляння екзогенної послідовності) (див., наприклад, публікації патентних заявок США №№ 2007/0134796; 2005/0064474; 2008/0182332). Конструйовані ZFP значно полегшують вставляння екзогенної послідовності або модифікацію ендогенної послідовності в конкретних ділянках-мішенях у рослин і забезпечують направлену зміну геномів рослин з більшою ефективністю, ніж загальноприйняті способи (див., наприклад, патенти США №№ 7262054, 7235354, 7220719, 7001768 і 6534261). Проте, зберігається необхідність в композиціях і способах для направленої зміни генів, залучених до синтезу жирних кислот, для отримання рослин і рослинних продуктів (наприклад, рослинних олій), що містить вибрані жирні кислоти. За допомогою продукування видів рослин зі зниженими рівнями конкретних і всіх насичених жирних кислот в олії насіння можна отримувати олійні харчові продукти, що містить менше насичених жирних кислот. Такі продукти приносять користь для охорони здоров'я, знижуючи захворюваність атеросклерозом і ішемічною хворобою серця. СУТЬ 1 UA 109418 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний опис стосується композицій і способів для модуляції експресії і направленої зміни в цілих рослинах або в рослинних клітинах одного або декількох генів рослин, залучених до біосинтезу жирних кислот, таким чином, змінюючи склад жирних кислот в цілій рослині або в рослинних клітинах. Цілі рослини або рослинні клітини можуть належати до односім'ядольних (однодольних) або двосім'ядольних (дводольних) видів рослин, включаючи в деяких конкретних варіантах здійснення олієпродукуючі рослини, а також включаючи культивовані клітини, клітини в рослині на будь-якій стадії розвитку і рослинні клітини, виділені з цілої рослини, і які (або їх потомство) регенерують в рослини. Рослинні клітини можуть містити одну або декілька гомеологічних або паралогічних послідовностей генів, будь-яка кількість яких або всі з них можуть бути мішенню для модифікації способами, що описуються в цьому документі. У одному з аспектів в цьому документі описаний ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, білок з цинковими пальцями (ZFP)), який специфічно зв'язується з геном, залученим до шляху біосинтезу жирних кислот у рослин. У деяких варіантах здійснення ген являє собою ген Brassica napus. У деяких конкретних варіантах здійснення, ген Brassica napus може кодувати ацетилКоА-карбоксилазу (ACCазу), β-кетоацил-АСР-синтетази (KAS, наприклад, KAS I-KAS IV), тіоестеразу жирних кислот В (FATB, наприклад, FATB1-FATB5, або інші тіоестерази пластид), синтазу жирних кислот (FAS), елонгазу жирних кислот (FAE, наприклад, FAE1), тіоестеразу жирних кислот А (FatA), десатуразу жирних кислот (Fad2, Fad3), G-3-P-дегідрогеназу пластид (GPDH), гліцерокіназу (GK), десатуразу білка-носія стеароїлацилу (S-ACP-DES) і олеоїл-АСРгідролазу. У деяких конкретних варіантах здійснення ген може являти собою ортолог або гомолог цих генів у інших видів олієпродукуючих рослин. У ще одному додатковому аспекті також надані злиті білки, що містить будь-який з ДНКзв'язувальних доменів (наприклад, ZFP), що описуються в цьому документі. У певних варіантах здійснення злитий білок містить білок з цинковими пальцями і домен регуляції транскрипції (наприклад, домен активації або репресії), також відомий як ZFP TF. У інших варіантах здійснення злитий білок містить ZFP і нуклеазний домен з утворенням нуклеази з цинковими пальцями (ZFN), що розщеплює ген-мішень в області генома, яка представляє інтерес. У певних варіантах здійснення ZFN включає злитий поліпептид, що містить конструйований зв'язувальний домен цинкових пальців зі специфічністю до гена, залученого до шляху біосинтезу жирних кислот у рослин (наприклад, ген, що кодує ACCазу, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB5, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK або SACP-DES), і домен розщеплення, і/або один або декілька злитих поліпептидів, що містить конструйований зв'язувальний домен цинкових пальців і напівдомен розщеплення. У певних варіантах здійснення зв'язувальні домени цинкових пальців зв'язуються з ділянкою-мішенню, як показано в таблиці 2 або таблиці 10A. У певних варіантах здійснення зв'язувальні домени цинкових пальців містять послідовність, вибрану з групи, яка складається з білків з цинковими пальцями, що містить домени розпізнавання (наприклад, одиничного ланцюга), представлені в таблиці 1 або таблиці 10B. Домени розщеплення і напівдомени розщеплення можна отримувати, наприклад, з різних рестрикційних ендонуклеаз і/або хомінг-ендонуклеаз. У одному з варіантів здійснення напівдомени розщеплення отримують з рестрикційної ендонуклеази типу IIS (наприклад, FokI). У інших аспектах в цьому документі надані полінуклеотиди, які кодують будь-який з ДНКзв'язувальних доменів (наприклад, білки з цинковими пальцями) і/або злиті білки, що описуються в цьому документі. Певні варіанти здійснення, що описуються в цьому документі, являє собою експресуючий ZFP вектор, що містить полінуклеотид, який кодує один або декілька ZFP, що описуються в цьому документі, функціонально зв'язані з промотором. У одному з варіантів здійснення один або декілька з ZFP являють собою ZFN. ZFP і злиті білки, що містить ці ZFP, можуть зв'язуватися з геном, залученим до синтезу жирних кислот, і/або розщеплювати його в кодуючій області гена або в некодуючій послідовності в гені або поруч з ним, такий як, наприклад, лідерна послідовність, трейлерна послідовність або інтрон, або в нетранскрибованій області, вище або нижче кодуючої області. У певних варіантах здійснення ZFP або ZFN зв'язуються з кодуючою послідовністю або регуляторною послідовністю гена, залученого до біосинтезу жирних кислот, і/або розщеплюють їх. У іншому аспекті в цьому документі описані композиції, що містить один або декілька білків, злитих білків або полінуклеотидів, як описано в цьому документі. Рослинні клітини можуть містити один унікальний ген-мішень або декілька паралогічних піків одного і того ж гена. Таким чином, композиції можуть містити один або декілька білків, які містять ZFP (і полінуклеотидів, що кодують їх), направлених на один або декілька генів, залучених до синтезу жирних кислот в рослинній клітині. ZFP можуть бути направленими до всіх паралогічних або гомеологічних генів і 2 UA 109418 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 конкретних вибраних паралогічних або гомеологічних генів в рослинній клітині або їх сполучення. У іншому аспекті в цьому документі надана рослинна клітина-хазяїн, що містить один або декілька білків або полінуклеотидів (наприклад, експресуючі ZFP вектори), як описано в цьому документі. Для полінуклеотидів, рослинна клітина-хазяїн може бути стабільно трансформованою або транзиторно трансфікованою або бути підданою їх сполученню одним або декількома експресуючими ZFP векторами. У одному з варіантів здійснення один або декілька експресуючих ZFP векторів експресують в рослинній клітині-хазяї одну або декілька ZFN. У іншому варіанті здійснення один або декілька експресуючих ZFP векторів експресують в рослинній клітині-хазяї один або декілька ZFP TF. У іншому аспекті в цьому документі описаний спосіб модуляції експресії одного або декількох генів, залучених до біосинтезу жирних кислот в рослинній клітині, де спосіб включає: (a) введення в рослинну клітину одного або декількох експресуючих векторів, що кодують один або декілька ZFP TF, які зв'язуються з ділянкою-мішенню в одному або декількох генах, залучених до біосинтезу жирних кислот, в таких умовах, що відбувається експресія ZFP TF і модуляція одного або декількох генів. Модуляція може являти собою активацію або репресію. У певних варіантах здійснення щонайменше один ділянка-мішень знаходиться в гені(ах) ACCази, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB5, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK і/або S-ACP-DES. У інших варіантах здійснення відбувається модуляція більше одного гена, залученого до біосинтезу жирних кислот. У будь-якому зі способів модуляції експресії генів, залучених до біосинтезу жирних кислот, як описано в цьому документі, цими способами отримують рослинні клітини з модифікованим вмістом жирних кислот, наприклад, зі зниженням кількості насичених жирних кислот в рослинних клітинах. У деяких варіантах здійснення модифікований вміст жирних кислот в рослинних клітинах приводить до модифікованого вмісту жирних кислот в насінні рослини, наприклад, до зниження кількості насичених жирних кислот в насінні рослини. У деяких варіантах здійснення рослина являє собою олієпродукуючу рослину з модифікованим вмістом жирних кислот в насінні олієпродукуючої рослини (наприклад, зі зниженим вмістом насичених жирних кислот). У певному конкретному варіанті здійснення рослина являє собою рослину Brassica napus з модифікованим вмістом жирних кислот в насінні рослини Brassica napus (наприклад, зі зниженим вмістом насичених жирних кислот). У іншому аспекті в цьому документі описаний спосіб розщеплення одного або декількох генів, залучених до біосинтезу жирних кислот в рослинній клітині, де спосіб включає: (a) введення в рослинну клітину одного або декількох експресуючих векторів, що кодують одну або декілька нуклеаз (наприклад, ZFN), які зв'язуються з ділянкою-мішенню в одному або декількох генах, залучених до біосинтезу жирних кислот, в таких умовах, що відбувається експресія нуклеаз(и) (наприклад, ZFN) і розщеплення одного або декількох генів. У певних варіантах здійснення щонайменше одна ділянка-мішень знаходиться в гені, що кодує ACCазу, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB5, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK і/або S-ACP-DES. У інших варіантах здійснення розщеплюється більше одного гена, залученого до біосинтезу жирних кислот. Крім того, в будь-якому з способів, що описуються в цьому документі, розщеплення одного або декількох генів повинно приводити до делеції, додавання і/або заміни нуклеотидів в розщеплюваній області. У ще одному аспекті в цьому документі описаний спосіб введення в геном рослинної клітини екзогенної послідовності, де спосіб включає стадії: (a) приведення клітини в контакт з екзогенною послідовністю (донорний вектор) і (b) експресію в клітині однієї або декількох нуклеаз (наприклад, нуклеаз з цинковими пальцями), як описано в цьому документі, де одна або декілька нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК так, що розщеплення хромосомної ДНК на етапі (b) стимулює вбудовування донорного вектора в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. У певних варіантах здійснення одна або декілька нуклеаз являють собою злиття домену розщеплення рестрикційної ендонуклеази типу IIs і сконструйованого зв'язувального домену цинкових пальців. У інших варіантах здійснення нуклеаза містить хомінг-ендонуклеазу, наприклад, хомінг-ендонуклеазу з модифікованим ДНК-зв'язувальним доменом. У будь-якому зі способів, що описуються в цьому документі, екзогенна послідовність може кодувати білковий продукт. У ще одному додатковому аспекті також надана трансгенна або нетрансгенна рослинна клітина, що отримується будь-яким зі способів, описаних в цьому документі. У іншому аспекті в цьому документі надана рослина, що містить трансгенну або нетрансгенну рослинну клітину, отриману, як описано в цьому документі. 3 UA 109418 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У іншому аспекті в цьому документі надане насіння рослини, що містить трансгенну або нетрансгенну рослинну клітину, отриману, як описано в цьому документі. У іншому аспекті в цьому документі надана олія з насіння, що отримується з рослини, що містить трансгенну або нетрансгенну рослинну клітину, отриману, як описано в цьому документі. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фігура 1 являє собою схематичне зображення шляхів біосинтез жирних кислот в канолі (В. napus). Воно адаптоване по John Shanklin, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY (Thelen and Ohlrogge, 2002, Metabolic engineering 4:12-21). Фігура 2 являє собою схематичне зображення положень ділянок-мішеней в гені KASII для різних ілюстративних направлених на KASII ZFP TF. Числа означають ділянки-мішені ZFP, що містяться в конструкціях, приведених в таблиці III. Склади ZFP приведені в таблицях I і II. Фігура 3 являє собою зображення експресії мРНК KASII в листі рослин T0, трансформованому активуючою KASII конструкцією ZFP TF 4695, як визначено за допомогою кПЛР-РЧ, у вигляді діаграми. Для розрахунку кратності зростання експресії, представленої на діаграмі, застосовували середнє по 27 контрольних рослинах. У певних випадках спостерігали більш ніж 3-кратне зростання експресії мРНК KASII. Фігура 4 являє собою зображення відношень експресії KASII-ZFP TF/тубуліну в листі рослин T1, детектованій кПЛР-РЧ, у вигляді діаграми. Порівнювали три випадки разом з відповідними нульовими значеннями. Фігура 5 являє собою зображення у вигляді діаграми середніх відношень експресії мРНК KASII/тубуліну в TF, які містять ZFP, і сегрегуючих нуль-рослин T1, кожної з трьох подій, як визначено за допомогою кПЛР-РЧ. У листя цих рослин T1 спостерігали 2-3-кратне підвищення експресії мРНК KASII. Фігури 6A і 6B являють собою діаграми, отримані із застосуванням статистичного програмного забезпечення JMP для однофакторного аналізу жирних кислот(и)-мішеней, що демонструють узгоджене і значне (р =